Evaluation der Effekte von Rho kinase Inhibiton auf die korneale Nervenregeneration in vivo

Evaluation der Effekte von Rho kinase Inhibiton auf die korneale Nervenregeneration in vivo

S. Mertsch

, I. Neumann

, G. Geerling

, S. Schrader

1

Labor für Experimentelle Ophthalmologie, Klinik für Augenheilkunde, PIUS Hospital , Carl-von-Ossietzky Universität Oldenburg

2

Labor für Experimentelle Ophthalmologie, Klinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Düsseldorf Potentielle Interessenkonflikte 1. nein, 2. nein, 3. nein, 4. nein,

Verletzung oder degenerative Schädigung des kornealen Nervenplexus (KNP) sind Hauptursachen der Entstehung einer Neurotrophen Keratopathie (NK) und des neurogen induzierten trockenen Auges. Die spontane Regeneration der Hornhautnerven ist oftmals unvollständig und die zugrunde liegenden Mechanismen sind nahezu unbekannt. Die Stimulation der Hornhautnervenregeneration stellt einen vielversprechenden kurativen Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankungen dar. Ziel dieser Studie war es, die Wirkung eines Rho-Kinase-Inhibitors auf die Regeneration der Hornhautnerven in einem in vivo Mausmodell mittels konfokaler Mikroskopie über einen Zeitverlauf von 4 Wochen zu untersuchen.

Einleitung Methoden

In dieser in vivo Studie konnte erstmalig ein positiver Einfluss einer Rho Kinase Inhibition auf das Auswachsen kornealer Nerven nach Verletzung aufgezeigt werden. Die topische Applikation eines Rho Kinase Inhibitors stellt eine potentiell vielversprechende neue Therapie-Option zur Behandlung der NK, sowie des neurogen induzierten trocknen Auges dar.

Schlussfolgerung Ergebnisse

2D Assays

In vivo Experiment Setup

In vivo konfokale Messung mit HRT III und RCM 28 Tage postOP

MSC Transplantation: Beeinflussung der Immunreaktion Der KNP in den rechten Augen von 8-10 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n=24)

wurde mittels eines 1.2mm tiefenregulierten Trepans durchtrennt. Die Augen wurden zweimal täglich mit 10 µl Augentropen behandelt, welche entweder 100µM Y27632/NaCl/50%Glycerin oder nur NaCl/50%Glycerin enthielten. An Tag 0, 7, 14, 21, und 28 wurden die kornealen Nerven mittels HRT III mit RCM dokumentiert. Die Länge der Nervenfasern wurde mittels CCMetrix Software in 20 HPF/Maus gemessen. An Tag 14 und 28 wurden je 12 Tiere aus dem Versuch genommen, die Korneas präpariert und mit βIIItubulin als whole-mount angefärbt.

Die trigeminalen Ganglien (TG) wurden ebenfalls entnommen und die mRNA Expression von ROCK1 und 2, LIMK, cdc42, GAP43 und NGF mittels qrtPCR in den TG der operierten Seite (OP-G) der nicht-operierten Seite (OP-KO-G) und der unbehandelten nativen Kontrolle (KO-G) gemessen.

Sonja.Mertsch@uni-oldenburg.de

(A,B) Beispiel des neuronalen Scratch Assays 24 Stunden nach scratchen (A) ohne Behandlung und (B) mit Inhibitor-Treatment. (C) Ergebnisse des 2D Scratch Assay mit Messung der Gesamtfaserlänge. Sowohl an Tag 1 als auch an Tag 2 zeigen Neurone behandelt mit Inhibitor eine signifikant höhere Faserlänge als die Kontrollen. (D-F) Beispiel des Single Neuron Assays mit Auswertung (D) nach 24h und (E) nach 48h Treatment mit Inhibitor. Es zeigt sich auch hier ein vermehrtes kreuzen der Axone in den hinteren Kreisen unter Inhibitor-Treatment, was auf eine erhöhte Faserlänge schließen lassen kann.

1,2mm tiefenregulierter Trepan, 80µm Schnitttiefe,

rechtes Auge operierte, linkes Auge unbehandelt

0d 7d 14d 21d 28d

OP +

Messung Messung Messung +

2. Endpunkt Messung

Messung + 1. Endpunkt

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

2 x AT

12 Tiere,

• 6 x Inhibitor

• 6 x Kontrolle 12 Tiere,

• 6 x Inhibitor

• 6 x Kontrolle

Timeline: Die rechten Augen der 24 C57BL/6J Mäuse wurden trepaniert und 2x tgl im Abstand von 10 Stunden mit 10µl Rho Kinase Inhibitor in 0.9%

NaCl/50% Glycerin oder nur 0.9%NaCl/50%Glycerin

behandelt. Der KNP wurde wöchentlich mit dem HRT III mit RCM vermessen.

Nach 14 und 28 Tagen wurden jeweils 12 Tiere aus dem Versuch genommen und die Korneas als wholemount angefärbt.

Maus 1 Maus 2 Maus 3 Maus 4 Maus 5 Maus 6

Maus 7 Maus 8 Maus 9 Maus 10 Maus 11 Maus 12

KontrolleInhibitor

Wholemount-Staining mit anti-βIII-tubulin (rot). (A,B) Maus Nr7 mit Y27632 Behandlung, die Inzision der Kornea ist deutlich sichtbar, ebenfalls zeigen sich Nervenfasern, welche die Inzisionsstelle in verschiedenen Tiefen kreuzen. C) Maus Kontrolle ohne Inzision und ohne Behandlung zeigt ein dichtes Netz der Nervenfasern.

qrtPCR Messung der Trigeminalen Ganglien 14Tage postOP

mRNA Expressionslevel in den Trigeminalen Ganglien mit und ohne Inhibitor-Behandlung.

Nach 14 Tage Inhibitor-Behandlung zeigte sind eine Herunterregulierung von ROCK1, ROCK2 und gap43.

Ebenfalls zeigte sich eine gesteigerte Expression von α-tubulin, LIMK und NGF im direkten Vergleich mit den TGs von unbehandelten Tieren (gesetzt als 100%).

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% 160%

Rho Kinase 1 Rho Kinase 2 α-tubulin LIMK gap43 cdc42 NGF

Rho Kinase 1

Rho Kinase

2 α-tubulin LIMK gap43 cdc42 NGF TG von native nicht-operiert, nicht

behandelt 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

TG von ReAuge operiert - Inhibitor (OP-

KO-G) 107% 100% 124% 142% 86% 109% 114%

TG von ReAuge operiert + Inhibitor (OP-

G) 95% 89% 125% 133% 83% 101% 114%

mRNA Expression des Trigeminalen Ganglions nach14 Tagen-Treatment

A) HRT III Bilder von Maus 1-12 4 Wochen nach OP. Für die Auswertung wurden jeweils 20 HPF pro Tier /Messung verblindet mittels CCMetrix Software ausgewertet. B) Ergebnisse der Gesamtfaserlänge pro HPF zu allen gemessenen Zeitpunkten. Direkt nach Op zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Faserlänge. Nach 7 Tagen reduzierte sind in allen Tieren die Faserlänge signifikant, ein direkter Vergleich zwischen Kontrolle und Y27632 zeigt jedoch eine signifikant erhöhte Faserlange bei den Inhibitor-Tieren.

In den Kontrolltieren nimmt die Faserlänge weiter ab bis Tag 28, in den Inhibitor-Tieren zeigt sich eine Steigerung der Faserlänge bis auf den Ursprungswert nach 21 Tagen.

Wholemount-Staining 28 Tage postOP

Ms7 4 Wochen Y27632

Inzision

Inzision

Ms7 4 Wochen Y27632

Inzision

Inzision

Kontrolle native ohne OP

Nervenfasern

A B C

n.s.

**

***

*** ***

A

B

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

Kontrolle Y27632 Kontrolle Y27632

D1 D2

ø Gesamtlänge pro well [µm]

2D Scratch Assay

A Kontrolle B Inhibitor

D1 D2

D E

C

0 100 200 300 400 500 600

1. Kreis 2. Kreis 3. Kreis 4. Kreis 5. Kreis 6. Kreis

relatives Axon/Kreis Crossing [%]

Single Neuron Assay d1 Kontrolle d1 Y27632 d2 Kontrolle d2 Y27632

F

D1 D1

Inhibitor Inhibitor

** ** ^**

** **

**

*