4 4 Diskussion Diskussion
4.2.2 Typ B: Serinpeptidase Typ B: Serinpeptidase .1
4.2.2.2 Molekularbiologische Charakteristika Molekularbiologische Charakteristika
Eine Identifizierung der Gene der sekretierten Peptidasen aus den Salinivibrio-Stämmen erfolgte in dieser Arbeit anhand von Genbanken in E. coli. Ein Screening dieser Genbanken nach Peptidase produzierenden Klonen auf Plattenassays misslang. Trotz sensitiver Assays und Verfahren zur Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Proteinen konnten keine Klone mit proteolytischer Aktivität gefunden werden. Die vermutlichen Ursachen hierfür werden in Abschnitt 4.3 diskutiert.
Deshalb wurde das Screening nach Peptidasegenen in den Genbanken durch Kolonie-Hybridisierung mit Sonden durchgeführt, deren Sequenz homolog zu bekannten Peptidasegenen war. Eine Einschränkung der Suche auf Subtilisin-ähnliche Peptidasen in diesem Verfahren hatte folgende Gründe: So wurden bisher alle molekularbiologisch charakterisierten halophilen Serinpeptidasen, denen die Peptidase B ebenfalls zugeordnet werden konnte, als Mitglieder der Familie der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen erkannt (siehe Tab. 2). Zudem scheinen die Subtilisin-ähnlichen Peptidasen durch ihr breites Substratspektrum und ihren Einsatz in vielen biotechnologischen Prozessen (Siezen, 1996) als sehr geeignet in Bezug auf die Zielsetzung. Die Proteinase K findet als Vertreter dieser Familie schon Anwendung in Kits für die Nukleinsäureaufreinigung. Weiterhin sind sehr viele Enzyme dieser Familie gut charakterisiert und einige schon rekombinant hergestellt worden. Dagegen liegen für die Metallopeptidasen, die hier durch die Peptidase A vertreten werden, vergleichsweise wenige Sequenzinformationen vor. Erst eine Primärstruktur von halophilen Metallopeptidasen wurde bislang publiziert (Sánchez-Porro Álvarez, 2005). Ein Sondendesign für das Auffinden der Peptidase A aus der Familie der Metallopeptidasen erschien daher wenig aussichtsreich.
Anhand eines Sequenz-Alignments von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen verschiedener Mikroorganismen (Bakterien und Pilze) konnten degenerierte Primer entwickelt werden, die homolog zu drei konservierten Regionen der katalytischen Triade dieser Peptidase-Familie waren. Mit Hilfe dieser Primer und chromosomaler
DNA des Salinivibrio-Stammes B12/16 (#795) wurde eine Sonde für das Screening nach Subtilisin-ähnlichen Peptidasen synthetisiert. Die Hybridisierung der Sonde mit Fosmid-Genbanken der Salinivibrio-Stämme in E. coli erbrachte mehrere hybridisierungspositive Klone. Die Subklonierung und anschließende Sequenzierung von hybridisierungspositiven Fosmidklonen führte zur Identifizierung eines Peptidasegens. Das hier als proAS bezeichnete Peptidasegen kodiert für ein etwa 55 kDa großes hypothetisches Präprotein aus der Familie der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen (Abschnitt 3.3.3). Aufgrund einer Übereinstimmung des Molekular-gewichtes und der Zugehörigkeit zu den Serinpeptidasen der ermittelten Sequenz sowie der biochemischen Eigenschaften der rekombinanten ProAS-Peptidase (siehe Abschnitt 3.4.3 und 4.3), kann eine Identität der ProAS mit der chromatografisch definierten Peptidase B geschlussfolgert werden.
Mit nur 65% Identität zur nächst verwandten Peptidase ProA aus Vibrio alginolyticus bestehen deutliche Unterschiede im Vergleich der Aminosäuresequenz von ProAS zu bekannten Peptidasen (Abschnitt 3.3.3).
Die Sequenzen der ProAS-Peptidase unterscheiden sich in den 9 untersuchten Stämmen nur geringfügig (94% Übereinstimmung auf Aminosäureebene; Abb. 17, Abschnitt 3.3.3). Ausgehend von der Analyse der proAS-Teilsequenzabschnitte (400 bp) bildeten sich jedoch spezifische Unterschiede heraus, so dass eine Einteilung der ProAS-Peptidasen zu 3 nahe verwandten Gruppen erfolgen konnte. Diese Gruppierung korreliert mit der systematischen Einordnung der Stämme aufgrund der 16S-rRNA-Analyse (siehe Abb. 32). So konnten die ProAS-Peptidasen der Gruppe I in Stämmen der Salinivibrio aegyptiaca-Verwandtschaft nachgewiesen werden. Die Identität der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/12 (#140) und SJ6S/14 (#148) auf Basis der 16s rRNA-Sequenzen ließ sich auch auf Ebene der Peptidasegene proAS wieder finden. Der eigenständige Stamm B3/1-2 (#418) nimmt auch auf Ebene der Peptidasegene eine Abseitsstellung ein, während die Peptidasegruppe III mit den Stämmen aus der Verwandtschaft mit S. costicola übereinstimmt. Somit kann hier die phylogenetische Einordnung der Stämme aufgrund ihrer 16S-rRNA–Sequenzen auch auf Basis der proAS-Gene wieder gefunden werden.
16S-rDNA (Teilsequenz: 590 bp):
0 1.0
SJ5Ü/12 (#140) SJ6S/14 (#148) SJ2/3-1 (#073) SJ5Ü/8 (#098)
Salinivibrio aegyptiaca sharmensis B3/1-2 (#418)
B8/26-2 (#504) B12/10-1 (#748)
Salinivibrio costicola alcaliphilus
Nukleotid-Austausch (x100)
proAS (Teilsequenz: 400 bp):
Nukleotid-Austausch (x100)
0 2
4 6
8 10 12
14 16
18
proAS(#098) proAS(#430) proAS(#140) proAS(#148) proAS(#073) proAS(#418) proAS(#79 proAS(#745)
8) proAS(#504)
proA (V.alginolyticus)
Gruppe I Gruppe II Gruppe III
Abb. 32: Gegenüberstellung der phylogenetischen Stammbäume auf Basis der 16S-rDNA- und proAS-Teilsequenzen. Die Länge der Verzweigungen repräsentiert die Divergenz zwischen zwei Sequenzen, die Zahlen bezeichnen die Anzahl der Substitutionsereignisse.
Folgt man einer weiteren Untergliederung der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen von Siezen & Leunissen (1997), kann die ProAS-Peptidase aufgrund homologer Sequenzabschnitte der katalytischen Domänen der Proteinase K-Familie zugeordnet werden (Abb. 40 im Anhang, Bereiche im Alignment gelb markiert). Diese Familie beinhaltet, neben vielen Subtilisin-ähnlichen Peptidasen aus Pilzen, einige Peptidasen aus gram-negativen Bakterien, so auch das Aqualysin I aus Thermus aquaticus und ProA aus Vibrio alginolyticus. Von einigen Mitgliedern dieser Familie ist bekannt, dass sie als Präproenzyme synthetisiert werden, wobei beim Aqualysin I neben dem N-terminalen auch ein C-terminales Propeptid vorhanden ist (Larsen et al., 2006). Während das Präpeptid als Signalpeptid nach dem Transport ins Periplasma abgespalten wird, fungiert das N-terminale Propeptid möglicherweise als Chaperon für die Faltung der Peptidase zum aktiven Enzym (Lee et al., 1992). Es gibt viele Hinweise, dass die Abspaltung des Propeptids und Faltung zum aktiven Enzym autoproteolytisch erfolgt. Das C-terminale Propeptid und seine Abspaltung wird dagegen mit dem Transport des Aqualysins über die äußere Membran von Thermus aquaticus in Zusammenhang gebracht (Lee et al., 1994; Lee et al., 1996).
Allerdings ist auch zumindest eine Subtilisin-ähnliche Peptidase charakterisiert
worden, bei der keine Abspaltung von Prosequenzen erfolgt (Kannan et al., 2001).
Im Alignment mit der Proteinase K und Aqualysin I konnten für die ProAS-Peptidase keine Hinweise auf homologe Propeptid-Sequenzen gefunden werden (siehe Abb. 40 im Anhang). Während die vermutliche katalytische Peptidase-Domäne von ProAS ca.
60% Homologie zu Aqualysin I und Proteinase K aufweist, besteht im Bereich der Prosequenzen nur etwa 20% Übereinstimmung. Eine Abspaltung größerer Propeptide von 10-20 kDa, wie es von den zuvor genannten Peptidasen bekannt ist, ist anhand des übereinstimmenden Molekulargewichts der sekretierten Peptidase B (~50 kDa) im Vergleich mit ihrer von der Sequenz errechneten Größe (55 kDa, abzüglich 2 kDa des hypothetischen Präpeptids) nicht ersichtlich. Das Vorhanden-sein und die Größe von Prosequenzen bei der ProAS-Peptidase könnten zukünftige Sequenzierungen der terminalen Enden des sekretierten Enzyms aufklären.
4.3
4.3 Heterologe Expression der Serinpeptidase ProAS inHeterologe Expression der Serinpeptidase ProAS in E. coliE. coli
Die heterologe Expression einer Vielzahl von Serinpeptidasen aus mesophilen und extremophilen (insbesondere thermophilen und alkaliphilen) Bakterien und Pilzen in E. coli wurde bereits beschrieben (u.a.: Arnorsdottir et al., 2002; Deane et al., 1987;
Gödde et al., 2005; Gunkel & Gassen, 1989; Gupta et al., 2002a; Ikemura et al., 1987; Jang et al., 2002; Kwon et al., 1995; Maciver et al., 1994). Dahingegen fehlen bislang Berichte über eine erfolgreiche heterologe Expression von halophilen Peptidasen in ihrer aktiven Form in E. coli. So führte die Expression einer Peptidase aus dem moderat halophilen Bakterium Pseudoalteromonas ruthenica in E. coli zur Akkumulation von inaktivem Enzym in Inclusion Bodies (Sánchez-Porro Álvarez, 2005). Ebenfalls liegen keine Berichte über eine heterologe Expression von Peptidasen in halophilen Vertretern der Bacteria vor. Die heterologe Expression von halophilen Peptidasen aus Archaeen in halophilen Archaeen-Wirtsstämmen wurde hingegen schon mehrfach beschrieben (Kamekura et al., 1992; Kamekura et al., 1996; Shi et al., 2006). Ein Beispiel hierfür ist die Expression von aktivem Halolysin, eine halophile Serinpeptidase von Haloferax mediterranei, in Haloferax volcanii (Kamekura et al., 1992; Kamekura et al., 1996).
In dieser Studie gelang die Klonierung und heterologe Expression einer Subtilisin-ähnlichen Peptidase aus dem moderat halophilen Salinivibrio sp. Stamm B3/1-2 (#418) in E. coli. Mit dem Fosmid F114 transformierte E. coli-Zellen zeigten eine Sekretion von aktiver Peptidase. Diese erwies sich in der Analyse der biochemischen
Merkmale und des Molekulargewichtes als übereinstimmend mit der Wildtyp-Peptidase ProAS(#418), die der chromatografisch definierten Wildtyp-Peptidase B entspricht.
Das Fosmid F114 besaß ein ~40 kb großes DNA-Fragment von Stamm B3/1-2 (#418) als Insert, auf dem das Peptidasegen proAS(#418) identifiziert wurde. Dem verwendeten Fosmidvektor fehlen eigene Promotoren und andere Kontrollelemente für eine Expression der auf dem Insert lokalisierten Gene. Deshalb liegt der Schluss nahe, dass die Expression von ProAS(#418) mit den wildtypeigenen Kontroll-elementen (u.a. Promotor, Signalsequenz, Shine-Dalgarno-Sequenz, Terminator, Stoppcodon) in E. coli gelang. Aktives Enzym konnte nur unter sehr spezifischen Bedingungen nachgewiesen werden. So trat Aktivität nur nach einer geringen Erhöhung der Fosmidkopiezahl pro Zelle (durch Induktion mit L-Arabinose) und Absenkung der Temperatur auf 23°C in der zellfreien Kultur auf. Der Einsatz von Fosmiden und die hier ausgearbeiteten Bedingungen zur heterologen Expression einer Peptidase wurde bisher noch nicht beschrieben. Er könnte ein allgemein gangbarer Weg zu optimierten Expressionssystemen für Klonierungen von letalen Genen aus halotoleranten/halophilen Bakterien sein.
Für die heterologe Überexpression der Subtilisin-ähnlichen Peptidase ProAS wurden in dieser Arbeit drei verschiedene üblich verwendete Expressionsvektoren (pJF118EH; PBAD/gIII; pASK-IBA44) benutzt. In einer vorbereitenden Modellstudie zur Auswahl eines bestgeeigneten Vektors und Optimierung der Expression in E. coli wurde Subtilisin E aus Bacillus subtilis verwendet. Demnach kam es mit den Vektoren pBAD/gIII und pASK-IBA44 zur erfolgreichen Expression von aktivem Subtilisin E. Der Vektor pBAD/gIII schien nach Optimierung der Expressions-Bedingungen als am besten geeignet.
Eine heterologe Expression von aktiver Peptidase ProAS(#748) aus dem moderat halophilen Stamm B12/10-1 (#748) gelang jedoch mit keinem der zur Verfügung stehenden Expressionsvektoren. Es konnten jedoch eindeutige Hinweise auf eine induzierbare Transkription des rekombinanten Gens bei zwei Expressionsklonen (pBAD-proAS(#748) und pBAD-proAS-ol(#748)) durch das Auftreten von proAS(#418)-spezifischer mRNA nachgewiesen werden (siehe Abschnitt 3.4.1.2.1).
Vage Hinweise auf die Expression von rekombinantem Protein gab der Nachweis eines Peptids mit ähnlicher Größe zum unprozessierten rekombinanten Expressions-produkt in der PAGE-Analyse des Klons pBAD-proAS(#748) (siehe Abb. 22 /
Abschnitt 3.4.1.2.1). Der Grund für das Fehlen von aktiver rekombinanter Peptidase ist unklar.
Für das Fehlschlagen der heterologen Expression von aktiver extrazellulärer ProAS-Peptidase in E. coli mittels Expressionsvektoren werden hier folgende Hypothesen aufgestellt:
1.) Toxizität der rekombinanten ProAS auf den Wirtsstamm:
Ein generelles Problem bei der heterologen Expression von aktiven Peptidasen stellt die zumeist toxische Wirkung der gebildeten Enzyme auf den Wirtsstamm dar (Wladyka et al., 2005). Je nach Lokalisation und Aktivität der rekombinanten Peptidasen in der Wirtszelle kommt es zur Wachstumshemmung bzw. zum Zelltod (Arnorsdottir et al., 2002; Bott & Betzel, 1996; Goldberg, 1992). Die toxische Wirkung resultiert dabei aus der unregulierten Hydrolyse von essentiellen wirtseigenen Proteinen. Diese führt im Cytoplasma zur Störung bzw. Zerstörung des zellulären Metabolismus, während periplasmatisch oder extrazellulär sekretierte Peptidasen eine Destabilisierung der Bakterienzellen durch Degradation von Membran- und Zellwandbestandteilen bewirken können. Die Instabilität einiger Expressionsklone und die beobachtete Wachstumshemmung aller hier untersuchten Expressionsklone, schon ab einer Induktion auf niedrigstem Niveau, legt die Vermutung nahe, dass ein toxischer Effekt vom Expressionsprodukt ausgeht. Gleiches scheint auch für die Etablierung von Peptidase produzierenden Klonen in Genbanken mittels konventioneller Vektoren zu gelten. Ein vollständiges Fehlen solcher Klone in Screenings von Genbanken konnte auch an anderer Stelle beobachtet werden (u.a.
Herzog, 2002; Lämmle, 2004). Bei bakteriellen Peptidase-Produzenten wurden zwei Mechanismen beschrieben, die dem Wildtyp eine Kontrolle über die proteolytische Aktivität der gebildeten Enzyme ermöglichen (Wladyka et al., 2005). So werden sekretierte Peptidasen zumeist als inaktive Zymogene ausgeschieden, die eine Aktivierung durch Abspaltung der Proregionen außerhalb der Zelle erfahren (Khan &
James, 1998). Es wird vermutet, dass die Proregion als Chaperon für die korrekte Faltung zum aktiven Enzym fungiert und z.B. beim Subtilisin E autokatalytisch abgespalten wird (Yabuta et al., 2001). Des Weiteren ist die Produktion von spezifischen Peptidase-Inhibitoren bekannt, die die Aktivität der zelltoxischen Peptidase in der Zelle regulieren (Taguchi et al., 1997). Der letzt genannte Mechanismus fand bei Wladyka et al. (2005) erstmalig Anwendung, eine heterologe
Co-Expression der Peptidase Staphopain A mit ihrem Inhibitor Staphostatin A wurde in E. coli mit Erfolg durchgeführt. Die heterologe Expression von extrazellulären Peptidasen als Zymogene findet dagegen allgemeine Anwendung und ist zumeist notwendig zum Erhalt des aktiven rekombinanten Enzyms (Anderson et al., 1999;
Eder et al., 1993; Yabuta et al., 2003). Allerdings zeigen viele Studien, dass auch bei der heterologen Expression der Peptidasen als Zymogene ein toxischer Effekt auf den Wirt die Expression hemmt oder komplett inhibiert (Arnorsdottir et al., 2002; Bott
& Betzel, 1996; Goldberg, 1992). Ob dieser Effekt vom Zymogen selber oder einer Aktivierung desselbigen zum aktiven Enzym durch Autoproteolyse resultiert, ist bislang noch nicht untersucht worden. Ein Vorhandensein eines Propeptids in der hier untersuchten Peptidase konnte nicht abschließend geklärt werden (siehe 4.2.2.2).
2.) Fehlende Stringenz in der Regulation der heterologen Expression
Bedingt durch den vermutlich toxischen Charakter von ProAS sollte die heterologe Expression streng reguliert sein. So kann bei weniger dichten (leaky) Promotoren und auch im Zusammenhang mit einer hohen Kopiezahl des Vektors eine geringe basale Expression (background expression) im uninduzierten Zustand bereits toxische Konzentrationen von ProAS entstehen lassen. Dies kann zum Absterben der Zelle und damit zur Instabilität eines Klons führen (Arnorsdottir et al., 2002;
Sørensen & Mortensen, 2005). Der tac-Promotor des in dieser Arbeit verwendeten Vektors pJF118EH besaß offensichtlich ein zu hohes basales Niveau der Expression:
Die Klonierung von Subtilisin E und der Peptidase ProAS(#748) in diesem Vektor führte zu instabilen Klonen. Es bedarf somit stark regulierter Promotoren auf den verwendeten Expressionsvektoren, die mit pASKIBA44 und pBAD/gIII in dieser Arbeit zur Verfügung standen.
Neben der Dichtigkeit stellt die Stärke von Promotoren ein allgemeines Problem bei der heterologen Expression von Proteinen dar. Hohe Expressionsraten führen dabei häufig zu einer Proteinaggregation im Cytoplasma (Villaverde & Carrio, 2003), den so genannten Inclusion Bodies, welche die Sekretion aktiver Enzyme verhindert. Abhilfe kann eine Senkung der Expressionsrate durch Verringerung der Induktormenge schaffen. Die Ausbildung von Inclusion Bodies konnte bei Verwendung des Vektors pASK-IBA44 in dieser Studie beobachtet werden. In mit 0,2 μg/ml Anhydrotetracyclin induzierten E. coli-Zellen konnten bei der proAS-Expression Inclusion Bodies
mikroskopisch nachgewiesen werden. Eine Verringerung der Induktormenge führte zum Verschwinden der unlöslichen Proteinaggregate, allerdings nicht zur Sekretion von aktivem Enzym. Möglicherweise wurde die Peptidase als inaktives Enzym sekretiert, wie ein Protein ähnlicher Größe zur Wildtyp-Peptidase in der PAGE-Analyse der zellfreien Kultur vermuten ließ.
In einigen Expressionsstrategien ist die Bildung von Inclusion Bodies Teil des Verfahrens (Baneyx, 1999). Ein Vorteil ergibt sich hierbei durch Verringerung des zelltoxischen Effektes durch die Inaktivität der aggregierten rekombinanten Peptidasen. Eine Aktivierung des gereinigten Enzyms wird in einigen Fällen über eine Denaturierung und anschließende Renaturierung unter geeigneten Puffer-bedingungen erreicht (Parry, 2002; Villaverde & Carrio, 2003). Thermophile Peptidasen können dagegen einfach über Erhitzen der Enzymaufreinigung aktiviert werden (Fu et al., 2003; Gödde et al., 2005; Morikawa et al., 1994; Wu et al., 2004).
Die Aktivierung der rekombinanten Peptidase erfolgt dabei in vielen Fällen über eine Prozessierung durch Autoproteolyse und Faltung zum reifen und aktiven Enzym (Gödde et al., 2005; Villaverde & Carrio, 2003). Eine Anwendung der Renaturierungs-Verfahren für Serinpeptidasen nach Parry (2002) führte allerdings in dieser Studie zu keiner aktiven Peptidase in der Aufreinigung der Inclusion Bodies.
Womöglich konnten die Bedingungen für eine Renaturierung zum aktiven Enzym nicht eingestellt werden. Möglicherweise waren die Enzyme auch irreversibel denaturiert.
3.) Abweichende Codon-Usage durch den Wirtsstamm
Ebenfalls ein allgemeines Problem bei der heterologen Expression von Proteinen ist die unterschiedliche Codon-Usage von Wirtsstamm und Wildtyp. Eine Verminderung der Expressionsrate kann durch eine hohe Anzahl von Codons in der heterologen DNA verursacht werden, die in E. coli selten genutzt werden (Makrides, 1996). Eine computergestützte Analyse mit dem Programm codon usage analyser 2.0 (Fuhrmann et al., 2004) deckte für das proAS-Gen aus 3 Salinivibrio-Stämmen 5 (bei proAS(#418) und proAS(#795)) bzw. 8 (bei proAS(#748)) Codons auf, die von E. coli K12-Stämmen wenig genutzt werden (<10% Anpassungsfähigkeit). Möglicherweise resultierte daraus eine verminderte Syntheserate des heterologen Proteins. Auf das vollständige Ausbleiben von aktiver Peptidase bei den Expressionsklonen hatte die abweichende Codon-Usage jedoch vermutlich keinen ausschlaggebenden Einfluss.
Zum einen konnte die Sekretion einer aktiven ProAS-Peptidase durch den Fosmidklon F114 in E. coli gezeigt werden. Zum anderen legte ein nach der Induktion gebildetes Peptid in der PAGE-Analyse der Expressionsklone (pASK-proAS(#748) und pBAD-(pASK-proAS(#748)), welches eine ähnliche Größe zum erwarteten Genprodukt besaß, die Vermutung nahe, dass eine Translation stattgefunden hatte.
Für eine spätere Produktionsoptimierung wird die Verwendung von speziellen E. coli-Stämmen, die zusätzliche Genkopien für seltene tRNA-Codons besitzen, vorgeschlagen. Ebenso wäre eine Mutagenese der betreffenden Codons in der proAS-Sequenz vorstellbar, um diese durch für E. coli häufig genutzten Codons zu ersetzen.
4. Transport, Prozessierung und Faltung der rekombinanten Peptidase
Für die extrazelluläre Lokalisation von Proteinen muss in gramnegativen Bakterien ein Durchqueren von zwei Membranen (Cytoplasma- und äußere Membran) gewährleistet sein. Mehrere Transportsysteme für die Membran-Translokation in Prokaryoten wurden beschrieben (Pugsley et al., 2004). Die Sekretion kann dabei schematisch in einen Sec-abhängigen und einen Sec-unabhängigen Weg unterschieden werden (Coutte et al., 2001). Sekretierte Proteine des Sec-unabhängigen Wegs beinhalten dabei kein abspaltbares N-terminales Signalpeptid und werden in einem Schritt durch beide Membranen transportiert (Fath & Kolter, 1993; Plano et al., 2001). Beim Sec-abhängigen Weg erfolgt der Transport zweistufig. Der Transport ins Periplasma wird über ein N-terminales Signalpeptid vermittelt, welches während des Transports proteolytisch abgespalten wird. Im zweiten Schritt kann das Enzym über verschiedene Transportwege durch die äußere Membran exportiert werden (Coutte et al., 2001). Hierfür sind einige Transport-systeme bekannt: der AT-Weg (autotransporter pathway) (Desvaux et al., 2004;
Henderson et al., 1998), TPS-Weg (two-partner secretion pathway)(Jacob-Dubuisson et al., 2004), der Typ II Sekretionsweg (general secretory pathway) (Sandkvist, 2001) und Typ IV-Sekretionssysteme (Backert & Meyer, 2006).
Bei der Analyse der proAS-Gene konnte ein hypothetisches N-terminales Signal-peptid identifiziert werden. Dies lässt auf den SignalSignal-peptid-vermittelten posttrans-lationalen Transport der Proteine ins Periplasma schließen. Bisher wurden zwei dieser Transportwege in Bakterien beschrieben: Der gut untersuchte und weit verbreitete Sec-Transportweg (Sec: secretory) und der Tat-Transportweg (Tat:
twin-arginine-translocation). Die markante Consensus-Sequenz (R-R-X-F-L-K*) im Signalpeptid des Tat-Wegs (Blaudeck et al., 2003) lag in den 3 untersuchten Signalpeptiden der Salinivibrio-Stämme dieser Studie nicht vor.
Die ProAS-Sequenz der hier untersuchten moderat halophilen Bakterien besaß dagegen die typischen Eigenschaften (von Heijne, 1983) für eine Translokation über den Sec-Weg. Dieser wird hier als Transportweg der Peptidase ProAS ins Periplasma angenommen. Die Abspaltung des Signalpeptides vom zumeist inaktiven Vorläufer (Winnacker, 1985) nach dem Transport über den Sec-Weg ist entscheidend für die Expression der rekombinanten Proteine mit authentischem N-terminalen Ende (Sørensen & Mortensen, 2005). Der Sec-Weg ist ebenfalls im Wirtsstamm E. coli vorhanden. Einige heterologe Signalpeptide erwiesen sich dabei als voll funktional in E. coli (Sørensen & Mortensen, 2005). Die Sekretion von ProAS Peptidase durch den Fosmidklon lässt vermuten, dass das Wildtyp-Signalpeptid von E. coli erkannt wird. Möglicherweise wurde die Sekretion aber auch durch Proteine ermöglicht, die ebenfalls auf dem Fosmid kodieren und eine transportvermittelnde bzw. sekretionserleichternde Funktion besitzen, so wie es bei der Sekretion einer Pektat-Lyase aus Erwinia chrysanthemi in E. coli beschrieben wurde (He et al., 1991a; He et al., 1991b). Die Sequenzierung eines Fosmidabschnittes (~1000 bp) stromaufwärts vom proAS(#418) ergab jedoch keinen Hinweis auf Sequenzen, die homolog zu bekannten Transportergenen waren.
Um die Sekretion von rekombinanten Proteinen ins Periplasma bei E. coli zu gewährleisten, wird für die Überexpression das Wildtyp-Signalpeptid häufig gegen ein E. coli-spezifisches ersetzt. Die hier verwendeten Expressionsvektoren pASK-IBA44 und pBAD/gIII beinhalteten dementsprechend die kodierende Sequenz des ompA- bzw. gIII-Signalpeptides für E. coli. Dass sogar die Fusion eines Wildtyp-signalpeptides mit dem gIII-Signalpeptid des Vektors in E. coli zur heterologen Expression von aktivem periplasmatischen bzw. extrazellulären Subtilisin E führt, konnte hier im Modellversuch und bei Sroga & Dordick (2002) gezeigt werden. Das Vorhandensein eines Proteins ähnlicher Größe zum Expressionsprodukt im Periplasma des Klons pBAD-proAS(#748) legt die Vermutung nahe, dass in diesem Klon ebenfalls ein Transport der rekombinanten ProAS(#748) ins Periplasma stattfand. Im Vektor pBAD-proAS(#748) liegt die kodierende Sequenz des vektor-eigenen gIII-Signalpeptides fusioniert mit dem kompletten proAS(#748)-Gen vor,
*X steht hier für eine hochvariable Stelle in der Aminosäuresequenz.
welches am 5’-Ende für ein hypothetisches Signalpeptid des Wildtyps kodiert. Ob und welches der beiden Signalpeptide des rekombinanten Proteins im Periplasma abgespalten wurde, konnte nicht aufgeklärt werden.
Ebenfalls wichtig für die Expression eines aktiven Enzyms ist die Ausbildung von möglichen Disulfidbrücken im Periplasma. Ein Alignment mit der kristallografisch gut untersuchten Peptidase Aqualysin I (Takagi et al., 1990) ergab für die ProAS-Peptidase eine hohe Homologie von zwei Bereichen, die im Aqualysin I an der Ausbildung von Disulfidbrücken beteiligt sind (Kwon et al., 1988). So besitzt die Peptidase ProAS vermutlich zwei Disulfidbrücken (208. + 240. AS und 309. + 340.
AS*, siehe Abb. 40 im Anhang), die auch in der nächst verwandten Peptidase ProA vermutet werden (Siezen & Leunissen, 1997). Somit scheint die Sekretion ins Periplasma eine Voraussetzung zur Ausbildung von korrekt gefalteter ProAS-Peptidase zu sein.
Der weitere Transport aus dem Periplasma über die äußere Membran ist weniger gut untersucht. Die bislang bekannten Systeme, die diesen Transport gewährleisten, wurden schon weiter oben genannt. E. coli K12 fehlen offensichtlich solche Transportwege. Eine extrazelluläre Lokalisation der rekombinanten Proteine wird zumeist mit einem passiven Transport aufgrund einer Destabilisierung der äußeren Membran erklärt (Sørensen & Mortensen, 2005). Dieser Mechanismus wird auch für die extrazelluläre Lokalisation von aktivem Subtilisin E im Modellsystem vermutet.
Möglicherweise spielte daher ein aktiver Transport durch die äußere Membran für die heterologe Expression von kleineren Mengen der ProAS-Peptidasen in dieser Studie keine Rolle.
Folglich ist nicht nur die extrazelluläre Lokalisation der heterologen Peptidasen an sich bedeutend, sondern ebenfalls die darin eingeschlossenen Transport-, Prozessierungs- und Faltungsvorgänge zum Erhalt eines aktiven Enzyms.
Die Notwendigkeit von höheren Salzkonzentrationen bei der heterologen Expression zur Sekretion von aktiven Enzymen wird für einige halophile Peptidasen vermutet. So kennzeichnet eine sehr geringe Enzym-Stabilität unter salzarmen Bedingungen einige halophile Peptidasen (Izotova et al., 1983; Kamekura et al., 1992). Die relative Salzempfindlichkeit der hier untersuchten Peptidasen und die gelungene Expression von aktiver ProAS-Peptidase in E. coli (bei ~170 mM NaCl im Medium) lässt eine
*Die Nummern geben die Position der Cysteinreste im Alignment der Aminosäuresequenzen an.
ausgeprägte Salzabhängigkeit bei der Expression der ProAS-Peptidasen zum jetzigen Forschungsstand allerdings nicht erkennen.
Bei der zukünftigen Klonierung von stark salzabhängigen Peptidasen würde eine heterologe Expression in halophilen Bakterien sinnvoll erscheinen. Zumal wenn diese über notwendige Transporter für die extrazelluläre Sekretion verfügen. Seit kurzem stehen Vektoren für die heterologe Expression von Proteinen in den moderat halophilen Bakterien aus der Gattung Halomonas und Chromohalobacter zur Verfügung (Afendra et al., 2004; Vargas & Nieto, 2004).
Entscheidend für die heterologe Expression von aktiver Peptidase in E. coli (Fosmidklon) zeigte sich letztendlich die Kombination von niedriger Syntheserate und niedriger Inkubationstemperatur (~23°C). Wie schon an anderer Stelle vermutetet (Ikemura et al., 1987; Sroga & Dordick, 2002) sind diese Bedingungen wahrscheinlich bei einigen rekombinanten Peptidasen Voraussetzung für eine korrekte Prozessierung und Faltung zum aktiven Enzym. Möglicherweise liegt unter diesen spezifischen Bedingungen ein Gleichgewicht vor, so dass es zur Expression, zum Transport und zur Prozessierung der aktiven Enzyme kommen kann, allerdings ohne die dafür zugehörigen Systeme im Wirtsstamm zu inaktivieren. Die Ergebnisse der Modellstudie mit Subtilisin E und die Expression von aktiver ProAS-Peptidase durch den Fosmidklon F114 begründen jedenfalls diese Annahme, auch wenn im Fall des Fosmidklons ein anderes System verwendet wurde. Die schwache Anhebung der Fosmidkopiezahl entspricht hier durch Vervielfältigung der proAS-Gene und ihrer Kontrollelemente ebenfalls einer leichten Steigerung der Synthese-rate. Dies und die Inkubation bei 23°C führten letztendlich nach einer erstaunlich langen Induktionsphase von 110h zur aktiven ProAS-Peptidase in der zellfreien Kultur. Auch bei Deane et al. (1987) konnte bei der heterologen Expression der nächstverwandten ProA in E. coli eine Verzögerung nach der Induktion von 18 h bis zum Nachweis von aktiver Peptidase festgestellt werden. Warum es zu dieser extrem langen Induktionsphase kam, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden.
Möglicherweise trat eine eher spontane, nicht völlig korrekte Faltung zum aktiven Enzym in der zellfreien Kultur auf. Hinweise auf eine eventuelle labile Struktur gab der Vergleich der biochemischen Eigenschaften. So zeigte die rekombinante Peptidase im Gegensatz zum Wildtypenzym eine hohe Empfindlichkeit gegenüber stark chaotropen Salzen.
Letztendlich scheint für die heterologe Expression von größeren Mengen an aktiver ProAS-Peptidase kein gängiges Expressionssystem geeignet. Die toxische Wirkung der rekombinanten Peptidase auf den Wirt oder auf essentielle Proteine bei zellfreien Expressionssystemen scheint bislang unvereinbar mit einer ökonomischen Produktion. Die heterologe Expression als inaktives Enzym und spätere Prozessierung zur aktiven Peptidase bietet sich hierbei als mögliche Lösung an. Eine Möglichkeit ist hierfür die Überexpression als inaktives Fusionsprotein (Makrides, 1996). Um allerdings die anschließenden Verfahren und Bedingungen zur korrekten Prozessierung und Faltung des Enzyms herauszufinden, bedarf es in Zukunft weiter-gehender Analysen der Sequenz und Struktur der reifen Peptidasen aus den Wildtypen.
4.4
4.4 Einsatz der Metallopeptidase und der Serinpeptidase (ProAS) ausEinsatz der Metallopeptidase und der Serinpeptidase (ProAS) aus