ODgesamt
1.14 Genotypisierung des Cytochrom-P450 2D6- (CYP2D6) Poly- Poly-morphismus
hier erfolgt der Nachweis mittels eines 4 %igen Agarosegels mit den gleichen Laufbedingungen wie beim Exon 3.
Bei der gelelektrophoretischen Analyse der beiden separat durchgeführten RFLP-reaktionen sind die Banden, die 20 und 46 bp umfassen, aufgrund ihrer geringen Größe nicht nachweisbar.
1.14 Genotypisierung des Cytochrom-P450 2D6- (CYP2D6)
PM-Phänotyps in der kaukasischen Bevölkerung ermöglicht. Somit erscheint es ausreichend, eine größere Population nur auf diese Allele hin zu untersuchen, um Aussagen über die Verteilung der Hauptgenotypen und damit der Phänotypen erzielen zu können. Zudem soll das Vorliegen der Genduplikation untersucht werden, um überprüfen zu können, ob eine unterschiedliche Verteilung zwischen der Fall- und der Kontrollgruppe besteht.
1.14.1 Nachweis des CYP2D6*3-Allels mittels Tetra-Primer-PCR
Beim CYP2D6*3-Allel liegt eine Deletion an Position 2637 vor, die zum Verlust von Adenosin an dieser Stelle führt und eine Leserahmenverschiebung zur Folge hat. Die Analyse der Sequenz, die die Position 2637 mit einschließt mit dem Internet-programm Webcutter, ergab keine Restriktionsschnittstelle für irgendein Enzym, die einen zweifelsfreien Nachweis möglich machen würde. Deshalb ist es notwendig die Analyse mittels ASO-PCR durchzuführen. In der Regel erfolgt der Nachweis mittels ASO-PCR durch zwei getrennte PCR-Reaktionen, wodurch die Gefahr von Kontaminationen besteht, deshalb wird in dieser Arbeit ein Ein-Cup-Verfahren durchgeführt. Dabei sind im Reaktionsansatz sowohl die Primer für die Erststrang-synthese als auch für die anschließende ASO-PCR enthalten. Im ersten Schritt ist die Annealingtemperatur höher als im zweiten Reaktionsschritt, wodurch Fehlpaarungen bei der PCR verhindert werden. Dies wird durch unterschiedlich lange Primerpaare ermöglicht, die für jeden der beiden Reaktionsschritte optimiert sind.
Die Optimierung der Tetra-Primer-PCR wurde in einem Gradientenzykler (T-Gradient, Biometra) ermittelt. Der für das Screening der Proben verwendete Reak-tionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
• PCR-Puffer 2,5 µl
• dNTP´s 2,0 µl
• CYP2D6 up 0,5 µl (10 µM)
• CYP2D6 do 0,5 µl (10 µM)
• CYP2D6 2637 up 0,5 µl (10 µM)
• CYP2D6 2637 do 0,5 µl (10 µM)
• Hot Start Taq-Polymerase 0,5 µl (5 u/µl)
• H2O x µl
• DNA x µl (300 ng)
• Summe 25,0 µl
Die optimierten Temperaturbedingungen betragen 94°C für die Prädenaturierung gefolgt von 15 Zyklen bei 94°C für 30 s, 64°C für 3 0 s und 72°C für 60 s für die
Erststrangsynthese. Dieser Voramplifikation schloss sich die ASO-Amplifikation an, die bei 94°C für 30 s, 53°C für 30 und 72°C für 40 s durchgeführt wurde.
Die Analyse der PCR-Fragmente erfolgte durch Auftrennung in einem 3,5%igen small DNA-Agarose-Gel bei 10 V/cm für 60 min. Bei der Tetra-Primer-PCR entsteht ein Präamplifikat von 1106 bp, das auch als interne Kontrolle für den Erfolg der PCR diente und ein 553 bp- sowie ein 580 bp-Fragment, dass das Wildtypallel und das CYP2D6*3-Allel darstellt.
1.14.2 Nachweis des CYP2D6*4-Allels mittels PCR, ASO-PCR und RFLP-Analyse
Das CYP2D6*4-Allel ist durch zwei Punktmutationen charakterisiert, die an den Positionen 188 im Exon 1 und 1934 im Exon 4 lokalisiert sind. Die Mutation 188 führt zu einem Austausch von C zu T und 1934 resultiert in einen Basenwechsel von G zu A. Für den Nachweis der beiden Mutationen wird jeweils eine Standard PCR mit anschließenden RFLP (1934) bzw. ASO-PCR (188) durchgeführt.
Für die Amplifikation der Exon 1-Sequenz, das die Position 188 mit einschließt, wurde eine Hot Star PCR (Qiagen) durchgeführt, für die folgende Primer synthetisiert wurden:
1934 up: 5´-CGC CTT CGC CAA CCA CTC CG-3´ (n = 20) 1934 do: 5´-ATG CAA ATC CTG CTC TTC CGA-3´ (n = 21)
Für den PCR-Ansatz wurden 0,5 µg Proben-DNA eingesetzt, das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 50 µl und hatte folgende Zusammensetzung:
• 10x Puffer 5,00 µl
• H2O x µ
• DNTP`s 4,00 µl (10 µM)
• 1934 up 2,50 µl (10 µM)
• 1934 do 2,50 µl (10 µM)
• Hot Star Taq 0,25 µ (2,5 U)
• Gesamtvolumen 50,00 µl
Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Nach einem Präde-naturierungsschritt bei 95°C für 15 min folgten 30 Zyklen bei 94°C für 30 s, 60°C für 30 s und 72°C für 50 s. Das amplifizierte PCR-Produ kt umfasste 359 Basenpaare und wurde in einer anschließenden RFLP-Reaktion mit dem Restriktionsenzym MvaI
(MBI) in Fragmente definierter Länge geschnitten. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 90 min im Wasserbad. Zur Analyse wurden die Proben anschließend in einem 3
%igen Agarosegel bei 6 Volt/cm aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Dabei wird das Wildtypallel vollständig geschnitten, so dass ein 252 und ein 107 bp umfassendes Fragment entsteht. Bei Vorlage der Mutation geht die Schnittstelle verloren, so dass das ungeschnittene Fragment die Mutation anzeigt.
Die PCR-Reaktion zum Nachweis der Mutation 188 im Exon 1 erfolgt mit gleicher Zusammensetzung des Reaktionsgemisches wie für die PCR zur Amplifikation des Exons 4 nur mit zwei anderen Primerpaaren:
188 up: 5´-CCC CTG GCC GTG ATA GTG G-3´ (n = 19) 188 do: 5´-ATG GAG CAG GTG GAA GGA GGA GAC-3´ (n = 24)
Auch die PCR-Bedingungen sind die gleichen, sie unterscheiden sich lediglich in der Annealing-Temperatur, die hier 67°C beträgt. Das au s der Reaktion resultierende 763 bp umfassende Fragment wurde anschließend zum Mutationsnachweis einer ASO-PCR unterzogen.
Für die ASO-PCR wurden drei Primer verwendet, zwei von ihnen liegen mit ihrem 3´-Ende genau auf der Mutationsposition und unterscheiden sich durch die letzte Base, wodurch, nach stringenter Optimierung, nur das C- oder T-Allel amplifiziert wurde.
Die unterschiedlichen Primer wurden in zwei getrennten Ansätzen eingesetzt, wodurch sowohl homozygote Wildtypen und Mutanten als auch heterozygote Mutanten bei ihrer anschließenden Auftrennung im Agarosegel nachgewiesen wurden. Für die ASO-PCR wurden folgende Primer synthetisiert:
188 up: 5´-CCC CTG GCC GTG ATA GTG G-3´ (n = 19) 188C: 5´-TGG CAG GGG GCC TGG TGG ( n= 18) 188T: 5´-TGG CAG GGG GCC TGG TGA ( n= 18)
Es wurden für jeden der ASO-Primer ein separater Ansatz pipettiert, der ein Gesamtvolumen von 25 µl hatte:
• 10x Puffer 2,50 µl
• H2O x µ
• MgCl2 2,00 µl
• dNTP`s 2,00 µl (5 µM)
• 188 up 1,25 µl (10 µM)
• 188C bzw. T do 1,25 µl (10 µM)
• Hot Star Taq 0,13 µ (2,5 U)
• Gesamtvolumen 25,00 µl
Die PCR wurde mit folgenden Parametern durchgeführt: Nach einem Prädenaturierungsschritt bei 95°C für 15 min folgte n 18 Zyklen bei 94°C für 30 s zur Denaturierung, 60°C für 30 s für die Primerhybridis ierung und 72°C für 50 s zur Elongation der Primer. Die amplifizierten PCR-Produkte hatten eine Länge von 95 Basenpaaren und wurden in einem 3 %igen Agarosegel aufgetrennt.
1.14.3 Nachweis des CYP2D6*6-Allels mittels PCR und RFLP-Analyse
Im CYP2D6*6-Allel liegt eine Deletion an Position 1795 vor. Für den Nachweis des CYP2D6*6-Allels wurde eine Tetra-Primer-PCR durchgeführt. In dieser PCR erfolgt sowohl die Erststrangsynthese als auch die nachfolgende allelspezifische Ampli-fikation in einem Reaktionsansatz. Dabei sind im Reaktionsansatz sowohl die Primer für die Erststrangsynthese als auch für die anschließende ASO-PCR enthalten. Im ersten Schritt ist die Annealingtemperatur höher als im zweiten Reaktionsschritt, wodurch Fehlpaarungen bei der PCR verhindert werden. Dies wird durch unter-schiedlich lange Primerpaare ermöglicht, die für jeden der beiden Reaktionsschritte optimiert sind.
Die Optimierung der Tetra-Primer-PCR wurde in einem Gradientenzykler (T-Gradient, Biometra) ermittelt. Der für das Screening der Proben verwendete Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
• PCR-Puffer 2,5 µl
• dNTP´s 2,0 µl
• CYP2D6*6 up 0,5 µl (10 µM)
• CYP2D6*6 do 0,5 µl (10 µM)
• CYP2D6 1795 up 0,5 µl (10 µM)
• CYP2D6 1795 do 0,5 µl (10 µM)
• Hot Start Taq-Polymerase 0,5 µl (5 u/µl)
• H2O x µl
• DNA x µl (300 ng)
• Summe 25,0 µl
Die optimierten Temperaturbedingungen betrugen 94°C für die Prädenaturierung gefolgt von 15 Zyklen bei 94°C für 30 s, 63°C für 3 0 s und 72°C für 60 s für die Erststrangsynthese. Dieser Voramplifikation schloss sich die ASO-Amplifikation von 27 Zyklen an, die bei 94°C für 30 s, 53°C für 30 un d 72°C für 40 s durchgeführt wurde.
Die Analyse der PCR-Fragmente erfolgte durch Auftrennung in einem 3,5%igen small DNA-Agarose-Gel bei 10 V/cm für 60 min. Bei der Tetra-Primer-PCR entsteht ein Präamplifikat von 750 bp, das auch als interne Kontrolle für den Erfolg der PCR diente und ein 421 bp sowie ein 356 bp umfassendes Fragment, das das Wildtypallel und das CYP2D6*6-Allel darstellt.
1.14.4 Deletionsnachweis des CYP2D6-Gens (CYP2D6*5) mit Hilfe der Long-Distance-PCR
Das CYP2D6*5-Allel ist dadurch charakterisiert, dass das komplette Gen deletiert ist.
Der Nachweis der homozygoten bzw. heterozygoten Deletion des Gens wurde mit einer Long-Distance-Multiplex-PCR nach Hersberger et al. (2000) mit dem PCR-Kit der Firma Qiagen geführt. Die Primer, die für die PCR verwendet wurden überspannen das gesamte Gen und liegen außerhalb der Deletionssequenz.
Folgende Primer wurden für die Reaktion verwendet:
Dup up: 5´-CAG GCA TGA GCT AAG GCA CCC AGA C-3´
Dup do: 5´-CAC ACC GGG CAC CTG TAC TCC TCA-3´
Dup K up: 5´-GTT ATC CCA GAA GGC TTT GCA GGC TTC A-3`
Dup K do: 5´-GCC GAC TGA GCC CTG GGA GGT AGG TA-3´
Für den PCR-Ansatz wurden 250 ng Proben-DNA eingesetzt, das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 50 µl und hatte folgende Zusammensetzung:
• 10x Puffer 5,00 µl
• H2O x µ
• Q-Solution 10,00 µl
• dNTP`s 4,00 µl (10 µM)
• Dup up 2,50 µl (10 µM)
• Dup do 2,50 µl (10 µM)
• Dup K up 2,50 µl (10 µM)
• Dup K do 2,50 µl (10 µM)
• Taq (Qiagen) 0,25 µ (2,5 U)
• Gesamtvolumen 50,00 µl
Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Nach einem Prädenaturierungsschritt bei 94°C für 2 min folgten 35 Zyklen bei 94°C für 10 s zur Denaturierung, 65°C für 30 s für die Primerhybridis ierung und 68°C für 5 min zur Elongation der Primer. Das Wildtypallel ist durch eine 5,1 kb und das CYP2D6*5-Allel durch eine 3,2 kp große Bande gekennzeichnet. Die Auftrennung erfolgte in einem 1
%igen Agarosegel bei 4 Volt/cm für 2 h.
1.14.5 Duplikationsnachweis des CYP2D6-Gens mittels Multiplex-long-distance-PCR
Neben der Deletion des CYP2D6-Gens ist auch die Duplikation des Gens nachgewiesen worden. Die Nachweismethode beruht auf einer Long-Distance-Multiplex-PCR nach Steijns und Van der Weide (1998), bei der mit den Primern 2D6Dup up (5´-TCC CCC ACT GAC CCA ACT CT-3´) und 2D6Du do (5´-CAC GTG CAG GCA CCT AGA T-3´) ein 3,6 kb umfassendes Fragment amplifiziert wird, das von einer Kopie des CYP2D6-Gens zur nächsten reicht. Versuchspersonen, die dieses Fragment besitzen sind Träger der Duplikation. Zur internen Kontrolle der PCR wurde ein 5,2 kb umfassendes Fragment durch die Primer 2D7 up (5´-CCC TCA GCC TCG TCA CCT CAC-3´) und 2D6Du do amplifiziert, das bei allen Reaktionen den Erfolg der PCR anzeigt.
Zur Durchführung der PCR wurde folgender Reaktionsansatz mit 500 ng Proben-DNA und einem Gesamtvolumen von 50 µl pipettiert:
• 10x Puffer 5,00 µl
• H2O x µ
• Q-Solution 10,00 µl
• dNTP`s 4,00 µl (10 µM)
• 2D6Du up 2,50 µl (10 µM)
• 2D6Du do 2,50 µl (10 µM)
• 2D7 up 2,50 µl (10 µM)
• Taq (Qiagen) 0,25 µ (2,5 U)
• Gesamtvolumen 50,00 µl
Die Konditionen für die Amplifikation waren wie folgt: Nach einem Denaturierungsschritt von 94°C folgten 37 Zyklen vo n 94°C für 15 s, 67°C für 30 s und 68°C für 6 min und ein letzter Elongationsschri tt bei 72°C für 10 min. Die resultierenden PCR-Produkte wurden in einem 1 %igen Typ Grading Agarosegel (GIBCO) bei 3 Volt/cm separiert.