3 3 Ergebnisse Ergebnisse
3.2.4 Einfluss von Metallionen auf die Peptidase-Aktivität Einfluss von Metallionen auf die Peptidase-Aktivität
Der Einfluss monovalenter und divalenter Kationen (KCl, MnCl2, MgCl2, FeCl2, CaCl2, CuSO4) auf die Aktivität der Peptidasen wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tab. 21 zusammengefasst. Es konnte keine augenfällige Aktivierung (>1,5-fache Aktivitäts-Steigerung) der Peptidasen durch die untersuchten Kationen festgestellt werden. Der Einsatz von KCl (2 mM) im Assay beeinflusste die Aktivität der untersuchten Peptidasen nur gering (88-123% relative Aktivität). Dabei zeigte die KCl-Zugabe auf die Aktivität der Peptidase A aller Stämme (Ausnahme: SJ2/3-1 (#073): 96% rel. Aktivität) einen positiven Effekt, wahrscheinlich aufgrund der Steigerung der Salinität (vergl. 3.2.3). Der Zusatz von MnCl2 zeigte auf die Aktivität der untersuchten Peptidasen eine hemmende Wirkung (44-83% relative Aktivität).
Die Peptidase B der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098) und SJ6S/14 (#148) zeigten allerdings mit MnCl2 eine schwach erhöhte Aktivität (mit 117-128% relativer
Aktivität). Keine oder eine schwach aktivierende Wirkung auf die Peptidase A-Aktivität (99-147%) war auch bei Zusatz von MgCl2 und CaCl2 messbar. Die Peptidase B der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098), SJ6S/14 (#148), B3/14 (#430) und B12/10-1 (#748) zeigten allerdings bei MgCl2-Zugabe gehemmte Aktivität (mit 74-90% rel. Aktivität), ebenso die Peptidase B der Stämme SJ5Ü/8 (#098), B3/1-2 (#418), B8/B3/1-26-B3/1-2 (#504) und B1B3/1-2/10-1 (#748) und Peptidase A von Stamm B3/14
FeCl2 die
s-ngen wurde daher auf den insatz der untersuchten Kationen im Assay verzichtet.
w Peptid
(#430) bei Zusatz von CaCl2.
Eine hemmende Wirkung von Kupfersulfat konnte bei allen untersuchten Peptidasen nachgewiesen werden. Der Einsatz von 2 mM FeCl2 führte sowohl im Fluoreszenz-test als auch im spektrophotometrischen Test zu einem totalen Ausfall der Aktivität bei allen Proben, es konnte nicht geklärt werden, ob das verwendete
Assays inhibierte oder eine komplette Inhibition der Enzymaktivität vorlag.
Eine stichprobenartige Wiederholung der Versuche ergab eine hohe Schwankung breite der Ergebnisse, jedoch mit gleich bleibender Tendenz (Daten nicht gezeigt).
Da die untersuchten Peptidasen keine eindeutige Aktivierung durch die untersuchten Kationen zeigten, konnte eine Abhängigkeit oder mögliche Co-Faktoren der Enzyme nicht identifiziert werden. Bei den weiteren Untersuchu
E
Tab. 21: Abhängigkeit der re tä h
und B
lativen Pe der
ptidase-Aktivi wählten S
t* von versc e unter
iedenen Metallionen. Es
urden die ase A ausge tämm sucht.
Stamm Peptidase 2 mM KCl 2 mM MnCl2 2 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM CuSO4
A 96 % 63 % 109 % 147% 76 %
SJ2/3-1 (#073)
B 105 % 118 % 89% 126% 56 %
A 111 % 57 % 109 % 139 % 68 %
SJ5Ü/8 (#098)
B 97 % 117 % 74 % 54 % 78 %
A n.b. n.b. 99 % 103 % n.b.
SJ5Ü/12 (#140)
B n.b. n.b. 102 % 102 % n.b.
A 123 % 52 % 107 % 126% 21%
SJ6S/14 (#148) 1
B 88 % 28 % 77 % 104% 67 %
A 112 % 58 % 137 % 102 % 12 %
B3/1-2 (#418)
B 115 % 44% 104% 67% 54 %
A n.b. n.b. 99 % 89 % n.b.
B3/14 (#430)
B n.b. n.b. 88 % 116 % n.b.
B8/26-2 (#504) B 102% 51% 108% 94% 49%
A 102 % 63 % 90 % 102 % 34 %
B12/10-1 (#748)
B 105% 83% 101% 94% 63 %
B 97% 91% 101% 113% 68%
B12/16 (#795)
* Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von Kationen wurde gleich 100% gesetzt.
n.b.= nicht bestimmt.
3.3.22..55 EiEinnfflluusssschchaaoottrrooppeerrAgAgeennzziieennauauffdidieePePeppttiiddaasseenn
Salze, wie Guanidinhydrochlorid (GuHCl) und Guanidinisothiocyanat (GuSCN), wirken stark chaotrop denaturierend auf Proteine. In der Nukleinsäurereinigung werden sie u.a. als Stabilisatoren gegen nukleolytischen Abbau im Zelllysat eingesetzt. Weitere Bestandteile sind Detergenzien, wie das anionische Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS). Im Hinblick auf den möglichen biotechnologischen Einsatz wurde die Toleranz der Peptidasen gegenüber chaotropen Agenzien
zien wäre für den Einsatz als zelllytisches Enzym zur
Nuklein-bnisse der Untersuchung mit GuHCl und GuSCN sind in Tab. 22 zusammengefasst.
T s n chaotro lze f die tida tiv r Pep d B der
St
untersucht. Eine Aktivität der untersuchten Peptidasen in Gegenwart von chaotropen Salzen und Detergen
säurereinigung wünschenswert.
Die Erge
ab. 22: Einflus ämme.
vo pen Sa n au Pep se-Ak ität* de tidase A un Relative Peptidase-Aktivität*
Guanidinhydrochlorid (GuHCl) Guanidinisothiocyanat (GuSCN) Stamm Peptidase 0,5 M 1,0 M 2,0 M 3,0 M 0,2 M 0,6 M 0,8 M
A 106% 90% 24% 9% 118% 42% 15%
SJ2/3-1 (#073)
B 70% 43% 16% 7% 73% 13% 9%
A 77% 69% 24% 11% 112% 53% 23%
SJ5Ü/8 (#098)
B 39% 13% 0% 0% 102% 71% 31%
A n.b. 63% n.b. 8% n.b. n.b. 18%
SJ5Ü/12 (#140)
B n.b. 23% n.b. 0% n.b. n.b. 9%
A 104% 100% 34% 17% 119% 51% 22%
SJ6S/14 (#148)
B 38% 36% 4% 0% 64% 23% 10%
A 82% 77% 34% 15% 84% 63% 26%
B3/1-2 (#418)
B 75% 61% 37% 21% 78% 44% 31%
A n.b. 61% n.b. 6% n.b. n.b. 14%
B3/14 (#430)
B n.b. 40% n.b. 2% n.b. n.b. 7%
B8/26-2 (#504) B 86% 64% 31% 14% 89% 45% 15%
A 82% 49% 46% 10% 95% 21% 12%
B12/10-1 (#748)
B 60% 22% 27% 37% 89% 18% 11%
B12/16 (#795) B 55% 40% 24% 8% 88% 13% 10%
* Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von chaotropen Salzen wurde gleich 100% gesetzt.
n.b.= nicht bestimmt.
Ein Großteil der Proben zeigte unter Einfluss von 3M GuHCl oder 0,8 M GuSCN noch Peptidase-Aktivität. So zeigte die Peptidase A der Stämme B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748) bei der höchsten getesteten GuHCl-Konzentration von 3 M noch eine Restaktivität von 21% bzw. 37%. Bei 0,8 M GuSCN zeigten die Peptidase A der Stämme SJ5Ü/8 (#098), SJ6S/14 (#148) und B3/1-2 (#418) Restaktivitäten von 22%
bis 26%, bzw. die Peptidase B von Stamm SJ5Ü/8 (#098) und B3/1-2 (#418) je 31%.
Auffällig war die höhere GuSCN und GuHCl-Resistenz der Peptidase A gegenüber der Peptidase B, mit Ausnahme von Stamm B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748).
Die Toleranz der Peptidase A und B gegenüber SDS wurde exemplarisch an drei Stämmen gezeigt (Abb. 11). Die Stämme SJ2/3-1 (#073), B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748) stellten eine repräsentative Auswahl aus jeweils einer der 3 Verwandtschaftsgruppen (vergl. 3.1.2) der 9 bearbeiteten Stämme dar. Waren die einzelnen Messergebnisse einer hohen Schwankungsbreite unterworfen (siehe 3.1.4), wiesen die Mittelwerte jedoch eine Tendenz in der SDS-Toleranz der Peptidasen auf (Abb. 11). So zeigte eine Konzentration von 0,1% SDS nur wenig Einfluss auf die Aktivität der Peptidase A der hier untersuchten Stämme, wobei bei steigender SDS-Konzentration (0,5% und 1% SDS) ein Absinken der relativen Aktivität z.T. bis auf 15% zu beobachten war. Die Peptidase B hingegen zeigte mit 0,1% SDS eine Steigerung der Aktivität von 143%-187%, wohingegen sie bei den öheren Konzentrationen einen Rückgang der Aktivität bis auf 27% (bei 1% SDS) aufwies. Beide Peptidasen (A und B) besaßen also eine Toleranz gegenüber SDS, was auch durch proteolytische Aktivität der Proben während der SDS-PAGE demonstriert wurde (siehe 2.6.8).
h
0%
50%
100%
relati
150%
200%
250%
300%
- B12/101(#748) -Peptidase A
B12/101(#748) -Peptidase B
ve Peptidase-Aktivität
0,1% SDS 0,5% SDS 1% SDS
SJ2/31(#073) -Peptidase A
SJ2/31(#073) -Peptidase B
B3/12(#418) -Peptidase A
B3/1-2(#418) Peptidase B
Abb. 11: Relative Peptidase-Aktivität* der Peptidase A und B in Abhängigkeit zur SDS-Konzentration.
* Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von SDS entspricht 100%.
3.3.22..66 EiEinnfflluussssvovonnInInhhiibbiittoorreennauauffdidieePePeppttiiddaasseenn
Der Einsatz von spezifischen Peptidase-Inhibitoren sollte die Zuordnung der untersuchten Peptidasen zu bekannten Gruppen von Peptidasen ermöglichen.
Insbesondere wurde nach Serinpeptidasen und Metallopeptidasen gesucht (siehe Einleitung, Abschnitt 1.2.1.1). Als Inhibitor für Serinpeptidasen (und einigen wenigen
nanthrolin und EDTA. Der erinpeptidase-Inhibitor PMSF besaß nur geringe hemmende Wirkung (16-39%
r Peptidase A der genannten Stämme um eine Metallopeptidase handelt.
s von Inhib r ie Aktivi r Peptidase A und B.
Cysteinpeptidasen) wurde PMSF benutzt, Phenanthrolin bzw. EDTA als Inhibitoren für Metallo- und Metallionen-aktivierte Peptidasen (Salvesen & Nagase, 2001). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tab. 23 zusammengefasst.
Die Peptidase A der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/12 (#140), B3/14 (#430) und B12/10-1 (#748) zeigte eine komplette Inhibition bzw. starke Inhibition (58-68%
Inhibition) durch die Metallopeptidase-Inhibitoren Phe S
Inhibition). Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei de
Tab. 23: Einflus ito en auf d tät de Inhibition [%]
Stamm Peptidase PMSF (10 mM)
Phena throlinn (10
EDTA M) m (5 mM) A 16 r5 >99a) 68 SJ2/3-1 (#073)
B >99a) -b) 11
A 54 r18 >99a) 58 SJ5Ü/8 (#098)
B >99a) -b) 54
A 36 r8 >99a) .b.n SJ5Ü/12 (#140)
B >99a) -b) .b.n A 56 r9 >99a) 63 SJ6S/14 (#148)
B >99a) -b) 71
A 69 r22 >99a) 29 B3/1-2 (#418)
B >99a) 40 r18 62 A 61 r16 >99a) 68 B3/14 (#430)
B >99a) -b) 50
B8/26-2 (#504) B 91 r1 -b) 51
A 39 r21 >99a) 58
B12/10-1 (#748) a) b)
B >99 - 91
B12/16 (#795) B >99a) -b) 35
a)Peptidase-Aktivität unter der Nachweisgrenze; b)Aktivitätssteigerung bis zu 168% Restaktivität durch Phenanthrolin.
n.b.: nicht bestimmt
Ebenfalls starke (58-68% Inhibition) bis komplette Inhibition konnte durch die Metallopeptidase-Inhibitoren bei der Peptidase A der Stämme SJ5Ü/8 (#098), SJ6S/14 (#148) und B12/10-1 (#748) beobachtet werden. Schwierigkeiten für die sichere Zuordnung zu den Metallopeptidasen bereitete aber die starke inhibitorische Wirkung (54-61% Inhibition) von PMSF auf die Aktivität. Gleiches gilt für Peptidase A des Stammes B3/1-2 (#418) mit 69% Inhibition durch PMSF und geringer Wirkung von EDTA mit 29% Inhibition, aber kompletter Inhibition durch Phenanthrolin.
Die Peptidase B aller untersuchten Stämme wurde stark (91% Inhibition bei Stamm B8/26-2 (#504)) bis komplett durch 10 mM PMSF inhibiert. Dagegen zeigte
SJ2/3-1 (#073) und B12/16 (#795) zu den
Serin-B aller Stämme sehr deutlich heraus, dass es sich hierbei um zwei verschiedene Enzyme handelt. Insofern stehen diese
en des Einflusses des pH-Wertes, des NaCl-Phenanthrolin nur bei Stamm B3/1-2 (#418) eine Inhibition der Peptidase B-Aktivität von 40%, bei allen anderen Stämmen konnte keine Inhibition der Peptidase B festgestellt werden.
Mit der geringen Inhibition von 11% bzw. 35% durch EDTA konnte eine Zuordnung der Peptidase B der Stämme
peptidasen erfolgen. Die Peptidase B der restlichen Stämme zeigte eine Inhibition von 50-71% durch 5 mM EDTA. Eine eindeutige Zuordnung dieser Peptidasen konnte deshalb nicht erfolgen.
Zusammenfassend stellt die unterschiedliche Wirkung von PMSF und Phenanthrolin bzw. EDTA auf die Peptidase A und
Ergebnisse im Einklang mit den Dat Gehalts und von chaotropen Salzen.
3.3.22..77 GeGewweebbeeaauuffllöösseennddeeAkAkttiivviittäätt
Auf Plattentests konnte nachgewiesen werden, dass die Peptidasen der 9 untersuchten Stämme sowohl Magermilch und reines Casein, als auch Gelatine als Substrate verwerten konnten (Daten nicht gezeigt). Die Tauglichkeit der Peptidasen für den Einsatz in Nukleinsäure-Aufreinigungskits wurde hier exemplarisch anhand
y) unter Standard-des Lyse-Verhaltens gegenüber tierischem Gewebe untersucht. Für die Versuche standen Mäuseschwanzstückchen zur Verfügung. Als Kontrolle diente die kommerziell verwendete Proteinase K (10 μg/μl, MOLZYM).
Dieser Versuch wurde mit jeweils 450 μl Konzentrat aus 8 Kulturüberständen (siehe Tab. 24) durchgeführt. Das Lyse-Verhalten der Peptidasen an tierischem Gewebe wurde zunächst unter den zuvor gewonnenen Optimalbedingungen untersucht. Die Gewebestückchen wurden in Puffer (30mM Tris-HCl, pH 9, 5 mM NaCl) mit zellfreiem Kultur-Konzentrat bei 50°C inkubiert, wobei die enthaltene Peptidase-Gesamtaktivität zwischen 0,4-1,08 kFl-Units (Fluoreszenzassa
bedingungen lag. Die nach Betriebsanweisung (PrestoSpin D Tissue-Kit, MOLZYM) eingesetzte Gesamtaktivität der Proteinase K betrug dagegen 75 kFlU. Die Proben wurden alle 10 min kräftig gemischt und ihr Zustand protokolliert.
Die Lyse der Gewebeproben erfolgte, abhängig vom Stamm, mit unterschiedlicher Geschwindigkeit (siehe Tab. 24). Anfängliche Lyseerscheinungen, wie Trübung des Puffers, traten bei den Stämmen SJ6S/14 (#148), B3/14 (#430) und B12/16 (#795) schon nach 20 min Inkubation auf. Eine vollständige Zersetzung des Muskelgewebes konnte bei diesen 3 Stämmen nach 120 min Inkubation beobachtet werden (siehe Abb. 12). Eine Zersetzung der Mäuseschwanzhaut konnte nur in geringem Maße festgestellt werden; sie wurde am Versuchsende zur Überprüfung der Muskel-gewebelyse entfernt. Das Konzentrat von Stamm SJ5Ü/8 (#098) zeigte unter diesen Bedingungen kein Anzeichen von gewebelytischem Verhalten, während die Proteinase K aufgrund nicht optimaler Reaktionsbedingungen nur eine verlangsamte Lyse zeigte.
a. b.
Abb. 12: Wirkung des zellfreien Kultur-Konzentrates von Stamm B12/16 (#795) auf ein Mäuseschwanzstückchen in Reaktionspuffer (30 mM Tris-HCl pH 9, 5 mM NaCl) und Inkubation bei 50°C. a. 0 min; b. 120 min: Haut wurde manuell entfernt, das Muskelgewebe hat sich von den Schwanzwirbeln (Pfeil) gelöst und wurde zersetzt.
Beachte die Trübung der Lösung in b. aufgrund der Zersetzung des Muskelgewebes.
kung der ko trie Ku rübers de auf ein tückchen (ca la ) nach 0, 60, 90 und 120 min Reaktionspuffe mM ris-H H 9, M NaC bei
Tab. 24: Wir nzen rten ltu tän
Mäuseschwanzs . 1 cm ng 3
Inkubation in r (30 T Cl p 5 m l)
50°C.
Konzentrat Gesamtaktivität
30 min 60 min 90 min 120 min [kFlU]1)
SJ2/3-1 (#073) 0,4 - - + +
SJ5Ü/8 (#098) 0,65 - - - -
SJ6S/14 (#148) 0,99 + + ++ +++
B3/1-2 (#418) 1,05 - (+) (+) +
B3/14 (#430) 1,01 + + ++ +++
B8/26-2 (#504) 1,08 (+) (+) (+) + B12/10-1 (#748) 0,96 (+) (+) (+) + B12/16 (#795) 0,69 + + ++ +++
Prot. K (200 μg) 75,0 - - (+) +
Kontrolle (H2O) - - - - -
1)Die Gesamtaktivität der eingesetzten Konzentrate (450 μl) wurde unter Standardbedingungen (Fluoreszenzassay, 30 mM Tris-HCl pH 9; 5mM NaCl; 30 min, 37°C) bestimmt.
Zeichen-Erklärung: (+): leichte Trübung; +: Trübung; ++: Freisetzung von kleinen Gewebestückchen; +++: komplette Lyse des Muskelgewebes
Das Lyse-Verhalten in einem modifizierten Lysepuffer (0,5 M GuSCN; 0,5%
Tween 20; 5 mM CaCl2; 0,5% SDS; 30 mM Tris-HCl, pH 9) bei 50°C für die Nukleinsäure-Extraktion wurde mit den aktivsten Konzentraten der Stämme SJ6S/14 (#148), B3/14 (#430) und B12/16 (#795) untersucht. Im Vergleich zum vorherigen Versuch war die Lyse des Gewebes verlangsamt. Nach 120 min traten erste leichte Lyseerscheinungen auf, die durch eine Freisetzung von kleinen Gewebeteilchen zu erkennen waren. Eine vollständige Zersetzung des Muskelgewebes unter diesen Bedingungen erfolgte nur bei Stamm B12/16 (#795) nach 18 h Inkubation, die
timierten Reaktionsbedingungen für
durch GuSCN im Gegensatz zur Proteinase K, die allerdings bis zu 100-fach konzentrierter vorlag, stark gehemmt.
wäre das gewebelytische Verhalten anderen Proben blieben in ihren frühen Zersetzungszuständen stehen. Die Kontrolle mit 75 kFlU Proteinase K hingegen konnte den Mäuseschwanz unter diesen Bedingungen innerhalb von 3 h komplett bis auf die Sehnen und Knochen zersetzen.
Wurde die eingesetzte Menge an Proteinase K auf eine Aktivität von 1 kFlU reduziert, verzögerte sich der komplette Abbau hingegen auf etwa 12 h.
In diesem Versuch konnte das gewebelytische Verhalten der Peptidasen aus 8 Konzentraten nachgewiesen werden. Unter op
die untersuchten Peptidasen zeigten einige der Konzentrate sogar eine höhere Aktivität am Muskelgewebe als die hochkonzentrierte Proteinase K. In den eingesetzten Konzentrationen wurde jedoch die sichtbare proteolytische Aktivität der Konzentrate
In Hinblick auf die biotechnologische Nutzung
der hier beschriebenen Peptidasen im hochkonzentrierten Zustand (>75 kFlU) und ein Einsatz der Enzyme für eine komplette DNA oder RNA-Isolierung aus Gewebe interessant.
3.3.22..88 AnAnaallyysseedederrPePeppttiiddaasseennmimitttteellssPAPAGGEE
Zur Abschätzung des Molekulargewichts der Peptidasen und Analyse der kontaminierenden Proteine wurden zellfreie Kulturen und Präparate aus der Phenyl-sepharose-Chromatografie mit Hilfe der Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Die Bestimmung der nativen Größe der Peptidasen sollte dabei über einen direkten Aktivitätsnachweis im Gel erfolgen. Die Analyse erfolgte anhand einer repräsentativen Auswahl, als Stämme kamen SJ2/3-1 (#073), B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748) zum Einsatz, die zueinander aufgrund von 16S-rRNA-Sequenz-vergleichen (siehe 3.1.2) die meisten Unterschiede aufwiesen.
Für den Aktivitätsnachweis wurden die Proben unter denaturierenden Bedingungen (2% SDS) im Gel aufgetragen, ohne sie vorher zu erhitzen. Eine Hitzedenaturierung der Proben (5 min bei 85°C) im SDS-Probenpuffer deaktivierte jegliche proteolytische Aktivität. Der Peptidasenachweis erfolgte nach der Auftrennung im
Kontakt-en großKontakt-en
s Stammes B3/1-2 (#418) eine ~55 kDa-Bande mit schwacher Aktivität und eine Doppelbande unterhalb von ~30 kDa mit ebenfalls schwacher Aktivität. Es wird vermutet, dass durch Autoproteolyse eine Zersetzung der Peptidase B in kleinere aktive Enzymteile stattgefunden hat. Dies ist auch von anderen Serinpeptidasen bekannt (Arnorsdottir et al., 2002). Eine Verifizierung wurde nicht vorgenommen.
Zymogramm (siehe 2.6.10). Eine direkte Zymografie, bei der die Auftrennung und der Aktivitätsnachweis in PA-Gelen mit copolymerisiertem Substrat erfolgten, war nicht erfolgreich. Die Peptidasen konnten offensichtlich aufgrund ihrer hohen Affinität zu den copolymerisierten Proteinen im Gel nicht aufgetrennt werden und bildeten einen hochmolekularen Schmier im aktivgefärbten Gel.
In allen drei genannten Stämmen konnten bei der Analyse mittels SDS-PAGE und anschließender Kontakt-Zymografie in den Kulturüberständen zwei Aktivitätszonen festgestellt werden (siehe bspw. Abb. 13). Das Molekulargewicht ließ sich mit ca. 55 kDa und ca. 35 kDa nur ungefähr ermitteln, da die Aktivitätszonen ein
Wirkungsbereich aufwiesen. Diese Aktivitäts-Banden konnten auf die beiden aktiven Fraktionspools durch Phenylsepharose-Chromatografie zurückgeführt werden. Somit lässt sich eine direkte Zuordnung der Aktivitätsbande, die bei ca. 35 kDa auftritt, zu der Peptidase A bei den drei untersuchten Stämmen schlussfolgern. Dasselbe gilt für die Peptidase B, die der Aktivität bei 55 kDa zugeordnet werden konnte.
Eine längere Lagerung der Proben in 30 mM Tris-HCl >4 Monate reduzierte nicht nur die Aktivität, sondern es konnten auch Veränderungen hinsichtlich des Musters der Aktivitätsbanden beobachtet werden. So zeigte die angereicherte Probe von Peptidase B de
Abb. 13: SDS-PAGE der zellfreien Kultur (ZK) und den Phenylsepharosefraktionspools A (PA) und B (PB) des Stammes SJ2/3-1 (#073) und B12/10-1 (#748). a: Silbergefärbtes Polyacrylamidgel;
b: Kontakt-Zymogramm mit Peptidase-Aktivitätszonen, durch grafische Aufhellung hervorgehoben.
Die Position einiger Banden der Proteinleiter wurde mit weißen Strichen markiert. Marker = PageRuler Prestained Protein ladder.
3.3
3.3 Molekularbiologische Identifizierung von Subtilisin-ähnlichen PeptidasenMolekularbiologische Identifizierung von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen