Charakterisierung von extrazellulären halotoleranten
bzw. halophilen Peptidasen in Hinblick auf ihre
biotechnologische Nutzung
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
Dem Fachbereich Biologie und Chemie (FB2)
der Universität Bremen vorgelegt von
Helge Mühl Januar 2007
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Die vorliegende Arbeit wurde in der Firma Molzym GmbH & Co. KG durchgeführt. Ich möchte mich an dieser Stelle bei Prof. Dr. Ulrich Fischer und Prof. Dr. Michael Lorenz für die Bereitstellung des Themas bedanken. Bei Prof. Dr. Lorenz bedanke ich mich besonders für die Betreuung, Diskussionsbereitschaft und die hilfreichen Hinweise beim Verfassen dieser Arbeit. Der Firma Molzym GmbH & Co. KG gilt mein Dank für die Möglichkeit einen hervorragend ausgestatteten Arbeitsplatz zu nutzen. Den Mitarbeitern, besonders Dr. Claudia Disqué, Katja Bergholz und Silke Bohnacker, möchte ich für die gute Arbeitsatmosphäre und den fruchtbaren Ideen-austausch danken. Für die zeitweise Nutzung von Arbeitsplatz, Laborausstattung und Labormaterialien spreche ich der Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie der Universität Bremen, im Besonderen Prof. Dr. U. Fischer, meinen Dank aus. Ein herzliches Dankeschön gilt Petra Herzog und Kristina Schmanke für das Korrektur-lesen der vorliegenden Arbeit.
Meiner Familie und meinen Freunden bin ich für die bedingungslose Unterstützung in allen Lebenslagen sehr verbunden. Ganz besonders möchte ich mich an dieser Stelle auch bei meiner Freundin Madeleine bedanken, die mich immer unterstützt hat und mein Leben stets bereichert.
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1 Einleitung 1
1.1 Peptidasen 1
1.1.1 Terminologie und Klassifizierung der Peptidasen 2
1.1.1.1 Serinpeptidasen 6
1.1.1.2 Metallopeptidasen 7
1.2 Halophile Bakterien, Adaption an hohe Salzkonzentrationen 8
1.2.1 Halophile Enzyme 9
1.2.1.1 Halophile Peptidasen 10
1.2.2 Halophile Peptidasen in der Biotechnologie 11
2 Material und Methoden 16
2.1 Mikroorganismen 16
2.1.1 Halotolerante und halophile Bakterienstämme 16
2.1.2 Klonier- & Expressionsstämme 16
2.1.3 Sonstige Stämme 17
2.2 Plasmide 17
2.3 Synthetische Oligonukleotide (Primer) 18
2.4 Medien, Lösungen & Puffer 20
2.4.1 Luria-Bertani (LB) Medium (Sambrook & Russell, 2001) 20 2.4.2 Salinenmedium-Lanzarote (SML) (Sinn-Meyer, 2003) 20 2.4.3 M9 Minimal Medium (Sambrook & Russell, 2001) 20 2.4.4 M9-Salzlösung (5x) (Sambrook & Russell, 2001) 21
2.4.5 RM-Medium (Sambrook & Russell, 2001) 21
2.4.6 Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Peptidasen 21 2.4.6.1 Skimmilk-Agarose für den Peptidasenachweis in PA-Gelen 21
2.4.7 Antibiotika und Medien-Zusätze 21
2.4.8 Puffer und Lösungen 22
2.4.9 Chemikalien 23
2.5 Mikrobiologische Methoden 23
2.5.1 Anzucht der halophilen Isolate 23
2.5.2 Anzucht der Klonier- und Expressionsstämme 23
2.6 Proteinbiochemische Methoden 23
2.6.1 Gewinnung von zellfreien Kulturüberständen 23
2.6.2 Protein-Fällung der Kulturüberstände 23
2.6.3 Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500 24
2.6.4 Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninic Acid)-Methode 24
2.6.5 Heterologe Proteinexpression in E. coli 24
2.6.6 Zellernte und Zellaufschluss 25
2.6.7 Säulenchromatografie 25
2.6.7.1 Anionenaustauschchromatografie 25
2.6.7.2 Hydrophobe Interaktionschromatografie 26
2.6.7.3 Gelfiltrationschromatografie 26
2.6.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970,
modifiziert) 27 2.6.9 Detektion von Peptidase-Aktivität auf festen Medien 28 2.6.10 Peptidasenachweis im Polyacrylamid-Gel (Kontakt-Zymogramm) 28 2.6.11 Quantitative Peptidase-Aktivitätsbestimmung 29 2.6.11.1 Azocasein-Assay (Charney & Tomarelli, 1947, modifiziert) 29 2.6.11.2 EnzCheck Protease Assay Kit (Invitrogen) 29 2.6.11.3 Casein-Assay (Kunitz, 1947, modifiziert) 30 2.6.11.4 Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität 31 2.6.11.5 Einfluss von chaotropen Salzen auf die Peptidase-Aktivität 31
2.6.11.6 Einfluss von NaCl und Metallionen auf die Peptidase-Aktivität 31 2.6.11.7 Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität 32
2.7 Molekularbiologische Methoden 32
2.7.1 Nukleinsäure-Extraktion aus Bakterien 32
2.7.1.1 Extraktion chromosomaler DNA 32
2.7.1.2 Isolierung von RNA aus E. coli 32
2.7.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 32
2.7.1.4 Isolierung von Fosmid-DNA aus E. coli 32
2.7.2 Agarose-Gelelektrophorese und Dokumentation 33
2.7.3 Southern-Blot 33
2.7.4 Northern-Blot 34
2.7.5 Kolonie-Blot 34
2.7.6 Hybridisierung 35
2.7.7 Herstellung von DNA-Sonden 35
2.7.8 Herstellung von Genbanken 35
2.7.9 Subklonierung 36
2.7.10 Ligation 36
2.7.11 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen 36
2.7.12 Transformation 37
2.7.13 Replikaplattierung (Tatum & Lederberg, 1947) 38
2.7.14 Polymerasekettenreaktion (PCR) 38
2.7.15 Sequenzierung und Auswertung der Sequenzdaten 39
3 Ergebnisse 40
3.1 Extrazelluläre Peptidasen aus halotoleranten und halophilen Bakterien 40 3.1.1 Vorauswahl und Charakterisierung von Peptidase produzierenden Isolaten 40 3.1.2 Systematische Einordnung der ausgewählten Peptidase-Produzenten
mittels 16S-rRNA Analyse 43
3.1.3 Physiologie der Enzymbildung 45
3.1.4 In vitro Peptidase-Assays - Möglichkeiten und Grenzen der verwendeten
Assays 46 3.1.5 Anreicherung der Peptidasen aus Kulturüberständen der halophilen
Stämme 49
3.1.5.1 Säulenchromatografie 51
3.2 Biochemische Charakterisierung extrazellulärer Peptidasen 53 3.2.1 Einfluss des pH-Wertes auf die Peptidase-Aktivität 54 3.2.2 Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität 55
3.2.3 Salzabhängigkeit der Peptidasen 56
3.2.4 Einfluss von Metallionen auf die Peptidase-Aktivität 58 3.2.5 Einfluss chaotroper Agenzien auf die Peptidasen 60 3.2.6 Einfluss von Inhibitoren auf die Peptidasen 61
3.2.7 Gewebeauflösende Aktivität 63
3.2.8 Analyse der Peptidasen mittels PAGE 65
3.3 Molekularbiologische Identifizierung von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen 67 3.3.1 Entwicklung der Sonde für Subtilisin-ähnliche Peptidasen 69 3.3.2 Identifizierung von Klonen und Subklonen mit homologen Sequenzen zu
Subtilisin-ähnlichen Peptidasen 70 3.3.3 Identifizierung und Sequenzanalyse der Peptidasegene 72 3.3.4 Identifizierung des Signalpeptids in ProAS(#748) 74 3.4 Heterologe Expression der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen in E. coli 75 3.4.1 Peptidase-Überexpression mit Expressionsvektoren 76 3.4.1.1 Modellsystem: Expression von Subtilisin E in E. coli 76 3.4.1.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren 77 3.4.1.1.2 Expressionsanalyse 78
3.4.1.2 Heterologe Expression von ProAS(#748) 81
3.4.1.2.1 Analyse der Expression von ProAS(#748) durch pBAD 83 3.4.2 Heterologe Expression einer aktiven Peptidase durch den Fosmidklon F114 84
3.4.3 Übereinstimmung der Peptidase F114 mit Peptidase B aus B3/1-2 (#418) 86 3.4.3.1 Reinigung der rekombinanten Peptidase F114 87 3.4.3.2 Biochemische Eigenschaften der Peptidase F114 im Vergleich zur
Wildtyp-Peptidase B 88 3.4.3.3 Bestimmung des Molekulargewichtes von Peptidase F114 91
4 Diskussion 95
4.1 Zugehörigkeit der Peptidase produzierenden moderat halophilen Stämme zur Gattung Salinivibrio 97 4.2 Salinivibrio bildet zwei Typen von extrazellulären Peptidasen 99
4.2.1 Typ A: Metallopeptidase 100
4.2.2 Typ B: Serinpeptidase 102
4.2.2.1 Biochemische Charakteristika 102
4.2.2.2 Molekularbiologische Charakteristika 104
4.3 Heterologe Expression der Serinpeptidase ProAS in E. coli 107 4.4 Einsatz der Metallopeptidase und der Serinpeptidase (ProAS) aus
Salinivibrio in der Biotechnologie 116
5 Zusammenfassung 121
6 Literaturverzeichnis 123
7 Anhang 140
Abkürzungsverzeichnis:
Abkürzung Bedeutung Abkürzung Bedeutung
A. dest. Destilliertes Wasser Mr Relative molekulare Größe [kb]
AzU Azocaseinunit MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
n.b. Nicht bestimmt
Bp Basenpaare OD Optische Dichte
BSA Rinderserumalbumin ORF Offenes Leseraster
Cfu Kolonie bildende Einheiten PA Polyacrylamid
DNA Desoxyribonukleinsäure PAGE Polyacrylamid Gel Elektrophorese
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat Phenanthrolin 1,10-Phenanthrolin
E. coli Escherichia coli PMSF Phenylmethylsulphonylfluorid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure RNA Ribonukleinsäure
ERG Eppendorfreaktionsgefäß RT Raumtemperatur (18-25°C)
FlU Fluoreszenzunit SDS Natriumdodecylsulfat
GuHCl Guanidinhydrochlorid SML 12/8 Salinemedium Lanzarote (12% NaCl; pH8)
GuSCN Guanidinisothiocyanat TCA Trichloressigsäure
IPTG Isopropyl- E-D-1-thiogalactopyranosid
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
Kbp Kilobasenpaare Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
kFlU Kilo-Fluoreszenzunit v/v Volumen pro Volumen
KuU Kunitz-Unit w/v Gewicht pro Volumen
1
1
Einleitung
Einleitung
1.1
1.1 PeptidasenPeptidasen
Peptidasen katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen und sind daher in der Lage Proteine und Peptide zu spalten, wobei kürzere Peptidfragmente oder freie Aminosäuren als Spaltprodukte entstehen können. Peptidasen sind für alle Pro- und Eukaryoten essentiell und beeinflussen die Funktionalität sowohl einzelner Zellen als auch ganzer Organe bzw. vielzelliger Organismen. Übereinstimmend mit ihrer hohen biologischen Relevanz kodieren etwa 2% aller Gene für Peptidasen (Rawlings et al., 2006).
Abhängig von der Sequenzspezifität der Peptidasen erfolgt eine schematische Unterteilung in eine limitierte und eine unlimitierte Proteolyse (Hooper, 2002). Bei der unlimitierten Proteolyse werden Proteine durch unspezifische Peptidasen zumeist im Rahmen des Protein-Turnover in der Zelle oder digestorischer Vorgänge außerhalb der Zelle zu Oligopeptiden oder Aminosäuren abgebaut. Katalysieren Peptidasen dagegen eine spezifische Spaltung, spricht man von einer limitierten Proteolyse, wobei es zumeist zur Spaltung einzelner Peptidbindungen kommt. Diese selektive Modifikation wird von vielen Proteinen zur Entwicklung ihrer biologisch aktiven Form benötigt. So sind Viren auf die proteolytische Segmentierung ihrer Polyproteine angewiesen, während Peptidasen bei Pro- und Eukaryoten zur Abtrennung der Signalpeptide sekretierter Proteine notwendig sind. Fernerhin katalysieren sie die Prozessierung von inaktiven Enzymvorstufen (Proenzyme oder Zymogene) zu aktiven Enzymen durch Abspaltung der Propeptide. Beispielsweise werden selbst viele Peptidasen als Proenzym synthetisiert und bedürfen einer proteolytischen Aktivierung (Khan & James, 1998). Ort und Zeitpunkt dieser Aktivierung stellen hierbei einen wichtigen Mechanismus der biologischen Regulation dar. Dement-sprechend besitzen Peptidasen eine entscheidende Funktion in Regulations-prozessen, u.a. in komplexen Abläufen wie Sporulation, Zellvermehrung, Zell-differenzierung, Blutgerinnung, Blutdruck- und Immunregulation (Mann & Lorand, 1993; Rao et al., 1998). Ebenso können Peptidasen als integrale Membranproteine auch Rezeptorfunktionen übernehmen und eine interzelluläre Kommunikation sowohl über ihre Substrate als auch über den direkten Zell-Zell-Kontakt gewährleisten (Albiston et al., 2001). Gleichbedeutend mit der Aktivierung ist für die Regulation aber
ebenso die Inaktivierung der Enzyme, welche wiederum durch eine proteolytische Spaltung erfolgen kann (Barrett, 2000).
Eine Vielzahl von Peptidasen aus Bakterien wurde bereits beschrieben und näher charakterisiert. Neben den ubiquitären intrazellulären Peptidasen synthetisieren viele Bakterien proteolytische Enzyme zur Sekretion in das umgebende Medium (Rao et al., 1998). Einige dieser extrazellulären Peptidasen sind Toxine oder virulenz-vermittelnde Faktoren (Matsumoto, 2004). Ausgehend von ihrer medizinischen Bedeutung bei bakteriellen Infektionen sind sie Gegenstand intensiver Forschung. Ein Beispiel für extrazelluläre Peptidasen, die eine Invasion von bakteriellen Krank-heitserregern in ihre Wirte ermöglichen, sind die IgA-Peptidasen. Meningitis-Erreger, wie Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis und Haemophilus influenzae, können durch spezifische Proteolyse der IgA-Antikörper des Wirtes die Immun-barriere der Mukosa überwinden (Poulsen et al., 1996). Weit verbreitet ist die Fähigkeit der Bakterien durch sekretierte Peptidasen proteinhaltige Substrate, die außerhalb der Zelle lokalisiert sind, für ihren zentralen Metabolismus zu nutzen. Die unlimitierte Hydrolyse extrazellulärer Proteine durch unspezifisch wirkende Peptidasen stellt den Bakterien dabei leicht aufnehmbare Oligopeptide und Amino-säuren zu Verfügung (Kalisz, 1988). Im Hinblick auf ihr breites Substratspektrum sind diese extrazellulären Peptidasen aus Bakterien von herausragendem Interesse für den Proteinabbau in diversen industriellen Prozessen. In Zusammenhang mit ihrer hohen Toleranz gegenüber extremen Bedingungen haben sich dabei besonders Enzyme von extremophilen Mikroorganismen in biotechnologischen Anwendungen durchgesetzt (Hough & Danson, 1999).
1.1.1
1.1.1 Terminologie und Klassifizierung der PeptidasenTerminologie und Klassifizierung der Peptidasen
Die Bezeichnung für die Peptidbindungshydrolasen ist in der Literatur nicht einheitlich. Es werden Bezeichnungen wie Proteasen, Proteinasen oder Peptidasen häufig nach Belieben eingesetzt. Obwohl schon Bergmann und Ross (1936) eine klare Definition erstellten und diese auch seit 1992 von der IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology - Nomenclature Committee, 1992) vertreten wird, ist von einer Umsetzung in der aktuellen Literatur nur wenig zu erkennen (vergleiche hierzu z.B.: Arnorsdottir et al., 2005; Hiraga et al., 2005; Lama et al., 2005; Venugopal & Saramma, 2006). Nach der geltenden Definition der IUBMB werden alle proteolytisch aktiven Enzyme (= Peptidbindung spaltende
Hydrolasen) als Peptidasen bezeichnet. Protease ist nunmehr ein Synonym für Peptidase. Der Definition folgend können die Peptidasen aufgrund ihrer katalytischen Eigenschaften in Exopeptidasen (Synonyme: Exoprotease) und Endopeptidasen (Synonyme: Proteinase, Endoprotease) unterteilt werden (siehe Abb. 1). Ist die Aktivität der Exopeptidasen an die Nähe der N- und C-Termini des Substrates gebunden, sind die Endopeptidasen in der Regel entfernt von diesen Termini aktiv. Diese Gruppierung ist gleichzeitig die Grundlage zur Klassifizierung der Peptidasen nach dem System der Enzyme Commission (EC) der IUBMB.
Aktivität entfernt von den Termini:
Endopeptidase
(Syn: Proteinase, Endoprotease) Abspaltung endständiger Aminosäuren:
Exopeptidase (Syn: Exoprotease) Proteolytische Enzyme: Peptidase (Syn: Protease) Aminopeptidasen (EC 3.4.11) Dipeptidasen (EC 3.4.13)
Dipeptidyl- & Tripeptidylpeptidasen (EC 3.4.14) Peptidyldipeptidasen (EC 3.4.15) Serincarboxypeptidasen (EC 3.4.16) Metallocarboxypeptidasen (EC 3.4.17) Cysteincarboxypeptidasen (EC 3.4.18) Omegapeptidasen (EC 3.4.19) Serin-Endopeptidasen (EC 3.4.21) Cystein-Endopeptidasen (EC 3.4.22) Aspartat-Endopeptidasen (EC 3.4.23) Metallo-Endopeptidasen (EC 3.4.24) Threonin-Endopeptidasen (EC 3.4.25) Endopeptidasen, unbekannt (EC 3.4.99)
Abb. 1: Terminologie und Klassifizierung der proteolytischen Enzyme nach der IUBMB (verändert nach: Barrett, 2001 und http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/).
Die weitere Untergliederung (siehe Abb. 1) der Peptidasen im EC-System erfolgt nach der Reaktionsart des Substratumsatzes (in Amino-, Dipeptidyl-, Tripeptidyl-, Peptidyldi-, Carboxy- und Omegapeptidasen) und anhand der Merkmale der katalytischen Domänen (in Serin-, Aspartat-, Cystein-, Threonin- und Metallo-peptidasen).
Die Klassifizierung der Peptidasen nach dem EC-System weist allerdings für den wissenschaftlichen Gebrauch Schwächen auf. So werden genealogisch verschiedenartige Peptidasen in der gleichen Gruppe zusammengefasst und die überaus zahlreichen Endopeptidasen durch nur fünf Untergruppen repräsentiert. Zudem finden im EC-System strukturelle und evolutionäre Gemeinsamkeiten zwischen den einzelnen Enzymen keine Beachtung (Barrett, 2001). Infolgedessen wurde von Rawlings und Barrett (1993) das MEROPS-System aufgestellt, welches aus den grundlegenden Enzymstrukturen und den evolutionären
Verwandtschafts-verhältnissen der Peptidasen auf Basis ihrer Aminosäuresequenzen hervorgeht. In diesem hierarchischen System kommt es zur Einteilung der Peptidasen in Clans und Familien. Ein Clan fasst dabei verschiedene Familien zusammen, deren Vertreter sich jeweils von einem gemeinsamen „Vorfahren“ ableiten lassen. Die Bezeichnung der zurzeit 49 verschiedenen Clans wird durch zwei Großbuchstaben vorgenommen, wobei der jeweils erste Buchstabe auf den Aminosäurerest der katalytischen Gruppe hinweist: Aspartat (A), Cystein (C), Glutamin (G), Metallo (M), Serin (S), Threonin (T). Unterscheiden sich diese Aminosäurereste innerhalb der Familien eines Clans, wird dieser zur Gemischt-Gruppe (P) eingeordnet. Der zweite Buchstabe der Clan-bezeichnung ist dagegen frei wählbar. Proteolytische Enzyme, die sich bisher nicht in die bestehenden Gruppen einordnen lassen, werden hingegen in einer Unbekannt-Gruppe (U) zusammengefasst. Die einzelnen Familien sind ebenfalls durch den Großbuchstaben der katalytischen Gruppe (A, C, G, M, S, T und U) und eine fortlaufende Nummer gekennzeichnet. Jede Familie ist dabei um ein Typenenzym herum aufgestellt. Weitere Vertreter dieser Familie müssen signifikante Überein-stimmungen mit der Primärstruktur des Typenenzyms oder der schon in der Familie vorhandenen Peptidasen aufweisen. Dabei ist im Gegensatz zu dem EC-System zu beachten, dass sowohl Exopeptidasen als auch Endopeptidasen in der gleichen Familie vertreten sein können.
Eine treffende Benennung der jeweiligen Clans und Familien hat sich aufgrund der dynamischen Entwicklung ihrer Klassifizierung erst in wenigen Fällen durchgesetzt. Eine zahlenmäßige Übersicht der bislang (Stand: November 2006) bekannten Clans, Familien und Peptidasen nach MEROPS ist in Tab. 1 zusammengefasst. Auf eine komplette Darstellung aller Clans wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet. Eine ständig aktualisierte Übersicht der momentan 49 Clans und 185 Familien, in denen die über 48.000 bekannten Peptidasen zusammengefasst werden, ist unter http://merops.sanger.ac.uk/ einzusehen.
Tab. 1: Übersicht über die Anzahl der Clans, Familien und Enzyme der bislang bekannten Peptidasen nach MEROPS (Rawlings et al., 2006). Zu den jeweiligen katalytischen Gruppen wurden wenige Beispiele zur Verdeutlichung der MEROPS-Klassifizierung eingestellt.
Katalytische Gruppe (Kürzel) Clan Beispiele Familie Enzyme Typenenzym (Herkunft) 7 14 2.915
A1 Pepsin A (Homo sapiens) A2 Retropesin (HIV 1) AA
A11 Copia Transposon Peptidase (Drosophila melanogaster)
Aspartat (A)
AC A8 Signal-Peptidase II (Escherichia coli)
9 47 4.636
C1 Papain (Carica papaya) CA
C2 Calpain 2 (Homo sapiens)
C11 Clostripain (Clostridium histolyticum)
Cystein (C)
CD
C25 Gingipain R (Porphyromonas gingivalis)
1 1 12
Glutamin (G)
GA G1 Scytalidoglutamin-Peptidase (Scytalidium lignicolum)
15 53 15.611
M1 Aminopeptidase N (Homo sapiens) M4 Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus) M10 Matrix-Metallopeptidase-1 (Homo sapiens) M12 Astacin (Astacus astacus)
M26 IgA1-spez. Metallopeptidase (Streptococcus sanguinis) M41 FtsH Peptidase (Escherichia coli)
MA
M64 IgA Peptidase (Clostridium ramosum) MC M14 Carboxypeptidase A1 (Homo sapiens)
Metallo (M)
ME M16 Pitrilysin (Saccharomyces cerevisiae)
12 28 14.169
S8 Subtilisin Carlsberg (Bacillus licheniformis) SB
S53 Sedolisin (Pseudomonas sp. 101) S9 Prolyl-Oligopeptidase (Sus scrofa) SC
S33 Prolyl-Aminopeptidase (Neisseria gonorrhoeae)
Serin (S)
SJ S16 Lon-A Peptidase (Escherichia coli)
1 1 155
Threonin (T)
T- T5 Ornithin-Acetyltransferase (Saccharomyces cerevisiae)
3 30 9.389
PA S1 Chymotrypsin A (Bos taurus) C3 Picornain 3C (menschl. Poliovirus 1)
PB C44 Amidophosphoribosyltransferase (Homo sapiens)
T1 Archaeen Proteasom, Beta Komponente (Thermoplasma acidophilum)
PC C26 Gamma-Glutamylhydrolase (Rattus norvegicus)
Gemischt (P)
C56 PfpI Peptidase (Pyrococcus furiosus)
1 9 1.560
Unbekannt (U)
U- U4 Sporulations-Faktor SpoIIGA (Bacillus subtilis)
Gesamt: 49 185 48.970
Die Verbreitung von bakteriellen Peptidasen erstreckt sich mit Ausnahme der Glutamin-Gruppe, deren Vertreter bislang nur in Pilzen gefunden wurden, über alle katalytischen Gruppen. Soweit bekannt, sind Peptidasen aus Bakterien in 40 der 49 Peptidase-Clans vertreten. Extrazelluläre Peptidasen aus halophilen Bakterien, die Gegenstand dieser Arbeit sind, sind bisher nur aus zwei katalytischen Gruppen bekannt: den Serinpeptidasen und den Metallopeptidasen (Vergleiche hierzu Tab. 2 & De Castro et al., 2006). Zu einer übereinstimmenden Zuordnung kam Gupta et al.
(2002b) ebenfalls für extrazelluläre Peptidasen aus einer anderen Gruppe von extremophilen Bakterien, den Alkaliphilen.
1.1.1.1
1.1.1.1 SerinpeptidasenSerinpeptidasen
Über ein Drittel aller Peptidasen wird zu den Serinpeptidasen gerechnet, basierend auf einem reaktiven Serinrest in ihrem aktiven Zentrum. In den meisten Fällen bildet dieser Serinrest mit einem Histidin- und einem Aspartatrest eine sog. katalytische Triade. Zurzeit werden nach MEROPS 12 Clans der Serinpeptidasen unterschieden, sowie ein Clan (PA) aus der Gemischt Gruppe (P), der neben Vertretern der Serin-peptidasen ebenso CysteinSerin-peptidasen enthält (Rawlings et al., 2006). Zwischen den einzelnen Clans der Serinpeptidasen bestehen keine verwandtschaftlichen Beziehungen, so dass vermutlich die funktionelle Ähnlichkeit dieser Enzyme auf eine unabhängige, konvergierende Evolution zurückzuführen ist (Rawlings & Barrett, 1994; Siezen et al., 1991).
Die Spaltung der Peptidbindung erfolgt in einer zweistufigen Reaktion. Bei der Acylierung wird die Carbonylgruppe des zu spaltenden Peptides durch die Hydroxy-gruppe des Serinrestes nukleophil angegriffen und bildet ein kovalent gebundenes Enzym-Peptid-Intermediat. Das benachbarte Histidin übernimmt bei der Reaktion das freie Proton, während Aspartat zum einen den Imidazolring des Histidins positioniert und zum anderen die positive Ladung partiell neutralisiert. Nach Freisetzung des C-terminalen Fragmentes erfolgt die Esterspaltung der Zwischenstufe durch den nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls (Rawlings & Barrett, 1994).
Die am weitesten verbreiteten Clans der bakteriellen Serinpeptidasen stellen die Chymotrypsin-ähnlichen (PA(S)), Subtilisin-ähnlichen (SB), und Clp-ähnlichen (SK) Peptidasen, sowie die /-Hydrolasen (SC) dar (Lesk & Fordham, 1996; Ollis et al., 1992; Siezen & Leunissen, 1997; Wang et al., 1997).
Der Clan der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen beinhaltet dabei die wohl bestunter-suchten Peptidasen, wie etwa das Subtilisin E aus Bacillus subtilis. Die biologische Funktion der vielen bekannten extrazellulären Peptidasen dieses Clans steht haupt-sächlich im Zusammenhang mit der Hydrolyse komplexer Nährstoffe. Eine Aufgliederung der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen erfolgt nach MEROPS in eine gleichnamige Familie (S8) mit über 1400 Enzymen, charakterisiert durch die Reihenfolge ihrer katalytischen Triade (Asp, His, Ser) und in die Familie der Sedolisine (S53) mit einer katalytischen Tetrade (Glu, Asp, Asp, Ser) und etwa 120
bekannten Vertretern. Die auch als Subtilasen bezeichnete Familie S8 wird von Siezen & Leunissen (1997) abweichend zum MEROPS-System als Superfamilie angesehen und aufgrund von Sequenzhomologien der katalytischen Domänen in 6 Familien (Subtilisin, Thermitase, Kexin, Pyrolysin, Proteinase K und Lantibiotische Peptidasen) eingeteilt (Abb. 2).
Abb. 2: Dendrogramm der Superfamilie der Subtilasen (aus Siezen & Leunissen, 1997).
1.1.1.2
1.1.1.2 MetallopeptidasenMetallopeptidasen
Die Metallopeptidasen bilden nach den Serinpeptidasen die zweitgrößte Gruppe an proteolytischen Enzymen. Charakteristisch sind ein, seltener zwei gebundene Zinkionen, die direkt in die hydrolytische Aktivität des Enzyms eingebunden sind. Anstatt Zinkionen können ebenfalls andere Metallionen wie Mangan, Nickel und Kobalt in einigen Metallopeptidasen gefunden werden (Auld, 1995). Die Funktion der divalenten Kationen ist die Aktivierung eines Wassermoleküls, welches die zu hydrolysierende Peptidbindung an der Carbonylgruppe angreift (Häse & Finkelstein, 1993). Im Gegensatz zu den Serin- und Cysteinpeptidasen werden dabei keine kovalent gebundenen Intermediate ausgebildet, ähnlich dem Reaktionsmechanismus der Aspartatpeptidasen.
Die Metallopeptidasen werden aktuell in 15 Clans eingeteilt, wobei die ubiquitär verbreiteten Zinkine (Clan MA) mit zwei Untergruppen (Gluzinkine (MA(E)) und Metzinkine (MA(M)) und über 31 Familien den wichtigsten Clan darstellen (Hooper, 1994; Rawlings et al., 2006). Allen Zinkinen ist das Zn-bindende Motiv HEXXH* zueigen, wobei die Gluzinkine die Zinkionen über zwei Histidin-Reste aus dem HEXXH-Motiv und einem Glutamat, das außerhalb des Motivs verfügbar ist, binden. Die Metzinkine besitzen hingegen statt des Glutamats einen weiteren Histidin- oder Asparaginsäurerest.
Unter den Zinkinen befinden sich viele bakterielle extrazelluläre Metallopeptidasen, u.a. in den Familien der Thermolysine (M4), mikrobiellen Collagenasen (M9) und Matrix-Metallopeptidasen (M10) (Häse & Finkelstein, 1993; Hooper, 1994; Turner, 2003). Bei den Thermolysinen handelt es sich häufig um unspezifische Peptidasen,
die zumeist zur bakteriellen Ernährung durch Degradation extrazellulärer Proteine beitragen (de Kreij et al., 2000). Die mikrobiellen Collagenasen (Harrington, 1996) und die Matrix-Metallopeptidasen spielen durch Hydrolyse der Matrixproteine im tierischen Gewebe eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese bakterieller Infektionen (Lee & Murphy, 2004).
1.2
1.2 Halophile Bakterien, Adaption an hohe SalzkonzentrationenHalophile Bakterien, Adaption an hohe Salzkonzentrationen
Als Peptidase-Produzenten lag für diese Arbeit eine Stammsammlung von halophilen und halotoleranten Bakterien aus Salinen vor. Während geringe Mengen an Salz für alle Lebewesen essentiell sind, zeichnen sich halophile Organismen durch ihre Abhängigkeit von hohen Konzentrationen verschiedener Salze aus. Halotolerante Bakterien besitzen demgegenüber ihr Wachstumsoptimum unter mesophilen Bedingungen, sind aber dennoch in der Lage höhere Salzkonzentrationen zu tolerieren. Typische Lebensräume für halophile Bakterien sind neben Salinen u.a. Salzseen, Salzwüsten und Steinsalzlager. Diese Habitate setzen spezielle Mechanismen voraus, um den osmotischen Druck ihrer hypersalinen Umwelt im Cytoplasma auszugleichen und sich vor dem denaturierenden Effekt des Salzes zu schützen (DasSarma & Arora, 2001). Die Klassifizierung der einzelnen Spezies anhand ihrer physiologischen Eigenschaften gestaltet sich bei den halophilen Bakterien schwierig und ist bisher in der Literatur nicht einheitlich definiert (Kushner, 1988; Ramos-Cormenzana, 1988; Ventosa et al., 1998). So zeigen viele moderat halophile Arten als Adaption an die stark schwankenden Umweltbedingungen ihrer Biotope eine Anpassung an weite Bereiche von Salzkonzentrationen (siehe Abb. 3)
mesophil marin moderat halophil extrem halophil
% NaCl (w/v): 0 0,5 2 15 32
Süßwasser Brackwasser Hypersalin Extrem Hypersalin Seen/Flüsse Ästuare Meere Salinen, Salzseen Steinsalz Meerwasser Klassifizierung: Biotope: Organismen*: 3 Halobacterium salinarum (5-30%) Ectothiorhodospira halochloris (10-32%) Vibrio alginolyticus (0-7,5%) Halobacteroides halobius (8-16%) Paracoccus halodenitrificans (0-30%)
Abb. 3: Einige halotolerante und halophile Bakterien, ihre Klassifizierung und mögliche Biotope (aus Mühl, 2002).
Halotolerante und halophile Bakterien finden sich in diversen Ordnungen der Bacteria und Archaea, wobei halotolerante und moderat halophile Vertreter vermehrt unter den Bacteria und extrem halophile häufig unter den Archaea zu finden sind. Diese Verteilung basiert vermutlich auf den unterschiedlichen resistenzvermittelnden Strategien der Organismen. Extrem halophile Archaea besitzen ein Cytoplasma, welches isoton mit dem umgebenden Medium ist. Durch Akkumulation von Kalium-ionen und gleichzeitiger Ausschleusung von NatriumKalium-ionen wird ein osmotisches Gleichgewicht zwischen Cytoplasma und umgebendem Medium hergestellt. Da Kaliumionen weniger Wasser in ihrer Hydrathülle binden als Natriumionen, steht der Zelle damit mehr freies Wasser zur Verfügung. Im Gegensatz dazu halten die Vertreter der halotoleranten und halophilen Bacteria mit Ionen-Pumpen die cyto-plasmatische Salzkonzentration verhältnismäßig niedrig. Mit der Anreicherung so genannter kompatibler Solute in der Zelle werden die Wasseraktivitätsunterschiede zum Außenmedium ausgeglichen. Diese kompatiblen Solute, wie beispielsweise Trehalose, Ectoin und Betain, funktionieren dabei als organische Osmotika, ohne die biochemischen Prozesse der Zelle zu hemmen (Galinski, 1993). Diese verschiedenen Strategien führen dazu, dass bei halophilen Bacteria nur Enzyme mit Kontakt zum Außenmedium (extrazelluläre und membranassoziierte Enzyme) einen halophilen Charakter aufweisen. Im Gegensatz dazu besteht bei den extrem halophilen Archaea die Notwendigkeit sowohl bei intra- als auch bei extrazellulären Enzymen speziell an hohe Salzkonzentrationen angepasst zu sein (Kushner, 1988).
1.2.1
1.2.1 Halophile EnzymeHalophile Enzyme
Aufklärung über die Adaption an höhere Salzkonzentrationen bei halophilen Enzymen konnten Untersuchungen an einigen extrem halophilen Enzymen aus Archaeen geben (Madern et al., 2000). Diese Enzyme sind übereinstimmend durch eine erhöhte Anzahl von sauren Aminosäureresten auf ihrer Oberfläche und somit durch ein negatives Oberflächenpotential charakterisiert (Bieger et al., 2003; Madern et al., 2000; Mevarech et al., 2000). Die daraus abzuleitende Halophilie ist am besten über das Solvatisierungs-Stabilisations-Modell zu erklären (Premkumar et al., 2005). Hydratisierte Ionen binden an der negativen Enzymoberfläche und bilden eine so genannte Solvatisierungs-Hülle aus. Diese Hülle verhindert eine Anreicherung von Wasser oder Salzen auf der Proteinoberfläche, was einen Zusammenbruch der Enzymstruktur oder ein Aussalzen durch Aggregation der Enzyme verhindert
(Costenaro et al., 2002; Ebel et al., 2002). Bei salzarmer bzw. salzfreier Umgebung kommt es hingegen zur gegenseitigen Abstoßung der negativen Ladungen auf der Enzymoberfläche und damit zur Entfaltung des Enzyms. Einhergehend mit der Entfaltung ist die zumeist irreversible Inaktivierung der extrem halophilen Enzyme (Adams & Kelly, 1995).
Demgegenüber müssen die strukturellen Mechanismen von halotoleranten und moderat halophilen Enzymen, die es ermöglichen sowohl bei niedrigen als auch bei höheren Salzkonzentrationen stabil und katalytisch aktiv zu sein, noch aufgeklärt werden (vergl. hierzu: Deutch, 2002; Polosina et al., 2002; Wejse et al., 2003; Yoshimune et al., 2004).
1.2.1.1
1.2.1.1 Halophile PeptidasenHalophile Peptidasen
Im Gegensatz zu den extremophilen Peptidasen aus thermophilen und alkaliphilen Prokaryoten, gibt es vergleichsweise wenige Untersuchungen an halophilen Peptidasen. Eingehende biochemische Charakterisierungen erfolgten an einigen Peptidasen aus extrem halophilen Archaeen (zusammengefasst in De Castro et al., 2006), die im Folgenden als haloarchaeale Peptidasen bezeichnet werden. Allen haloarchaealen Peptidasen gemeinsam ist ein Aktivitätsoptimum bei hohen Salz-konzentrationen. So besitzen die Peptidasen aus Natronococcus und Natrialba ein Optimum > 1 M NaCl, welches von den Peptidasen aus Haloferax und Halobacterium mit > 3 M NaCl übertroffen wird. Sie gehören, soweit bekannt, alle zu den Serin-peptidasen. Die Primärstrukturen von vier haloarchaealen Serinpeptidasen wurden bestimmt und erlauben eine Einordnung der Enzyme in die Familie der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen (MEROPS: S8). Anhand von Sequenzvergleichen lassen sie sich einer eigenen Gruppe, den Halolysinen, zuordnen, benannt nach der Peptidase Halolysin I aus Haloferax mediterranei (Siezen & Leunissen, 1997; Stepanov et al., 1992). Kristallografische und weitere Untersuchungen zur Struktur der extrazellulären haloarchaealen Peptidasen liegen noch nicht vor.
Informationen über sekretierte halophile und halotolerante Peptidasen der Bacteria wurden fast ausschließlich innerhalb der letzten 2-3 Jahre gewonnen. Es wurden Peptidasen sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Bakterien isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese untersuchten Enzyme besitzen teilweise einen extrem halophilen Charakter mit einem Aktivitätsoptimum bei hohen Salz-konzentrationen (3 M und 4,2 M NaCl). Es sind aber auch Peptidasen mit einem
halotoleranten (0-1 M NaCl bzw. 0-0,5 M NaCl) bis moderat halophilen (0,34 M und 1,7 M NaCl) Charakter isoliert worden (vergleiche Tab. 2). Die Klassifizierung der Peptidasen hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber verschiedenen Inhibitoren konnte die Zugehörigkeit zu den Serinpeptidasen oder den Metallopeptidasen zeigen. Sequenzinformationen der Peptidasegene aus halophilen Bacteria liegen bislang nur für eine Metallopeptidase aus Pseudoalteromonas ruthenica (Sánchez-Porro Álvarez, 2005) vor. Ausgehend von einem Sequenzvergleich ist diese Peptidase in die Familie der Thermolysine (MEROPS: M4) einzuordnen.
1.2.2
1.2.2 Halophile Peptidasen in der BiotechnologieHalophile Peptidasen in der Biotechnologie
Die Verwendung von Peptidasen erstreckt sich über ein weites Einsatzgebiet zur Modifikation und Degradation von Proteinen in industriellen Prozessen. Proteo-lytische Enzyme machten dabei im Jahr 2002 40% der weltweiten Umsätze mit technischen Enzymen (Gesamtvolumen: ca. 1,2 Mrd. EUR) aus (Gupta et al., 2002b). Mittlerweile ist der Umsatz mit Enzymen in der so genannten weißen Biotechnologie auf 5 Mrd. EUR (2005) angestiegen, wobei der größte Teil mit alkalischen und thermophilen Peptidasen erzielt wird (Bendlin, 2006; Maurer, 2004). Peptidasen finden Anwendung bei der Entfernung von proteinhaltigen Verschmutzungen als Zusatz in diversen Reinigungs- und Waschmitteln sowie in der Abwasser- und Abfallbehandlungsindustrie. Darüber hinaus kommen proteolytische Enzyme u.a. zur Haarentfernung und Gerbung in der lederverarbeitenden Industrie sowie zur Modifikation von Nahrungs- und Futtermitteln und in diversen Bereichen in der Pharmaindustrie zum Einsatz (Gupta et al., 2002b; Rao et al., 1998).
Die Verwendung von halophilen Peptidasen in der Biotechnologie ist dagegen bislang auf wenige Anwendungen beschränkt (Eichler, 2001; Margesin & Schinner, 2001). Einen Einsatz von halophilen Peptidasen im hypersalinen Milieu beschreiben Hiraga et al. (2005) und Namwong et al. (2006) für die beschleunigte Fermentation von asiatischen Fischsoßen. Die traditionelle Methode für die Degradation der Fisch-fleischproteine in den stark salzhaltigen Soßen durch Einsatz halophiler proteo-lytischer Bakterien ist sehr zeitaufwändig und beträgt über ein Jahr. Durch Verwendung von gereinigten Serinpeptidasen aus einem Filobacillus- und Halobacillus-Stamm könnte gegenüber dem traditionellen Verfahren ein erheblicher Zeitgewinn und damit einen wirtschaftlichen Vorteil entstehen.
Tab. 2: Peptidasen aus halophilen und halotoleranten Vertretern der Bacteria und Archaea und ihre Charakteristika.
Optimalbedingungen
Organismus Peptidase NaCl
(M) Temp (°C) pH Mr (kDa) Bemerkungen Referenz Archaea Halobacterium halobium Subtilisin-ähnliche Peptidase 4,0-5,0 37 8,0-9,0 41 -Kompletter irreversibler Aktivitätsverlust in < 2 M NaCl -Gensequenz bekannt (Izotova et al., 1983) Halobacterium halobium
Serinpeptidase 4,0 n.b. n.b. 66 (Ryu et al.,
1994) Halobacterium salinarum n.b. 3,0-4,0 n.b. 8,0 n.b. (Norberg & von Hofsten, 1969) Haloferax mediterranei R4 Subtilisin-ähnliche Peptidase 3,0-4,3 n.b. n.b. 41 Gensequenz bekannt (Kamekura & Seno, 1993; Kamekura et al., 1996) Haloferax mediterranei VKM-B 1538 Subtilisin-ähnliche Peptidase 4,5 55 8,0-8,5 41 -Autoproteolyse des Enzyms nach Entsalzung -Gensequenz bekannt (Stepanov et al., 1992) Halogeometricum borinquense TSS101 Serinpeptidase 3,4 60 10,0 86 (Vidyasagar et al., 2006a) Natrialba asiatica
Subtilisin-ähnliche Peptidase 2,0 75-80 10,7 46 Gensequenz bekannt (Kamekura & Seno, 1990; Kamekura et al., 1992) Natrialba magadii
Subtilisin-ähnliche Peptidase 1,5 60 8,0-10,0 45 Gensequenz bekannt (Gimenez et al., 2000; Ruiz & De Castro, 2006)
Natrococcus occultus Serinpeptidase 1,0-2,0 60 7,0-9,0 130 (Studdert et
al., 2001) Bacteria Bacillus sp. 21-1 n.b. 0,5 n.b. 8,0 & 12,0 n.b. (Kamekura & Onishi, 1974) Bacillus sp. Vel Serinpeptidase 0,03 37 10,0-11,0 29 (Gupta et al.,
2005) Serinpeptidase 0,0-0,5 60 7,5 29 Bacillus subtilis FP-133 Metallo-peptidase 0,0-0,5 45 8,0 34 (Setyorini et al., 2006) Chromohalobacter sp. TVSP101 n.b. 4,5 80 8,0 n.b. (Vidyasagar et al., 2006b) Filobacillus sp. RF2-5 Serinpeptidase 1,7 60 10,0-11,0 49 (Hiraga et al.,
2005) Halobacillus sp. SR5-3 Serinpeptidase 4,2 50 10,0 43 (Namwong et al., 2006) Pseudoalteromonas ruthenica Metallo-peptidase 0,0-1,0 55 8,5 38 Gensequenz bekannt (Sánchez-Porro Álvarez, 2005; Sánchez-Porro et al., 2003b) Pseudomonas sp. A-14 n.b. 3,0 n.b. 8,0 120 (Duong Van Qua et al., 1981) Salinivibrio costicola unsichere
Zuordnung 0,34 60 8,0 38 (Lama et al., 2005) Salinivibrio sp. AF-2004 Metallo-peptidase 0,0-0,5 65 8,5 38 (Karbalaei-Heidari et al., 2006) n.b.= nicht bestimmt.
Das biotechnologische Potential der halophilen Enzyme liegt jedoch nicht explizit im Einsatz im hypersalinen Milieu, sondern in ihrer Fähigkeit unter Bedingungen mit geringer Wasseraktivität katalytisch aktiv zu sein (Rodriguez-Valera, 1992). Dabei ermöglicht die Eigenschaft der extrem halophilen Enzyme zur Bildung einer Solvatisierungs-Hülle (siehe 1.2.1) ihre Verwendung unter diesen extremen Bedingungen. Ryu et al. (1994) setzten erfolgreich eine sekretierte Serinpeptidase von Halobacterium halobium in 33% Dimethylformamid zur Synthese von glycin-haltigen Oligopeptiden ein. So ist die zukünftige Anwendung von halophilen Peptidasen als Biokatalysatoren in Flüssigkeiten mit hohen Konzentrationen an organischen Lösungsmitteln sehr Erfolg versprechend (Fukushima et al., 2005; Marhuenda-Egea & Bonete, 2002; Usami et al., 2005).
Während die extrem halophilen Enzyme aufgrund ihrer irreversiblen Inaktivierung unter salzarmen oder salzfreien Bedingungen (Adams et al., 1995) für ein breites Anwendungsspektrum ungeeignet erscheinen, bieten möglicherweise Enzyme aus moderat halophilen oder halotoleranten Bakterien wegen ihrer Aktivität innerhalb einer großen Spannbreite von Salzkonzentrationen ein hohes Potential (Sánchez-Porro et al., 2003a; Ventosa et al., 1998). Ein gesteigertes Interesse an verschiedenen Enzymen dieser Organismen für diverse biotechnologische Anwendungen konnte in letzter Zeit verzeichnet werden (u.a. Makowski et al., 2006; Redecke et al., 2006).
Zur industriellen Produktion bakterieller Peptidasen werden gewöhnlich verschiedene Flüssigkultivierungsverfahren (z.B. Fed-Batch oder Chemostat) der Peptidase-Produzenten in Fermentern genutzt (Gupta et al., 2002a). Um die Produktions-leistung zu steigern, wird in über 50% der Fälle auf genetisch manipulierte Mikro-organismen zurückgegriffen (Rao et al., 1998). Eine verbreitete Methode ist hierbei die Produktion von rekombinanten Enzymen durch eine heterologe Expression in bekannten mesophilen Laborstämmen, wie E. coli. Dieses Verfahren könnte für halophile Peptidasen neben der möglichen Produktionssteigerung weitere wirtschaftliche Vorteile bieten. So könnte u.a. auf die salzhaltigen Komplexmedien für die halophilen Organismen verzichtet werden, einhergehend mit dem Wegfall von kostenintensiven und stark korrosiven Medienbestandteilen. Eine erfolgreiche heterologe Expression von halophilen Peptidasen in mesophilen Wirtsstämmen ist aktuell jedoch nicht bekannt. Dagegen wurden andere halophile Enzyme schon
erfolgreich in E. coli exprimiert (Camacho et al., 2002; Diaz et al., 2006). So konnten Mijts & Patel (2002) eine -Amylase von Halothermothrix orenii in E. coli exprimieren. Ein viel versprechendes Einsatzgebiet für halophile Peptidasen stellen Kits für die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus tierischen, pflanzlichen und bakteriellen Zellen und Geweben dar. Der vollständige Zellaufschluss ist dabei ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche Extraktion der Nukleinsäuren. Der hierfür in vielen Kits eingesetzte enzymatische Aufschluss von Zellen und Geweben hat gegenüber mechanischen Aufschlussverfahren den Vorteil, dass es keiner speziellen technischen Ausstattung beim Anwender bedarf. Allerdings erfordert der Einsatz in den Kits besondere Voraussetzungen an die zu verwendenden Peptidasen. So sind zur Gewinnung von qualitativ hochwertigen Nukleinsäuren Bedingungen während des Zellaufschlusses notwendig, die nukleolytische Enzyme sofort inaktivieren. Eine bewährte Methode ist hierfür der Einsatz stark chaotroper Salze, wie Guanidin-hydrochlorid (GuHCl) und Guanidinisothiocyanat (GuSCN) in hohen Konzentrationen (Boom et al., 1990; Chirgwin et al., 1979; Chomczynski & Sacchi, 1987). Diese Salze verhindern durch Denaturierung der freigesetzten DNasen und RNasen eine Degradation der zu gewinnenden Nukleinsäuren. Zusätzlich zu den chaotropen Salzen werden Detergenzien wie SDS und Tween20 zur Unterstützung der Zelllyse eingesetzt. Überwiegend wird bislang in den Kits zur Nukleinsäurereinigung Proteinase K zum Zellaufschluss eingesetzt. Diese Serinpeptidase aus einem mesophilen Pilz (Tritirachium album) zeigt unter hohen Konzentrationen stark chaotroper Salze (GuHCl: < 3 M; GuSCN: < 0,8 M) und Detergenzien (SDS: Optimum 0,2-1%) eine erhöhte katalytische Aktivität (Hilz et al., 1975; QIAGEN, 1997). Eingehende Untersuchungen an anderen Peptidasen bezüglich ihrer Toleranz gegenüber chaotropen Bedingungen sind nicht bekannt.
Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist es von Interesse, dass weitere Peptidasen für den enzymatischen Aufschluss von Zellen und Geweben zur Verfügung stehen. Dabei sind die halophilen Peptidasen aufgrund ihrer zuvor beschriebenen Eigenschaften sehr viel versprechend, um unter den harschen Bedingungen im Lysepuffer proteolytische Aktivität zu zeigen. In dieser Arbeit sollten daher erstmalig sekretierte Peptidasen aus halophilen Bakterien auf ihre Toleranz gegenüber hochchaotropen Bedingungen untersucht werden. Die biochemische Charakterisierung der angereicherten proteolytischen Enzyme sollte Hinweise bezüglich ihres Einsatzes in Kits zur Nukleinsäurereinigung liefern. Des Weiteren
sollte die Klonierung und Identifizierung der Gene eine molekularbiologische Charakterisierung der halophilen Peptidasen ermöglichen. Zusätzlich sollte die rekombinante Produktion einer halophilen Peptidase anhand einer heterologen Expression in E . coli untersucht werden.
2
2
Material und Methoden
Material und Methoden
2.1
2.1 MikroorganismenMikroorganismen 2.1.1
2.1.1 Halotolerante und halophile BakterienstämmeHalotolerante und halophile Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit verwendeten halotoleranten und halophilen Bakterienstämme (Tab. 35 im Anhang) wurden aus Umweltproben isoliert und in einer über 1000 Stämme umfassenden Stammsammlung niedergelegt (Sinn-Meyer, 2003). Die Umweltproben wurden 1998 auf Lanzarote (Kanarische Inseln, Spanien) gesammelt. Die Probenstandorte waren zwei Salinen: Salinas de Janubio (SJ) und Salinas del Rio (SR) sowie ein küstennaher See: El Golfo (EG). Weitere Probennahmen fanden 1999 an den Salinen zwischen La Baule (B) und Guéronde (Bretagne, Frankreich) statt.
Ein Großteil der untersuchten Bakterien wurde bislang morphologisch und auf extra-zelluläre Enzyme untersucht (Sinn-Meyer, 2003). Eine systematische Einordnung erfolgte bisher an etwa ¼ der Stämme auf Basis einer „amplified ribosomal DNA-restiction analysis (ARDRA)-Untersuchung“ (Vogt, 2000) und in wenigen Fällen durch Bestimmung einer Teilsequenz des 16S rRNA-Gens (Neumann, 2005; Sinn-Meyer, 2003).
In dieser Arbeit wurde die Stammbezeichnung nach Sinn-Meyer (2003) verwendet, der zwecks Übersichtlichkeit ihre Nummerierung in Klammern als Suffix hinzugefügt wurde.
2.1.2
2.1.2 Klonier- & ExpressionsstämmeKlonier- & Expressionsstämme
Es wurden verschiedene Escherichia coli-Stämme für die Erstellung der Genbanken, Klonierungen und Expressionsstudien verwendet, die in Tab. 3 zusammengefasst sind.
Tab. 3: Verwendete Klonier- und Expressionsstämme, ihre Genotypen, Herkunft und Verwendung in dieser Arbeit.
Stamm Genotyp Referenz/Herkunft Verwendung
E. coli BL21 (DE3)
F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB
mB
-) (DE3)
(Studier & Moffatt, 1986)
Expressionsstudien E. coli C600 F- tonA21 thi-1 thr-1 leuB6 lacY1
glnV44 rfbC1 fhuA1
(Hanahan, 1983) Expressionsstudien E. coli DH5 F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1
gyrA96 deoR nupG 80d lacZM15 (lacZYA-argF) U169, hsdR17(rK -mK + ) (Hanahan, 1985) Klonierung, Expressionsstudien
E. coli Epi300 F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK - rpsL nupG trfA
Epicentre Fosmid-Klonierung, Expressionsstudien E. coli HB101 F- mcrB mrr hsdS20(rB mB -) recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1 rpsL20(SmR) glnV44
(Boyer & Roulland-Dussoix, 1969)
Expressionsstudien
E. coli LMG194
F´lacX74 galE thi rpsL phoA (Pvu II) ara714 leu::Tn10.
(Guzman et al., 1995)
Expressionsstudien E. coli O17 F- (Kauffmann, 1944) Expressionsstudien E. coli SF8 C600 thr-, leu-, thi-, r-, m-, recB-, recC
-, lop-11-, lig+
(Bachmann, 1972) Expressionsstudien E. coli Top10 F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)
80lacZM15 lacX74 deoR nupG recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1
-Invitrogen Klonierung, Expressionsstudien
E. coli XL1-blue
F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq (lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)endA1 gyrA96(NalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44
Stratagene Expressionsstudien
2.1.3
2.1.3 Sonstige StämmeSonstige Stämme
Des Weiteren standen für diese Studie noch verschiedene andere Bakterienstämme zur Verfügung (Tab. 4).
Tab. 4: Weitere verwendete Bakterienstämme und ihre Verwendung in dieser Arbeit.
Stamm Referenz/Herkunft Verwendung
Bacillus subtilis Marburg 168 (Burkholder & Giles, 1947) / DSMZ Sondendesign Geobacillus stearothermophilus
DSM# 2313
(Nazina et al., 2001) / DSMZ Sondendesign Thermus aquaticus YT-1 (Brock & Freeze, 1969) / DSMZ Sondendesign
2.2
2.2 PlasmidePlasmide
In dieser Arbeit wurden für die Erstellung von Genbanken, zur Klonierung von Genen und Sequenzabschnitten und für die Expression verschiedene Plasmide (siehe Tab. 5) verwendet.
Tab. 5: Verwendete Plasmide, ihre Herkunft und Verwendung. Plasmid Mr [kbp] Relevante
Charaktere Verwendung Referenz
pUC13 2,7 Apr, lacZD Klonierung (Vieira & Messing, 1987)
pNOFMCS 7 Apr, Ptac, endA* Subklonierung MOLZYM, Bremen pBAD/gIII A 4,1 Apr, PBAD, gIII ss,
6xHis-tag, rrnB, araC
Expressionsstudien Invitrogen
pBAD/gIII B 4,1 Apr, PBAD, gIII ss, 6xHis-tag, rrnB, araC
Expressionsstudien Invitrogen
pASK-IBA44 3,3 Apr, Ptet, OmpA ss; Strep-tag, 6xHis-tag, Rtet
Expressionsstudien IBA, Göttingen
pJF118EH 5,3 Apr, Ptac Expressionsstudien (Fürste et al., 1986) pCC1FOS
(Fosmid)
8,1 Cmr, ori, oriV Erstellen von Genbanken, Expressionsstudien
Epicentre
pJF-subE ca. 6,4 Apr, aprE Expression Subtilisin E
diese Arbeit pASK-subE ca. 4,4 Apr, aprE Expression
Subtilisin E
diese Arbeit pBAD-subE ca. 5,2 Apr, aprE Expression
Subtilisin E
diese Arbeit
pBAD-Calmodulin 4,6 Apr, Kontrolle
Expressionsstudien
Invitrogen pJF-proAS(#748) ca. 6,8 Apr, proAS(#748) Expression
ProAS(#748)
diese Arbeit pASK-
proAS(#748)
ca. 4,8 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748)
diese Arbeit
pASK-proAS-ol(#748)
ca. 4,8 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748) ohne WT-Signalpeptid
diese Arbeit
pBAD- proAS(#748)
ca. 5,6 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748)
diese Arbeit
pBAD-proAS-ol(#748)
ca. 5,6 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748) ohne WT-Signalpeptid
diese Arbeit
Abkürzungen: Apr= Ampicillin-Resistenz; Cmr= Chloramphenicol-Resistenz; endA*= modifiziertes endA-Gen ohne Leader-peptid-Sequenz für den Transport ins Periplasma; Ptac= IPTG-induzierbarer tac-Promotor; Ptet= Tetracyclin-Promotor; Rtet= Tetracyclin-Repressor; PBAD= araBAD Promotor; gIII ss= Gene III Sekretionssignalgen; 6xHis-tag= C-terminales Polyhistidin;
rrnB= Transkription Terminatorregion; OmpA ss= OmpA Sekretionssignalgen; ori=single-copy F-Faktor; oriV= induzierbarer multi-copy Replikationsursprung; aprE=Subtilisin E-Gen; proAS(#748)= Peptidasegen des Stammes B12/10-1 (#748). 2.3
2.3 Synthetische Oligonukleotide (Primer)Synthetische Oligonukleotide (Primer)
Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma biomers.net GmbH (Ulm) synthetisiert und dienten als Primer in PCR-Reaktionen wie beschrieben.
Tab. 6: Eingesetzte synthetische Oligonukleotide. Bezeichnung Sequenz (5’-3’) Target Anwendung + Annealing-temperatur Referenz DG74r AGGAGGTGATC CAACCGCA
16s rDNA A, S 46°C (Greisen et al.,
1994) R1n GCTCAGATTGAA
CGCTGGCG
16s rDNA A, S 46°C (Tichy & Simon,
1994) U2 ACATTTCACAAC
ACGAGCTG
16s rDNA A, S 46°C (Tichy & Simon,
1994)
970r CCACATGCTCCA
CCGCTTG
16s rDNA A, S 46°C Disqué, pers.
Mitteilung SubSrev GYSGCCATCGA WGTACC* Serinpeptidasen A, P Gradient: 49-66°C diese Arbeit SubHfor GACTGTAAYGG YCAYGG* Serinpeptidasen A, P, S Gradient: 49-66°C diese Arbeit SubDfor TATGTTATYGAT ACBGG* Serinpeptidasen A, P Gradient: 49-66°C diese Arbeit subtilisin_for AAYGGNCAYGG NACNCAY* Serinpeptidasen A, P Gradient: 49-66°C (Jang et al., 2002) subtilisin_rev YGGYGTYGCCA T NGANGT* Serinpeptidasen A, P Gradient: 49-66°C (Jang et al., 2002) SubHraus301 AGCTTCTCAAAC TGGGGCAGC Serinpeptidasen S Gradient: 49-66°C diese Arbeit SubHraus96 TAGCGTTTGCTG CTGAGAG Serinpeptidasen S Gradient: 49-66°C diese Arbeit SubHraus61 CCCCGCCAATC ACGCCGGACG Serinpeptidasen S Gradient: 49-66°C diese Arbeit pASK_subE_ leadfor ATGGTAGGTCTC AGCGCCATGAG AAGCAAAAAATT GTGGATCAG
aprE (Subtilisin E) K: pASK-subE 60°C diese Arbeit
pASK_subE_rev ATGGTAGGTCTC AGGCCTTGTGC AGCTGCTTGTAC GTTGA
aprE (Subtilisin E) K: pASK-subE 60°C diese Arbeit
sube_for GAATTCATGAGA
AGCAAAAAATTG TGG
aprE (Subtilisin E) K: pJF-subE 60°C diese Arbeit
sube_rev GTCGACTTATTG
TGCAGCTGCTT GT
aprE (Subtilisin E) K: pJF-subE 60°C diese Arbeit
sroga_for ATAGCGCTAGC ATGAGAAGCAAA AAATTGTGG
aprE (Subtilisin E) K: pBAD-subE 53°C (Sroga & Dordick, 2002) sroga_rev TTGTTCTAGAAT
TCCTTGTGCAGC TGCTTGTACG
apr E (Subtilisin E) K: pBAD-subE 53°C (Sroga & Dordick, 2002) pASK13_1 leadfor ATGGTAGGTCTC AGCGCCATGTTA AAGCATGCTCTT AGCTGTT
aprE (Subtilisin E) K: pASK-slp(#748) 60°C diese Arbeit pASK13_1rev ATGGTAGGTCTC AGGCCGTAACG GGCGGTCACGC TGAC
aprE (Subtilisin E) K: pASK-proAS(#748) 60°C diese Arbeit Bad13_1for AAACCATGGAAC AACATGAAGGTA AACAAGG proAS(#748) K: pBAD-proAS-ol(#748) 60°C diese Arbeit Bad13_1leadfor AAAACCATGGAA ATGTTAAAGCAT GCTCTTAGC proAS(#748) K: pBAD-proAS(#748) 60°C diese Arbeit Bad13_1rev AAAGAATTCAGT AACGGGCGGTC ACGC proAS(#748) K: pBAD-proAS(#748) & pBAD-proAS-ol(#748) 60°C diese Arbeit +
Anwendungs-Kürzel: A= PCR-Amplifikation, S= Sequenzierung; K= Klonierung. *Basencode für sog. „Wobbles“ (Nukleotid-gemische in degenerierten Primern): Y= C+T; S= C+G; W= A+T; B= C+G+T; N= A+C+G+T. Gelbe Markierung: Erkennungs-stelle für eingefügte RestriktionsschnittErkennungs-stellen.
2.4
2.4 Medien, Lösungen & PufferMedien, Lösungen & Puffer
Alle Nährmedien wurden nach Lösen der Bestandteile in A. dest. und dem Einstellen des gewünschten pH-Werts mit NaOH oder HCl autoklaviert (20 min, 121°C). Feste Medien wurden durch die Zugabe von 1,5% (w/v) Agar-agar (Merck) in die Medien-zusammensetzung vor dem Autoklavieren hergestellt. Hitzesensible Bestandteile, wie etwa Antibiotika und Vitamine, wurden sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren hinzugefügt.
2.4.1
2.4.1 Luria-Bertani (LB) Medium (Sambrook & Russell, 2001)Luria-Bertani (LB) Medium (Sambrook & Russell, 2001)
LB-Medium: Pepton (Difco) 10 g/l
Hefeextrakt (Difco) 5 g/l
Speisesalz 10 g/l
pH: 7,5
2.4.2
2.4.2 Salinenmedium-Lanzarote (SML) (Sinn-Meyer, 2003)Salinenmedium-Lanzarote (SML) (Sinn-Meyer, 2003) SML 12/8 (12% NaCl, pH8): Casamino Acids (Difco) 7,5 g/l
Hefeextrakt (Difco) 10 g/l
Speisesalz 120 g/l
pH: 8
Zugabe nach Autoklavieren (aus sterilen Stammlösungen):
Tri-Natrium-Citrat 11,6 mM Magnesiumsulfat 0,13 mM Calciumchlorid 0,05 mM Kaliumchlorid 28 mM FeCl2 0,18 mM Na2HPO4 10 mM
Für entsprechende Experimente konnte der jeweilige Salzgehalt und pH-Wert des SML-Mediums variieren (NaCl: 1%, 2%, 6%, 10%,12%, 20%; pH-Wert: 8; 9,5).
2.4.3
2.4.3 M9 Minimal Medium (Sambrook & Russell, 2001)M9 Minimal Medium (Sambrook & Russell, 2001)
Die getrennt autoklavierten Bestandteile wurden steril zum M9-Medium zusammen-gefügt. Zur Anzucht von Vitamin-defizienten E. coli-Stämmen wurden entsprechende Vitamine (siehe Tab. 8) aus sterilfiltrierten Lösungen hinzugefügt.
Bestandteile M9-Medium (1l): A. dest. 776 ml
5x M9 Salzlsg. 200 ml
1 M MgSO4 2 ml
20% Glucose-Lsg. 20 ml
2.4.4
2.4.4 M9-Salzlösung (5x) (Sambrook & Russell, 2001)M9-Salzlösung (5x) (Sambrook & Russell, 2001) Bestandteile M9-Salzlösung (5x): Na2HPO4*7H2O 64 g/l
KH2PO4 15 g/l
NaCl 2,5 g/l
NH4Cl 5 g/l
2.4.5
2.4.5 RM-Medium (Sambrook & Russell, 2001)RM-Medium (Sambrook & Russell, 2001)
Bestandteile RM-Medium (1l): A. dest. 776 ml 5x M9 Salzlsg. 200 ml 20% Casamino Acids 100 ml 20% Glucose-Lsg. 10 ml 1 M MgCl2 1 ml 2.4.6
2.4.6 Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer PeptidasenFeste Medien für den Nachweis extrazellulärer Peptidasen
Als Grundlage für die Peptidase-Plattentests wurden je nach verwendetem Stamm und Versuch die festen Medien aus 2.4.1; 2.4.2 und 2.4.3 verwendet und die Substrate aus Tab. 7 hinzugefügt.
Tab. 7: Peptidase-Plattentests, ihre Substrate und Zusammensetzung. Plattentest Substrat Menge
[g/l] modifiziert nach Bemerkungen
Skimmilk-Agar Magermilch-pulver (Sucofin) 20 (DeShazer et al., 1999)
Dem Medium wurde nach Autoklavieren 2% Magermilch aus einer 20% Mager-milch-Stammlösung unter Rühren hin-zugegeben und die Platten sofort gegossen. Schnelles Abkühlen verhindert die Ausflockung der Magermilch. Gelatine-Hydrolyse Gelatine (Merck) 10 (Klemme & Pfleiderer, 1977)
Die Gelatine wurde vor dem Autoklavieren zugegeben.
Casein-Agar
Casein (Carl Roth)
10 (Cowan & Daniel, 1982)
Das Casein wurde vor dem Auto-klavieren dem Medium zugegeben. 2.4.6.11 Skimmilk-Agarose für den Peptidasenachweis in PA-Gelen elen
2.4.6. Skimmilk-Agarose für den Peptidasenachweis in PA-G
Zum Nachweis von Peptidase-Aktivität in Polyacrylamidgelen wurden dünne Skimmilk-Agaroseplatten in Petrischalen gegossen. Agarose (2%) wurde in Aktivitätspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 9, 50 mM NaCl) durch Kochen gelöst und beim Abkühlen unter Rühren mit 0,5-1% Magermilchlösung versetzt. Um eine Ausflockung der Magermilch zu vermeiden, wurden die Platten sofort nach dem Gießen gekühlt.
2.4.7
2.4.7 Antibiotika und Medien-ZusätzeAntibiotika und Medien-Zusätze
Zur Kultivierung von Trägern resistenzvermittelnder Plasmide wurden entsprechende Antibiotika dem Medium, wie in Tab. 8 aufgeführt, zugegeben. Die sterilfiltrierten
Stammlösungen wurden dem Medium nach dem Autoklavieren bei etwa 55°C hinzu-gefügt. Ebenso wurde mit den Medienzusätzen zur Induktion von plasmidlokalisierten Promotoren (Tab. 8) verfahren.
Tab. 8: Antibiotika und andere Medien-Zusätze.
Substanz Stammlösung Endkonzentration Antibiotika: Chloramphenicol 12,5 mg/ml 12,5 μg/ml Ampicillin 120 mg/ml 120 μg/ml Induktoren: L-Arabinose 20% bzw. 133 mM 1,3-33 mM IPTG 1 M 1 mM Anhydrotetracyclin* 400 μg/ml 0,05-0,2 μg/ml Vitamine: Thiamin 100 mg/ml 0,1 mg/ml
*Anhydrotetracyclin wurde in dieser Arbeit als Induktor für den Expressionsvektor pASK-IBA44 verwendet und besitzt eine wesentlich schwächere antibiotische Wirkung als Tetracyclin (Degenkolb et al., 1991).
2.4.8
2.4.8 Puffer und LösungenPuffer und Lösungen
- Denaturierungslösung (Kolonieblot): 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl
- FA-Elektrophoresepuffer (1x): 20 mM MOPS (free acid); 5 mM Na-Acetat; 1 mM EDTA; 0,74% Formaldehyd; pH 7,0
- Hybridisierungslösung: 1μl DIG-markierte Sonde pro 1 ml Prähybridisierungslösung
- Magermilch (20%): 20% (w/v) Magermilchpulver (Sucofin) wurde in A. dest. vollständig gelöst und kurz autoklaviert (max. 7 min, 121°C). Lagerung: 4°C. - Neutralisierungslösung (Kolonieblot): 1 M Tris-HCl pH7,5; 1,5 M NaCl - Osmotic Shock-Lösung 1 (OS1): 20 mM Tris-HCl, pH 8; 2,5 mM EDTA;
20% Saccharose
- Osmotic Shock-Lösung 2 (OS2): 20 mM Tris-HCl, pH 8; 2,5 mM EDTA - PA-Gel-Waschpuffer: 0,1% Tween 20, 30 mM Tris-HCl pH 9
- Peptidase-Reaktionspuffer (1x): 30 mM Tris-HCl, pH 9; 5mM NaCl
- Prähybridisierungslösung: 5x SSC; 0,1% N-Laurolylsarkosin; 0,2% SDS; 2% Blocking Reagenz (Roche); 50% deionisiertes Formamid
- SDS-Probenpuffer, 4x (PAGE): 252 mM Tris-HCl, pH 6,8, 40% Glycerin, 8% SDS, 0,01% Bromphenolblau
- SSC (20x): 174 g/ l NaCl; 88,2 g/l Tri-Natrium-Citrat; pH 7
- Tris-Glycin-Puffer, 10x (PAGE): 0,25 M Tris-Base (Sigma), 1,92 M Glycin, 1% SDS
2.4.9
2.4.9 ChemikalienChemikalien
Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders vermerkt, von den Firmen Merck, Sigma, Fluka und Carl Roth (Deutschland) in p.a.-Qualität bezogen.
2.5
2.5 Mikrobiologische MethodenMikrobiologische Methoden 2.5.1
2.5.1 Anzucht der halophilen IsolateAnzucht der halophilen Isolate
Die für diese Arbeit ausgewählten Stämme (Tab. 35) wurden der bei -80°C hinter-legten Stammsammlung entnommen. Die Reaktivierung der Stämme erfolgte auf SML-Agarplatten bei den entsprechenden Isolationsbedingungen der jeweiligen Stämme bei 30°C im Brutschrank. Zur Kultivierung in Flüssigkultur wurden die Stämme 1:10 aus ÜNK angeimpft und, wenn nicht anders angegeben, bei 30°C und 200 rpm in max. ¼ gefüllten Erlenmeyerkolben in Schüttelinkubatoren inkubiert.
2.5.2
2.5.2 Anzucht der Klonier- und ExpressionsstämmeAnzucht der Klonier- und Expressionsstämme
Die E. coli-Stämme (Tab. 3) wurden auf LB-Medium ausgestrichen und bei 37°C im Brutschrank (Heraeus) über Nacht inkubiert. Flüssigkulturen wurden in LB-Medium mit einer Einzelkolonie angeimpft und bei 37°C mit 140-200 rpm im Schüttelinkubator inkubiert. Wenn Stämme als Träger für resistenzvermittelnde Plasmide verwendet wurden, enthielt das Medium das entsprechende Antibiotikum (Tab. 8).
2.6
2.6 Proteinbiochemische MethodenProteinbiochemische Methoden 2.6.1
2.6.1 Gewinnung von zellfreien KulturüberständenGewinnung von zellfreien Kulturüberständen
Zur Gewinnung zellfreier enzymhaltiger Kulturüberstände wurden die Bakterienzellen mittels Zentrifugation (Volumen <2ml: 1 min, 11.000 x g; >2ml: 30 min, 6000 x g) abgetrennt und der Überstand sterilfiltriert (Porendurchmesser: 0,45 μm). Alle Proben wurden bei +4°C gelagert.
2.6.2
2.6.2 Protein-Fällung der KulturüberständeProtein-Fällung der Kulturüberstände
Die Fällung der Proteine in den Kulturüberständen (mit 12% NaCl-Gehalt) erfolgte mit Ammoniumsulfat bzw. Ethanol (Coligan et al., 1998). Die Zugabe der Fällmittel wurde sehr langsam unter Rühren mit anschließender Inkubation über Nacht auf Eis
durch-geführt. Ammoniumsulfat wurde bis zur Sättigung (ca. 490 g/l) und Ethanol zu 85% (v/v) den salzhaltigen Kulturüberständen zugegeben. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation (20.000 x g, 30 min, 4°C) abgetrennt und anschließend in Tris-HCl-Puffer (30 mM, pH 9) aufgenommen.
Eine anschließende Dialyse gegen das 50-fache Volumen Tris-HCl-Puffer (30 mM, pH 9) in Dialyseschläuchen (Servapor, Serva; Ausschlussgrenze ca. 14 kDa) bei 4°C entfernte noch vorhandene Salze.
2.6.3
2.6.3 Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500
Eine Aufkonzentrierung der Kulturüberstände erfolgte mittels Dialyse gegen 5 l 30-40% Polyethylenglykol 3500 in 30 mM Tris-HCl, pH 9 in Dialyseschläuchen (Servapor, Serva; Ausschlußgrenze ca. 14 kDa). Die Dialyse wurde bis zur gewünschten Einengung der Proben auf Eis unter Rühren durchgeführt. Das PEG 3500 konnte mehrfach verwendet werden. Eine anschließende Dialyse der Probe gegen das 50-fache Volumen Tris-HCl-Puffer (30 mM, pH 9) entfernte noch vorhandene Salze.
2.6.4
2.6.4 Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninic Acid)-MethodeProteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninic Acid)-Methode
Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem BCA-Assay-Kit QuantiPro (Sigma) nach Anweisung. Für den Nachweis wurden 50 μl Probe mit 50 μl BCA-Lösung gemischt und 1 h bei 60°C inkubiert. Die anschließende Absorptionsmessung und Bestimmung des Proteingehaltes wurde mit einem BioPhotometer (Eppendorf) bei 562 nm durch-geführt. Die Konzentrationsberechnung erfolgte anhand einer zuvor erfassten Kalibration mit einer BSA-Verdünnungsreihe (5, 10, 20, 30 und 50 μg/ml). Die Bestimmung des Proteingehaltes erfolgte für jede Probe über eine Dreifachmessung. Inhibitorische Effekte bei der Bestimmung des Proteingehaltes durch den hohen Salzgehalt im SML-Medium wurden mittels TCA-Fällung der Proteine (QuantiPro BCA-Assay-Kit) und anschließender Lösung in A. dest. beseitigt.
2.6.5
2.6.5 Heterologe Proteinexpression inHeterologe Proteinexpression in E. coliE. coli
Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen E. coli-Stämmen (siehe Tab. 3) untersucht. Dabei wurden alle Expressionsexperimente mit Kulturen von frisch transformierten Zellen, bzw. mit deren bei -80°C hinterlegten Zellen durch-geführt. Die Kulturen wurden, wenn nicht anders erwähnt, aus ÜNK 1:10 in 20 ml LB, M9 oder RM mit den entsprechenden Antibiotika (Tab. 8) in 100 ml
Erlenmeyer-kolben inokuliert und bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Die Induktion mit den jeweiligen Substanzen und eine eventuelle Senkung der Inkubationstemperatur erfolgten bei einer OD600nm von 0,5.
2.6.6
2.6.6 Zellernte und ZellaufschlussZellernte und Zellaufschluss
Die Expressionsstudien machten es erforderlich neben der zellfreien Kultur die cyto-plasmatische und pericyto-plasmatische Fraktion der E. coli-Zellen nach heterolog exprimierten Peptidasen zu untersuchen. Nach Bestimmung der OD600nm wird die extrazelluläre Fraktion durch Abtrennen der Überstände nach Zentrifugation von 1-5 ml Kultur (1 min, 11.0000 x g) im ERG separiert. Zur Gewinnung der peri-plasmatischen Fraktion wird mit dem verbliebenen Zellpellet eine osmotische Schockprozedur durchgeführt. Das Zellpellet wird dazu mit OS1-Lösung (siehe 2.4.8) resuspendiert. Das Volumen der eingesetzten Puffer wird rechnerisch bestimmt, so dass die Lösung einer OD600nm von 5,0 entspricht.
Der Ansatz wird 10 min auf Eis inkubiert und danach für 1 min (11.000 x g; 4°C) zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird mit der zuvor ermittelten Menge an OS2-Lösung (siehe 2.4.8) resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Der Überstand nach einer weiteren Zentrifugation (10 min, 11.000 x g; 4°C) wird als periplasmatische Fraktion in ein ERG überführt. Für die cytoplasmatische Fraktion wird das verbliebene Zellpellet mit 5μl Lysozym (100mg/ml) in entsprechender Menge (s.o.) RS-Puffer (MOLZYM) bei 37°C für 30 min lysiert.
Die Aktivitätsbestimmung der Zell-Fraktionen erfolgte im Fluoreszenzassay (2.6.11.2) unter Standardbedingungen.
2.6.7
2.6.7 SäulenchromatografieSäulenchromatografie
Bei den vorgenommenen Säulenchromatografien wurde eine FPLC (Äkta FPLC, Amersham Biosciences) mit angeschlossenem Fraktionssammler (Frac 950, Amersham Biosciences) eingesetzt. Alle Arbeitsschritte fanden bei RT statt.
2.6.7.1
2.6.7.1 AnionenaustauschchromatografieAnionenaustauschchromatografie
Eine Anreicherung des Enzyms aus zellfreier Kultur wurde mittels Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) geprüft. Die 14 ml Säule wurde mit 10-fachem Säulenvolumen 50 mM Tis-HCl, pH 8 äquilibriert. Als Probe diente 400 ml zellfreie Kultur, der zuvor gegen 50x Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 8 dialysiert wurde. Der Auftrag auf die Säule erfolgte mit 1-2 ml/min und anschließender Wäsche mit 10x
Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl, pH 8. Die Elution erfolgte über einen KCl-Gradienten (Start: 50 mM Tris-HCl, pH 8, bis 1 M KCl in demselben Puffer) mit einer Flussrate von 2 ml/min über 180 min (6,5 Säulenvolumen). Das Volumen der einzelnen Fraktionen betrug 2 ml.
2.6.7.2
2.6.7.2 Hydrophobe InteraktionschromatografieHydrophobe Interaktionschromatografie
Die Anreicherung von Peptidasen aus Kulturüberständen sollte mittels Phenyl-sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) geprüft werden. Die 25 ml Säule wurde mit dem 10-fachen Säulenvolumen 1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 8, äquilibriert. Die zellfreie salzhaltige Kultur wurde vor dem Auftragen mit 1 M Ammoniumsulfat versetzt und mit NaOH auf pH 8 eingestellt. Der Probenauftrag auf die Säule erfolgte mit einer Flussrate von 1-1,5 ml/min. Die Säule wurde anschließend mit dem 15-20-fachen Säulenvolumen mit 1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 8 (Flussrate: 2 ml/min) gewaschen. Die Elution erfolgte über einen Ammoniumsulfat-Gradienten (Start: 1 M in 50 mM Tris-HCl, pH 8; Ende: Puffer ohne Ammoniumsulfat) mit einer Flussrate von 1-2 ml/min über 120 bzw. 180 min. Nach Erreichen des Gradienten-Endes wurden noch weitere 50-100 min mit Puffer gewaschen. Das Volumen der einzelnen Fraktionen betrug 2 ml. Zur Regeneration der Säule wurde die bräunlich verfärbte Matrix mit 10x Säulenvolumen 1 M NaOH und anschließender Wäsche mit 20 x Säulenvolumen A. dest. gewaschen.
Zur Messung der Peptidase-Aktivität in den Fraktionen wurden die Proben zuvor gegen 30 mM Tris, pH 9 dialysiert.
2.6.7.3
2.6.7.3 GelfiltrationschromatografieGelfiltrationschromatografie
Zur Auftrennung der enzymhaltigen Fraktionen aus der hydrophoben Interaktions-chromatografie standen zwei verschieden große Gelfiltrationssäulen zur Verfügung. Die Fraktionspools wurden vor dem Auftrag mittels Dialyse gegen PEG (siehe 2.6.3) 20x-40x aufkonzentriert. Die beiden Superdex 200 HiLoad (Amersham Biosciences) Säulen (30 cm mit V0=8,06 ml bzw. 60 cm mit V0= 44,4 ml) wurden mit 50 mM Tris-HCl, pH 8, äquilibriert. Das Auftragen von 50-250 μl Probe und die Elution mit Äquilibrierungspuffer erfolgten mit einer Fließrate von 0,2 ml/min. Die Fraktionsgröße betrug 0,5-1 ml. Die Peptidase-Aktivität der Fraktionen wurde mit dem Fluoreszenz-assay (2.6.11.2) bestimmt.
