Molekulargenetische Untersuchung von Genen der Phase I- und Phase II-Enzyme bei Lungenemphysem

der Universität Bremen

Molekulargenetische Untersuchung

von Genen der Phase I- und Phase

II-Enzyme bei Lungenemphysemen

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

-Doctor rerum naturalium-

vorgelegt dem

Fachbereich Biologie/Chemie

der Universität Bremen

von

Ich bedanke mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. W. Schloot für die

Überlassung des Themas und die vielfältigen Anregungen, die zum

Gelingen dieser Arbeit beitrugen.

Herrn Prof. Dr. D. Beyersmann danke ich für die Übernahme des

Koreferats und die Möglichkeit meine gentechnischen Arbeiten in seinen

Laborräumen durchführen zu können.

Ein besonderer Dank gilt meiner Frau Doris Nordhusen, die mit viel

Geduld und Liebe meine ständigen Launen ertragen und darüber hinaus

einen wesentlichen Teil der Korrektur übernommen hat.

Eine wichtige Ansprechpartnerin war mir meine Kollegin Andrea Mehles,

mit der ich wichtige Fragen meiner Arbeit diskutieren konnte, dafür vielen

Dank.

Des weiteren möchte ich mich bei den Mitgliedern der Arbeitsgruppe von

Prof. Dr. D. Beyersmann dafür bedanken, dass sie mich so freundlich

aufgenommen und unterstützt haben.

Ich danke der Hans-Böckler-Stiftung, die meine Dissertation ideell und

finanziell erst ermöglicht hat. Dabei gilt mein besonderer Dank Werner

Fiedler für seine freundliche Unterstützung und Frau Prof. Dr. K Nixdorff,

die mir als Vertrauensdozentin hilfreich zur Seite stand.

Allen nicht Genannten , die mir während der Anfertigung der Doktorarbeit

in jeglicher Art geholfen haben, sei hiermit ebenfalls gedankt.

2 Material ______________________________________________________________ 12

2.1 Chemikalien ______________________________________________________ 12 2.2 Lösungen ________________________________________________________ 14 2.3 Geräte und Verbrauchsmaterial _____________________________________ 16 2.4 Probenmaterial ___________________________________________________ 19 2.5 Probenmaterial des Lungenemphysemkollektivs________________________ 19 2.6 Probenmaterial der Kontrollgruppe __________________________________ 20

3 Methoden _____________________________________________________________ 21

3.1 DNA-Extraktion aus Vollblut nach der Salzextraktionsmethode __________ 21 3.2 Quantifizierung der isolierten DNA __________________________________ 22 3.3 Quantifizierung der Primer _________________________________________ 22 3.4 Die Bestimmung der GSTM3 Genotypen ______________________________ 22

3.4.1 Polymerase Chain Reaktion (PCR) des GSTM3 Gens __________________ 23 3.4.2 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) _______________ 24 3.4.3 Tetra-Primer-PCR zum Nachweis der GSTM3*A- und GSTM3*B-Allele __ 25

3.5 Genotypisierung der Glutathion-S-Transferase Klasse ππππ-1 (GSTP1) _______ 27

3.5.1 PCR zur Amplifikation des Exon 5 zum Nachweis der Mutation 1578 A ŸG im GSTP1-Gen ________________________________________________________ 27 3.5.2 PCR zur Amplifikation des Exon 6 zum Nachweis der Mutation 2293 C ŸT im GSTP1-Gen ________________________________________________________ 29 3.5.3 ASO-PCR mit anschließendem RFLP zur Unterscheidung der Genotypen GSTP1*A*C und GSTP1*B*D ___________________________________________ 30

3.6 Genotypisierung der Glutathion-S-Transferasen Klasse Mu 1 (GSTM1) und der Klasse Theta 1 (GSTT1)_______________________________________________ 32

3.6.1 Genotypisierung der Glutathion-S-Transferasen Klasse µ (GSTM1) und der Klasse θ (GSTT1) mittels Multiplex-PCR ___________________________________ 33 3.6.2 GSTM1 Heterozygotennachweis mittels Long-Distance-PCR____________ 34 3.6.3 GSTT1 Heterozygotennachweis mittels Long-Distance-PCR ____________ 35 3.6.4 Duplikationsnachweis des GSTM1-Gens ____________________________ 36 3.6.5 Duplikationsnachweis des GSTT1-Gens ____________________________ 37

3.7 Untersuchung des Polymorphismus der mikrosomalen Epoxid-hydrolase (mEH) 38

3.7.1 PCR zur Amplifikation der Exons 3 und 4 des mEH-Gens ______________ 39 3.7.2 RFLP zum Nachweis der Mutationen im Exon 3 und 4 des mEH-Gen _____ 40

3.8 Genotypisierung des Cytochrom-P450 2D6- (CYP2D6) Poly-morphismus___ 41

3.8.1 Nachweis des CYP2D6*3-Allels mittels Tetra-Primer-PCR _____________ 42 3.8.2 Nachweis des CYP2D6*4-Allels mittels PCR, ASO-PCR und RFLP-Analyse 43

3.8.3 Nachweis des CYP2D6*6-Allels mittels PCR und RFLP-Analyse ________ 45 3.8.4 Deletionsnachweis des CYP2D6-Gens (CYP2D6*5) mit Hilfe der

3.9 Nachweis der CYP1A1-Allele CYP1A1*2A und *3 mittels PCR und RFLP _ 48

3.9.1 Nachweis der CYP1A1-Allele CYP1A1*2B und *4 mittels PCR und RFLP 49

3.10 Untersuchung der GSTM3*A- und *B-Expression mit gentechnischen

Methoden ______________________________________________________________ 50

3.10.1 Beschreibung des pIRES2-EGFP-Vektors ___________________________ 50 3.10.2 Amplifikation der GSTM3-Allele GSTM3*A und GSTM3*B ___________ 51 3.10.3 Restriktionsverdau der GSTM3*A- und GSTM3*B-Fragmente und des

pIRES2-EGFP-Vektors __________________________________________________ 52 3.10.4 DNA-Gelextraktion_____________________________________________ 53 3.10.5 Ligierung der DNA-Fragmente mit dem pIRES2-EGFP-Vektor __________ 53 3.10.6 Erzeugung kompetenter E.coli-Zellen_______________________________ 54 3.10.7 Transformation mit dem ligierten Vektoren __________________________ 55 3.10.8 Plasmidextraktion ______________________________________________ 55 3.10.9 Zellkultur _____________________________________________________ 56 3.10.10 Transformation der humanen Zellinien A549 und HeLa mit der

rekombinierten Plasmid-DNA_____________________________________________ 57 3.10.11 Quantitative RT-PCR _________________________________________ 58 3.10.12 RNA-Präparation_____________________________________________ 58 3.10.13 Formaldehyd-Agarose Gelelektrophorese der RNA-Proben ___________ 59 3.10.14 DNase-Verdau und cDNA-Synthese______________________________ 60 3.10.15 Quantitative PCR zum Nachweis von Expressionunterschieden der GSTM3-Allele 61

3.11 Statistische Methoden ______________________________________________ 62

3.11.1 Bestimmung der Allelfrequenz ____________________________________ 62 3.11.2 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ___________________________________ 62 3.11.3 Bestimmung der Risikowahrscheinlichkeit (Odds ratio =OR) ____________ 63 3.11.4 Vierfelder -χ2-Test_____________________________________________ 64

4 Ergebnisse ____________________________________________________________ 66

4.1 Der Nachweis der GSTM3*A- und GSTM3*B-Allele mittels einer

Tetra-Primer-PCR ____________________________________________________________ 66 4.2 GSTM3-Expressionstudien _________________________________________ 67 4.3 Optimierung der quantitativen RT-PCR ______________________________ 68 4.4 Optimierung der Inkubationsdauer für den Expressionsvektor pIRES2-EGFP in A549- und HeLa-Zellen ________________________________________________ 71 4.5 Untersuchung der Expression der GSTM3*A- und GSTM3*B-Allele in A549- und HeLa-Zellen ________________________________________________________ 72 4.6 Genotypisierung der Gene der Glutathion-S-Transferase Klasse µ (GSTM1) und der Klasse θθθθ (GSTT1) ________________________________________________ 75

4.6.1 Genotypisierung der GSTM1- und GSTT1-Gene mittels Multiplex-PCR ___ 75 4.6.2 Der GSTM1-Heterozygotennachweis _______________________________ 76 4.6.3 Nachweis der GSTM1-Duplikation und Entwicklung einer Screening-Methode 78

4.6.4 Lokalisierung und Eingrenzung der GSTT1-Deletion durch PCR-Kartierung 80 4.6.5 Nachweis der GSTT1-Duplikation _________________________________ 82

4.8 Genotypisierung der mikrosomalen Epoxidhydrolase (mEH) _____________ 88 4.9 Genotypisierung des Cytochrom P450 2D6-Gens _______________________ 89

4.9.1 Bestimmung des CYP2D6*3-Allels mittels Tetra-Primer-PCR ___________ 90 4.9.2 Nachweis des CYP2D6*4-Allels mittels PCR und RFLP _______________ 91 4.9.3 Nachweis der CYP2D6-Deletion die zum CYP2D6*5-Allel führt mittels Mutiplex-Long-Distance-PCR (MLDP) _____________________________________ 91 4.9.4 Bestimmung der Mutation des CYP2D6*6-Allels mittels Tetra-Primer-PCR 92 4.9.5 Nachweis der CYP2D6 Duplikation mit Hilfe einer Multiplex-Long-Distance-PCR 93

4.10 Statistische Auswertung der Genotypisierungen ________________________ 94 4.11 Allel- und Genotypenverteilung des GSTM3-Gens ______________________ 94

4.11.1 GSTM3-Genotypisierung ________________________________________ 96

4.12 Bestimmung der Allel- und Genotypenverteilung des GSTM1-Gens _______ 99

4.12.1 Statistische Auswertung der GSTM1-Genotypisierung ________________ 101

4.13 Bestimmung der Allel- und Genotypenverteilung des GSTT1-Gens _______ 103

4.13.1 Statistische Auswertung der GSTT1-Genotypisierung _________________ 106

4.14 Bestimmung der Allel- und Genotypenverteilung des GSTP1-Gens _______ 108

4.14.1 Statistische Auswertung der GSTP1-Genotypisierung _________________ 110

4.15 Bestimmung der Allel- und Genotypenverteilung des CYP1A1-Gens ______ 112

4.15.1 Statistische Auswertung der CYP1A1-Genotypisierung _______________ 114

4.16 Bestimmung der Allel- und Genotypenverteilung des CYP2D6-Gens ______ 115

4.16.1 Statistische Auswertung der CYP2D6-Genotypisierung _______________ 118

4.17 Mutations- und Genotypenverteilung des mEH-Gens___________________ 119

4.17.1 Statistische Auswertung der mEH-Genotypisierung___________________ 124

4.18 Allgemeines Risiko durch den Konsum von Zigaretten _________________ 126

4.18.1 Vergleich von Genotypen zwischen Rauchern und Nichtrauchern _______ 126

4.19 Multivariaten-Analyse ____________________________________________ 129

5 Diskussion ___________________________________________________________ 133

5.1 Die Phase-I-Gene der Cytochrom P450-Familie _______________________ 133 5.2 Der Cytochrom P450 2D6 (CYP2D6) Polymorphismus _________________ 134

5.2.1 Vergleich der CYP2D6-Genotypenverteilung bei Kontroll- und

Lungenemphysemkollektiv im Vergleich mit anderen Studien __________________ 136

5.3 Der Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) Polymorphismus _________________ 139

5.3.1 Häufigkeitsverteilung der CYP1A1-Genotypen beim Kontroll- und

Lungenemphysemkollektiv im Vergleich zu anderen Studien ___________________ 141

5.4

Der Polymorphismus der mikrosomalen Epoxidhydrolase (mEH)

5.4.1 Genotypenfrequenz für die Lungenemphysempatienten und das

Kontrollkollektiv im Vergleich mit anderen Studien __________________________ 145 5.4.2 Biologische Plausibilität für einen Zusammenhang zwischen der

Lungenemphysemerkrankung dem Polymorphismus des mEH-Gens _____________ 148

Transferasen _________________________________________________________ 150 5.5.3 Die Deletion und Duplikation der Glutathion-S-Transferasen der Klasse Mu1 und Theta 1 __________________________________________________________ 152

5.6 Der genetische Polymorphismus der Glutathion-S-Transferase Klasse µ 1 (GSTM1) _____________________________________________________________ 160

5.6.1 Häufigkeitsverteilung der GSTM1-Genotypen _______________________ 161 5.6.2 Häufigkeitsverteilung des GSTM1-Genotypen bei Lungen-emphysempatienten 162

5.6.3 Die homozygote GSTM1-Deletion als Risikofaktor für die Entstehung des Lungenemphysems im Vergleich mit anderen Studien_________________________ 163 5.6.4 Biologische Effekte des GSTM1-Polymorphismus ___________________ 164

5.7 Der genetische Polymorphismus der Glutathion-S-Transferase Theta 1

(GSTT1) ______________________________________________________________ 167

5.7.1 Die Häufigkeitsverteilung der GSTT1-Genotypen bei den Kontrollen und im Vergleich mit anderen Studien ___________________________________________ 168 5.7.2 Die Häufigkeitsverteilung der GSTT1-Genotypen im

Lungenemphysemkollektiv und im Vergleich mit anderen Studien _______________ 168 5.7.3 Der GSTT1-Polymorphismus als Risikofaktor für die Entstehung des

Lungenemphysems ____________________________________________________ 169 5.7.4 Mögliche molekularbiologische Mechanismen der epidemiologischen

Assoziation des GSTT1-Polymorphismus __________________________________ 172

5.8 Der genetische Polymorphismus der Glutathion-S-Transferase ππππ (GSTP1)_ 174

5.8.1 Häufigkeiten der GSTP1-Genotypen im Kontroll- und Patientenkollektiv im Vergleich mit anderen Studien ___________________________________________ 176

5.9 Der GSTM3-Polymorphismus ______________________________________ 179

5.9.1 Häufigkeitsverteilung der GSTM3-Genotypen im Kontroll- und

Lungenemphysemkollektiv ______________________________________________ 180

5.10 Ausblick ________________________________________________________ 183

6 Zusammenfassung _____________________________________________________ 185 7 Literatur ____________________________________________________________ 187

Einleitung

Chronisch obstruktive Lungenerkrankungen gehören neben den kardiovaskulären Erkrankungen zu den größten Volkskrankheiten weltweit (Morr, 2001).

Das Lungenemphysem ist durch anatomische Kriterien charakterisiert und setzt eine dauerhafte und irreversible Erweiterung der Atemwege distal des Bronchioli terminales voraus, die von einer Destruktion der Alveolarsepten ohne relevante Fibroisierung begleitet ist (Gillissen, 2000). Da diese morphologischen Ver-änderungen schwierig nachzuweisen sind, wird die Diagnose meistens indirekt aufgrund klinischer Zeichen wie Lungenüberblähungen (Fassthorax), Tracheo-bronchialkollaps und niedriger Diffusionskapazität sowie dem radiologischen, gegebenenfalls dem computertomographische Befund gestellt (Ullmer und Solèr, 1999, Fletcher and Pride, 1984).

In der internationalen und nationalen Literatur werden das Lungenemphysem und die chronische Bronchitis oft unter dem Begriff der COPD „chronic obstructive pulmonary disease“ verwendet (Jeffery, 2000, ATS (American Thoracic Society), 1995; Gillissen, 2000). Beide Erkrankungen zeigen ähnliche Veränderung bei der Untersuchung der Lungenfunktion, zudem sind die äußeren Symptome wie Husten mit Auswurf gleich (Fabbri et al, 1998), und es werden ähnliche pathophysiologische Mechanismen bei der Entstehung vermutet (Siafakas et al., 1995). In einigen Studien wird auch das Asthma bronchiale mit unter diesen Begriff gefasst, dies ist aber nicht allgemein anerkannt (Fletcher and Pride, 1984). Die Schwierigkeit bei der Berücksichtigung des Asthma bronchiale innerhalb des COPD-Begriffes ist dadurch begründet, dass die Pathophysiologie und Pathogenese gegenüber den beiden anderen Erkrankungen unterschiedlich ist, und die Möglichkeit der Rückbildung sowie der Therapie besteht (American Thoracic Society, 1995). Zudem sind die Symptome nach einmaliger Gabe eines ß-Agonisten beim Asthma bronchiale zum größten Teil reversibel, während die chronische Bronchitis und das Lungenemphysem keine Reversibilität zeigen (Barnes, 1997).

Weltweit gehört die COPD zu den führenden Todesursachen. Sie nimmt in den USA nach Herz-, Kreislauferkrankungen, malignen Tumoren und Schlaganfällen z. Z. den vierten Rang in der Mortalitätsstatistik ein (NLHEP, 1998). In einer Studie, die von der Harvard School of Public Health zusammen mit der WHO und der Weltbank durchgeführt wurde, wird die COPD in einer Vorausschätzung ausgehend von 1990

auf das Jahr 2020 in der Mortalitätsreihung vom 6. auf den 3. Platz steigen (Lopez and Murray, 1998; Murray and Lopez, 1997). Zudem gehen die Autoren der Studie davon aus, dass die Morbidität gemessen am DAILY (disability adjusted life years) sich verdoppeln wird, so dass die COPD an die fünfte Stelle der 15 weltweit führenden Krankheiten rücken wird.

Neben der Erhöhung der Mortalitätsrate haben Querschnittsuntersuchungen in Deutschland gezeigt, dass bei etwa 14% der erwachsenen Bevölkerung mit einer Abweichung der Lungenfunktion zu rechnen ist (Morr, 2001). Die Häufigkeit des Emphysems wird nach Rieben und Fritze (1985) mit 10% angegeben und es wird in schwächerer Ausprägung bei bis zu 65 % der erwachsenen Männer nachgewiesen Thurlbeck et al., 1974). Zurzeit wird die Anzahl der Personen in Deutschland, die an einem klinisch relevanten Lungenemphysem leiden mit 400.000 angegeben (Konietzko und Fabel, 2000).

Der wesentliche ätiologische Faktor bei der Genese des Lungenemphysems ist das Rauchen und wird mit 80-90 % für die Entstehung einer COPD verantwortlich gemacht (Ullmer und Solér, 1995; DHHS, 1984). So konnte für die USA gezeigt werden, dass die altersadjustierte Mortalität für Lungenerkrankungen pro 100.000 Personen bei männlichen Rauchern bei 104 und bei weiblichen bei 62 lag, während die Zahlen von Nichtrauchern mit 9 (Männer) bzw. 5 (Frauen) pro 100.000 um den Faktor 10 geringer war (Gillissen, 2000). Die US-Gesundheitsbehörde formulierte erst 1984 den ersten Kausalzusammenhang zwischen der Genese der COPD und dem Zigarettenkonsum (DHHS, 1984). Wesentliche toxische Substanzen, die beim Zigarettenkonsum in den Organismus aufgenommen werden, sind polyzyklische Kohlenwasserstoffe, aromatische Amine, Nitrosamine sowie eine Vielzahl von Schwermetallen und Radikalen, die eine zyto- und genotoxische Wirkung ausüben (Hoffman and Hecht, 1990, McClellan, 1996, Hecht, 1999, Bergen and Caporaso, 1999). Die epithelialen Gewebe und hier ganz besonders die der Lunge, die neben dem Larynx und der Pharynx als erstes mit diesen Schadstoffen exponiert werden, sind auf ein wirkungsvolles Entgiftungssystem angewiesen, um die schädlichen Effekte abwehren zu können. Neben dem Rauchen spielen Arbeitsplatz- und Umwelt-expositionen eine wesentliche Rolle als Risikofaktoren für die Genese der COPD.

So konnte nachgewiesen werden, dass eine chronische Exposition mit gas- und staubförmigen Schadstoffen eine wesentliche ätiologische Rolle bei der Entstehung eines Lungenemphysems spielt (Ruckby et al., 1984; Huang et al., 1994). Hierzu zählen im wesentlichen Getreidestaube (Erkinjuntti-Pekkanen et al., 1998), Isocyanate, Cobalt, Kadmium, Staube aus dem Kohle- und Goldbergbau und andere

Mineralstaube, Holzstäube (besonders Rotzedern) sowie Papier- und Baumwollstäube (Sigsgaard et al., 1992, Siafakas et al., 1995; Rothenbacher et al., 1997; Becklade, 1989; Carrozzi et al., 2000; Hendrick, 1997), wobei zu bemerken ist, dass das Risiko durch diese Expositionen mit den einzelnen Stoffe bzw. Stoffgemische geringer ist, als das Risiko des Rauchens, und eine Mischexposition für die Umwelt- und Arbeitsplatzexpositionen mit dem Rauchen kann in der Regel nicht ausgeschlossen werden.

Für die Pathogenese des Lungenemphysems scheint somit ein äußerer Reiz, der durch verschiedene Inhalationsnoxen gegeben ist, notwendig zu sein, um zu einer chronischen Inflammation der Atemwege, des Lungenparenchyms und der Lungengefäße zu führen (Rahman and MacNee, 1999, Jeffery, 1990). Während dieses Prozesses kommt es zu einer Akkumulation und Vermehrung von Makrophagen (Gee et al., 1980, Hoidal and Niewoehner, 1983, Cambell and Wald, 1983), T-Lymphozyten, die überwiegend aus CD8 (+)T-Lymphozyten bestehen (Kemeny et al., 1999) und neutrophilen Granulozyten (Corrigan and Kay, 1991, McNee and Selby, 1993). Diese setzten während des Entzündungsprozesses vermehrt Proteasen frei (Shapiro, 1995, Snider et al., 1991), die bei einem Mangel an Antiproteasen (Wilkens und Sybrecht, 2001, Shapiro, 1995), der angeboren oder erworben sein kann, zur Zerstörung des Lungenparenchyms führt (Shapiro, 1995, Kimbel, 1980, Ulmer und Solér,1999), wodurch die Alveolarwände ihre Elastizität verlieren und es zur Überblähung der distalen Atemwege kommt (Gillooly and Lamb, 1993, Lamb et al., 1993). Bei Fortbestehen der exogenen Exposition setzt eine progressive Verminderung des expiratorischen Atemflusses ein, die durch eine permanente Destruktion des Lungenparenchyms mit Verlust der alveolären Septen zum expiratorischen Kollaps kleiner Atemwege führt (Wilkens und Sybrecht, 2001, Kim et al., 1991 Gillooly and Lamb, 1993, Lamb et al., 1993).

Nach der Protease/Antiprotease-Hypothese wird die Emphysementstehung durch ein Ungleichgewicht von proteolytischen Enzymen und antiproteolytischen Schutz-Mechanismen verursacht (Shapiro, 1995, Ishizaki and Ameshima, 1995, Snider, 1991). Diese Endopeptidasen (Proteasen) haben die Aufgabe Proteine durch Hydrolyse der Peptidbindungen zu degradieren. Die normale physiologische Funktion dieser Proteasen besteht eigentlich in der Abwehr von infektiösen Mikroorganismen (Gadeck and Pacht, 1996). Entscheidend beteiligt an der Entstehung des Lungenemphysems ist die neutrophile Elastase, die von neutrophilen Granulozyten freigesetzt wird (McNee and Selby, 1993, Ishizaki and Ameshima, 1995, Campbell and Wald, 1983). Aber auch andere Proteasen sind in diesem Zusammenhang von Bedeutung, soweit diese nicht inhibiert werden (Gillisson, 2000). Normalerweise befinden sich nur wenige freie Elastasen im Respirationstrakt, aber

deren Konzentration kann aufgrund von Entzündungsprozessen stark ansteigen und damit pathophysiologisch bedeutsam werden (Shapiro, 1995, McNee and Selby, 1993, Janoff, 1985). Blue und Janoff (1978) konnten zusätzlich einen Zusammen-hang zwischen Zigarettenkonsum und einer gesteigerten proteolytischen Aktivität nachweisen, die auf eine Akkumulation von neutrophilen Granulozyten und einer gesteigerten Freisetzung von Proteasen zurückzuführen ist. Neben dem Anstieg der Elastase-Konzentration aufgrund von Entzündungsprozessen und chronischen Zigarettenkonsum kann eine Defizienz an Antiproteasen das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Proteinen zugunsten der Proteasen verschieben (Hornebeck et al., 1984). Ursache des Antiproteasenmangels kann ein genetischer Defekt sein, wie beim α1-Antitrypsin-Mangel (Zhou and Fischer, 2000), sowie eine Inaktivierung von Antiproteasen durch Oxidationprozesse, wie sie hauptsächlich durch Tabak-konsum verursacht werden (Janoff, 1986, Niewoehner and Hoidal, 1983, White et al., 1979). Diese Inaktivierung der Antiproteasen führt zu einem Übergewicht von Proteasen, die die Destruktion des Lungenparenchyms zur Folge hat (Weiss, 1989). Antiproteasen spielen als Inhibioren der Proteasen bei der Aufrechterhaltung dieses Gleichgewichts eine wichtige Rolle (Shapiro, 1995). Neben der bereits erwähnten α1-Antitrypsin sind weitere Antiproteasen an diesem Gleichgewicht beteiligt, wie die sekretorische Leukoprotease (SLPI) eine nicht-glykosylierende Serienprotease (Hubbard et al., 1991) und mehrere Metalloproteasen, die unter den Oberbegriff der „tissue inhibitors of metalloproteinases“ (TIMP´s) gefasst werden und zu denen das Cystatin C und das α2-Makroglobin gehören (Culpitt et al., 1999, Mulligan et al., 1993).

In der Pathogenese des Lungenemphysems spielte bisher nur der α1

-Antitrypsinmangel eine wichtige genetische Rolle. Dem Proteinase-Inhibitor α1

-Antitrypsin obliegt im wesentlichen die Aufgabe die Bindung und Inaktivierung der neutrophilen Elastase zu gewährleisten (Shapiro, 1995, Norman et al., 1997). Zur Zeit sind über 100 serologisch und teilweise genetisch determinierte Varianten bekannt. Die klinisch für das Lungenemphysem bedeutsame Z-Variante wird bei 95% aller kaukasischen Patienten mit α1-Antitrypsinmangel gefunden.

Die Z-Variante liegt mit ca. 3% in der nordeuropäischen Bevölkerung vor und stellt das häufigste Allel mit einem klinisch-pathologischen Bezug dar (Cox et al., 1995). Eine deutliche Assoziation zur Erkrankung an einem Lungenemphysem ist jedoch lediglich für homozygote Träger dieses Allels sowie der Null-Allele (5% aller Defizienz-Allele) beschrieben worden (Cox und Levison, 1988), während für die Allele M und S keine Hinweise für eine Prädisposition zur Entwicklung eines Lungenemphysems bekannt sind. Die Inzidenz der α1-Antitrypsin-Mangelkrankheit

Lungenemphysem nicht gleichzeitig an einem α1-Antitrypsinmangel leiden

(Seersholm et al., 1998), scheinen weitere genetische Faktoren in der Entstehung von Lungenemphysemen involviert zu sein. Somit erscheint es naheliegend, dass andere genetisch bedingte Enzympolymorphismen in die Pathogenese des Lungenemphysems involviert sind. Diese Hypothese wird auch dadurch unterstützt, dass nicht alle Raucher oder mit anderen Risikosubstanzen exponierte Personen an einer chronisch obstruktiven Lungenschädigung erkranken. Es ist naheliegend zu vermuten, dass genetisch bedingte Unterschiede bei der Entgiftung von Schadstoffexpositionen für die Entstehung des Lungenemphysems von Bedeutung sind.

Ein wirkungsvoller Mechanismus im Entstehen zyto- und genotoxischer Störungen stellt die Funktion der Phase I- und Phase II-Enzyme dar. Phase I-Enzyme werden vorwiegend durch die Gene des Cytochroms P450 repräsentiert und haben bei der Bildung reaktiver Intermediärprodukte eine wichtige Bedeutung. Demgegenüber haben Phase II-Enzyme eine detoxifizierende Funktion. Insbesondere bei Vorliegen von Mutationen innerhalb der Phase I- und Phase II-Gene kann dies zu veränderten enzymkinetischen Eigenschaften führen, die zu einer Akkumulation schädigender Metabolite beitragen können und ein hohes Maß pathogener Effekte erwarten lassen.

Einen wichtigen pathogenetischen Faktor bei Lungenerkrankungen stellt der Polymorphismus der Glutathion S-Transferasen (GST) dar. Bereits 1997 berichteten Baranova et al. über das signifikant häufigere Auftreten der homozygoten Deletion des GSTM1-Gens bei Patienten mit chronischer Bronchitis. Einen höheren Level polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe beobachteten Kato et al. (1995) bei Personen mit einem GSTM1-Nullgenotyp, was einen wichtigen Faktor zur Induktion von Mutationen darstellen kann. Zahlreiche Arbeiten belegen, dass das Fehlen des GSTM1-Gens mit einem erhöhten Risiko für das Entstehen von Lungenkarzinomen verbunden ist (Kawajiri et al., 1995; Kihara et al., 1995, Nakajima et al., 1995; Seidegard et al., 1990), insbesondere dann, wenn weitere genetische Cofaktoren (z. B. GSTT1-Nullgenotyp) involviert sind (Jourenkova et al., 1997; Saarikoski et al., 1998; To-Figueras et al., 1997). Inwieweit dem GSTM1-Polymorphismus eine Bedeutung bei der Prädisposition für ein Lungenemphysem zukommt ist bislang nicht geklärt. In der kaukasischen Bevölkerung sind ca. 50 % der Menschen nicht Träger des GSTM1-Gens, so dass hier ein wichtiger Risikofaktor für die Prädisposition lungenschädigender Effekte vermutet werden kann.

Ein weiterer genetischer Polymorphismus der im Zusammenhang mit dem GSTM1-Gen häufig mit untersucht wird, ist der Glutathion-S-Transferase Theta 1 (GSTT1). Wie beim GSTM1-Polymorphismus liegt auch hier eine Deletion des Gens vor, die bei ca. 20% der kaukasischen Bevölkerung vorkommt (Brockmöller et al., 1996). Wiencke et al. (1995) konnten nachweisen, dass das GSTT1 eine Schutzfunktion gegenüber oxidativen Stress ausübt. Da GSTT1 außer in der Leber auch in Erythrozyten und weißen Blutzellen exprimiert wird, aber nicht in Geweben der Lunge, kann sie innerhalb der Blutgefäße die Konzentration von Oxidantien reduzieren und somit als ein wirkungsvoller Schutzmechanismus zur Verhinderung der Inaktivierung von Antiproteasen dienen, die durch Oxidationsprozesse verursacht werden können (Beatty et al., 1980).

Die Klasse µ der Glutathion S-Transferasen besteht aus fünf funktionsfähigen Mitgliedern, die alle auf Chromosom 1p13 lokalisiert sind (Pearson et al., 1993; Ross et al.1993), sie liegen dort in einem Kluster vor und haben folgende Anordnung 5´-GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-GSTM3-3´(Xu et al., 1998). Für die einzelnen Mitglieder dieser Klasse ist bekannt, dass sie zum Teil große Substrat-überschneidungen aufweisen (Matthias et al., 1998), dies trifft besonders für das GSTM1- und GSTM3-Enzym zu, die beide in der Lunge exprimiert werden (Anttila et al., 1995, Nakajima et al., 1995). Das GSTM3- ist wie das GSTM1-Enzym an der Entgiftung polyzyklischer Kohlenwasserstoffe (Ketterer et al., 1992) und reaktiven Sauerstoffspezies und Radikalen der Lipidoxidation beteiligt (Hussey et al., 1993, Berhane et al., 1994, Comstock et al., 1994). Auch für das GSTM3-Gen konnte ein Polymorphismus nachgewiesen werden, hier liegt eine drei Basenpaar-Deletion im Intron 6 des Gens vor, die zur Generierung einer Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle für Ying Yang 1 (YY1) führt, wobei das mutierte Allel als GSTM3*B und das Wildtypallel als GSTM3*A bezeichnet werden (Inskip et al 1995). YY1 ist ein Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der die Expression von vielen Genen beeinflusst (Flanagan, 1995, Becker et al., 1994). Es wird vermutet das GSTM3*A und GSTM3*B verschieden stark exprimiert werden und dadurch ein Unterschied in der Effizienz der Detoxifikation entsteht (Yengi et al., 1996). Für YY1 wird im Zusammenhang mit der GSTM3-Expression sowohl eine stimulierende als auch eine reprimierende Wirkung vermutet (Yengi et al., 1996, Inskip et al 1995), allerdings liegt zur Zeit noch kein eindeutiger Beweis für eine der beiden Hypothesen vor.

Ebenso liegen bisher noch keine Untersuchungen über unterschiedliche gewebsspezifische Expressionsmuster der beiden Genvarianten vor. Anttila et al. (1995) konnten nachweisen, dass im Lungenparenchym von Rauchern und Ex-Rauchern, die kurz zuvor mit dem Zigarettenkonsum aufgehört hatten, in Verbindung mit der homozygoten GSTM1-Deletion ein signifikant erniedrigte GSTM3-Expression

zu beobachten ist. Ein weiterer Zusammenhang konnte für GSTM1*A und GSTM3*B, die miteinander signifikant gekoppelt sind, gefunden werden. Dieser enge Zusammenhang der beiden Gene auf genetischer und regulatorischer Ebene sowie die Substratüberschneidungen und das gemeinsame Vorkommen im Lungenepithel lassen vermuten, das ein Zusammenhang zwischen obstruktiven Lungenerkrank-ungen und diesen Polymorphismen einzeln oder in Kombination gegeben sind. Auch die Glutathion-S-Transferase Pi 1 (GSTP1) ist an der Verstoffwechselung von zyto- und genotoxischen Substanzen des Tabakrauches beteiligt. Zusätzlich wird es in den Alveolen, in alveolären Makrophagen und im respiratorischen Bronchioli stark exprimiert (Cantlay et al., 1994). Auch für GSTP1 wurde ein Polymorphismus nachgewiesen, der zu einem Aminosäureaustausch von Isoleucin 105 zu Valin und von Alanin 114 zu Valin führt. Die Mutationen befinden sich in Exon 5 und 6 des Gens (Board et al., 1989). Der mögliche Austausch an Position 105 des Protein ist daher von Interesse, weil sie sich in der hydrophoben Substratbindungsstelle befindet, was beträchtlichen Einfluss auf die Art der chemischen Reaktion hat (Johannson et al., 1998). Individuen mit dem 105Val-Allel haben ein höheres Risiko an einem Lungentumor zu erkranken als Personen mit dem 105Ils-Allel (Ryberg et al., 1997).

Einen weiteren enzymatischen Mechanismus zum Schutz vor oxidativem Streß stellt die mikrosomale Epoxidhydrolase (mEH) dar. In einer Studie an Patienten mit chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen wurden bei Personen, die an einem Lungenemphysem litten, mehr Individuen ermittelt, die eine geringer Enzymaktivität der mikrosomalen Epoxidhydrolase aufwiesen als in der Kontrollgruppe beobachtet wurden (Smith und Harrisson, 1997). Demnach kann vermutet werden, dass Personen mit geringer Aktivität der mEH und einem GSTM1-Nullgenotyp ein besonders hohes Risiko für die Bildung lungenschädigender Metabolite tragen.

Darüber hinaus ist bekannt, dass an der Aktivierung von Substanzen des Zigarettenkonsums, z.B. Benzo(a)pyren und polyaromatische Kohlenwasserstoffe, die Arylhydrocarbon Hydroxylase (AHH bzw. CYP1A1) beteiligt ist, und neuere Untersuchungen bei Patienten mit Lungentumoren weisen darauf hin, dass insbesondere der Genotyp (CYP1A1*2A/*2A) signifikant häufiger auftritt (Kiyohara et al., 1998). Neben dem bislang unbekannten Einfluss des CYP1A1-Polymorphismus als prädisponierenden Faktor bei der Entstehung des Lungenemphysems, kommt dem CYP2D6-Polymorphismus eine ähnliche Bedeutung in der Rolle lungen-schädigender Effekte zu.

5-10 % der kaukasischen Bevölkerung verstoffwechseln das Substrat Debrisoquine nicht und werden dem „poor metabolizer“ (PM) Phänotypen zugerechnet, dieser Phänotyp wird autosomal rezessiv vererbt (Daly et al., 1996) und ist durch mehrere Allele determiniert, deren Produkte keine Enzymaktivität aufweisen (Sachse et al., 1997, Griese et al., 1998, Sachse et al., 1998, Bartsch et al., 2000). Mehrere epidemiologische Studien haben gezeigt, dass die PM-Allele CYP2D6*3, *4, *5, *6 für 93-97,5 % aller inaktiven Allele in der kaukasischen Bevölkerung kodieren (Marez et al., 1997, Sachse et al., 1997, Griese et al., 1998, Sachse et al., 1998). Individuen mit diesem Phänotypen haben ein geringeres Risiko an Lungenkrebs zu erkranken (Ayesh et al., 1984). Das CYP2D6-Enzym ist für die Aktivierung von Tabak-spezifischen Nitrosaminen und Nikotin verantworlich (Barsch et al. 2000). Neben dem PM-Phänotyp sind noch drei weitere Phänotypen beschrieben worden, der „extensive metabolizer“ (EM), der „ultrarapid metabolizer“ (UM) und der „intermediate metabolizer“ (Broly et al., 1991, Sachse et al., 1997). In drei Studien konnte eine signifikante Assoziation zwischen dem EM-Phänotypen und der Lungenkrebserkrankung (Vineis et al., 1994, Bartsch and Hietanen, 1996, Ambrosone et al., 1996) festgestellt werden.

Zusammenfassend ergibt sich, dass die vorgestellten Enzympolymorphismen eine erbliche Disposition für die Entwicklung verschiedener Lungenerkrankungen, insbesondere des Lungenemphysems, beinhalten können. Daher erscheint es sinnvoll, hier weitere genetische Faktoren in der Pathogenese des Lungen-emphysems zu vermuten und zu untersuchen. Die medizinische Bedeutung für die Entstehung des Lungenemphysems, der hier untersuchten genetischen Polymor-phismen, soll in einer Fall-Kontroll-Studie überprüft werden. Ziel dieser Arbeit ist es, das Bindeglied zwischen Expositionen, wie das Rauchen, und der tatsächlichen Erkrankung zu untersuchen und somit mögliche genetische Dispositionen zu erkennen, die letzentliche eine frühere Diagnose ermöglichen.

Material

1.1 Chemikalien

Alle Chemikalien haben, wenn nicht anders angegeben, den Reinheitsgrad pro analysis (p.a).

Agar Serva

Agarosen:

DNA Agarose (100 bp - 23 kb) Biozym

Electrophoresis Purity Reagent Agarose (Ultra Pure DNA Grade) Bio-Rad

Small DNA Agarose (< 1 kb) Biozym

AmpliTaq DNA Polymerase mit 10x PCR Puffer (5 Units/µl) Perkin Elmer

Borsäure H3BO3 Merck

Calcium-Chlorid CaCl2 Serva

Dulbecco´s Modifiziertes Eagle Medium (high Glucose) Gibco EDTA (Ethylendiamin.tetraessigsäure) C10H12N2O8Na4 Sigma

Essigsäure 100 % (Eisessig) CH3COOH Merck

Ethanol absolut C₂H₅OH Merck

Ethidiumbromid (10 mg/ml) C₂₁H₂₀BrN₃ Gibco (3,8-Diamin..o-6-ethyl-5-phenylphenanthridiniumbromid)

Expand Long Template PCR System (5 Units/µl) Roch

Extran MA 01 alkalisch Merck

Fetales Kälberserum Serva

Ficoll Typ 400 Sigma

GeneAmp dNTPs (10 mM) Perkin Elmer

Glycerol 87 % C3H8O3aq. Fluka

Igepal CA 630 Sigma

Isopropanol C3H8O Acros

HotStarTaq DNA Polymerase Kit (5 Units/1µl) Qiagen

Hexamincobaldchlorid Serva

Kaliumchlorid KCl Merck

Kresolrot C21H18O5S Fluka

Luciferase Assay System Promega

Magnesiumchlorid Hexahydrat MgCl2 Sigma

Manganchlorid Serva

Mineralöl M-3516 (Light white oil) Sigma

Molekulargewichtsmarker: 3; Lambda DNA/EcoRI

(564- 21226 bp; 11 Fragmente; 0,5 mg DNA/ml) MBI 5; pBR322 DNA/BsuRI

(8 - 587 bp; 22 Fragmente; 0,5 mg DNA/ml) MBI VI;

(154- 2176 bp;15 Fragmente; 10,0 µg DNA/ml) Boehringer 8; pUC Mix

(19 - 1114 bp;17 Fragmente; 0,5 mg DNA/ml) MBI VIII;

(19 - 1114 bp;17 Fragmente; 10,0 µg DNA/ml) Boehringer 10; φX174 DNA/HinfI

(24 - 726 bp; 21 Fragmente; 0,5 mg DNA/ml) MBI 13; Lambda DNA/Eco47I

(308-8126 bp; 15 Fragmente 0,5 mg DNA/ml) MBI

N,N’-Methylenbisacrylamid (Bis) 2x C7H10N2O2 Serva

Natriumchlorid NaCl Riedel-de Haën

Natriumhydroxid Plätzchen NaOH Riedel-de Haën

Oligonukleotide sequenzspezifisch Applied

Proteinase K Boehringer Restriktionsendonukleasen:

MnlI (10 U/µl) MBI

SacI (10 U/µl) MBI

HindIII (10 U/µl) MBI

KpnI (10 U/µl) MBI

Rubidiumchlorid RbCl Serva

Salzsäure 37 % (rauchend) HCl Fluka

SDS (Dodecylsulfat Na-salt) C12H25O4SyNa Serva

Taq PCR Core kit (5 Units/1µl) Qiagen

TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin..) C6H16N2 Serva

TRIZMA Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) C4H11NO3 Sigma

Vektoren

PRL-TK-Vector Promega

PGL2-Control DNA Promega

2-PGF Clone Tech

Xylene cyanol FF C₂₅H₂₇N₂O₆S₂Na Sigma

Zelllinien HeLa, A549 DSMZ

1.2 Lösungen

EDTA (0,5 M) 18,6 g EDTA

ad 100 ml Aqua bidest

pH mit 10 N NaOH auf 8.0 einstellen

Entwickler-Lösung 3,0 % Natriumhydroxid 3 g

0,5 % Formaldehyd 1,35 ml

ad 100 ml Aqua bidest (Lösung frisch ansetzen.) Ethidiumbromid-Färbebad (13 mM)100 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml)

500 ml Entmin..eralisiertes Wasser

Fixier-/Stopplösung 10 % Ethanol (absolut)100 ml

0,5 % Eisessig 5 ml

Gelbeladungspuffer 6x (MBI) 0,2 % Bromphenolblau

0,2 % Xylencyanol

60,0 % Glycerol

60,0 mM EDTA

Gelbeladungspuffer 0,05 % Xylencyanol [Xylene cyanol FF]

0,10 % Kresolrot

0,25 % Tartazine

15,00 % Ficoll Typ 400

(Aufbewahrung bei Raumtemperatur) TAE-Puffer (Arbeitslösung: 1x)

TAE-Puffer (Stammlösung: 50x) 242 g Trisma Base

(Trisacetat) 57,1 ml Eisessig

100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) ad 1 l Aqua bidest

pH mit Eisessig auf 8,3 einstellen [Sambrook et al., 1989]

TBE-Puffer (Arbeitslösung: 1x)

TBE-Puffer (Stammlösung: 10x) 108 g TRIZMA Base

(Trisborat) 55 g Borsäure

40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) ad 1 l Aqua bidest

pH mit Eisessig auf 8,3 einstellen [verändert nach: Sambrook et al., 1989]

TE-Puffer (pH 7,5) 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA TKM1-Puffer (pH 7,6) 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM KCl 10 mM MgCl2 2 mM EDTA

TKM2-Puffer (pH 7,6) 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM KCl 10 mM MgCl2 400 mM NaCl2 2 mM EDTA TKM2-Puffer (pH 7,6) 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM KCl 10 mM MgCl2 400 mM NaCl2 2 mM EDTA SOB-Medium: 2% Trypton 0,5% Hefeextrakt 0,05% NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 - SOB-Agar-Platten: SOB-Medium 1,5% Agar - FSB-Medium: 10 mM Kaliumacetat (pH 7,5) 45 mM MnCl2 10 mM CaCl2 100 mM RbCl 3 mM Hexamin..coboltchlorid 10% Glycerol

Der pH-Wert wurde nur bei denjenigen Lösungen angegeben, bei denen er eingestellt wurde.

1.3 Geräte und Verbrauchsmaterial

Blutentnahmeröhrchen 9 ml S-Monovette

mit 1,6 mg Kalium-EDTA/ml Blut, steril Sarstedt

Einmal-Injektions-Kanülen Gr. 2 (0,80 x 40 mm) Sterican B. Braun

Einmalspritzen Omnifix 10 ml Luer B. Braun

Elektrophoresekammer senkrecht (PAA), Min..i protean II Bio-Rad

Elektrophoresekammern: Gel Electrophoresis Apparatus GNA-100Pharmacia Horizontal Gel Electrophoresis System Horizon 11x14 Gibco BRL Horizontal Gel Electrophoresis System Horizon 20x25 Gibco BRL Horizontal Gel Electrophoresis System Horizon 58 Gibco BRL Erlenmeyerkolben (25, 50, 100, 250, 500 ml) Schott Filme 665 Professional (s/w) ISO 80/20° (8,5x10,8 c m) Polaroid

Folien zum Einschweißen PF 04 no name

Folieneinschweißgerät Polystar 100GE Rische + Herfurth

Glasplatten Mini PII Bio-Rad

Handschuhe Peha-soft

Hitzesterilisator ST-6200 Heraeus

Inkubationswannen no name

Inkubator GFL

Kühlschrank KU1710 Liebherr

Küvettentrockner Roto-Vette 310 Hellma

Laborzentrifuge 3K12 Sigma

Löffelspatel Bochem Luminometer Lumac

Magnetrührer Combimag RCT IKA

Magnetrührstäbe (10, 30, 50, 60 mm) no name Magnetstab-Entferner no name Meßkolben (10, 25, 50, 100, 250, 1000 ml) Brand Meßzylinder (10, 25, 50, 100, 250 ml) Brand Mikrowellen R-5V12 Sharp NN-M337W Panasonic

Parafilm „M“ American National Can

PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml, einzeln, mit Deckel Biozym

Petrischalen/Zellkulturschalen Nunc pH-Meter pH523 WTW Pipetten: Comforpette (10, 20, 100, 1000 µl) Eppendorf Varipette (0,5-10, 10-100;100-1000 µl) Eppendorf Pipettenspitzen (20, 100, 1000 µl) Eppendorf no name Pipettenspitzenboxen Eppendorf Pipettenständer Nr. 32 Schäfer Potter S Braun

Präzisionsküvetten Quarzglas Suprasil Nr. 114-QS, K281 Hellma

Präzisionswischtücher Kimwipes Lite Kimberly-Clark

Reaktionsgefäße Nr. 3810; 1,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäße Nr. 72.699; 0,5 ml Sarstedt

Reaktionsgefäße Safe-Lock 2,0 ml Eppendorf

Reaktionsgefäßzentrifuge Capsule HF-120 Tomy Seiko

Rotfilter A003 Cokin

Schüttelgerät Reax 2000 Heidolph

Schüttler GFL3018 GFL

Sicherheitsschrank Düperthal

Skalpell, Sterilskalpell Aesculap

Sofortbildkamera Land Camera MP-4 Polaroid

Spacer Bio-Rad

Spannungsquellen: Electrophoresis power

supply PS9009 Gibco

Electrophoresis power supply ST504 Gibco Model 200/2.0 Power Supply Bio-Rad

ohne Bezeichnung Hölzel

Spritzenfilter NALGENE 0,2 µm Porengröße, steril Nalge Comany

Spülmaschine Desinfektor G7736 Miele

Trio-Heated Lid Biometra

Trio-Thermoblock Biometra

Ultraschallbad Heat Systems Ultrasonics Devices

UV-Tisch Camag Reprostar II Camag

Vakuumkonzentrator Speed vac SVC 100 Savant

Vibrationsmischer Jürgens

Waage Sartorius portable PT1200 Sartorius

Wägeschälchen no name

Wasseraufbereitungsanlage Milli-Q Millipore

Wasserbad M6 Lauda

Zentrifugenröhrchen 15 ml Sarstedt

1.4 Probenmaterial

Alle untersuchten Personen sind wohnhaft im Lande Bremen oder dessen unmittelbaren Umgebung und nach Angabe der Personen kaukasischer Abstammung, diese umfaßt die weiße Bevölkerung, die ihre Wurzeln in Europa, Nordafrika, Indien oder dem Nahen und Mittleren Osten hat (Zetkin-Schaldach, 1985).

1.5 Probenmaterial des Lungenemphysemkollektivs

Insgesamt standen 125 Blutproben von Patienten mit einem chronisch obstruktiven Lungenemphysem zur Verfügung. Das Blut der Patienten wurde in hiesigen Krankenhäusern und bei niedergelassenen Lungenfachärzten gewonnen und uns von Frau Dr. Manuela Prüß aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. H. Walter (Universität Bremen) zur Verfügung gestellt.. Die Diagnose wurde anhand der körperlichen Untersuchung, Thorax-Aufnahmen, computertomographischen Aufnahmen sowie einer Lungenfunktionsprüfung (Vitalkapazität, Totalkapazität, Residualvolumen, Atemwegswiderstand, forciertes Expirationsvolumen pro Sekunde und prozentual zur Vitalkapazität, Diffusionskapazität für Kohlenmonoxid, arterieller

O2 und CO2 Partialdruck) gestellt. Anhand von Fragebögen, die gemeinsam mit

einem Untersucher ausgefüllt wurden, wurden die o. g. personenbezogenen Daten erhoben. Dabei liegen dieser Arbeit folgende Angaben zu den Patienten vor:

·Alter zum Zeitpunkt der Erkrankung an einem Lungenemphysem ·Alter zum Zeitpunkt der Blutentnahme

·Geschlecht ·Wohnort (Stadt)

·Angaben zur ethnischen Zugehörigkeit

·Angaben zur Atemluftbelastung (Stäube, Dämpfe) (nur bei Patienten) ·Angaben zum Rauchen

Die 125 Patienten weisen zum Zeitpunkt der Blutentnahme ein Durchschnittsalter von 65,05 Jahren auf, davon sind 64,8 % männlichen (n=81) und 35,2 % weiblichen (n=44) Geschlechts.

Nach der Entnahme werden die Proben bei –20°C gelag ert, auf Eis transportiert und bis zur DNA-Extraktion im Zentrum für Humangenetik und Genetische Beratung der Universität Bremen bei –20°C gelagert. Die Blutprob e umfaßt 5,0 ml venöses Blut, das zur Antikoagglutination mit 200 µl 0,5 M EDTA versetzt wurde.

1.6 Probenmaterial der Kontrollgruppe

Die untersuchten Kontrollpersonen bestanden aus 264 Probanden, (126 Männer /47,73 % und 138 Frauen /52,27 %) ohne bekannte Erkrankungen im Alter zwischen 17 und 88 Jahren und einem Altersdurchschnitt von 46,5 Jahren. Als Probenmaterial diente Vollblut; aus diesen Blutproben (je 10 ml) wurde die DNA extrahiert und molekulargenetisch untersucht (siehe Patienten Kollektiv). Alle untersuchten Probanden wurden über das Versuchsvorhaben informiert und alle personen-bezogenen Daten wurden anonymisiert.

Es wurden Daten zum Geschlecht, Alter, ethnische Zugehörigkeit, Nikotinkonsum und etwaige Schadstoffexposition mit Fragebogen ermittelt. Das Probenmaterial der Kontrollpersonen wurde von Blutspendern des Zentralkrankenhauses St. Jürgen Str., Bremen, und Studenten der Universität Bremen gewonnen.

Methoden

1.7 DNA-Extraktion aus Vollblut nach der Salzextraktionsmethode

Aus den zur Verfügung stehenden Blutproben wurde die DNA mittels Salzextraktion nach Lahiri und Nürnberger (1991) isoliert.

Die DNA wurde mit der Salzextraktionsmethode gewonnen; sie liefert preisgünstig eine größere DNA Ausbeute als vergleichbare andere Methoden der DNA-Extraktion und ist zudem relativ ungefährlich für den Experimentator. Den Patienten und Kontrollpersonen wurden jeweils 5 ml Vollblut entnommen und in ein 15 ml Sarstedt-Röhrchen, das 200 µl 15%igen EDTA enthält, überführt und mit dem gleichen Volumen TKM1-Puffer versetzt und gut vermischt. Zur Lyse der Zellen wurde 200 µl IGPAL dem Blut-Puffergemisch hinzugefügt und mehrmals mit einem Vibrations-mischer (Jürgens) gemischt. Anschließend wurden die Proben bei 3400 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) sedimentiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig dekantiert. Das Pellet wurde mit TKM1-Puffer resuspendiert und erneut bei 3400 x g bei RT abzentrifugiert, dieser Waschschritt wurde solange wiederholt, bis das Pellet weiß erscheint. Durch diese Waschschritte wurden die zellulären Bestandteile aus der Suspension entfernt.

Das Pellet wurde vollständig in 800 µl TKM 2-Puffer resuspendiert und in ein 2,0 ml Eppendorfcup überführt. Die Lösung wurde mit 10 %igen SDS (SIGMA) vermischt und für 10 min bei 55°C inkubiert. Um die DNA von d en sie umgebenen Proteinen zu befreien, wurde der Lösung 300 µl 6 M gesättigte NaCl-Lösung hinzugefügt und durch mehrmaliges invertieren gemischt. Die Proteine präzipitieren durch den Entzug ihrer Hydrathülle und wurden bei den nachfolgenden Zentrifugation bei 12500 x g (bei 4°C für 10 min) von der in der wässrigen Lösun g befindlichen DNA getrennt. Der Überstand wurde abgenommen und mit dem gleichen Volumen Isopropanol versetzt. Das Cup wurde mehrmals invertiert, bis die DNA präzipitierte und anschließend bei 12500 x g bei 4°C für 10 min sedimentiert. Der Über stand wurde vorsichtig dekantiert und mit 1 ml 70 %igen Ethanol gewaschen, um das restliche Isopropanol zu entfernen und bei 12500 x g erneut für 5 min rezentrifugiert. Dieser Schritt wurde wiederholt. Abschließend wurde das Ethanol mit einer Pipette abgenommen und das Pellet an der Luft getrocknet. Zum Schluss wurde das getrocknete Pellet mit einem entsprechendem Volumen TE-Puffer (die Menge ist abhängig von der Größe des Pellet ) versetzt und bei 37 °C über Nacht resuspen diert.

1.8 Quantifizierung der isolierten DNA

Für die anschließende weitere Untersuchung der DNA wurde die genaue DNA-Konzentration ermittelt. Die Quantifizierung erfolgte durch spektralphotometrische Messung der DNA-Absorption in einem Wellenlängenbereich zwischen 220 und 300 nm. Hierfür werden in einer Quarzküvette (Helma) mit der Schichtdicke von 1 cm 5 µl der isolierten DNA (in Lösung) mit 995 µl Aqua bidest. (Verdünnung 1:200) versetzt und im Photometer (Uvicon 900, Kontron) gemessen. Es wurde jeweils eine Doppelbestimmung durchgeführt, als Referenz-Wert diente Aqua bidest. Eine Absorption von 1 (OD) bei 260 nm und einer Schichtdicke von 1 cm entspricht einer Konzentration von 50 µg doppelsträngiger DNA pro ml (Sambrook et al., 1989). Daraus ergibt sich folgende Konzentrationsberechnung:

]

[

50

)

(

200

]

[

g

ml

OD

Verdünnung

sfaktor

g

ml

c

μ

=

×

×

μ

Die Reinheit der DNA wird durch den Absorptionsquotienten von 260 nm und 280 nm bestimmt. Proteine haben durch den Gehalt an Tyrosin und Tryptophan ihr Absorptionsmaximum bei 280 nm. Der Quotient sollte ca. 1,8 betragen, ein niedrigerer Wert weist auf Protein-, ein höherer Wert auf mögliche RNA-Verunreinigungen hin (Sambrook et al., 1989).

1.9 Quantifizierung der Primer

Die Konzentrationsbestimmung der synthetisierten PCR-Primer erfolgte mittels spektralphotometrischer Messung anhand nachfolgender Formel:

Nukleotide

der

Anzahl

OD

gesamt

ml

mol

c

×

=

10

]

[

μ

Anschließend erfolgte eine Verdünnung der Oligonukleotide auf 10 µM. Die Oligonukleotide wurden bis zum Gebrauch bei –20°C g elagert.

1.10 Die Bestimmung der GSTM3 Genotypen

Für das GSTM3-Gen wurde eine 3 bp Deletion in Intron 6 an Position 2670-2672 beschrieben, die zur Generierung einer Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor Ying Yang 1 (YY1) führt. Die Mutante mit der Deletion wird als GSTM3*B bezeichnet,

das unveränderte Allel als GSTM3*A. Für die Differenzierung der beiden Allele wurden zwei Methoden entwickelt und etabliert. Bei der ersten Methode wurde ein 549 bp langes Fragment, das Exon 6 und 7 einschließt, mittels PCR amplifiziert. Dieses Fragment wurde mit Hilfe des Restriktionsenzyms Mnl1 (MBI) einem Restriktionsverdau unterzogen und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Methode wurde von Inskip et al. (1995) beschrieben und durch die Wahl neuer Primer modifiziert, wodurch ein kürzeres PCR-Fragment amplifiziert wird. Die zweite Methode ist ein Nachweisverfahren, das auf einer Standard PCR mit nachgeschalteter ASO-PCR beruht, die in einem Reaktionsansatz gefahren werden. Diese Methode ist ein schnelles Verfahren zum Nachweis der beiden verschiedenen Allele, das zudem zeit- und arbeitssparend ist, da nur eine PCR erforderlich ist und der nachfolgende Restriktionsverdau nicht mehr erforderlich ist. Zudem hat diese Methode den Vorteil der geringeren Kontaminationsgefahr, da beide PCR-Reaktionen in einem Ansatz erfolgen anstatt in zwei getrennten Reaktionsschritten.

1.10.1 Polymerase Chain Reaktion (PCR) des GSTM3 Gens

Die PCR zur Amplifizierung des GSTM3-Fragments für den anschließenden RFLP, wurde mit dem Gen-Amp-Taq PCR Reaktions-Kit (Perkinelmer) durchgeführt. Für die GSTM3 Genotypisierung wurden folgende Primer synthetisiert:

GM3 up 5` TCA AGT GAA GGC AAT GAG AAC C 3` (n=22) GM3do 5` ACT TAA AGG TCT AGA GGT GTC C 3` (n= 22)

Je Ansatz wurden 200 ng Proben-DNA für die PCR eingesetzt, das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 30 µl. Es wurde folgender Reaktionsansatz hergestellt, der auch in der gleichen Reihenfolge pipettiert wurde:

Volumina Reagenzien 3,0 µL Puffer II

3,0 µL MgCl2 je 0,25 µL dNTP`s

4,0 µL aqua bidest (steril)

je 1,0 µL Primer GM3 up (je 20 µM) je 1,0 µL Primer GM3 do (je 20 µM) 0,12 µL Taq Polymerase

0,2 µg DNA

Die PCR wurde anschließend in einem Trio-Thermoblock (Biometra) gestartet. Nach einem Vorlaufschritt bei 94 °C für 2 min zur vollst ändigen Denaturierung der DNA bestand jeder Zyklus aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 s, einem Hybridisierungschritt bei 64°C für 30 s und einem S yntheseschritt bei 72°C für 45 s. Dieser Zyklus wurde 30 mal wiederholt, bevor ein letzter Syntheseschritt bei 72°C für 10 min folgte in dem alle bis dahin nicht vollständig amplifizierten PCR-Produkte zu Ende verlängert wurden. Die mit den Primern GM3 up und GM3 do vervielfältigte GSTM3-DNA umfasste ein 549 bp PCR-Fragment, das für den Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus eingesetzt wurde.

1.10.2 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)

Das amplifizierte GSTM3-DNA-Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym Mnl 1 (MBI) in Fragmente definierter Länge geschnitten. Das GSTM3*B Allel verliert an Position 230 (vom 5´-Ende gesehen) eine Restriktionsschnittstelle für Mnl 1 (Abb. 1).

Abbildung 1: Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus des

GSTM3-Gen-Fragments. Dargestellt sind die Fragmentlängen in bp für das jeweilige Allel, die sich durch den Ristriktionsl-Fragment-Längenpolymorphismus für Mnl 1 ergeben. Das *A-Allel besitzt alle Ristriktionsschnittstellen, bei *A-Allel GSTM3*B geht durch die 3 Phasenpaardeletion die dritte von links gelegene Restriktionsschnittstelle für MnlI verloren.

Die gelelektrophoretische Auftrennung der RFLP-Fragmente erfolgte in einem 4,5%igen small DNA Agarose-Gel (Biozym) mit 1 x TBE als Laufpuffer. Die Bandenauftrennung erfolgte bei 9 V/cm für 90 min. Die Elektrophorese wurde in einer 20-25 Horizontal Gel Electrophoresis System (Gibco BRL) durchgeführt. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel in einem Ethidiumbromidbad gefärbt

GSTM3 GSTM3*A GSTM3*B 122 88 20 49 127 75 63 6 122 134 20 127 75 63 6 549

und zur Dokumentation der Ergebnisse wird vom Gel ein schwarz/weiß Photo mit einer Polaroidkamera (MP-4 Polaroid) mit Rotfilter angefertigt, die Belichtungszeit beträgt ca. 1,5-2 Minuten. Diese Prozedur wurde für den Nachweis und die Doku-mentierung aller folgenden gelelektrophoretische Auftrennung durchgeführt, deshalb werden nur die geänderten Parameter bzw. Puffer und Agarosen dargestellt.

1.10.3 Tetra-Primer-PCR zum Nachweis der GSTM3*A- und

GSTM3*B-Allele

Die Tetra-Primer-PCR ist eine schnelle Nachweismethode zur Differenzierung der GSTM3*A- und Allele. Zum Nachweis der GSTM3*A- und GSTM3*B-Allele wird im ersten Teil der Reaktion mit den Primer GSTM3 up und GSTM3 do ein Fragment von 549 bp amplifiziert. Der zweite Teil der Reaktion wird mit zwei allelspezifischen Primern durchgeführt, die wesentlich geringere Annealing-temperaturen aufweisen als das erste Primerpaar. Durch diese Tetra-Primer PCR ist eine Unterscheidung der beiden Allele möglich und erzeugt neben dem 549 bp Fragment ein 256 bp langes Fragment für GSTM3*A und ein 327 bp langes Fragment für GSTM3*B (Abb. 2).

1 tcttctttct aaactcctct ttccccaccc tgccatcctc aagtgaaggc aatgagaacc GSTM3 up

61 cacctagaga aggggctact aagtgtccat cactggcctg tgccctgatt aactacaaag Ex 6 121 atgatcacca ctattctcat tctgtttttt cctctcagga aaaactgaag cctcagtact 181 tggaagagct acctggacaa ctgaaacaat tctccatgtt tctggggaaa ttctcatggt

M3*A 241 ttgccgggga aaaggtagga agaagggaaa agaagaggat acttctctat ctctgcaggc M3*A do

M3*B 241 ttgccgggga aaaggtagga agaagggaaa agaag at acttctctat ctctgcaggc M3*B up

Ex 7 301 tactactcct cagacctaag catcttattg cttttcttct agctcacctt tgtggatttt 361 ctcacctatg atatcttgga tcagaaccgt atatttgacc ccaagtgcct ggatgagttc 421 ccaaacctga aggctttcat gtgccgtttt gaggtgacgt ttcctgcacc tttctcttat 481 aaaaacactc acaggctccc ctgggacctg caggatccca tagtggagga ttcttccccg 541 gcttttgcct aatgggatca atggttggac acctctagac ctttaagtct

GSTM3 do

Abbildung 2: Sequenz des amplifizierten GSTM3-Genfragments mit Lage der

Primer (unterstrichene Basen), die kodierenden Exonsequenz von Exon 6 und 7 sind grau hinterlegt. Die durch die Deletion im GSTM3*B-Allel verursachte Sequenz-verschiebung wird durch Gegenüberstellung der beiden Sequenzbereich des *A- und *B-Allels verdeutlicht.

Die Tetra-Primer-PCR wurde mit folgenden selbst entwickelten Primern durchgeführt: GSTM3up 5´-tcaagtgaaggcaatgagaacc-3´ (n = 22) Tm 64°C

GSTM3do 5´-ggacacctctagacctttaagt-3´ (n = 22) Tm 64°C M3*B do 5´-agagatagagaagtatcct-3´ (n = 19) Tm 52°C M3*A up 5´-agaagggaaaagaagatac-3´ (n = 19) Tm 52°C

Je Ansatz wurden 0,2 µg Proben-DNA für die PCR eingesetzt, das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 25 µl. Es wurde folgender Reaktionsansatz hergestellt, der auch in der gleichen Reihenfolge pipettiert wurde:

Volumina Reagenzien

2,5 µL Puffer II 2,5 µL MgCl2 je 0,25 µL dNTP`s

4,0 µL aqua bidest (steril)

je 2,5 µL Primer GM3 up (je 20 µM) je 2,5 µL Primer GM3 do (je 20 µM) je 1,0 µl M3*B do je 1,0 µl M3*A up 0,12 µL Taq Polymerase 0,2 µg DNA

X µL aqua bidest (steril)

Die PCR wurde unter folgenden Temperaturbedingungen durchgeführt: Nach einem Vorlaufschritt bei 94 °C für 2 min zur vollständige n Denaturierung der DNA bestand der erste Zyklus aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 s, einem Hybridisierungschritt bei 64°C für 30 s und einem S yntheseschritt bei 72°C für 45 s. Dieser Zyklus wurde 20 mal wiederholt und diente der Synthese des ersten Strangs. Diesem erste Zyklus folgte der zweite aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 s, einem Hybridisierungschritt bei 52°C für 30 s und einem Syntheseschritt bei 72°C für 45 s. Dieser Zyklus wurde 20 mal wiederhol t. Zum Schluß folgte ein 10 minütiger letzter Syntheseschritt bei 72°C. Die PCR wurde in einem Trio-Thermoblock (Biometra) durchgeführt. Die Darstellung der amplifizierten Fragmente erfolgt mittels Gelelektrophorese.

Die gelelektrophoretische Auftrennung der Tetra-Primer-PCR-Fragmente erfolgte in einem 4 %igen small DNA Agarose-Gel (Biozym) mit 1 x TAE als Laufpuffer. Die Separierung der Banden erfolgte bei 8 V/cm für 90 min.

1.11

Genotypisierung der Glutathion-S-Transferase Klasse

ππππ-1

(GSTP1)

Das GSTP1 Gen besteht aus sechs Introns und sieben Exons und umfasst ca. 2,8 kb. Für GSTP1 sind zwei Polymorphismen bekannt, ein Austausch von Isoleucin zu Valin an Position 105 und ein Austausch von Alanin zu Valin an der Position 114 des Proteins, die durch eine Transition von A zu G an Position 1578 und eine Transition von Position 2293 in der kodierenden Sequenz verursacht wird (Board et al., 1989, Ali-Osman et al., 1997). Mittlerweile sind vier Allele beschrieben worden, das Wildtypallel GSTP1*A, sowie die Allele GSTP1*B, GSTP1*C und GSTP1*D (Tab. 1). Die Kombination dieser Allele führt zu 10 verschiedenen Genotypen.

Tabelle 1: GSTP1-Allele mit den zugrundeliegenden Mutationen und den daraus

resultierenden Aminosäureaustauschen.

GSTP1-Allel Position 1578 Aminosäure Position 2293 Aminosäure

GSTP1*A Adenin Isoleucin Cytosin Alanin

GSTP1*B Adenin Ÿ Guanin Valin Cytosin Alanin

GSTP1*C Adenin Ÿ Guanin Valin Cytosin Ÿ Thymin Valin

GSTP1*D Adenin Isoleucin Cytosin Ÿ Thymin Valin

Zum Nachweis der Mutationen wurde eine Methode entwickelt, bei der die Exons 5 und 6, die die Mutationen enthalten können, mittels PCR amplifiziert werden und anschließend einem RFLP unterzogen werden. Bei Vorlage von zwei heterozygoten Mutationen in den getrennt amplifizierten Exons 5 und 6 kann nicht unterschieden werden, ob die Mutationen auf einem Allel liegen oder auf beide Allele verteilt sind. Deshalb könnte in diesem Fall entweder der Genotyp GSTP1*A*C oder GSTP1*B*D vorliegen, um diese beiden Genotypen unterscheiden zu können wurde in dieser Arbeit eine Methode etabliert, die auf einer ASO-PCR an genomischer DNA mit anschließendem RFLP basiert.

1.11.1 PCR zur Amplifikation des Exon 5 zum Nachweis der

Mutation 1578 A ŸŸG im GSTP1-Gen ŸŸ

Zur Genotypisierung der Mutation 1578 A ŸŸŸ G wurde ein 176 bp langes Fragment Ÿ mittels einer Standard PCR mit dem Gen-Amp-Taq PCR Reagentien Kit

(Perkinelmer) amplifiziert. Zur Amplifizierung des GSTP1 Gens wurden folgende Primer verwendet:

GSTP1 105 up 5` ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA 3` (n = 20) GSTP1 105 do 5` TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT 3` (n = 20) Zur Durchführung der PCR wird folgender Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 30 µl pipettiert:

Volumina Reagenzien

3,0 µL Puffer I je 0,25 µL dNTP`s

4,0 µL aqua bidest (steril)

je 1,0 µL Primer GSTP1 105 up (je 20 µM) je 1,0 µL Primer GSTP 105 do (je 20 µM) 0,12 µL Taq Polymerase

0,2 µg DNA

X µL aqua bidest (steril)

Die DNA wurde bei 94 °C für 2 min prädenaturiert di e anschließenden PCR-Zyklen bestanden aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 s, einem Hybridisier-ungsschritt bei 62°C für 30 s und die Elongation wu rde bei 72°C für 30 s durchge-führt. Dieser Zyklus wurde 30 mal wiederholt, bevor ein 10 minütiger letzter Syntheseschritt bei 72°C folgte. Die PCR wurde in e inem Trio-Thermoblock (Biometra) gestartet. Das mit den Primern GSTP1 105 up und GSTP1 105 do vervielfältigte GSTP1 DNA ergab ein 176 bp langes PCR-Fragment, das für den RFLP eingesetzt wurde.

Das GSTP1 Genfragment des Exon 5 wurde mit dem Restriktionsenzym BsmAI (NBI) in Fragmente definierter Länge geschnitten. Das Wildtyp-Allel weist dabei keine Schnittstelle für BsmAI auf und zeigt nach gelelektrophoretischer Auftrennung ein 176 bp umfassendes Fragment. Bei Vorlage eines Basenaustausches von A1578G, in einem der beiden Allele, entsteht zusätzlich zum 176 bp Fragment noch ein 98 bp und ein 58 bp umfassendes Fragment. Bei homozygoter Mutation an dieser Stelle ist das 176 bp Fragment vollständig geschnitten und nur das 98 und 58 bp Fragment werden im Gel sichtbar. Der Restriktionsverdau wurde bei 55°C für 90 Minuten inkubiert. Die Auftrennung erfolgte in einem 4%igen Agarosegel bei einer Spannung von 8 Volt/cm für 90 min.

1.11.2 PCR zur Amplifikation des Exon 6 zum Nachweis der

Mutation 2293 C ŸŸŸŸT im GSTP1-Gen

Zum Nachweis der Mutation 2293 C ŸŸŸŸT wurde ebenfalls das Gen-Amp-Taq PCR Reagentien Kit (Perkinelmer) verwendet. Mittels einer Standard PCR wurde ein 217 bp umfassendes Fragment amplifiziert. Zur Amplifikation des Exon 6 des GSTP1-Gens wurden folgende Primer verwendet:

GSTP1 114 up 5` GTT GTG GGG AGG AAG CAG AGG 3` (n = 21) GSTP1 114 do 5` CAC AAT GAA GGT CTT GCC TCC C 3` (n = 22) Das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 30 µl, je Ansatz wurden 0,2 µg Proben-DNA für die PCR eingesetzt. Es wurde folgender Reaktionsansatz hergestellt:

Volumina Reagenzien

3,0 µL Puffer I je 0,25 µL dNTP`s

4,0 µL aqua bidest (steril)

je 1,0 µL Primer GSTP1 114 up (je 20 µM) je 1,0 µL Primer GSTP 114 do (je 20 µM) 0,12 µL Taq Polymerase

0,2 µg DNA

X µL aqua bidest (steril)

Die PCR wurde nach folgendem Schema durchgeführt: n ach einem Vorlaufschritt bei 94 °C für 2 min zur vollständigen Denaturierung der DNA, bestand jeder Zyklus aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 s, einem Hybridisierungsschritt bei 62°C für 30 s und einem Syntheseschritt bei 72°C fü r 30 s. Dieser Zyklus wurde 30 mal wiederholt, bevor ein 10minütiger letzter Syntheseschritt bei 72°C folgte. Das mit den Primern GSTP1 114 up und GSTP1 114 do amplifizierte GSTP1-PCR-Fragment wurde in einem anschließenden RFLP eingesetzt.

Das GSTP1-Genfragment des Exon 6 wurde mit dem Restriktionsenzym AciII (NBI) einem Verdau unterzogen. Dabei wird das Wildtypallel vollständig in ein 129 bp und ein 88 bp umfassendes Fragment geschnitten. Bei Vorlage der Mutation C2293T fällt die Restriktionsschnittstelle weg, so dass bei Vorlage der heterozygoten Mutation drei Fragmente von 217, 129 und 88 bp und bei der homozygoten Mutation lediglich eine Bande von 217 bp im Ethidiumbromid gefärbten Gel zu erkennen sind. Der Restriktionsverdau wurde bei 37°C für 90 Minuten in kubiert. Die Auftrennung erfolgte in einem 4%igen Agarosegel bei einer Spannung von 8 Volt/cm für 60 min.

1.11.3 ASO-PCR mit anschließendem RFLP zur Unterscheidung der Genotypen GSTP1*A*C und GSTP1*B*D

Mit den separaten Nachweismethoden für die Position 1578 und 2293 mittels einer Standard PCR mit nachfolgendem RFLP ist es nicht möglich, bei Vorlage von zwei heterozygoten Mutation im Exon 5 und 6, die Genotypen GSTP1*A*C und GSTP1*B*D zu unterscheiden. Die Mutationen könnten entweder beide auf einem Allel lokalisiert sein, was dem Genotypen GSTP1*A*C entspricht, oder sie liegen auf unterschiedlichen Allelen und entsprechen dem Genotypen GSTP1*B*D. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine ASO-PCR gestützte Methode mit anschließenden RFLP entwickelt. Während der ASO-PCR an genomischer DNA wird nur das Allel amplifiziert, welches die Mutation G1578 trägt. Das amplifizierte Fragment erstreckt sich dabei von Position 1491 bis 2662 bis über die Position 2293 hinaus und wird nachfolgend für den RFLP verwendet (Abb. 3).

1472 gcctgctccc ctccacccaa ccccagggct ctatgggaag gaccagcagg Exon 5 GSTP 105 up

1522 aggcagccct ggtggacatg gtgaatgacg gcgtggagga cctccgctgc

GSTP105 a oder g 1572 aaatacatct ccctcatcta caccaactat gtgagcatct gcaccagggt

1622 tgggcactgg gggctgaaca aagaaagggg cttcttgtgc cctcaccccc GSTP 105 do

1672 cttacccctc aggtggcttg ggctgacccc ttcttgggtc agggtgcagg 1722 ggctgggtca gctctgggcc aggggcccag gggcctggga caagacacaa 1772 cctgcaccct tattgcctgg gacatcaacc agccaagtaa cgggtcatgg 1822 gggcgagtgc aaggacagag acctccagca actggtggtt tctgatctcc 1872 tggggtggcg agggcttcct ggagtagcca gaggtggagg aggatttgtc 1922 gccagtttct ggatggaggt gctggcactt ttagctgagg aaaatatgca 1972 gacacagagc acatttgggg acctgggacc agttcagcag aggcagcgtg 2022 tgtgcgcgtg cgtgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgtgtgta cgcttgcatt 2072 tgtgtcgggt gggtaaggag atagagatgg gcgggcagta ggcccaggtc 2122 ccgaaggcct tgaacccact ggtttggagt ctcctaaggg caatgggggc 2172 cattgagaag tctgaacagg gctgtgtctg aatgtgaggt ctagaaggat 2222 cctccagaga agccagctct aaagcttttg caatcatctg gtgagagaac 2272 ccagcaagga tggacaggca gaatggaata gagatgagtt ggcagctgaa 2322 gtggacagga tttggtacta gcctggttgt ggggagcaag cagaggagaa GSTP114 up

2372 tctgggactc tggtgtctgg cctggggcag acgggggtgt ctcaggggct

2422 gggagggatg agagtaggat gatacatggt ggtgtctggc aggaggcggg Exon 6 2472 caaggatgac tatgtgaagg cactgcccgg gcaactgaag ccttttgaga

2522 ccctgctgtc ccagaaccag ggaggcaaga ccttcattgt gggagaccag GSTP 114 do

Abbildung 3: Darstellung einer Teilsequenz des GSTP1-Gens. Gezeigt sind die

Positionen der verwendeten Primer (unterstrichene Basen) und deren Bezeichnung sowie die Schnittstellen des Restriktionsenzyms AciI (hell-graue Buchstaben). Mit den Primerpaaren GSTP 105 up und do und GSTP 114 up und do werden die beiden Fragmente für den Mutationsnachweis an Position 1578 und 2293 amplifiziert ,mit dem Primer GSTP 105 G kann die Differenzierung zwischen den Genotypen GSTP1*A*C und GSTP1*B*D durchgeführt werden.

Die ASO-PCR wurde an genomischer DNA mit dem hot Start PCR Kit (Qiagen) durchgeführt, wobei ein 1002 bp langes GSTP1 Genfragment durch die Primer GSTP 105 G (5´-ACC TCC GCT GCA AAT ACG-3´ ) und GSTP 114 do (5´- CAC AAT GAA GGT CTT GCC TCC C-3`) amplifiziert wurde. Es wurden 250 ng DNA im folgenden 30 µl Ansatz eingesetzt:

• PCR-Puffer 3,0 µl

• dNTP´s 2,0 µl

• GSTP 105G 0,5 µl (10 µM)

• GSTP114 do 0,5 µl (10 µM)

• Hot Start Taq-Polymerase 0,5 µl (5 u/µl)

• H2O x µl

Die optimierten Amplifikationsbedingungen für diese PCR sind für die erste Denaturierung 95°C für 15 min, gefolgt von 30 Zykle n mit 94°C zur Denaturierung, 61,5°C als Annealing-Temperatur und 72°C zur Synthe se des DNA-Abschnitts. Diesem Zyklus folgt ein 10 minütiger letzter Syntheseschritt.

Im Anschluss an die PCR erfolgt der Restriktionsverdau mit dem Enzym AciI (MBI), dass das PCR-Produkt bei Vorlage des Wildtyp-Allels in Fragmente von 8 bp, 93 bp, 365 bp und 536 bp schneidet. Hat ein Mutationsereignis stattgefunden, entsteht eine zusätzliche Bande in der Länge von 458 bp und die Banden mit einer Länge von 93 bp und 365 bp gehen verloren.

Zur Kontrolle der ASO-PCR wurde parallel eine zweite PCR mit durchgeführt, bei der ein zweiter ASO-Primer für die Position 1578 verwendet wurde, der an seinem Ende ein A anstatt eines G aufwiest. Hierzu wurden bei jeder ASO-PCR zwei Proben mit amplifiziert, von den die Genotypen bereits bestimmt waren. Eine der Proben hat den Genotypen GSTP1*A*A und weist an der Position 1578 auf beiden Allelen ein A und an der Position 2293 ein C auf, während die zweite Probe den Genotypen GSTP1*C*C enthielt, der an beiden Position homozygot mutiert ist. Der Erfolg der

PCR wurde dadurch bestimmt, dass die Probe mit dem Genotypen GSTP1*A*A nur die Bande zeigt, die mit dem GSTP105A-Primer amplifiziert wurde, während die Probe mit dem Genotypen GSTP1*C*C nur die Bande zeigte, die mit dem Primer GSTP105G amplifiziert wurde. So können die Proben sowohl in der gelelektro-phoretischen Darstellung als auch beim anschließenden RFLP als Kontrolle dienen.

1.12

Genotypisierung der Glutathion-S-Transferasen Klasse Mu 1

(GSTM1) und der Klasse Theta 1 (GSTT1)

Die menschliche Glutathion-S-Transferase der Klasse µ und θ weisen jeweils einen genetischen Polymorphismus auf. In der europäischen Bevölkerung weisen zwischen 38 bis 62 % eine homozygote Deletion des GSTM1-Gens auf (Bell et al., 1992, 1993; Lin et al., 1994). Für das GSTT1-Gen ist ebenfalls eine homozygote Deletion beschrieben worden, die bei 20-25 % der kaukasischen Bevölkerung vorkommt (Duncan et al., 1995; Deakin et al., 1996; Kempkes et al., 1996). Bisher erfolgte in den meisten epidemiologischen Studien der genotypische Nachweis der Glutathion-S-Transferase der Klasse µ und θ mittels einer Multiplex-PCR. Die Methode wurde in Anlehnung an Arand et al. (1996) modifiziert. Die Methode beruht darauf, dass Genabschnitte innerhalb des GSTM1- und GSTT1-Gens in einer PCR-Reaktion parallel amplifiziert werden. Das ß-Interferon 3-Gen wurde als interner Standard in der Multiplex-PCR simultan mitamplifiziert.

Fast alle epidemiologischen Studien beschränkten sich bisher darauf nachzuweisen, ob eine homozygote Deletion der Gene GSTM1 und GSTT1 vorliegt, bzw. ob mindestens eines der Allele nachzuweisen ist, eine Differenzierung zwischen homozygoten und heterozygoten Trägern der Allele war mit den bisherigen Methoden nicht möglich. Kerb et al. (1999) konnte mit einer „long-distance-PCR“ das GSTM1*0-Allel amplifizieren, wodurch es möglich wurde eine Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten GSTM1-Trägern zu erreichen. Aufgrund der ausgedehnten Länge der Amplifikate, ist diese Methode stark abhängig von der Qualität der DNA-Probe, zudem ist der GC-Gehalt der zu amplifizierenden Sequenz ausschlaggebend für den Erfolg der PCR. Deshalb wurde die Methode in dieser Arbeit weiter optimiert und der Umfang des Amplifikats extrem verkürzt, so dass eine Nachweismethode entstanden ist, die reproduzierbare Ergebnisse liefert, die für epidemiologische Studien notwendig sind. Das gleiche Problem der Unterscheidung zwischen homo- und heterozygoten stellt sich beim GSTT1-Polymorphismus. In dieser Arbeit wurde die Deletion des Gens eingegrenzt und eine auf einer „long-distance-PCR“ gestützte Methode etabliert, die ebenfalls eine Unterscheidung von homo- und heterozygoten GSTT1-Trägern ermöglicht.