Aus der Klinik für Neurologie (Direktor: Prof. Dr. med. M. Bähr) im Zentrum Neurologische Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
Pharmakologische Inhibition von Rho-Kinase im Mausmodell der Amyotrophen Lateralsklerose
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von René Günther
aus
Karl-Marx-Stadt
Göttingen 2014
D e k a n: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer
I. Berichterstatter: Prof. Dr. med. P. Lingor II. Berichterstatter/in: Prof. Dr. med. M. W. Sereda Promotor: Prof. Dr. med. M. Oppermann
Tag der mündlichen Prüfung: 23. Juni 2015
I
I. Abkürzungsverzeichnis --- VI II. Abbildungsverzeichnis --- VIII III. Tabellenverzeichnis --- X
1 Einleitung --- 1
1.1 Amyotrophe Lateralsklerose --- 1
1.1.1 Begrifflichkeit und Definition --- 1
1.1.2 Klinik, Verlauf und Prognose --- 2
1.1.3 Epidemiologie --- 3
1.1.4 Diagnostik --- 4
1.1.5 Ätiologie --- 5
1.1.6 Pathogenese --- 7
1.1.7 Aktuelle pharmakologische Therapie --- 11
1.2 Das High-copy-B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J-Mausmodell --- 11
1.2.1 Genetischer Hintergrund --- 11
1.2.2 Klinisch-funktionelles und pathomorphologisches Erscheinungsbild --- 12
1.3 ROCK-Inhibition – eine neue Therapiestrategie --- 15
1.3.1 Rho-Rock-Signalkaskade --- 15
1.3.2 ROCK-Inhibitoren --- 16
1.3.3 Neurophysiologische Rolle von ROCK und Hypothesen zur Neuroprotektion durch ROCK-Inhibitoren mit Bezug zur ALS --- 17
1.3.3.1 Axonale Plastizität und neurozelluläres Überleben --- 17
1.3.3.2 Proteinaggregation --- 22
1.4 Zielsetzung der Arbeit --- 24
2 Material und Methoden --- 27
2.1 Standardmaterialien --- 27
2.2 Experimentdesign --- 29
II
2.3 Tierzucht und Tierhaltung --- 29
2.4 Genotypisierung der SOD1-G93A-Punktmutation --- 30
2.5 Versuchsgruppen --- 32
2.5.1 Therapeutische Behandlung und Versuchsgruppenübersicht --- 32
2.5.2 Versuchsgruppen in einer Querschnittstudie nach präsymptomatischer Behandlung mit Fasudil --- 34
2.5.3 Versuchsgruppen der präsymptomatischen Behandlung mit Y-27632 --- 34
2.5.4 Versuchsgruppen der symptomatischen Behandlung mit Fasudil --- 34
2.5.5 Versuchstiere zur Methodenetablierung --- 35
2.6 Klinische Analyse des SOD1-G93A-Mausmodells --- 35
2.6.1 Analyse des Krankheitsverlaufs, Versuchsabbruch und Überlebensanalyse --- 35
2.6.2 Körpergewicht --- 36
2.6.3 Motorische Verhaltenstestungen --- 37
2.6.3.1 Gitterhängeversuch (hanging wire) --- 37
2.6.3.2 Drehwalzentest (rotarod) --- 38
2.6.4 Statistische Auswertung der klinischen Parameter --- 40
2.7 Histomorphologische und elektrophysiologische Evaluation nach präsymptomatischer Behandlung mit Fasudil --- 41
2.7.1 Perfusion der Versuchstiere --- 41
2.7.2 Allgemeines Procedere der Gewebepräparation --- 41
2.7.3 Darstellung und Analyse der axonalen Strukturen im Nervus ischiadicus --- 42
2.7.3.1 Präparation des Nervus ischiadicus --- 42
2.7.3.2 Fixierung und Einbettung des Nervus-ischiadicus-Gewebepräparates --- 43
2.7.3.3 Nervus ischiadicus – Gewebeaufbereitung und Myelinscheidenfärbung --- 43
2.7.3.4 Mikroskopie und Auswertung der histomorphologischen Analyse im Nervus ischiadicus --- 44
III
2.7.4 Analyse der motorischen Endplatten und die Bestimmung der Muskelatrophie im
Musculus gastrocnemius --- 46
2.7.4.1 Präparation des Musculus gastrocnemius --- 46
2.7.4.2 Bestimmung der Muskelatrophie anhand des Musculus gastrocnemius --- 47
2.7.4.3 Gewebeaufbereitung und Darstellung der motorischen Endplatten --- 47
2.7.4.4 Mikroskopie und Analyse der motorischen Endplatteninnervation --- 49
2.7.5 Darstellung und Analyse der α-Motoneurone im Rückenmarkspräparat --- 50
2.7.5.1 Rückenmarkspräparation --- 50
2.7.5.2 Gewebeaufbereitung und Darstellung der α-Motoneurone --- 51
2.7.5.3 Mikroskopie und Auswertung der Motoneurone --- 53
2.7.6 Elektrophysiologische Untersuchungen am SOD1-G93A-Mausmodell --- 55
2.7.6.1 Anästhesie --- 55
2.7.6.2 Ablauf der elektrophysiologischen Untersuchung --- 55
2.7.7 Statistische Auswertung der histomorphologisch und elektrophysiologisch erhobenen Daten --- 56
3 Ergebnisse --- 57
3.1 Querschnittstudie nach präsymptomatischer Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Fasudil --- 57
3.1.1 Degenerative Veränderungen der Motoneurone im Rückenmarkvorderhorn --- 57
3.1.2 Muskelatrophie und Innervationsprofil der motorischen Endplatten --- 60
3.1.3 Degenerative Veränderungen im Nervus ischiadicus --- 62
3.1.3.1 Progredienter Verlust der Axonanzahl im SOD1-G93A-Mausmodell --- 62
3.1.3.2 Histomorphologsiche Analyse des Nervus ischiadicus in der Querschnittstudie --- 63
3.1.4 Elektroneurographische Untersuchung --- 66
3.1.4.1 Elektroneurographische Vorversuche --- 66
3.1.4.2 Elektroneurographische Ergebnisse in der Querschnittstudie --- 68
IV
3.2 Präsymptomatische Behandlungsstudie mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 --- 70
3.2.1 Gewichtsanalyse --- 70
3.2.1.1 Gewichtsanalyse der Weibchen --- 70
3.2.1.2 Gewichtsanalyse der Männchen --- 72
3.2.2 Motorische Verhaltensanalyse --- 74
3.2.2.1 Motorische Verhaltensanalyse der Weibchen --- 74
3.2.2.2 Motorische Verhaltensanalyse der Männchen --- 75
3.2.3 Überlebensanalyse --- 76
3.2.4 Krankheitsverlauf --- 77
3.2.4.1 Krankheitsverlauf der Weibchen --- 77
3.2.4.2 Krankheitsverlauf der Männchen --- 78
3.3 Symptomatische Behandlungsstudie mit dem ROCK-Inhibitor Fasudil --- 79
3.3.1 Gewichtsanalyse --- 79
3.3.1.1 Gewichtsanalyse der Weibchen --- 79
3.3.1.2 Gewichtsanalyse der Männchen --- 81
3.3.2 Motorische Verhaltensanalyse --- 83
3.3.2.1 Rotarod-Verhaltensanalyse der Weibchen --- 83
3.3.2.2 Rotarod-Verhaltensanalyse der Männchen --- 83
3.3.3 Überlebensanalyse --- 85
3.3.4 Krankheitsverlauf --- 86
3.3.4.1 Krankheitsverlauf der Weibchen --- 86
3.3.4.2 Krankheitsverlauf der Männchen --- 87
4 Diskussion --- 88
4.1 Querschnittstudie nach präsymptomatischer Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Fasudil --- 88
4.1.1 Milde neuroprotektive Effekte auf Ebene der Motoneurone im ZNS --- 88
V
4.1.2 Kein Einfluss auf degenerative Veränderungen im PNS --- 91
4.1.3 Modulation von Gliazellen --- 94
4.2 Präsymptomatische Behandlungsstudie mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 --- 95
4.2.1 Verträglichkeit von Y-27632 --- 95
4.2.2 Präsymptomatische Behandlung mit Y-27632 verlängert den Erhalt der Motor- koordination --- 95
4.3 Symptomatische Behandlungsstudie mit dem ROCK-Inhibitor Fasudil --- 98
4.3.1 Verträglichkeit von Fasudil --- 98
4.3.2 Symptomatische Fasudilbehandlung verlängert den Erhalt der Motorkoordination in der männlichen Behandlungskohorte --- 99
5 Zusammenfassung --- 103
6 Literaturverzeichnis --- 105
VI
I. Abkürzungsverzeichnis
ALS - Amyotrophe Lateralsklerose
BSA - bovine serum albumin
ChAT - Cholin-Acetyl-Transferase dmL - distal-motorische Latenz
EAAT-2 - excitatory amino acid transporter 2 ER - endoplasmatisches Retikulum
fALS - familiäre Amyotrophe Lateralsklerose fALS1 - familiäre Amyotrophe Lateralsklerose Typ 1
FTD - Frontotemporale Demenz
FUS - fused in sarcoma
GAPs - GTPase activating proteins
GDIs - guanine nucleotide dissociation inhibitors GDP - Guanosindiphosphat
GEFs - guanine nucleotide exchange factors GTP - Guanosintriphosphat
IPC - insoluble protein complexes
MAG - myelin-associated glycoprotein MLC - myosin light chain
MND - Motoneuron disease
MPTP - 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin MSAP - Muskelsummenaktionspotential
mNLG - motorische Nervenleitgeschwindigkeit NCI - neuronal cytoplasmatic inclusions NF-M - Neurofilament-M
OMgp - oligodendrocyte-myelin-glycoprotein
PBS - phosphate buffered solution
PFA - Paraformaldehyd
PH-Domäne - Pleckstrin-homologe-Domäne PLS - Primäre Lateralsklerose
VII
PTEN - phosphatase and tensin homologue RBD - Rho binding domain
ROCK - Rho-Kinase
sALS - sporadische Amyotrophe Lateralsklerose SMA - Spinale Muskelatrophie
SOD1 - Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase-1
Stdf - Standardfehler
TDP 43 - TAR-DNA-binding protein-43 UPS - Ubiquitin-Proteasom-System VAChT - vesicular acetylcholine transporter ZTE - Zentrale Tiereinheit
VIII
II. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Pathomechanismen der ALS ... 10
Abbildung 2 Zeitlicher Verlauf der klinischen und neuropathologischen Veränderungen im high-copy-SOD1G93A-Mausmodell ... 14
Abbildung 3 Aktivierung des Rho-ROCK-Signalweges mit Folge einer Unterdrückung des axonalen Wachstums und des Zellüberlebens ... 20
Abbildung 4 ROCK-Inhibition verlängert das Überleben und verbessert die motorischen Fähigkeiten nach präsymptomatischer Behandlung mit Fasudil ... 25
Abbildung 5 Genotypisierung der SOD1-G93A-transgenen Tiere ... 32
Abbildung 6 Testapparaturen ... 39
Abbildung 7 Präparation des Nervus ischiadicus ... 42
Abbildung 8 Automatisierte Auswahl und Berechnung der Axoplasma-Fläche mit dem Image- J-Programm ... 46
Abbildung 9 Immunhistochemische Darstellung der motorischen Endplatte ... 49
Abbildung 10 Präparation des Rückenmarks ... 51
Abbildung 11 Auswertung der ChAT-Färbung. ... 54
Abbildung 12 Degenerative Veränderungen der Motoneurone in der Querschnittanalyse .... 59
Abbildung 13 Muskelatrophie im Musculus gastrocnemius in der Querschnittanalyse ... 60
Abbildung 14 Innerverationsprofil im Musculus gastrocnemius in der Querschnittanalyse ... 61
Abbildung 15 Progredienter Verlust der Axonanzahl im SOD1-G93A-Mausmodell ... 63
Abbildung 16 Histomorphologische Analyse des Nervus ischiadicus in der Querschnittanalyse ... 65
Abbildung 17 Elektroneurographische Vorversuche ... 67
Abbildung 18 Elektroneurographische Untersuchung in der Querschnittstudie ... 69
Abbildung 19 Gewichtsanalyse der Weibchen in der präsymptomatischen Studie mit Y-27632 ... 71
Abbildung 20 Gewichtsanalyse der Männchen in der präsymptomatischen Studie mit Y-27632 ... 73
Abbildung 21 Motorische Verhaltensanalyse der Weibchen in der präsymptomatischen Studie mit Y-27632 ... 74
IX
Abbildung 22 Motorische Verhaltensanalyse der Männchen in der präsymptomatischen Studie mit Y-27632 ... 75 Abbildung 23 Überlebensanalyse in der präsymptomatischen Studie mit Y-27632 ... 76 Abbildung 24 Analyse des Krankheitsverlaufes der Weibchen in der präsmyptomatischen
Studie mit Y-27632 ... 77 Abbildung 25 Analyse des Krankheitsverlaufes der Männchen in der präsymptomatischen
Studie mit Y-27632 ... 78 Abbildung 26 Gewichtsanalyse der Weibchen in der symptomatischen Studie mit Fasudil ... 80 Abbildung 27 Gewichtsanalyse der Männchen in der symptomatischen Studie mit Fasudil .. 82 Abbildung 28 Rotarod-Verhaltenssanalyse der Weibchen in der symptomatischen Studie mit
Fasudil ... 83 Abbildung 29 Rotarod-Verhaltensanalyse der Männchen in der symptomatischen Studie mit
Fasudil ... 84 Abbildung 30 Überlebensanalyse in der symptomatischen Studie mit Fasudil ... 85 Abbildung 31 Analyse des Krankheitsverlaufes der Weibchen in der symptomatischen Studie
mit Fasudil ... 86 Abbildung 32 Analyse des Krankheitsverlaufes der Männchen in der symptomatischen Studie mit Fasudil ... 87
X
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Standardmaterialien ... 28 Tabelle 2 Experiment- und Versuchsgruppenübersicht ... 33 Tabelle 3 Übersicht Einbettung des Nervus-ischiadicus-Gewebepräparates ... 43
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Amyotrophe Lateralsklerose 1.1.1 Begrifflichkeit und Definition
Das Krankheitsbild der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) wurde erstmals im Jahr 1869 durch den französischen Pathologen und Neurologen Jean-Martin Charcot beschrieben und zunächst als ‚Charcot’sche Sklerose‘ betitelt (Charcot und Joffory 1869). In den Vereinigten Staaten von Amerika wird diese Erkrankung nach einem an ALS erkrankten, zu seiner Zeit sehr erfolgreichen Baseball-Spieler, auch als Lou-Gehrig-Syndrom benannt (Cleveland und Rothstein 2001). Die in Deutschland verwendete Bezeichnung Amyotrophe Lateralsklerose setzt sich zusammen aus ‚a-myo-troph‘ und ‚Lateral-sklerose‘ und beschreibt damit die Erkrankung klinisch-pathologisch. ‚A-myo-troph‘ steht für den klinischen Befund der Muskelatrophie und Muskelschwäche. ‚Lateral-Sklerose‘ bezieht sich auf die durch die Glianarbe veränderten Seitenstränge des Rückenmarks, welche in autopsierten Patienten verhärtet zu tasten sind (Rowland und Shneider 2001). Im Weiteren Sinne ist die ALS eine Motoneuronerkrankung, wobei diesem Begriff auch noch andere Erkrankungen sub- summiert werden, bei denen eine fortschreitende Degeneration der Motoneurone vorliegt (Rowland und Shneider 2001; Swash und Desai 2000). Die ALS charakterisiert durch die kombinierte Degeneration des ersten und zweiten Motoneurons (Swash and Desai 2000;
Rowland und Shneider 2001; Lücking und Hufschmidt 2006). Eine ausschließliche De- generation des ersten Motoneurons findet sich bei der sehr seltenen Primären Lateral- sklerose (PLS), die als eigenständige Entität kontrovers diskutiert wird (Lücking und Hufschmidt 2006). Tritt eine isolierte Degeneration des zweiten Motoneurons auf, spricht man von einer spinalen Muskelatrophie (SMA), die im Kindesalter nach der Mukoviszidose eine der häufigsten letalen autosomal-rezessiv vererbten Erkrankungen darstellt (Lücking und Hufschmidt 2006). Als weitere seltene Unterformen der degenerativen Erkrankungen der Motoneurone werden die familiäre spastische Spinalparalyse und die hereditäre Bulbärparalyse (auch bekannt als Kennedy-Syndrom) angegeben (Lücking und Hufschmidt 2006).
2 1.1.2 Klinik, Verlauf und Prognose
Die Klinik der ALS definiert sich durch Funktionsstörungen des im motorischen Kortex gelegenen ersten und des bulbär (im Bulbus medullae) oder spinal (in der Medulla spinalis) gelegenen zweiten Motoneurons. Die Schädigung des ersten Motoneurons spiegelt sich klinisch in Hyperreflexie, Myoklonus, Spastik und auslösbaren Pyramidenbahnzeichen (z. B.
Babinski-Reflex), die des zweiten Motoneurons in Muskelschwund, Muskelschwäche und Faszikulationen wider (Rowland und Shneider 2001). Nach dem Erscheinungsbild der zu Beginn der Erkrankung auftretenden Symptomatik werden drei klinische Formen der ALS unterschieden. Der mit 65 % größte Teil der Patienten präsentiert sich mit einer auf die Extremitäten betonten Primärsymptomatik. Davon abzugrenzen sind 30 % der Patienten, welche zu Beginn mit bulbären Funktionsstörungen (z. B. Dysphagie und Dysarthrie) in Erscheinung treten. In 5 % der Fälle manifestiert sich die Erkrankung schon zu Beginn mit respiratorischen Störungen (Hardiman et al. 2011). Ein bulbärer Beginn, Schwäche der Atemmuskulatur und ein höheres Alter bei Erkrankungsbeginn gelten als negative Prognosefaktoren und gehen mit einer kürzeren Lebenserwartung einher (Talbot 2002;
Logroscino et al. 2008). Trotz anfänglich lokalisierter Primärsymptomatik breitet sich die Klinik der ALS im Krankheitsverlauf weiter aus. Die meisten Patienten entwickeln Schluckstörungen mit konsekutiven Ernährungsstörungen, Gewichtsverlust und allgemeiner Schwäche. Die hinzukommende Insuffizienz der Atemmuskulatur führt unweigerlich initial zu einer Belastungsdyspnoe und später zur Ruhedyspnoe. Die letztendlich progrediente Hypoventilation mit reflektorischer Hyperkapnie endet letal (Kiernan et al. 2011). Einige der Patienten versterben jedoch auch unerwartet plötzlich an Herzversagen, Lungenembolien oder anderen Begleiterkrankungen, noch bevor die Atemnot zum Tode führt (Talbot 2002).
Obwohl bei weit fortgeschrittener Erkrankung nahezu die komplette Willkürmotorik ausgefallen ist, gibt es interessanterweise muskuläre Regionen, welche bis zum Schluss von der Erkrankung verschont werden. Hierzu gehören beispielsweise Motoneuron- ansammlungen, die die Augenbewegung und die Sphinkteren der Ausscheidungsorgane steuern (Kanning et al. 2010). Neben dem fortschreitenden Verlust der motorischen Fähigkeiten werden bei ALS Patienten auch kognitive Einschränkungen beschrieben und nachgewiesen (Strong 2008). Schätzungen über die Häufigkeit von dementiellen Er- krankungen bei ALS-Patienten reichen von 3 bis 52 % (Strong 2008). Hierbei handelt es sich
Einleitung
3
häufig um die Form der frontotemporalen Demenz (FTD), bei der es durch degenerative Atrophien des frontalen und temporalen Hirnlappens zu Persönlichkeitsveränderungen mit einem gestörtem Sozialverhalten, interpersonellen Verhaltensauffälligkeiten und Affekt- verflachung kommt. Zudem können Störungen der Sprache und des Sprachverständnisses in Erscheinung treten (Strong et al. 2009). Das Auftreten einer FTD stellt ebenfalls einen negativen prognostischen Faktor dar (Chiò et al. 2009). Die ALS ist in ihrer Prognose stets infaust, wobei die Überlebenszeit variieren kann. Rund die Hälfte der Patienten versterben 30 Monate nach Symptombeginn und gerade einmal 15 - 20 % sind nach 5 Jahren noch am Leben. Lediglich ein kleiner Prozentsatz überlebt 10 Jahre nach dem Auftreten der ersten Symptome (Talbot 2002).
1.1.3 Epidemiologie
Die Inzidenz der ALS wird auf 2-3/100.000 pro Jahr geschätzt und ist weltweit gleich verteilt (Yoshida et al. 1986; Logroscino et al. 2010). Die Inzidenz ist für Männer (3,0/100.000) etwas höher als für Frauen (2,4/100.000) (Logroscino et al. 2010), obwohl hierbei zu erwähnen ist, dass keine geschlechterspezifischen Unterschiede bezüglich der Inzidenzen hereditärer Formen existieren (Kiernan et al. 2011). Das mediane Erkrankungsalter liegt für Männer bei 65,2 Jahren und für Frauen bei 67,0 Jahren, damit gilt die ALS als eine Erkrankung des höheren Lebensalters (Logroscino et al. 2010).
Eine epidemiologische Ausnahme bildete die südpazifische Insel Guam, auf der eine Endemie von ALS und des Parkinson-Demenz-Komplexes 1945 erstmals beschrieben wurde. 1954 wurde von dem Epidemiologen Kurland und dem Neurologen Mulder eine 100-fach höhere Inzidenz für ALS Erkrankungen bei den Ureinwohnern (Chamorros) im Vergleich zur restlichen Welt festgestellt. Zudem war hier eine sehr hohe Prävalenz familiärer Häufungen der ALS aufgefallen. Der Grund für diese Häufung ist bis heute nicht geklärt. Bei gleich- bleibend hohen Inzidenzen für den Parkinson-Demenz-Komplex sind mittlerweile die Inzidenzen für ALS auf der Insel Guam interessanterweise wieder auf ein mit der Weltbevölkerung vergleichbares Niveau gesunken (Lee 2011).
4 1.1.4 Diagnostik
Bis dato existieren keine etablierten ALS-spezifischen Tests oder Biomarker anhand derer eine definitive Diagnose gestellt werden könnte. Aus diesem Grund gilt die Erkrankung als eine klinische Ausschlussdiagnose. Die Kombination aus klinischer Untersuchung, Krankheits- verlauf und dem Ausschluss anderer Erkrankungen mit Hilfe von apparativer und laborchemischer Diagnostik führen schließlich zur Diagnosestellung (Hardiman et al. 2011).
Dabei ist es maßgeblich, dass die Kombination aus den degenerativen Veränderungen des zweiten Motoneurons mit Hilfe klinischer, elektrophysiologischer und/oder neuro- pathologischer Untersuchungen und des ersten Motoneurons durch klinische und elektrophysiologische Befunde nachzuweisen ist. Mit Hilfe von Zusatzdiagnostik wie Magnetresonanztomographie, Laboruntersuchungen und/oder Elektrophysiologie müssen Differenzialdiagnosen, wie motorische Neuropathien, mechanische Nerven-/Myelon- kompression, entzündliche Ursachen oder primäre Muskelerkrankungen ausgeschlossen werden (Körner et al. 2011a). Diese Kriterien wurden bereits 1994 ausführlich in den El- Escorial-Diagnosekriterien für wissenschaftliche und klinische Versuchsstudien formuliert und 1998 als Airlie-House-Kriterien revidiert (Brooks 1994; Brooks et al. 2000). Im Jahr 2008 konnten diese durch die Erhöhung der Wertigkeit der Elektrophysiologie zur Diagnose- stellung in den Awaji-Shima-Kriterien noch verbessert werden (Carvalho et al. 2008; Costa et al. 2012).
Bei den elektrophysiologischen Untersuchungen spielt die Elektromyographie als sehr sensitiver Indikator die wichtigste Rolle. Da das kompensatorische Aussprossen peripherer, überlebender Motoneuronaxone zu einer Verschleierung der Klinik führt, kann durch Visualisierung der Denervierung mittels Elektromyographie, noch vor Progression der Erkrankung, die Diagnose gesichert werden (Körner et al. 2011b). In der Elektroneurographie können sich Muskelsummenaktionspotentiale (MSAP) mit reduzierten Amplituden zeigen, wohingegen Leitungsblöcke eher für ein peripheres Engpasssyndrom (z. B. Sulcus Ulnaris Syndrom) oder eine multifokale motorische Neuropathie (MMN) sprechen würden. Da sich bei der ALS nahezu keine Sensibilitätsstörungen finden, stellt die Elektroneurographie differentialdiagnostisch auch eine feste Größe zum Ausschluss einer Polyneuropathie dar (Körner et al. 2011a).
Einleitung
5 1.1.5 Ätiologie
Die Ätiologie und Pathogenese der ALS ist trotz intensiver Forschungsbemühungen zu großen Teilen weiterhin ungeklärt. Lediglich circa 10 % der Fälle lassen sich auf genetische Mutationen mit familiärer Häufung zurückführen (van Damme und Robberecht 2013). Der Hauptanteil der ALS-Erkrankungsfälle zeigt jedoch keine familiäre Häufung und wird daher als sporadische Form (sALS) bezeichnet (Cleveland und Rothstein 2001; Lücking und Hufschmidt 2006). Ein Fünftel der familiären Formen (fALS) haben ihren Ursprung in einer autosomal-dominant vererbten Mutation des Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase-1-Gens (SOD1) auf dem Chromosom 21q22, welche zugleich als erste Genmutation der fALS bekannt wurde (fALS1) (Rosen 1993; Cleveland und Rothstein 2001). Die SOD1-Mutationen galten bis vor Kurzem als häufigste Form der fALS. Mit der Entdeckung der C9ORF72-Mutation 2011, die nun mit circa 40-50 % der fALS in Verbindung gebracht wird, rutscht die SOD1-Mutante auf den zweiten Rang der Häufigkeit der fALS (Robberecht und Philips 2013).
Interessanterweise wurde die C9ORF72-Mutante nicht ausschließlich in fALS, sondern auch in 25 % von FTD und schätzungsweise in 50-70 % der mit FDT assoziierten ALS gefunden (DeJesus-Hernandez et al. 2011; Renton et al. 2011; Robberecht und Philips 2013). Die zu Grunde liegende Pathogenese ist bislang nicht bekannt.
Neben den mit Abstand häufigsten SOD1- und C9ORF72-Mutationen existieren eine Reihe weiterer Mutationen, die sich bei bestimmten Fällen von fALS identifizieren lassen.
Insgesamt sind bisher über 20 Genloci bekannt (Robberecht und Philips 2013). Zu den vergleichsweise deutlich selteneren Varianten gehören unter anderem die Genmutationen der Proteinprodukte Alsin, Senataxin, vesicle associated membrane protein B (VAPB), Angiogenin, Optineurin, TAR DNA binding protein (TARDBP/TDP-43) und fused in sarcoma (FUS) (Ince et al. 2011). Ein typisches gemeinsames Charakteristikum der sALS und der fALS sind die in degenerierenden Motoneuronen vorhandenen neuronal cytoplasmatic inclusions (NCI), welche aus ubiquitinierten unlöslichen Proteinen bestehen (Leigh et al. 1991; Ince et al. 1998; Mackenzie et al. 2007). Die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen ist ein gemeinsames Charakteristikum von neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Morbus Parkinson, der Chorea Huntington oder dem Morbus Alzheimer und findet sich auch bei der ALS (Forman et al. 2004). Die krankheitsspezifischen pathologischen Proteine wie α- Synuclein bei Parkinson, Huntingtin bei Chorea Huntington und neurofibrillary tangles bei
6
der Alzheimer-Erkrankung wurden bereits identifiziert (Mackenzie et al. 2010). Bei der fALS1 lassen sich intrazelluläre SOD1-Aggregat-Einschlüsse in Motoneuronen und Gliazellen finden.
Im Gegensatz dazu blieb die Identifizierung von SOD1-Proteinaggregationen bei der sALS aus (Forman et al. 2004). Folglich schien naheliegend, dass insbesondere bei der sALS andere Proteine eine Rolle spielen könnten. Besondere Aufmerksamkeit gilt daher der kürzlichen Entdeckung der Mutationen in dem Protein TDP-43 in nahezu allen Fällen von SOD1- negativer fALS und dem Protein FUS in Fällen TDP-43-negativer und SOD1-negativer fALS (Neumann et al. 2006; Mackenzie et al. 2007; Kwiatkowski et al. 2009; Vance et al. 2009). Die Mutationen dieser Proteine werden für je 4 % der fALS-Fälle verantwortlich gemacht (Mackenzie et al. 2010). Von noch größerem Interesse ist jedoch, dass nicht nur in nahezu allen Fällen SOD1-negativer fALS, sondern auch in den bisher untersuchten Fällen von sALS, TDP-43 als pathologisches Protein in den NCI identifiziert wurde (Neumann et al. 2006;
Mackenzie et al. 2007; Mackenzie et al. 2010). Die physiologische Funktion von TDP-43 liegt in der Regulation von Transkriptions- und Splicingprozessen. Darüber hinaus werden diesem Protein Funktionen bei der Apoptose, der Zellteilung und der RNA-Interaktion zu- geschrieben. Welche Rolle die Pathologie der TDP-43-Genmutation spielt, ist bislang allerdings noch unklar und wird aktuell intensiv erforscht. Dennoch legt eine Hypothese nahe, dass es bei reduzierter physiologischer Funktion des TDP-43-Proteins (loss of function) zu morphologischen Zellkerndefekten, Zellzyklusstörungen, einem erhöhten Zelltod und gestörtem Neuritenwachstum kommen kann (Mackenzie et al. 2010). Auch die Rolle von FUS in der normalen Zellfunktion sowie in der pathologischen Form ist nicht bis ins Detail geklärt.
Es scheint aber in der Zellproliferation, DNA-Reparatur, Transkriptionsregulation und RNA- Interaktion eine wichtige Rolle zu spielen (Mackenzie et al. 2010).
Neuere Studien deckten weitere Mutationen in bisher unklaren Fällen von fALS auf.
Mutationen im Ubiquilin-2-Gen (UBQLN2) führen zu einer gestörten Regulation im Abbau von ubiquitinierten Proteinen und konnten für die X-chromosomal-dominante Form der fALS nachgewiesen werden. Interessanterweise finden sich in den für die ALS typischen Ubiquitin- positiven-Zelleinschlüssen hierbei nicht nur Ubiquilin-Protein-Aggregate, sondern auch Aggregate von bekannten Proteinen wie FUS und TDP-43, die auch in anderen Formen der ALS gefunden werden. SOD1-Aggregate wurden nicht nachgewiesen. Zudem zeigt eine weitere Analyse, dass sich in den Ubiquitin-positiven-Einschlüssen in Rückenmarksproben
Einleitung
7
aus sALS-Patienten auch Ubiquilin-2-Aggregate finden (Deng et al. 2011). In einer weiteren, erst kürzlich erschienenen Veröffentlichung wurden Mutationen im Profilin-1-Gen als eine weitere Ursache für 1 bis 2 % der fALS-Fälle gefunden (Wu et al. 2012). Das Profilin-1-Protein ist ein bekannter Regulator des Aktin-Myosin-Zytoskelettes und dessen Isoform Profilin-2 spielt eine wesentliche Rolle in der Pathologie der ALS-verwandten Erkrankung SMA (Suetsugu 1998; Bowerman et al. 2007). Im Gegensatz zur Ubiquilin-Mutation konnte jedoch das Profilin-Protein in den Ubiquitin-positiven-Einschlüssen in humanen sALS-Rückenmark- Proben nicht nachgewiesen werden (Wu et al. 2012).
1.1.6 Pathogenese
Das klinische Erscheinungsbild der familiären und der sporadischen Form unterscheidet sich nicht wesentlich voneinander, daher dient die Erforschung der familiären Form auch mit Hilfe von Tiermodellen bis heute als eine wichtige Grundlage, um tiefere Einblicke in die Pathologie der ALS zu erhalten (Bruijn et al. 2004). In einer erst kürzlich erschienen Veröffentlichung konnte gezeigt werden, dass sich der humane, klinische Phänotyp der fALS1 und die sALS stark ähneln (Synofzik et al. 2010). Diese spezielle Genmutation war 1994 die Grundlage für die Etablierung des SOD1-G93A-Mausmodelles, welches an Position 93 der Aminosäuresequenz einen Austausch der Aminosäure Glycin gegen Alanin aufweist (Gurney et al. 1994). Ähnlich dem humanen Krankheitsbild entwickeln die Tiere muskuläre Lähmungserscheinungen infolge eines Untergangs der Motoneurone und versterben nach einem schnell progressiven Krankheitsverlauf innerhalb von 4-5 Monaten (siehe Kapitel 1.2) (Turner and Talbot 2008). Durch die Modellierung der humanen ALS stellt das SOD1-G93A- Mausmodell eine Möglichkeit zur Analyse der ALS Pathomechanismen dar.
Die SOD1 ist ein ubiquitär exprimiertes Enzym, das die Umwandlung von toxischen Superoxiden, die bei der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung entstehen können, in Wasser oder Wasserstoffperoxid katalysiert (Bruijn et al. 2004). Anfänglich wurde vermutet, dass ein Funktionsverlust (loss of function) der Superoxiddismutase zu einer erhöhten Belastung durch Superoxide führt und die Krankheit auslösen kann. Dies konnte jedoch widerlegt werden, da in SOD1-G93A-transgenen Mäusen vielmehr eine normale bis erhöhte Enzymaktivität nachgewiesen werden konnte und auch der genetische knock-out oder die Überexpression von Wildtyp-SOD1 den Krankheitsverlauf nicht verändern konnten (Boillée
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et al. 2006; Rothstein 2009). Eine weitere Hypothese macht vielmehr die transgenen SOD1- Proteinaggregate für den Untergang der Motoneurone verantwortlich und man spricht daher häufig von einem gain of toxic function der SOD1-Mutante (Boillée et al. 2006;
Pasinelli und Brown 2006; Bendotti et al. 2012). Ein Hinweis hierfür ist durch die im Krankheitsverlauf zunehmenden Aggregateinschlüsse bei familiären sowie sporadischen Formen gegeben. Ob die Aggregate der Auslöser sind oder nur eine nützliche Absonderung von toxischen Proteinprodukten zum Schutz der Zelle, ist jedoch bisher nicht eindeutig geklärt (Cleveland und Rothstein 2001; Bruijn et al. 2004; Rothstein 2009). Die vorherrschende Meinung ist, dass es einerseits in Folge der gain of toxic function der SOD1- Mutante direkt zu einem Funktionsverlust von anderen Proteinen durch Ko-Aggregation kommt. Zum anderen glaubt man, dass die zu bewältigende Masse anfallender Protein- komplexe zur Überlastung der zellulären Proteindegradationssysteme, der Chaperone und des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) führt. Die konsekutive Anhäufung fehlgefalteter, funktionsgestörter Proteine führt wiederum zur Störung spezifischer Organell-Funktionen, beispielsweise der Mitochondrien, des Golgi-Apparates, des endoplasmatischen Retikulums und der Peroxisomen sowie zu einem gestörten axonalen Transport (Boillée et al. 2006;
Pasinelli und Brown 2006; Bendotti et al. 2012).
Des Weiteren wird eine oxidativ-toxische Wirkung durch SOD1-Mutanten und die Glutamat- Exzitotoxizität diskutiert. Letztere diente zur Etablierung eines bis heute gültigen pharma- kologisch-therapeutischen Angriffspunktes (siehe Kapitel 1.1.7). Dieser Therapieansatz basierte auf dem Nachweis des Verlustes an Glutamat-Transporter-1 beziehungsweise dem excitatory-amino-acid-transporter-2 (EAAT-2) auf der Oberfläche von Astrozyten bei ALS- Patienten (Rothstein et al. 1995). Diese Rezeptoren verhindern durch Absorption von Glutamat normalerweise eine überschießende Glutamateinwirkung mit konsekutivem Kalziumeinstrom in die Neurone (siehe Abbildung 1). Die Pathomechanismen dieser seit 1989 beschrieben Exzitotoxizität sind bis heute nicht vollständig geklärt, jedoch weiß man, dass die Störung der Kalzium-Homöostase eine Schlüsselstellung einnimmt und die Motoneurone aufgrund der geringeren Kalziumpufferkapazität ein besonders vulnerables Ziel darstellen (Heath und Shaw 2002; Lewinski und Keller 2005).
Ein weiterer wichtiger Punkt in der Pathogenese der ALS ist der Einfluss von Gliazellen. Eine wichtige Zellpopulation stellt die Mikroglia, die ortspezifischen Makrophagen des zentralen
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Nervensystems (ZNS), dar. Deren Hauptaufgabe ist die Initiierung einer ersten Abwehr- reaktion bei Infektionen oder Schädigungen im ZNS. Eine weitere, den Gliazellen zugehörige Zellreihe bilden die Astrozyten, welche komplexe Aufgaben, wie zum Beispiel die Regulation von extrazellulären Neurotransmitterkonzentrationen, Aufrechterhaltung der metabolischen und ionischen Homöostase und die Bereitstellung von Wachstumsfaktoren für die benachbarten Neurone übernehmen (Philips und Robberecht 2011). Die Rolle der Gliazellen ist in der Pathogenese der ALS bisher nur unzureichend verstanden. Anhand von Tier- modellen konnte man nachweisen, dass die Anzahl von Astrozyten und aktivierter Mikroglia mit Progression der Erkrankung stetig zunehmen (Hall et al. 1998). Experimente, in denen die mutierte SOD1 selektiv in Motoneuronen, Astrozyten oder Mikroglia exprimiert wurde, konnten überraschenderweise keine oder lediglich eine milde Degeneration der Moto- neurone induzieren (Gong et al. 2000; Pramatarova et al. 2001; Beers et al. 2006). Clement et al. (2003) konnten darüber hinaus anhand von chimären Mäusen zeigen, dass die Anwesenheit nicht-neuronaler Zellen vom Wildtyp in einem SOD1-transgenen Mausmodell zu einer deutlichen Verlangsamung der Degeneration der Motoneurone und zu einer Verlängerung des Überlebens führen können (Clement et al. 2003). Hieraus kann abgeleitet werden, dass die die Motoneurone umgebende Glia und andere Zellen eine wichtige Stellung bei der Degeneration der Motoneurone einnehmen (Philips und Robberecht 2011).
Diese Pathomechanismen könnten eine Ursache für die typischen pathomorphologischen Veränderungen der ALS sein, die unter dem Begriff dying back beschrieben werden.
Hierunter wird verstanden, dass die Erkrankung nicht an den Somata der Motoneurone, sondern vielmehr an deren distalen Enden, den motorischen Endplatten und Axonen, beginnt (Fischer und Glass 2007; Dadon-Nachum et al. 2011). Grund dafür könnte vor allem die oben genannte Störung des axonalen Transportes durch sich bildende Proteinkomplex- ablagerungen darstellen. In der wohl asymmetrischsten Zelle des menschlichen Körpers scheint das teilweise bis über einen Meter lange Axon die vulnerabelste Stelle des Motoneurons zu sein (Dadon-Nachum et al. 2011). Tatsächlich werden im SOD1-G93A- Mausmodell Denervierung der motorischen Endplatten und Degeneration der distalen Axone beobachtet, lange bevor klinische Symptome auftreten oder Motoneurone untergegangen sind (Kong und Xu 1998; Frey et al. 2000; Fischer et al. 2004; Pun et al. 2006).
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In Abbildung 1 werden vereinfachend die eben genannten Pathomechanismen der ALS zusammenfassend graphisch dargestellt.
Abbildung 1 Pathomechanismen der ALS
Das Schaubild stellt vereinfachend einige der wichtigsten bisher bekannten pathophysiologischen Wege und gestörten Funktionen des Motoneurons sowie den Einfluss der mutierten Superoxiddismutase (SOD1) dar. Die SOD1-Mutante führt unter anderem zur Störung der Proteindegradationssysteme. Folglich kommt es zur Anhäufung der SOD1-Mutante selbst und anderer fehlgefalteter Proteine. Konsekutiv bilden sich durch deren Akkumulation Proteinaggregate. Die SOD1- Mutante selbst und die Proteinaggregate wiederrum stören die Funktionen der Zellorganelle, v.a. der Mitochondrien, des Golgi-Apparates und des Endoplasmatischen Retikulums sowie den axonalen Transport. Des Weiteren sind extrazelluläre Mechanismen wie die Aktivierung und Dysfunktion von Astrozyten und Mikroglia in die Pathogenese integriert. Die Wiederaufnahme von Glutamat aus dem synaptischen Spalt ist durch die Verminderung von EAAT2-Rezeptoren an der Oberfläche von Astrozyten gestört, sodass die extrazelluläre Konzentration an Glutamat steigt und eine Exzitotoxizität auf das Motoneuron ausübt. Aufgrund der vulnerablen Kalziumpufferkapazität erhöht sich damit die intrazelluläre freie Kalziumkonzentration. In fortgeschrittenen Krankheitsstadien setzt aktivierte Mikroglia proinflammatorische Zytokine frei, welche sich auf das Motoneuron toxisch auswirken können. Die Störung des axonalen Transports und der Zellorganelle führen zunächst distal zur Denervierung der motorischen Endplatten und zur Degeneration der terminalen Axone mit konsekutiver Atrophie der Muskulatur. Die von distal nach proximal fortschreitenden pathomorphologischen Veränderungen werden unter dem Begriff dying back zusammengefasst. Erst am Schluss kommt es zum Untergang der Motoneurone. Riluzol, die bisher einzige zugelassene pharmakologische Therapie, reduziert die Glutamatfreisetzung aus präsynaptischen Neuronen und erhöht die Wiederaufnahme von Glutamat aus dem synaptischen Spalt und verringert somit die Exzitotoxizität auf das Motoneuron. Abbildung modifiziert nach Robberecht und Phillips, 2013, Seite 251, mit freundlicher Genehmigung von Nature Publishing Group.
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11 1.1.7 Aktuelle pharmakologische Therapie
Trotz umfangreicher Forschungsbemühungen sind die Therapieoptionen der ALS weiterhin enttäuschend. Neben einer Reihe symptomatischer Therapiemöglichkeiten vermag pharma- kologisch allein Riluzol in einer Dosis von 100 mg pro Tag das Überleben um gerade einmal 2 bis 3 Monate zu verlängern und wird daher auch in den deutschen Leitlinien für die Behandlung der ALS empfohlen (Miller et al. 2007; Andersen et al. 2007; Ludolph 2012).
Riluzol, 2-amino-6-trifluoromethoxybenzothiazole, reduziert die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt durch Reduktion der präsynaptischen Freisetzung und Aktivierung der Aufnahme in Astrozyten und präsynaptische Nervenendigungen (siehe Abbildung 1) (Cifra et al. 2013). Eine der letzten kürzlich veröffentlichten klinischen Studien fand mit dem Dopamin-Agonisten Dexpramipexol statt, welcher sich bereits in Tiermodellen als neuro- protektiv und daher erfolgsversprechend erwiesen hatte (Danzeisen et al. 2006; Corcia und Gordon 2012). Leider konnte auch dieses Medikament nach einer klinischen Phase-III-Studie, bei der man das Überleben, die Lungenfunktion, den Einfluss auf den ALS-Funktions-Score und die Kraftentwicklung untersucht hatte, keine statistisch signifikanten Vorteile für die Patienten erbringen (Cudkowicz et al. 2013). Daher besteht weiterhin eine dringende Notwendigkeit zur Entwicklung einer wirksamen Therapie für die Behandlung der ALS.
1.2 Das High-copy-B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J-Mausmodell 1.2.1 Genetischer Hintergrund
Transgene Mausmodelle wie das SOD1-G93A-Mausmodell entstehen durch die Micro- injektion von transgener DNS in befruchtete Mauseizellen, welche anschließend in ein scheintragendes Weibchen implantiert werden. Die daraus entstehenden Nachkommen enthalten das transgene Zielgen in ihrem Genom und werden zur Erhaltung eines Mausstammes mit einer anderen Mauslinie verpaart. Das als Goldstandard empfohlene und am häufigsten verwendete Mausmodell in der präklinischen Therapie- und Grundlagen- forschung der Amyotrophen Lateralsklerose ist aktuell das SOD1-G93A-Mausmodell (Turner und Talbot 2008; Ludolph et al. 2010). Das ursprünglich von Gurney et al. entwickelte Tiermodell trägt humane Genkopien der Superoxiddismutase mit einer Mutation von Glycin zu Alanin in Codon 93. Das Modell mit 18 Genkopien pro diploidem Genom (Linie G1)
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entwickelte dabei die der humanen ALS ähnliche Symptomatik (Gurney et al. 1994). Das durch die Firma Jackson Labs vertriebene Mausmodell B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur, welches in dieser Arbeit Anwendung fand, basiert auf der G1-Linie von Gurney, wobei aber die Menge der transgenen Genkopien nochmals um 40 % auf 25 Kopien pro diploidem Genom (G1H bzw. 1Gur-Linie) erhöht wurde (Chiu et al. 1995; Tu et al. 1996). Auch der Mausstammhintergrund B6SJL von Jackson Laboratories unterscheidet sich hierbei von der ursprünglich benutzten Mauslinie C57BL/6J, welcher durch die Verpaarung von C57BL/6J transgenen Hemizygoten mit Tieren eines SJL/J Hintergrundes entstanden ist.
1.2.2 Klinisch-funktionelles und pathomorphologisches Erscheinungsbild
Klinisch lassen sich SOD1-G93A-transgene Tiere lange Zeit nicht von Wildtyp-Tieren unterscheiden. Insbesondere die Gewichtszunahme entwickelt sich bei beiden Gruppen zunächst unauffällig, erst etwa ab dem Lebenstag 108 stagniert diese und es sind signifikante Unterschiede zu Wildtyp-Tieren messbar (Smittkamp et al. 2008). Erst mit circa 91 Tagen zeigen sich die ersten klinischen Symptome in Form eines Tremors einer oder beider Hinterläufe. Im Verlauf nimmt dieser an Intensität zu und breitet sich auf alle Extremitäten aus. Durch passives Bewegen der betroffenen Extremität kann man einen erhöhten Widerstand, als Ausdruck einer Spastizität, wahrnehmen. Zudem sind bei leichtem Beklopfen der Knie oder Fußknöchel repetitive Reflexbewegungen als Zeichen einer Hyperreflexie oder ein Klonus auslösbar (Chiu et al. 1995). Nach Auftreten der ersten Symptome schreitet die Erkrankung kontinuierlich voran. Leistungsschwäche und Bewegungsstörungen können mit Hilfe von motorischen Verhaltenstests, wie zum Beispiel dem Drehwalzentest (rotarod) oder dem Gitterhängetest (hanging wire) nachgewiesen werden (Fischer et al. 2004; Smittkamp et al. 2008; Alves et al. 2011). Elektrophysiologische Untersuchungen am Nervus ischiadicus zeigen mit zunehmendem Alter eine Reduktion der MSAP und der motorischen Nervenleitgeschwindigkeiten (mNLG) (Alves et al. 2011). Die Muskelatrophie betrifft zunächst vor allem die Hinterläufe und führt zu einer Umfangsverschmälerung im proximalen Bereich der unteren Extremitäten. Das normale Gangbild verwandelt sich in eine Art ‚Watschelgang‘. Mit zunehmender Muskelparese können die Tiere ihr Becken nicht mehr vom Untergrund abheben und ziehen sich mit den Vorderläufen vorwärts. Schlussendlich werden sie immer schwächer und sind nicht mehr in der Lage das Futter zu erreichen oder
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sich selbstständig aus der Rücken-/Seitenlage in die Bauchlage zu drehen. In diesem Endstadium erleiden einige der Tiere Augeninfektionen in einem oder beiden Augen aufgrund reduzierter Fellpflege im Kopfbereich, vermutlich aufgrund sich manifestierender Schwäche in den Vorderläufen (Chiu et al. 1995). Unter Berücksichtigung von Tier- versuchsabbruchkriterien erreichen die Tiere je nach Studie eine Lebenserwartung von durchschnittlich 130 bis 140 Tagen, mit einer Schwankungsbreite von 102 bis 166 Tagen (Chiu et al. 1995; Heiman-Patterson et al. 2005). Dabei treten Geschlechterunterschiede mit einer durchschnittlich höheren Lebenserwartung bei den Weibchen auf (Heiman-Patterson et al. 2005; Alves et al. 2011). Histomorphologisch lassen sich erste Veränderungen an den motorischen Endplatten der Wadenmuskulatur bereits an Tag 47 beschreiben, lange bevor klinische Symptome auftreten oder Motoneurone untergegangen sind. Ab Tag 80 wird ein Verlust großkalibriger Axone an den ventralen Nervenwurzeln sichtbar und erst ab 100 Tagen sinkt die Anzahl der großen Motoneurone im Vorderhorn signifikant (Fischer et al.
2004; Turner und Talbot 2008). Parallel zum Untergang der motorischen Bahnen nimmt die Anzahl von aktivierten Astrozyten und Mikroglia ab 100 Tagen deutlich zu (Hall et al. 1998).
In Abbildung 2 werden die klinisch-pathologischen Veränderungen auf einem Zeitstrahl zusammengefasst (Turner and Talbot 2008).
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Abbildung 2 Zeitlicher Verlauf der klinischen und neuropathologischen Veränderungen im high-copy-SOD1G93A- Mausmodell
Klinisch entwickeln die Tiere nach circa 3 Monaten einen Tremor der Hinterläufe, gefolgt von Schwäche und Gangstörungen. Auf zellulärer Ebene geht der ersten klinischen Symptomatik eine progrediente Degeneration der motorischen Endplatten und der distalen Axone voraus. Nach circa einem weiteren Monat progredienter Erkrankung führt dies zu Muskelparesen bis hin zur vollständigen Lähmung der hinteren Extremitäten. Auf zellulärer Ebene geht dies mit dem zunehmenden Untergang der Motoneuronzellkörper und einem reaktiven Anstieg der Astrozyten sowie der Microglia, einher. Auf molekularer Ebene führt die Akkumulation von mutanter SOD1 zu insoluble-protein-complexes (IPC, unlösliche Proteinkomplexe), die zum Teil an inclusions (Einschlusskörperchen) erkennbar sind, zur Störung von Zellorganellen wie dem Golgi-Apparat, den Mitochondrien, UPS, ER und letztendlich zur Induktion von Apoptosemechanismen. Abbildung entnommen aus Turner und Talbot, 2008, Seite 99, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.
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1.3 ROCK-Inhibition – eine neue Therapiestrategie 1.3.1 Rho-Rock-Signalkaskade
G-Proteine sind Signaltransduktoren, die durch Wechsel von einer Guanosindiphosphat (GDP)-gebundenen inaktiven in eine Guanosintriphosphat (GTP)-gebundene aktive Form, eine hormonkodierte Informationsübertragung über die Zellmembran hinweg ermöglichen (Mueller et al. 2005; Rassow et al. 2006). Rho-GTPasen stellen hierbei eine eigenständige Subfamilie der Superfamilie der Ras-zugehörigen kleinen GTPasen (monomere G-Proteine) dar und kommen in allen eukaryoten Zellen vor (Jaffe und Hall 2005). Bekannt geworden sind die Ras-GTPasen durch ihr onkogenes Potential schon vor über 20 Jahren (Sahai und Marshall 2002). Die Aktivierung von Rho-GTPasen wird durch eine Vielzahl an Zell- oberflächenrezeptoren wie Zytokinerezeptoren, Tyrosinkinasen, Adhäsionsrezeptoren und G-protein-coupled receptors (GPCRs) stimuliert. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) katalysieren den Austausch von GDP zu GTP und erhöhen damit die Rho-Aktivität. GTPase activating proteins (GAPs) stimulieren die intrinsische GTPase-Aktivität und Guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) unterdrücken den Austausch in die GTP-gebundene aktive Form und führen somit zu einer verminderten Rho-Aktivität (siehe Abbildung 3). Ist die Rho-GTPase aktiviert, beeinflusst diese über weitere Zielproteine eine Reihe an wichtigen Zellprozessen, wie die Aktin-Zytoskelett-Dynamik, Gentranskriptionsregulation, den Zell- zyklus und ist damit in die Zellteilung, Adhäsion, Migration, Phagozytose, Neuritenwachstum, Zellmorphologie sowie Zellwachstum und Überleben eingebunden (Kjoller und Hall 1999;
Rossman et al. 2005; Schmandke et al. 2007).
Rho-Kinasen (ROCK) sind AGC-Proteinkinasen mit einem Molekulargewicht von 160 kDa, welche vor über 15 Jahren als direkte Effektoren der Rho-GTPasen erstmals beschrieben wurden (Matsui et al. 1996). AGC-Kinasen sind eine Subgruppe der Serin-Threonin- Proteinkinasen und regulieren ihre spezifischen Proteinsubstrate durch Bindung einer Phosphatgruppe an Serin- oder Threoninaminosäurereste. Einen bekannten Vertreter der AGC-Gruppe stellt die Proteinkinase A dar, welche eine Schlüsselstellung im Glykogen- stoffwechsel einnimmt (Pearce et al. 2010). Es werden zwei Isoformen der Rho-Kinasen (ROCK I/II) unterschieden, die anhand ihrer unterschiedlichen gewebespezifischen Verteilung differenzierte Funktionen in vivo vermuten lassen (Nakagawa et al. 1996). Während ROCK II vor allem im Hirngewebe und Rückenmark vorkommt, wird ROCK I zumeist in nicht
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neuronalem Gewebe wie Herz, Lunge und Skelettmuskulatur exprimiert (Mueller et al. 2005;
Duffy et al. 2009). Bei Rindern wurden die höchsten Konzentrationen von ROCK II in Pyramidenzellen der Großhirnrinde und Hippocampus, sowie in den Purkinjezellen des Cerebellums gefunden. Zudem konnte man eine deutlich höhere Konzentration in der grauen im Vergleich zur weißen Substanz nachweisen (Hashimoto et al. 1999). Strukturell haben beide Kinasen eine katalytische Domäne am N-Terminus, gefolgt von einer coiled-coil- region und am C-Terminus des Proteins eine regulatorische Pleckstrin-homologe-Domäne (PH-Domäne) mit cysteinreichen repeats. Die coiled-coil-region dient der Interaktion mit anderen Proteinen und beinhaltet die Rho-binding-domain (RBD). Im inaktiven Zustand bindet die RBD und die PH-Domäne an die Kinase-Region des Proteins und bildet somit einen autoinhibitorischen loop. Erst durch Bindung der aktiven Rho-GTPase an die RBD wird die Schleife geöffnet und das Kinase-aktive Zentrum freigelegt. Andere Rho-unabhängige Aktivatoren stellen die Fettsäure Arachidonsäure oder die Apoptose-induzierende Caspase-3 dar (Riento und Ridley 2003). Inhibitoren der Rho-Kinasen sind Rad und Gem, die als Rad- Gem-Kir-Familie eine eigenständige Gruppe kleiner GTPasen darstellen (Ward 2002).
1.3.2 ROCK-Inhibitoren
Fasudil (HA1077) (1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine) und Y-27632 ((1)-(R)-trans-4- (1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamidedihydrochloride) gehören zu den am häufigsten genutzten und untersuchten ROCK-Inhibitoren. Beide Substanzen inhibieren beide Isoformen (ROCK I und ROCK II), jedoch zusätzlich mit deutlich weniger Spezifität auch andere Kinasen wie z. B. Proteinkinase A und Lim-Kinase (Lingor et al. 2007). Y-27632 stellt im Gegensatz zu Fasudil einen selektiveren Inhibitor von ROCK II dar (Uehata et al. 1997).
Fasudil, ein Isoquinolin-basierender Ligand, und Y-27632, eine Pyridinverbindung, unter- scheiden sich in ihrer Struktur deutlich, jedoch erzielen sie ihre inhibitorische Wirkung gleichermaßen über eine kompetitive Hemmung der ATP-Bindungsstelle von ROCK (Ishizaki et al. 2000; Jacobs et al. 2006). Die Bioverfügbarkeit und die Überwindung der Blut- Hirnschranke von Fasudil und Y-27632 nach oraler Applikation wurde in verschiedenen Tierstudien bereits mehrfach nachgewiesen (Hattori et al. 2004; Li et al. 2009; Bowerman et al. 2010; Bowerman et al. 2012; Tönges et al. 2014). Anfänglich wurde Fasudil aufgrund seines ausgeprägten vasodilatatorischen Effektes durch die Aufhebung der über die myosin
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light chain (MLC) gesteuerten Kontraktion der glatten Muskelzellen und der Kalzium- antagonisierenden Wirkung zur Verhinderung von cerebralen Ischämien durch Vasospasmen nach Subarachnoidalblutungen untersucht und ist bereits in Japan hierfür klinisch zugelassen (Zhao et al. 2006). Die bisher durchgeführten klinischen Studien stufen Fasudil für diese Indikation als ein sicheres Medikament ohne erwähnenswerte Nebenwirkungen ein (Zhao et al. 2011).
1.3.3 Neurophysiologische Rolle von ROCK und Hypothesen zur Neuroprotektion durch ROCK-Inhibitoren mit Bezug zur ALS
1.3.3.1 Axonale Plastizität und neurozelluläres Überleben
Eine Vielzahl an Effektorproteinen, die durch ROCK phosphoryliert und damit moduliert werden, sind in zahlreichen Publikationen bereits beschrieben. Viele dieser Effektoren regulieren die Zellmorphologie und Zellmotilität, andere sind in Zellzyklus oder Über- lebenskaskaden eingebunden (Tönges et al. 2011). Eine der Hauptaufgaben von ROCK ist die Regulation der Aktin-Zytoskelett-Organisation, wodurch eine Reihe wichtiger Funktionen in glatten Gefäßmuskeln, Endothelzellen, hämatologisch-immunologischen Zellen, Neuronen und Gliazellen gesteuert werden (Shin et al. 2008). Einer der hierbei umfangreich studierten Signalwege führt über die Phosphorylierung der myosin light chain phosphatase (MLCP) durch ROCK II (Kimura et al. 1996). Die daraus folgende Reduktion der MLCP-Aktivität verhindert die Inaktivierung der aktiven Phosphat-gebundenen MLC. Parallel dazu ist ROCK II, ähnlich wie die myosin light chain kinase (MLCK), in der Lage die MLC zur aktiven Form zu phosphorylieren. Die aktive MLC interagiert mit Aktinfilamenten und führt zur Myosin-Aktin- Kontraktion (Amano et al. 1996). Ein anderer wichtiger Weg über den ROCK Einfluss auf das Zytoskelett nimmt, ist die Aktivierung der LIM-Kinase (LIMK). LIMK seinerseits phosphoryliert und inhibiert Cofilin (Maekawa 1999). Cofilin wiederum spielt eine entscheidende Rolle in der Abspaltung von Aktinfilamenten sowie der Depolymerisierung von Aktin und ist somit essentiell für das axonale Wachstum (Ng und Luo 2004). Adducin und ERM-Proteine (Ezrin, Radixin, Moesin), die das Aktinzytoskelett maßgeblich beeinflussen und damit an der Regulation von Zellmotilität und axonalem Wachstum beteiligt sind, stellen weitere Substrate von ROCK dar (Kimura 1998; Matsui et al. 1998). Mikrotubulin-assoziierte-Proteine
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wie Tau oder MAP2 verringern ihre Mikrotubuli-Polymerisationsfunktion nach Phos- phorylierung durch ROCK. Collapsin response mediator protein-2 (CRMP2), ein durch ROCK aktiviertes spezifisch neuronales Protein, induziert einen Zusammenfall des axonalen Wachstumskegels und beschränkt somit die Regenerationsfähigkeit des Hirngewebes (Mueller et al. 2005; Schmandke et al. 2007). Darüber hinaus gibt es eine Reihe weiterer ROCK-Substrate, die an der Limitierung axonal-neuronalen Wachstums beteiligt sind. Bei der extrazellulären Initiierung der axonalen Wachstumsrestriktion ist das Myelin ein ent- scheidender Mediator. Myelingebundene Moleküle wie Nogo-A, myelin-associated glyco- protein (MAG), und oligodendrocyte myelin glycoprotein (OMgp) vermitteln eine Inhibition von axonalem Auswachstum auch über die Rho-ROCK-Signalkaskade (Mueller et al. 2005;
Schmandke et al. 2007; Tönges et al. 2011). Insbesondere für Nogo-A ist die Beteiligung am Zusammenbruch des neuronalen Wachstumskegels, dem growth cone collapse, und damit an der Unterbindung des Axonwachstums, nachgewiesen (Prinjha et al. 2000; Fournier et al.
2001; Pernet und Schwab 2012). Hypothetische Therapiekonzepte zur Stimulation axonaler Regeneration durch ROCK-Inhibitoren wurden bereits formuliert und werden intensiv erforscht (siehe Abbildung 3) (Kubo et al. 2008; Tan et al. 2011). Erhöhte Konzentrationen von Nogo-A konnten in der Skelettmuskulatur von ALS-Patienten und in einem SOD1- transgenen Mausmodell nachgewiesen werden (Dupuis et al. 2002). Zudem war eine signifikante Korrelation zwischen Höhe der Nogo-A-Konzentration und der Schwere der Erkrankung erkennbar (Jokic et al. 2005). Die Beteiligung der Nogo-A-vermittelten Unter- minierung der axonalen Regeneration konnte in einem kombinierten SOD1-transgenen Mausmodell mit Nogo-A-knock-out gezeigt werden. Hiernach zeigte sich ein signifikant längeres Überleben und eine Reduktion der Muskeldenervierung. Darüber hinaus konnte durch Überexpression von Nogo-A in Wildtyp-Tieren ein Schwund der Postsynapse und eine Retraktion der terminalen Axone in der Muskulatur beobachtet werden (Jokic et al. 2006).
Zudem demonstrieren Experimente in transfizierten neuronalen Zellkulturen mit humaner, mutierter (G93A) SOD1 im Vergleich zur Kontrolle mit humaner Wildtyp-SOD1 ein deutlich reduziertes Neuriten-Auswachstum und eine erhöhte Rate an Zelltod (Takeuchi et al. 2002).
In dem unter Kapitel 1.1.5 bereits erwähnten Artikel zur fALS durch Profilin-1-Mutation wird die zugrundeliegende Ursache zum Teil in einer durch Profilin-Mutation-bedingten axonalen Wachstumshemmung gesehen (Wu et al. 2012). Profilin-1 ist unter anderem für seine
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Funktion in der Aktin-Polymerisation und damit für seinen Einfluss auf das axonale Aus- wachstum bekannt (Suetsugu 1998; Wills et al. 1999). In primären Motoneuronzellkulturen, in denen das mutierte Profilin-1-Gen exprimiert wurde, konnte eine deutliche Hemmung des axonalen Wachstums nachgewiesen werden (Wu et al. 2012). ROCK I wiederum scheint direkt über Phosphorylierung von Profilin-1 dessen Funktion zu unterbinden (Shao et al.
2008b).
ROCK ist nicht nur in die axonale Plastizität, sondern auch in das neuronale Überleben eingebunden. Einer der entscheidenden Signalwege führt dabei über die direkte Aktivierung des bekannten Tumorsuppressors phosphatase and tensin homologue (PTEN) durch ROCK (Li et al. 2005; Meili et al. 2005). PTEN unterdrückt über eine Inaktivierung von Akt die Aktivität von mTOR (mammalian target of rapamycin), welches selbst einer der bekanntesten Stimulatoren von Proteinbiosynthese und Zellwachstum darstellt (Shi und Wei 2007; Park et al. 2010; Tönges et al. 2011). Darüber hinaus wird dieser durch ROCK stimulierten Kaskade nicht nur der Einfluss auf das neuronale Überleben zugeschrieben, sondern auch eine durch limitierte Proteinsynthese mit konsekutivem Fehlen notwendiger Proteine bedingte Hem- mung axonalen Wachstums (Park et al. 2008). Im Zusammenhang mit ALS fand eine andere Arbeitsgruppe heraus, dass bei Suppression von BTBD10, einem Akt-Aktivator, der Unter- gang von kultivierten Motoneuronen induziert werden kann. Interessanterweise fand man in Motoneuronen von sALS-Patienten und im SOD1-G93A-Mausmodell eine reduzierte Ex- pression von BTBD10 (Nawa et al. 2012). Möglicherweise könnte durch Stimulation von Akt über die ROCK-Inhibition auch in der Pathologie der ALS dem Sterben der Motoneurone entgegen gewirkt werden. Eine weitere, kürzlich erschienene Veröffentlichung untersuchte eine Reihe an Regulatorproteinen im Muskelgewebe von sALS-Patienten und fand heraus, dass eine hohe Konzentration von Akt mit einem längeren Überleben der Patienten positiv korreliert ist (Yin et al. 2012).
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Abbildung 3 Aktivierung des Rho-ROCK-Signalweges mit Folge einer Unterdrückung des axonalen Wachstums und des Zellüberlebens
In Folge einer Schädigung des ZNS werden Mediatoren wie z. B. Nogo A, MAG, Omgp etc. freigesetzt, was zu einer Aktivierung der Rho-GTPase führt und konsekutiv auch zur Aktivierung von ROCK. Die Aktivität der Rho-GTPase ist darüber hinaus durch Regulatoren wie GEFs, GDIs und GAPs reguliert. Die aktivierte ROCK wiederum führt einerseits über viele Signalwege zur Dysregulation des Aktin-Myosin-Zytoskeletts und dadurch zur Inhibition des axonalen Wachstums.
Andererseits führt diese zur Limitierung der Proteinbiosynthese und des Zellwachstums, was sich negativ auf das Zellüberleben auswirkt. ROCK-Inhibitoren, wie Fasudil und Y-27632, vermögen eine Unterdrückung der ROCK-Aktivität und können somit in diesen Signalweg eingreifen. Abbildung modifiziert nach Tan et al., 2011, Seite 655 mit freundlicher Genehmigung von International Journal of Ophthalmology.
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Aufgrund der genannten Funktionen für axonales Wachstum und neuronales Überleben sieht man in der Inhibition von ROCK ein vielversprechendes therapeutisches Ziel. Das Potential zur Stimulation von Neuritenwachstum und neuronalem Überleben durch ROCK- Inhibitoren konnte in vitro anhand von Zellkulturen und in vivo in einem Sehnerv- Schädigungs-Modell detailliert belegt werden (Lingor et al. 2007; Bermel et al. 2009).
Zahlreiche Studien belegten einen Aktivitätsanstieg des ROCK-Signalweges in Tiermodellen mit Rückenmarkverletzungen. Die hierbei gesetzten Läsionen führen zu einer konsekutiven motorischen Funktionseinschränkung der hinteren Extremität. Durch Inhibition der ROCK- Kaskade konnte eine signifikante Verbesserung der motorischen Fähigkeiten nachgewiesen werden (Hara et al. 2000; Dergham et al. 2002; Sung et al. 2003). Hara et al. konnten mit der Behandlung durch ROCK-Inhibitoren im Rückenmarkläsions-Tiermodell sogar eine bessere Funktionswiederherstellung im Vergleich zum derzeit aktuellen medikamentösen Standard mit Methylprednisolon erreichen (Hara et al. 2000). Eine erst kürzlich veröffentlichte Studie unserer Arbeitsgruppe untersuchte ROCK-Inhibition in einem in vitro 1-Methyl-4-Phenyl- pyridin-Zellkulturmodell und in einem subchronischen in vivo 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6- Tetrahydropyridin (MPTP)-Mausmodell der neurodegenerativen Parkinson‘schen Er- krankung. Die Behandlung mit Fasudil konnte in beiden Modellen den Untergang der dopaminergen Neurone und deren neuronaler Fortsätze abmildern. Zudem konnte in motorischen Verhaltenstestungen eine deutliche Verbesserung der motorischen Leistungs- fähigkeit nach Fasudilbehandlung gezeigt werden (Tönges et al. 2012).
SMA, eine der ALS verwandte Erkrankung, führt zum Motoneuronuntergang im Rückenmark aufgrund einer loss of function-Mutation im survival of motoneuron (SMN)-1-Gen mit dem Verlust an SMN-Protein. Das Fehlen von SMN führt über definierte Mechanismen zu einer gesteigerten Aktivierung der ROCK-Signalkaskade mit einer konsekutiven Hemmung axonalen Auswachstums. Durch Applikation von ROCK-Inhibitoren in Zellkulturversuchen, konnte dieser Dynamik entgegen gesteuert werden (Bowerman et al. 2007; Nolle et al.
2011). Funktionell konnte in vivo durch eine orale Behandlung mit Fasudil und Y-27632 in einem SMA-Mausmodell das Überleben der Tiere deutlich verlängert werden (Bowerman et al. 2010; Bowerman et al. 2012). Die Erfolge der Behandlung mit ROCK-Inhibitoren in einem Tiermodell der spinalen Muskelatrophie lassen grundsätzlich auch auf Erfolge in der Behandlung der ALS hoffen. Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Aktivierung der
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ROCK-Signalkaskade und dem Pathomechanismus der Erkrankung ließ sich jedoch bisher nur bei der SMA herstellen. Die regulierende Bindung des Profilin-Proteins durch das SMN- Protein verhindert eine überschießende freie Konzentration an Profilin IIa. Dieses wiederrum stellt einen bedeutenden Aktivator der Rho-ROCK-Signalkaskade dar. Der Verlust an SMN durch die Mutationen im Gen der SMA führt teilweise über diesen Pathomechanismus zu einem verminderten neuronalen Auswachstum und Differenzierung der Motoneurone (Bowerman et al. 2007).
1.3.3.2 Proteinaggregation
In der ALS ist die Proteinaggregation fehlgefalteter Proteine eine der markantesten histomorphologischen Erscheinungen. In SOD1-G93A-transfizierten Zelllinien konnte gezeigt werden, dass die SOD1-Mutante über die Protein-Degradationssysteme UPS und Makro- autophagie abgebaut wird und dass es durch Hemmung dieser Abbauwege zur Akkumulation der Proteine kommt (Kabuta et al. 2006). Im SOD1-G93A-Mausmodell konnte zudem gezeigt werden, dass die Aktivität von UPS im lumbalen Rückenmark deutlich reduziert ist. Interessanterweise sogar, bevor die ersten histopathologischen Veränderungen auftreten (Kabashi et al. 2004). ROCK kann die Aktivität der Protein-Degradations-Systeme wie zum Beispiel das UPS regulieren. Der genaue Signalweg ist bisher nicht verstanden, aber basierend auf Zellkultur-Versuchen weiß man, dass durch knock-out von ROCK-1 und ROCK- 2, die Aktivität des UPS deutlich gesteigert werden kann. Durch Applikation des ROCK- Inhibitors Y-27632 konnte gezeigt werden, dass in einem in vitro Huntington-Modell durch Aktivierung der Protein-Degradations-Systeme die erzeugten Huntingtin-Proteinaggregate reduziert werden können (Bauer et al. 2009). Weitere Studien wiesen der ROCK-Kaskade ein downstream-target mit antiaggregativen Eigenschaften, das Profilin-1, zu (Shao et al.
2008b). Profilin kommt hauptsächlich in zwei aktiven Isoformen vor. Profilin-1 ist in allen Zellen vorhanden und Profilin-2 kommt vor allem in neuronalen Zellen vor. Über einen bisher unbekannten Mechanismus scheint Profilin-1 antiaggregative Eigenschaften auf- zuweisen. Interessant ist, dass ROCK durch Phosphorylierung von Profilin-1 selbiges hemmt.
Eine Inhibition durch ROCK-Inhibitoren konnte in einem in vitro Huntington-Modell eine Aktivierung von Profilin-1 bewirken, was wiederum zur Reduktion von Huntingtin- Aggregaten geführt hat (Shao et al. 2008b). In einem Tiermodell der Proteinopathie Chorea
Einleitung
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Huntington konnte nach Behandlung mit Y-27632 eine Verbesserung der motorischen Leistung und eine Reduktion des mutierten Proteins Huntingtin nachgewiesen werden, ein Überlebensvorteil blieb jedoch aus (Li et al. 2009). Zudem konnte in einer weiteren Studie durch intravitreale Injektion von ROCK-Inhibitoren die Sehfähigkeit in einem Huntington- Mausmodell verbessert werden (Li et al. 2013).
Wie bereits in Kapitel 1.1.5 und Kapitel 1.3.3.1 erwähnt, konnten Mutationen im Profilin-1- Gen kürzlich als eine weitere Ursache bisher unklarer fALS entdeckt werden. In den hierbei untersuchten transfizierten Zellkulturen mit einer Profilin-1-Mutante ist im Vergleich zum Wildtyp-Profilin-1 eine deutliche Ausbildung von Aggregaten vor allem nach Inhibition des UPS zu sehen. Interessanterweise finden sich in den erzeugten Aggregaten auch TDP-43- Proteinaggregate. Hierdurch wird impliziert, dass nicht die Mutation allein, sondern auch eine Funktionseinschränkung des UPS die Aggregation von Proteinen begünstigt (Wu et al.
2012).
Allgemein scheinen die zellulären Proteinabbau-Mechanismen, wie UPS und Autophagie durch ROCK-Inhibition aktiviert zu werden (Pollitt et al. 2003; Shao et al. 2008a; Bauer et al.
2009). Bisher sind keine Veröffentlichungen zur Beeinflussung von Aggregation durch ROCK- Inhibition in der ALS bekannt, jedoch weisen die genannten wissenschaftlichen Unter- suchungen auf eine starke Beteiligung der UPS-Funktion und anderer Degradationssysteme in der Pathogenese der ALS hin. Wie die Chorea Huntington gehört auch die ALS zu den Proteinopathien. Hypothetisch könnte man daher auf Grundlage der genannten Therapie- erfolge im Huntington-Modell durch Stimulation der UPS-Funktion mit Hilfe von ROCK- Inhibitoren, ebenfalls auf eine erfolgreiche Beeinflussung der Aggregation in der ALS hoffen.
24 1.4 Zielsetzung der Arbeit
Unter Leitung von Prof. Dr. Paul Lingor und dem Projektleiter PD Dr. Lars Tönges konnten wir bereits in einer präsymptomatischen Studie mit oraler Fasudil-Behandlung im SOD1-G93A- Mausmodell eine Verlängerung der Überlebenszeit und eine Verbesserung der motorischen Leistung zeigen (Tönges et al. 2014) (siehe Abbildung 4). Hierbei wurde der ROCK-Inhibitor in einer Dosierung von 30 mg/kg Körpergewicht pro Tag und 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag ab Lebenstag 50 getestet. Es zeigte sich ein signifikant längeres Überleben in der Fasudil- 30mg/kg/Körpergewicht-Behandlungsgruppe mit einem mittleren Überlebensvorteil von 10 Tagen. Zudem konnten die Tiere durch Behandlung mit Fasudil 30 mg/kg/Körpergewicht in einer motorischen Leistungsfähigkeitsprüfung auf einer rotarod-Testapparatur im Zeitraum von Tag 107 bis 113 signifikant längere Laufzeiten im Vergleich zur Wasser-behandelten Kontrollgruppe erreichen. Ein solcher präsymptomatischer Behandlungserfolg in einem ALS- Mausmodell ist ein bedeutender Erfolg für die weitere Erforschung therapeutischer Behandlungsmöglichkeiten durch ROCK-Inhibition in der Amyotrophen Lateralsklerose.
Einleitung
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Abbildung 4 ROCK-Inhibition verlängert das Überleben und verbessert die motorischen Fähigkeiten nach prä- symptomatischer Behandlung mit Fasudil
Dargestellt sind die Untersuchungsergebnisse aus einer mit Fasudil 30 mg/kg Körpergewicht behandelten (Fas30), einer mit Fasudil 100 mg/kg Körpergewicht behandelten (Fas100) und einer unbehandelten (Veh) Gruppe aus SOD1-G93A- transgenen Weibchen. Dargestellt ist das Körpergewicht (A), der Krankheitsbeginn (B), das Überleben (C), die Krankheits- dauer (D) sowie die motorischen Verhaltenstestungen hanging wire (E) und rotarod (F). Signifikante Unterschiede bei p <
0,05 sind mit (*) gekennzeichnet. Abbildung entnommen aus Tönges et al., 2014, Seite 6, mit freundlicher Genehmigung von John Wiley and Sons.
