Charakterisierung von Tabaktransformanten mit einem bakteriellen a-Carotin-Hydroxylase-Gen (crtZ)

Tabaktransformanten mit einem bakteriellen â-Carotin-Hydroxylase-Gen (crtZ)

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften

Durchgeführt am Lehrstuhl für Physiologie und Biochemie der Pflanzen

Universität Konstanz

vorgelegt von

THOMAS GÖTZ

Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2001 1. Referent: Prof. Dr. P. Böger

2. Referent: Prof. Dr. K. Mendgen

Inhalt: Seite:

1. E

1

1.1 Vorkommen und Bedeutung der Carotinoide 1

1.2 Die Biosynthese der Carotinoide 2

1.3 Die Bedeutung des Zeaxanthins in der Pflanze 4

1.4 Der Xanthophyllzyklus 5

1.5 Aufgabenstellung 6

1.6 Vorarbeiten 8

2. M

M

10

2.1 Arbeitsmaterial 10

2.1.1 Verwendete Chemikalien und Enzyme 10

2.1.2 Verwendete Organismen 10

2.1.3 Verwendete Plasmide 11

2.2 Kulturbedingungen und Medien 12

2.2.1 Kulturbedingungen Escherichia coli 12

2.2.2 Kulturbedingungen Agrobacterium tumefaciens 12

2.2.3 In vitro-Kultur von Tabak 13

2.2.4 Anzucht von Tabakpflanzen auf Erde 14

2.2.5 Sterile Aussaat von Tabaksamen 14

2.3 DNA- und RNA-Präparationsmethoden 15

2.3.1 Plasmid-Großpräparation aus E. coli 15

2.3.2 Plasmid-Minipräparation aus E. coli (nach Holmes und Quigley) 16 2.3.3 Plasmid-Minipräparation aus E. coli (nach Birnboim und Doly) 17 2.3.4 Plasmid-Isolierung aus Agrobacterium tumefaciens 17 2.3.5 Präparation der genomischen DNA aus Tabak für PCR 18

2.3.7 Präparation der RNA aus Tabak für Northern-Blot 20

2.4 Klonierungsmethoden 21

2.4.1 Elektrophoretische Auftrennung von DNA auf einem Agarosegel 21

2.4.2 Restriktionsverdau von DNA 21

2.4.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 22 2.4.4 Abdauen und Auffüllen überstehender DNA-Enden 23

2.4.5. Dephosphorylierung von Vektorenden 23

2.4.6 Ligation zweier DNA-Fragmente 23

2.5 Transformationsmethoden 24

2.5.1 Transformation von E. coli (nach Mandel und Higa) 24 2.5.2 Transformation von E. coli (Elektroporation) 25 2.5.3 Transformation von Agrobacterium tumefaciens 26 2.5.4 Transformation von Tabakblattstückchen mit Hilfe von

Agrobacterium tumefaciens 27

2.6 Methoden zur genetischen Charakterisierung 28

2.6.1 DNA-Sequenzierung 28

2.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 29

2.6.3 DNA-DNA-Hybridisierung (Southern-Blot) 30 2.6.4 DNA-RNA-Hybridisierung (Northern Blot) 32

2.7 Proteinaufarbeitung und Western-Blot 34 2.7.1 Überexpression des crtZ-Proteins in E. coli 34

2.7.2 Aufreinigung des crtZ-Proteins 34

2.7.3 Herstellung eines Antikörpers im Hühnerei 35 2.7.4 Herstellung eines Antikörpers im Kaninchen 36

2.7.5 Proteinextraktion aus Tabak 36

2.7.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37

2.7.7 Western-Blot 39

2.8.1 Pigmentextraktion 41

2.8.2 Photometrische Pigmentbestimmung 41

2.8.3 Pigmentbestimmung durch HPLC 42

2.8.4 Messung der Photosyntheserate 43

2.8.5 Belichtungsversuche 44

3. E

45

3.1 Genetische Charakterisierung der crtZ-Pflanzen 45

3.1.1 Nachweis des crtZ-Gens durch PCR 45

3.1.2 Nachweis der Expression des crtZ-Gens durch Northern-Blot 47 3.1.3 Nachweis des Transgens über Kanamycinresistenz und

Entwicklung von homozygoten crtZ-Linien 49 3.1.4 Nachweis der Kopienzahl des crtZ-Gens im Genom durch

Southern-Blot 51

3.2 Nachweis des crtZ-Proteins 53

3.2.1 Berechnung des Molekulargewichtes des crtZ-Proteins 53 3.2.2 Überexpression des crtZ-Proteins in E. coli 54

3.2.3 Reinigung des crtZ-Proteins 55

3.2.4 Herstellung eines Antikörpers 55

3.3 Physiologische Charakterisierung der crtZ-Pflanzen 56 3.3.1 Vergleich des Pigmentgehaltes der Primärtransformanten 56 3.3.2 Vergleich der Keimungsrate und des Wachstums 59 3.3.3 Vergleich des Pigmentgehaltes in schwachlichtadaptierten

Tabakpflanzen 62

3.3.4 Vergleich der Zeaxanthinbildung im Starklicht 63

3.4.1 Messung der Resistenzdauer unter extremen Lichtbedingungen 67 3.4.2 Vergleich der Photosyntheseleistung unter extremen Licht-

bedingungen 69

3.5 Direkte Auswirkungen der UV-Strahlung 70 3.5.1 Beeinträchtigung der Zeaxanthinbildung aus Violaxanthin durch

UV-Strahlung 70

3.5.2 Zeaxanthin-Abbau im UV-Licht 71

3.5.3 Veränderung des Chlorophyllgehaltes während UV-Bestrahlung 76 3.5.4 Veränderung der Photosynthesekapazität nach UV-Bestrahlung 77

3.6 Langzeitwirkung der UV-Strahlung 78

3.6.1 Auswirkungen der UV-Strahlung auf den Phänotyp 78 3.6.2 Auswirkungen der UV-Strahlung auf die Bioproduktivität 80 3.6.3 Auswirkungen der UV-Strahlung auf den Pigmentgehalt 81

4. D

83

4.1 Zeaxanthin und die pflanzliche Stressabwehr 83 4.2 Genetische Charakterisierung und Entwicklung einer homozygoten

Linie 84

4.3 Physiologische Charakterisierung 86

4.4 Starklicht- und UV-Resistenz 87

5. Z

91

6. L

93

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumperoxodisulfat

bp Basenpaar

BSA Rinderserumalbumin

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

DIG Digoxigenin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxiribonucleinsäure

dNTPs Desoxynucleosidtriphosphate

E Einstein

EDTA Ethylendiaminotetraacetat

g Erdbeschleunigung / Gramm

HPLC High Performance Liquid Chromatography IPTG Isopropyl-â-D-thiogalactosid

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

LB Luria Broth

MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure

mRNA messenger-RNA

MS Murashige und Skoog

MW Molekulargewicht

OD Optische Dichte

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PEG Polyethylenglycol

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

RNA Ribonucleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute

rRNA ribosomale RNA

RT Raumtemperatur

RUBISCO Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase

SDS Natriumdodecylsulfat

SSC Standard Saline Citrat

TE Tris-EDTA

TEMED Tetramethylethylendiamin

T_i-Plasmid Tumor inducing Plasmid

TRIS N-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

UV Ultraviolett

VAZ Xanthophyllzykluspigmente

(Violaxanthin+Antheraxanthin+Zeaxanthin)

vde Violaxanthin-Deepoxidase

w/v weight per volume

1. E INLEITUNG

1.1 V

Die Stoffklasse der Carotinoide ist in der Natur weit verbreitet. Es sind meist gelb bis rot gefärbte Pigmente. Am bekanntesten sind das â-Carotin der Karotte und das Lycopin der Tomate. Carotinoide kommen aber auch in Bakterien, Pilzen und Tieren vor (Goodwin, 1980, Goodwin und Britton, 1988). Der Mensch kann Carotinoide nicht selbst herstellen, sondern muss sie mit der Nahrung aufnehmen (Provitamin A). Hier dienen Carotinoide zur Produktion des Sehfarbstoffs Rhodopsin (Simpson, 1983) sowie als membranständige Antioxidantien. In diesem Zusammenhang wird auch ein möglicher Schutz vor Krebserkrankungen durch Carotinoide diskutiert (Byers und Perry, 1992). Des weiteren findet man Carotinoide in der Muskulatur von Fischen, im Carapax der Crustaceen sowie im Gefieder vieler Vögel. Carotinoide, insbesondere das â-Carotin gehören zu den wichtigsten Lebensmittelfarbstoffen und werden teils synthetisch produziert. Zu erwähnen ist noch das Carotinoid Astaxanthin, das in der Lachszucht eine wichtige Rolle spielt, da es dem Fischfutter beigemengt wird, um die vom Verbraucher gewünschte Rotfärbung des Muskelfleisches zu bekommen.

Carotinoide können ungebunden in Lipidtröpfchen lokalisiert sein (Britton, 1983).

Meistens befinden sie sich aber in Membranen, wo sie zum größten Teil an Proteine gebunden sind. Angereichert in den Chromoplasten verschiedener Pflanzengewebe bewirken sie die Färbung von Blütenblättern, Antheren und Früchten. Die wichtigste Funktion besitzen die Carotinoide aber in den photosynthetisch aktiven Geweben, wo sie durch Überlagerung des Chlorophylls erst sichtbar werden, wenn dieses in der Seneszenz abgebaut wird. Hier sind die Carotinoide in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten lokalisiert und meist an ganz spezifische Proteine gebunden. Ihre Funktion ist dabei dreifach: Die sauerstoffhaltigen Carotinoide (Xanthophylle) dienen als Lichtsammelpigmente und verbreitern damit das Wirkungsspektrum der Photosynthese (Siefermann-Harms, 1987), sie schützen das Chlorophyll und die Lipide der Thylakoidmembranen vor Photooxidation und sie können die

Membranstabilität beeinflussen (Havaux, 1998).

1.2 D

B

C

Ausgangsverbindung der Carotinoidbiosynthese im Chloroplasten höherer Pflanzen ist das C₅-Molekül Isopentenylpyrophosphat (IPP). Dieses entsteht im Gegensatz zum Syntheseweg im Cytoplasma nicht über den Mevalonatweg, sondern ausgehend vom Pyruvat über Glycerinaldehyd-3-Phosphat (Lichtenthaler et al., 1997). Vier Moleküle IPP kondensieren dann zum C₂₀-Körper Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP). GGPP ist die zentrale Verbindung im Isoprenoidstoffwechsel des Chloroplasten. Aus ihr entstehen neben den Carotinoiden so wichtige Substanzen wie das Phytol, das das Chlorophyll in der Thylakoidmembran verankert, die Tocopherole (Vitamin E), das Plastochinon und die Gibberelline. Zwei Moleküle GGPP werden durch das Enzym Phytoensynthase zum Tetraterpen Phytoen verschmolzen. Nun folgen vier Dehydrogenierungsschritte, wobei alternierend links und rechts vom zentralen Kohlenstoffatom durch die Katalyse der Enzyme Phytoendesaturase (pds) und æ- Carotindesaturase (zds) je zwei Doppelbindungen entstehen. Dabei wandelt sich die Farbe der jeweiligen Substanzen von farblos (Phytoen) über blassgelb (æ-Carotin) zu rot (Lycopin, Farbstoff der Tomate). Die Reaktionsschritte bis zum GGPP sind im Stroma des Plastiden lokalisiert (Britton, 1988; Kleinig, 1989), die Phytoensynthase scheint locker mit Membranen assoziiert zu sein (Bartley et al., 1992), alle weiteren Enzyme sind integrale Membranproteine (Sandmann, 1991).

Nach dem Lycopin spaltet sich der Biosyntheseweg in zwei Äste auf. Durch das Enzym â-Zyklase werden die Enden des Lycopins in zwei â-Iononringe verwandelt, wodurch das â-Carotin entsteht. Ein anderer Teil des Lycopins bekommt nur an einem Ende einen â-Iononring, während das andere Ende durch das Enzym å-Zyklase zum å- Iononring zyklisiert wird, wodurch á-Carotin entsteht. á-Carotin ist Ausgangsverbindung für das quantitativ wichtigste Carotinoid der höheren Pflanze, Lutein, welches zusätzlich zwei Hydroxy-Gruppen besitzt. Es ist somit dem

Zeaxanthin vergleichbar, das durch Hydroxylierung des â-Carotins entsteht. Das zugehörige Enzym, die â-Carotin-Hydroxylase ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Aus Zeaxanthin entstehen durch Epoxidierung die Xanthophylle Antheraxanthin und Violaxanthin. Violaxanthin ist Ausgangsverbindung für das Carotinoid Neoxanthin und das Phytohormon Abscisinsäure.

Lycopin

Lycopin-å-Cyclase Lycopin-â-Cyclase

ä-Carotin ã-Carotin

Lycopin- Lycopin-

â-Cyclase â -Cyclase

á-Carotin â-Carotin

â -Carotin- â-Carotin-

Hydroxylase Hydroxylase

á-Cryptoxanthin â-Cryptoxanthin

á-Carotin- â-Carotin-

Hydroxylase Hydroxylase

Lutein Zeaxanthin

Zeaxanthin- Epoxidase Antheraxanthin

Zeaxanthin- Epoxidase Violaxanthin

Neoxanthin

Abb. 1.1 : Biosyntheseweg der wichtigsten Carotinoide in den Blättern höherer Pflanzen ausgehend vom Lycopin. Die im Tabakblatt mit Hilfe der HPLC detektierbaren Carotinoide sind unterstrichen.

Schema nach Mathis (1995)

1.3 D

B

Z

P

Das wichtigste Schutzpigment des Photosyntheseapparates ist das Xanthophyll Zeaxanthin. Es ist durch das Vorhandensein von 11 konjugierten Doppelbindungen in der Lage, überschüssige Energie von angeregten Triplett-Chlorophyllen aufzunehmen und in Form von Wärme abzugeben, bevor diese Energie größere Schäden im Photosyntheseapparat anrichten kann (Phillip et al., 1996). Zu einem solchen Energiestau kommt es dann, wenn die Pflanze plötzlich starken Lichtverhältnissen ausgesetzt wird, was in der Natur beim plötzlichen Durchbrechen der Sonne an einem bewölkten Tag oder bei der Wanderung von Sonnenflecken auf dem schattigen Waldboden der Fall ist. Dann kann die Elektronentransportkette nicht mit der Chlorophyllanregung Schritt halten und es kommt zum Energiestau an den Chlorophyllmolekülen. Bleibt das Chlorophyll in diesem hochenergetischen Triplettzustand, so kann es seine Energie auf Sauerstoff übertragen, der dadurch in den energetisch höheren Singulett-Zustand versetzt wird. Dies ist der erste Schritt zur Bildung von gefährlichen Sauerstoffradikalen, die mit verschiedenen Komponenten des Photosyntheseapparats sowie den Lipidmolekülen der Thylakoidmembranen reagieren und diese irreversibel schädigen können. Zeaxanthin kann wahrscheinlich auch auf der Stufe des Singulettsauerstoffs eingreifen, dessen Energie übernehmen und dadurch Schaden von der Zelle abwenden (Havaux et al., 1999). Eine weitere wichtige Funktion des Zeaxanthins besteht in der Stabilisierung der Thylakoidmembranen. Die Photosynthese kann in den Thylakoidmembranen lokal zu starker Erwärmung führen, die sich vor allem in einer erhöhten Instabilität der Membran auswirkt. Zeaxanthin kann hier stabilisierend wirken, da es mit seinem hydrophoben Mittelteil die Membran stäbchenartig durchspannen kann, während die hydrophilen Enden mit ihren Hydroxygruppen das Molekül im Stroma bzw. Lumen verankern. Diese Funktion ist umso wichtiger, da den Thylakoidmembranen die sonst stabilisierend wirkenden Sterole fehlen (Havaux, 1998).

Des weiteren wird vermutet, dass Zeaxanthin an der Blaulichtrezeption in Mais- koleoptilen beteiligt sein könnte (Quiñones und Zeiger, 1994).

1.4 D

X

In Grünalgen und höheren Pflanzen wird das Zeaxanthin unter normalen Bedingungen durch das Enzym Zeaxanthin-Epoxidase vollständig zum Violaxanthin epoxidiert. Das ist nötig, da Zeaxanthin wie oben erwähnt Energie von angeregten Chlorophyllmolekülen aufnehmen kann. Dies ist aber unter nicht sättigenden Lichtverhältnissen eine unerwünschte Reaktion, die mit der Photosynthese konkurriert.

Violaxanthin besitzt dagegen nur 9 konjugierte Doppelbindungen, was es energetisch in die Lage versetzt, seine Energie auf Chlorophylle zu übertragen (Phillip et al., 1996). Es ist deshalb in den Lichtsammelkomplexen von Photosystem II und Photosystem I lokalisiert (Thayer und Björkmann, 1992), wo es als Lichtsammelpigment zur Photosyntheseleistung beiträgt. Wird die Pflanze nun Starklichtbedingungen ausgesetzt, so wird ein Teil des Violaxanthins durch das Enzym Violaxanthin-Deepoxidase (vde) innerhalb weniger Minuten in das schützende Zeaxanthin überführt. Auslöser für die Aktivierung der vde ist ein pH-Wert unter 6,2 im Lumen des Thylakoiden, das pH-Optimum der vde liegt bei 5,2 (Eskling und Åkerlund, 1998). Diese Ansäuerung ist ein Zeichen für stark erhöhte Photosyntheseaktivität, denn es werden lichtbedingt mehr Protonen ins Lumen gepumpt als über die ATP-Synthase wieder abfließen können. Zusätzlich benötigt die vde hohe Konzentrationen an reduziertem Ascorbat, dessen Gehalt unter Stressbedingungen ansteigt.

Abb. 1.2 : Schema des Xanthophyllzyklus in höheren Pflanzen (Demmig-Adams and Adams, 1996)

Violaxanthin

Zeaxanthin

D e e p ox id a tio n Ep o xid a tio n

St a rk lic ht Sc hw a c hl ic ht

Antheraxanthin

1.5 A

Zur Aufklärung der Funktion einzelner Carotinoide im lebenden Organismus wurden bereits verschiedene Ansätze mit transgenen Bakterien, Cyanobakterien und Pflanzen verfolgt. Eine Möglichkeit dabei ist, die endogenen Carotinoidbiosynthesegene zu suchen und diese dann mit Hilfe der Antisense-Technik auszuschalten. Dabei wird das betreffende Gen in entgegengesetzter Orientierung hinter einen starken Promotor kloniert, und dieses so veränderte Genkonstrukt in den Ursprungsorganismus zurücktransformiert. Bei der Transkription dieses Genkonstruktes entsteht nun eine zur endogenen mRNA komplementäre RNA, die in großem Überschuss vorhanden ist und so die zu untersuchende mRNA durch Bildung eines RNA-Doppelstrangs an der Translation hindert. Leider sind diese transgenen Organismen oft nicht lebensfähig, was eine Untersuchung verhindert.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, das zu untersuchende Genprodukt überexprimieren zu lassen, indem man es in richtiger Orientierung hinter einen starken Promotor kloniert. Hierbei kommt es aber oft zur Cosuppression, das heißt zum Ausbleiben des gewünschten Resultats, was zu einer Verringerung der Menge an Genprodukt führt.

Diese Cosuppression kommt durch Hybridisierung der im Überschuss produzierten mRNA mit der DNA-Sequenz des entsprechenden endogenen Gens zustande (Jorgensen, 1990; Jorgensen, 1992; Matzke und Matzke, 1995). Ein Ausweg ist daher die Klonierung artfremder Gene. Deren Enzyme haben zwar dieselbe chemische Funktion, besitzen aber eine weitgehend andere DNA-Sequenz und entgehen so der Cosuppression.

Das nichtphotosynthetische Bakterium Erwinia uredovora besitzt Carotinoidbiosynthesegene, die als kompaktes Gencluster vorliegen (Misawa, 1990).

Verschiedene Gene dieses Genclusters, welche die Carotinoidbiosynthese bis zum Zeaxanthin umfassen, wurden bereits in unterschiedliche Organismen transformiert.

So führte zum Beispiel die Einführung des Phytoendesaturasegens (crtI) aus Erwinia uredovora sowohl in Cyanobakterien (Windhövel et al., 1994) als auch in höheren Pflanzen (Misawa et al., 1994; Windhövel et al. 1997) zur Resistenz gegen das Bleichherbizid Norflurazon, welches die pflanzliche Phytoendesaturase hemmt. Auch

das Phytoensynthasegen (crtI) aus Erwinia uredovora konnte erfolgreich in Cyanobakterien und Tabak transformiert werden (Windhövel et al., 1995).

An Cyanobakterien, welchen das â-Carotin-Hydroxylasegen (crtZ) aus Erwinia uredovora transformiert wurde, konnte ein deutlich erhöhter Zeaxanthin-Gehalt festgestellt werden. Cyanobakterien können das Zeaxanthin allerdings nicht wie höhere Pflanzen zu weiteren Xanthophyllen epoxidieren, so dass sich das Zeaxanthin hier anreichern kann. Auch fehlt den Cyanobakterien Lutein, das Hauptcarotinoid der höheren Pflanzen. Als Folge des erhöhten Zeaxanthingehaltes wurde in den transgenen Cyanobakterien eine erhöhte Resistenz gegenüber UV-Strahlung festgestellt (Götz et al., 1999). Auch transgene Escherichia coli-Zellen, die das Carotinoid Zeaxanthin anreicherten, zeigten einen erhöhten Schutz vor UV-Strahlung (Sandmann et al., 1998).

Aufbauend auf den Ergebnissen dieser beiden Versuche sollten in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen einer zusätzlichen â-Carotin-Hydroxylase aus Erwinia uredovora (crtZ) in höheren Pflanzen untersucht werden. Als Untersuchungsobjekt wurde Tabak (Nicotiana tabacum cv. Samsun) ausgewählt, da in dieser Pflanze die Methode der Transformation mit Agrobacterium tumefaciens gut etabliert ist.

Außerdem besitzt Tabak große Blätter, was bei den physiologischen Versuchen zu Pigmentgehalt und Photosynthese von großem Vorteil ist, sowie eine sehr hohe Samenproduktion pro Pflanze. Neu war an dieser Arbeit im Vergleich zu den vorangegangenen Versuchen mit Bakterien und Cyanobakterien, dass höhere Pflanzen eine Vielzahl weiterer Carotinoide besitzen. Vor allem aber existiert hier der Xanthophyllzyklus (s. 1.4), so dass das Zeaxanthin sich nicht akkumuliert, sondern zu weiteren Xanthophyllen (Antheraxanthin, Violaxanthin, Neoxanthin) weiterreagiert.

Die Hoffnung war allerdings, dass auch in höheren Pflanzen, ähnlich wie in Cyanobakterien der Gehalt an Zeaxanthin bzw. Xanthophyllzykluspigmenten (VAZ) erhöht werden könnte und dass dieses eine Auswirkung auf die Toleranz gegenüber Stressbedingungen wie Starklicht und UV-Strahlung hätte. Diese Fragestellung ist besonders interessant im Hinblick auf eine drohende anthropogene Klimaerwärmung sowie eine erhöhte UV-Strahlung durch Ozonabbau in der Stratosphäre.

1.6 V

Als Grundlage der hier vorliegenden Untersuchungen dienten transgene Tabakpflanzen, die als Teil meiner Diplomarbeit ebenfalls am Lehrstuhl Böger in Konstanz hergestellt wurden:

Dazu wurde das crtZ-Gen aus Erwinia uredovora, welches auf dem Überexpressionsvektor pT7-7 vorlag, zunächst mit einer pflanzlichen chloroplastenspezifischen Transitsequenz (Transitsequenz der kleinen Untereinheit der RUBISCO aus Pisum sativum) versehen. Nur so kann das Genprodukt nach seiner Translation in den Chloroplasten gelangen und dort aktiv werden. Die basengenaue Verschmelzung von crtZ-Gen und Transitsequenz wurde durch Sequenzierung überprüft. Dann wurden crtZ-Gen + Transitsequenz in den binären Vektor pGPTV- Kan-P35S einkloniert. Dieser Binäre Vektor besaß einen starken, konstitutiven Promotor (den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus) stromaufwärts des einklonierten Gens sowie pflanzliche Terminationssequenzen. Zusätzlich war zur späteren Selektion der transformierten Pflanzenzellen ein Kanamycinresistenzgen, ebenfalls eingebettet in pflanzliche Promotorstrukturen, zwischen den beiden Bordersequenzen des binären Vektors vorhanden (s. Abb. 1.3).

Dieser binäre Vektor wurde nun in Agrobacterium tumefaciens-Zellen einkloniert, welche ein entwaffnetes Ti-Plasmid besaßen. Nach Kontrolle auf Vorhandensein beider Plasmide in den Agrobakterien-Zellen, wurden Tabakblattzellen mit Agrobakterien infiziert. Dabei wird mit Hilfe von Genprodukten des Ti-Plasmids die zwischen den beiden Border-Sequenzen gelegene Transfer-Region aus dem binären Vektor herausgeschnitten, in eine Pflanzenzelle übertragen und dort fest ins Kerngenom der Pflanze integriert (Zupan et al., 1995; zur Methodik siehe 2.5.4). Mit Hilfe von Phytohormonen und einer Selektion auf das Antibiotikum Kanamycin, konnten aus einzelnen transformierten Blattzellen vollständige, fertile Tabakpflanzen regeneriert werden. Diese standen nun für die vorliegenden Arbeiten zur Verfügung.

Abb. 1.3: Binärer Vektor pGPTV-P35S-Kan mit einkloniertem crtZ-Gen + Transitsequenz.

Die eingezeichneten Schnittstellen dienten zur Überprüfung der richtigen Orientierung des Inserts. Abkürzungen: LB = Linke Bordersequenz, ter = pflanzliche Terminationssequenz, nptII = Kanamycin-Resistenzgen, Pnos = Nopalinsynthasepromotor (starker, konstitutiver Promotor, P35S = 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (starker, konstitutiver Promotor), tra + crtZ = crtZ-Gen mit angefügter Transitsequenz (kl. UE der RUBISCO aus Pisum sativum), RB = Rechte Bordersequenz

2 M ATERIAL UND M ETHODEN

2.1 A

2.1.1 Verwendete Chemikalien und Enzyme

Die verwendeten Chemikalien stammten, soweit nichts anderes angegeben ist, von den Firmen Roth (Karlsruhe), Roche (Mannheim), Merck (Darmstadt), Sigma (Deisenhofen), Riedel de Haen (Hannover) oder Serva (Heidelberg) und besaßen analytischen Reinheitsgrad.

Die verwendeten Enzyme wurden von den Firmen Roche (Mannheim), New England Biolabs (Beverly, MA, USA), Amersham (Amersham, Buckinghamshire, GB), Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) und MBI-Fermentas (Vilnius, Litauen) erworben.

2.1.2 Verwendete Organismen

Escherichia coli DH 5á

- erworben von BRL, Gaithersburg, MD, USA -Genotyp : F´ recA1 endA1 hsdR gyrA

-Referenz : Hanahan (1983)

Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 - Referenz: Hoekema et al. (1983) Nicotiana tabacum cv Samsun - Referenz: Horsch et al. (1985)

2.1.3 Verwendete Plasmide pT7-7-crtZ (Ruther et al., 1996)

- pT7-7 (Tabor and Richardson, 1985) mit crtZ-Gen aus Erwinia uredovora, einkloniert über Nde I / Hind III

Phänotyp: Ampr

pTRA 3XN (N. Misawa, 1990)

- pUC 118 (Messing, 1983) mit HindIII / Sph I-Fragment aus pSNIF (Schreier et al.,1985), welches die Transitsequenz der kleinen Untereinheit der RUBISCO aus Pisum sativum enthält.

Phänotyp: Ampr

binäre Vektoren pGPTV-Kan-P35S (U. Windhövel; nach Hoekema et al., 1983)

- pBIN 19 (Bevan, 1984) + CAMV-P35S-Promotor und Terminationssequenz aus pBI 121GS (Jefferson et al., 1987) ohne Glucuronidase-Gen, einkloniert über HindIII / Eco RI

Phänotyp: Kmr außerhalb der T-DNA zur Selektion in Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens

Kmr im Bereich der T-DNA zur Selektion in Tabak

2.2 K

M

2.2.1 Kulturbedingungen Escherichia coli

Escherichia coli wurde in LB-Flüssigmedium oder auf LB-Agarplatten (1.5% (w/v) Bacto-Agar, Difco, Detroit, Michigan, USA) angezogen. Die Inkubationstemperatur betrug jeweils 37 °C, die Flüssigkulturen wurden dabei geschüttelt. Zur Selektion von plasmidhaltigen Zellen wurde dem LB-Medium Ampicillin (50 µg/ml) oder Kanamycin (25 µg/ml) zugegeben.

LB-Medium:

10 g/l Casein (enzymatic hydrolysate from bovine milk) (Sigma, St. Louis, MO, USA)

5 g/l Hefe-Extrakt (Roth, Karlsruhe) 10 g/l NaCl

pH 7.5 eingestellt mit NaOH

2.2.2 Kulturbedingungen Agrobacterium tumefaciens

Auch die Agrobakterien wurden in LB-Flüssigmedium bzw. auf LB-Agar-Platten angezogen (Rezepte s. 2.2.1). Die Inkubationstemperatur betrug hier aber 25 °C. Zur Selektion der binären Plasmide enthielt das Medium 50 µg/ml Kanamycin.

2.2.3 in-vitro-Kultur von Tabak

In-vitro-Kulturen von Tabakpflanzen wurden in Einmachgläsern (Firma Weck, Wehr) mit MS-Medium (s. u.) + Agar (0.9% (w/v), Difco, Detroit, MI, USA) angezogen. Der pH-Wert des MS-Mediums betrug 5.6 und wurde mit 1 M KOH eingestellt.

Gegebenenfalls wurden noch 30 g/l Saccharose zugegeben. Selektiert wurde mit 50 mg/l Kanamycin. Die Tabakpflanzen wuchsen in einer Klimakammer bei 25 °C und bei einem Tag /Nacht-Rhythmus von 16 h Helligkeit (15-20 µEm^-²s^-1) und 8 h Dunkelheit.

MS-Basal-Medium (nach Murashige und Skoog, 1962; Sigma, St. Louis, USA):

mg/l

Ammoniumnitrat 1650.0

Borsäure 6.2

Calciumchlorid 332.2

Cobaltchlorid x 6H2O 0.025

Kupfersulfat x 5H2O 0.025

Ethylendiamintetraacetat x 2 H2O 37.26

Eisensulfat x 7 H2O 27.8

Magnesiumsulfat 180.7

Mangansulfat 16.9

Molybdänsäure x 2H2O 0.25

Kaliumjodid 0.83

Kaliumnitrat 1900.0

Kaliumphosphat 170

Zinksulfat x 7 H2O 8.6

Glycin 2.0

myo-Inositol 100.0

Nicotinsäure 0.5

Pyridoxin HCl 0.5

Thiamin HCl 0.1

2.2.4 Anzucht von Tabakpflanzen auf Humus

Um Samen zu gewinnen oder physiologische Messungen durchzuführen, war es notwendig, die transgenen Tabakpflanzen in Erde umzutopfen. Dazu wurden gut bewurzelte Pflanzen aus den Gläsern genommen, der an den Wurzeln anhaftende Agar entfernt und in Einheitserde gepflanzt. Zur Samengewinnung wurden die Blütenstände vor Öffnen der Blüten mit perforierten Kunststofftüten (Crispack-Beutel, Baumann Saatzuchtbedarf, Waldenbuch) umschlossen, um die Möglichkeit einer Fremdbestäubung auszuschließen. Für die physiologischen Experimente wurden von jeweils einer Pflanze möglichst viele identische Stecklinge gewonnen, die nach der Bewurzelung in Klimakammern (Heraeus Vötsch, bzw. BBC, York) mit definierten Bedingungen überführt wurden. Zur Adaptation wurden die Pflanzen vor den Experimenten zwei Wochen in die Klimakammern gestellt. Die Wachstumsbedingungen waren wie folgt:

Lichtintensität: 30 µE m^-2 s^-1 (Schwachlicht) bzw. 300 µE m^-2 s^-1 (Starklicht) Tag-Nacht-Rhythmus: 16 h hell, 8 h dunkel

Luftfeuchte: 65%

Temperatur: 23 °C

2.2.5 Sterile Aussaat von Tabaksamen

Ca. 200 Tabaksamen wurden vor der Aussaat mit einem Milchsieb von den anhaftenden Kapselbruchstücken getrennt und in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt.

Zur Desinfektion wurde 1 ml 70% Ethanol zugegeben und gut gemischt. Das Ethanol wurde sofort wieder mit einer Pipette entfernt und durch 1 ml 10% NaOCl mit etwas Spülmittel ersetzt. Die Samen blieben unter gelegentlichem Aufschütteln 20 Minuten in der NaOCl-Lösung. Nach Entfernung des NaOCl folgten 2 Waschschritte mit sterilem destilliertem Wasser. Nun wurden die Samen mit einer Impföse gleichmäßig auf MS-Agarplatten verteilt. Zur Selektion der Samen wurde dem MS-Medium 100 mg /l Kanamycin zugegeben.

2.3 DNA-

RNA-P

2.3.1 Plasmid-Großpräparation aus Escherichia coli (nach Birnboim und Doly 1979)

100 ml Bakterien-Übernachtkultur wurden abzentrifugiert (Sorvall RC5, SS34, 3000g, 4 °C, 15min) und der Rückstand in 3 ml Lösung 1 resuspendiert (Vortex, Stufe 6). Es folgte eine 10-minütige Inkubation auf Eis. Danach wurden 6 ml frisch zubereitete Lösung 2 zugegeben, vorsichtig gemischt und für weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wurden 4 ml Kaliumacetat-Lösung (3M, pH 5.2) zugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 30 Minuten Inkubation auf Eis wurde erneut zentrifugiert (s. o., 33000 g, 4 °C, 15 min), der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und der Rückstand verworfen. Zum Überstand wurden 5 µl RNAse (10 mg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.5 und 15mM NaCl) zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert.

Es folgte eine 3-malige Phenol-/Chloroform-Extraktion: Es wurden 3 ml Phenol (Roti- Phenol, Roth, in TE-Puffer äquilibriert, pH 7.5-8), sowie 3 ml Chloroform:

Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, gut geschüttelt und abzentrifugiert (Beckman TJ-6, 1500 g, 5 min, RT), die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen gegeben, die untere Phase verworfen. Zur oberen Phase wurden nun erneut je 3 ml Phenol und Chloroform zugegeben und obige Schritte wiederholt. Beim 3. Mal wurden 6 ml Chloroform zugegeben und wieder wie oben beschrieben verfahren. Dieser Schritt dient dazu, das Phenol aus dem Ansatz zu entfernen. Zum letzten abgenommenen Überstand wurden 25 ml eiskaltes Ethanol (96%, v/v) zugegeben, geschüttelt, und die DNA 2-15 h bei -20 °C gefällt.

Anschließend wurde die DNA abzentrifugiert (Sorvall RC5, SS34, 9600 g, 4 °C, 20 min), getrocknet und in 0.8 ml sterilem destilliertem Wasser gelöst. Nun wurden 0.16 ml 5 M NaCl und 1 ml 13% PEG (w/v) zugegeben, vorsichtig gemischt und 1 h auf Eis inkubiert. Der durch anschließende Zentrifugation (Eppendorf-Tischzentrifuge, max. Umdrehungszahl, 10 min, 4 °C) gewonnene DNA-Rückstand wurde mit eiskaltem 70%-igem Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge (Vacuum Concentrator, Bachofer, Reutlingen) getrocknet und in 60 µl sterilem destilliertem

Wasser gelöst.

Lösung 1 : 25 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM EDTA

15% (w/v)Saccharose

2 mg/ml frisch eingewogenes Lysozym Lösung 2 : 0.2 M NaOH

1% (w/v) SDS

2.3.2 Plasmid-Minipräparation aus Escherichia coli (Methode 1, nach Holmes und Quigley, 1981)

Eine auf etwa 1cm2 Fläche ausgestrichene Bakterienkolonie wurde mit einem stumpfen Zahnstocher von der Agarplatte entnommen, in 400 µl Lysispuffer suspendiert, 40 Sekunden im Wasserbad gekocht und sofort abzentrifugiert (Eppendorf-Tischzentrifuge, maximale Umdrehungszahl, RT, 15 min). Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und mit 160 µl Ammoniumacetat- Lösung sowie 560 µl Isopropanol vermischt. Die DNA wurde 1 h bei -20 °C gefällt, anschließend abzentrifugiert (s. o., 4 °C, 10 min), der Rückstand mit eiskaltem 70%

Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 20 µl sterilem destilliertem Wasser gelöst.

Lysispuffer: 8 % (w/v) Saccharose 0.5 % (v/v) Triton X 100

50 mM EDTA

10 mM Tris-HCl, pH 8.0 1 mg/ml Lysozym

10 µg/ml RNase

2.3.3 Plasmid-Minipräparation aus Escherichia coli (Methode 2, nach Birnboim und Doly, 1979)

Eine auf etwa 1 cm² Fläche ausgestrichene Bakterienkolonie wurde mit einem stumpfen Zahnstocher von der Agarplatte entnommen, in 100 µl kalter Lösung 1 suspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Dann wurden 200 µl Lösung 2 zugegeben, gut geschüttelt und mit 200 µl kaltem Kaliumacetat (3 M, pH 5.2) vermischt. Nach 10- minütiger Inkubation auf Eis wurde 10 Minuten bei RT abzentrifugiert (Eppendorf- Tischzentrifuge, max. Umdrehungszahl), der Überstand in ein neues Röhrchen gegeben und mit 1 ml eiskaltem 96% (v/v) Ethanol versetzt. Die DNA wurde 1 h bei - 20 °C gefällt, anschließend abzentrifugiert (s. o., 4 °C, 10 min), der Rückstand mit eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 20 µl destilliertem sterilem Wasser gelöst.

Lösung 1 : 50 mM Glucose 10 mM EDTA

25 mM Tris-HCl, pH 8.0 Lösung 2 : 0.2 mM NaOH

1% (w/v) SDS

2.3.4 Plasmidisolierung aus Agrobacterium tumefaciens (nach Hoykaas, 1988)

0.5 ml einer Agrobakterien-Übernachtkultur wurden pelletiert (Eppendorf- Tischzentrifuge, RT, 10 min) und in 100 µl Lösung 1 resuspendiert. Nach 10 Minuten Inkubation bei RT wurden 200 µl Lösung 2 zugegeben, gemischt und weitere 10 min bei RT inkubiert. Dann wurden 30 µl Lösung 3 zugegeben und gemischt. Sofort anschließend erfolgte die Zugabe von 150 µl Na-Acetat (3 M, pH 4.8) und nach dem Mischen eine 20-minütige Inkubation bei -20 °C. Nach Zentrifugation (s. o., 5 °C,

3 min) wurde der Überstand abgenommen, mit 400 µl Phenol/Chloroform (1:1) vermischt, und abzentrifugiert (s. o., RT, 3 min). Nun wurde die obere Phase entnommen und mit eiskaltem 96% (v/v) Ethanol vermischt. Die DNA wurde durch Zentrifugation (s. o., 5 °C, 10 min) pelletiert, mit 250 µl eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 25 µl sterilem destillierten Wasser gelöst.

Lösung 1: 50 mM Glucose 10 mM EDTA

25 mM Tris-HCl, pH 8.0

4 mg/ml Lysozym (frisch eingewogen)

Lösung 2: 1% (w/v) SDS 0.2 M NaOH

Lösung 3: 2 Volumina 0.2 M NaOH

1 Volumen Phenol (Roti-Phenol, Roth, in TE-Puffer, pH 7.5-8)

2.3.5 Präparation der genomischen DNA aus Tabak für PCR

Eine Tabakblattspitze (ca. 0.1 g Frischgewicht) wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu feinem Pulver zermörsert und in 500 µl TE-Puffer + 25 µl 20% (w/v) SDS +7,2 µl Proteinase K (20 mg/ml in H2O) aufgenommen. Es folgte zunächst eine 1-stündige Inkubation bei 37 °C, dann 30 min bei 50 °C. Nun wurden 100 µl 5 M NaCl sowie 80 µl CTAB/ NaCl-Lösung (0.7 M NaCl, 10% (w/v) CTAB in H2O) zugegeben, gut geschüttelt und 10 min bei 65 °C inkubiert. Es folgten vier Reinigungsschritte durch Ausschütteln mit 500 µl Chloroform, 500 µl Phenol, 250 µl Phenol + 250 µl Chloroform und 500 µl Chloroform. Zum abgenommenen Überstand wurden nun 800 µl Isopropanol zugegeben, die DNA bei Raumtemperatur gefällt und

abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 400 µl destilliertem Wasser gelöst. Durch Zugabe von 40 µl Kaliumacetat (3 M, pH 5.2) und 1 ml eiskaltem Ethanol wurde die DNA erneut gefällt. Die DNA wurde in einer Eppendorf-Tischzentrifuge (maximale Umdrehungszahl, 4 °C, 10 min) pelletiert, der Rückstand mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 - 100 µl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA-Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm photometrisch bestimmt. Für einen PCR-Ansatz wurden 1.5 µg DNA eingesetzt.

2.3.6 Präparation der genomischen DNA aus Tabak für Southern-Blot

Im Gegensatz zur vorangegangenen Methode kam es bei der DNA-Präparation für Southern-Blot weniger auf die Sauberkeit der DNA als auf eine große Ausbeute möglichst intakter DNA-Moleküle an.

Genau 2 g Tabakblätter wurden in einem gekühlten Mörser auf Eis zusammen mit 1 ml Extraktionspuffer zu einem homogenen Brei zerrieben. Der Brei wurde in ein 2-ml- Reaktionsgefäß überführt und in einer Tischzentrifuge 5 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 500 µl Extraktionspuffer, 500 µl Lysispuffer und 150 µl Laurylsarcosin (5% w/v) vorsichtig mit einem Spatel gelöst. Es folgte eine 20-minütige Inkubation bei 65 °C. Dann wurden 500 µl Chloroform zugegeben und mit einem Spatel sorgfältig untermischt.

Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 14000 rpm wurde der wässrige Überstand in ein neues 2-ml-Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Isopropanol vermischt.

Die DNA wurde abzentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und über Nacht bei 37 °C in 50 µl TE-Puffer gelöst. Die DNA-Ausbeute wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Mindestens 20 µg DNA waren für eine Spur im Southern-Blot notwendig. Die DNA wurde nicht eingefroren, sondern bei 4 °C gelagert.

Extraktionspuffer: 0,35 M Sorbitol

0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 0,005 M EDTA

0,02 M Natriumdisulfit

Lysispuffer: 2% (w/v) CTAB

0,2 M Tris-HCl, pH 7,5 0,05 M EDTA

2 M NaCl

2.3.7 Präparation der RNA aus Tabak für Northern-Blot

Bei der RNA-Präparation kam es vor allem darauf an, RNAse-frei zu arbeiten.

Deshalb mussten alle Gegenstände und Lösungen steril sein.

Etwa 0.5 g Tabakblätter wurden in einem sterilen, vorgekühlten Mörser mit flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zerrieben und in 2-ml-Reaktionsgefäße mit 500 µl Phenol und 500 µl heißem Boratpuffer (80 °C) überführt. Nun wurde bei voller Umdrehungszahl 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgenommen und mit 500 µl Phenol vermischt. Es folgten noch ein Phenol-Chloroformschritt (je 250 µl) und ein Chloroformschritt (500 µl) jeweils nach Zentrifugation und Abnahme des Überstands.

Eine erste Fällung geschah durch Zugabe von 1/10 Volumen 4 M NaCl und 1 Volumen Isopropanol zum wässrigen Überstand. Das nach Zentrifugation entstandene Pellet aus DNA + RNA wurde in 300 µl destilliertem Wasser resuspendiert. Nun wurde die RNA durch Zugabe von 150 µl 6 M LiCl und Inkubation bei 4 °C für 4 h, selektiv gefällt. Die gefällte RNA wurde durch Zentrifugation (14000 rpm, 4 °C) pelletiert, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 30 µl destilliertem Wasser gelöst. Die RNA-Ausbeute wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt und die Proben auf 1 µg/µl RNA eingestellt. 8 µg RNA waren pro Spur im Northern-Blot notwendig.

Die Proben wurden bei –80 °C aufbewahrt.

Boratpuffer: 0,2 M Borsäure 1% (w/v) SDS 30 mM EDTA

pH 9,0 (eingestellt mit NaOH)

2.4 K

2.4.1 Elektrophoretische Auftrennung von DNA auf einem Agarosegel

1 µl der zu untersuchenden DNA-Lösung wurde mit 5µl 1 x Auftragspuffer gemischt und auf ein 1 % (w/v in 1 x TAE) Agarose-Minigel (Gelgröße: 7.5 x 10 cm, Taschengröße 4 x 1 mm, Agarose von Pharmacia, Uppsala; Schweden) aufgetragen.

Die DNA wurde dann in einer Gelkammer in 1 x TAE bei konstanter Spannung (60- 80V) 1 bis 2 h lang aufgetrennt. Danach wurde das Gel aus der Kammer genommen, 10 min in Ethidiumbromid (1.5 µg/ml in H2O) gelegt und anschließend 10 min in destilliertem Wasser entfärbt. Die DNA wurde durch Bestrahlen mit langwelligem UV-Licht (UV-Transilluminator, UVP, San Gabriel, CA, USA) sichtbar gemacht und über eine Videokamera mit Hilfe des Programms Bioprofile (V 4.6, Vilber Lourmat, 1992) photographisch festgehalten.

6x Auftragspuffer :

(nach Sambrook et al., 1989, Tabelle 6.3, Puffer-Typ II) 0.25% (w/v) Bromphenolblau 0.25% (w/v) Xylencyanol FF

15% (v/v) Ficoll in Wasser 1x TAE (nach Sambrook et al. 1989, Tabelle 6.2):

40 mM Tris-Acetat, pH 8.0 1 mM EDTA

2.4.2 Restriktionsverdau von DNA

Die zu untersuchende DNA wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut (maximal 1 µl Enzym / 10 µl Verdau-Ansatz). Die Inkubationszeit betrug zwischen

1 h und 12 h bei meist 37 °C im vom Hersteller (meist Roche, Mannheim) empfohlenenen Puffer. Zur Überprüfung des Verdaus wurde 1 µl des Restriktionsansatzes auf ein Agarose-Minigel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.

2.4.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die mit Restriktionsenzymen vollständig verdaute DNA wurde in einem präparativen Agarose-Minigel aufgetrennt (Taschengröße 80 x 1 mm, 80 µl / Slot) und wie unter 2.4.1 beschrieben gefärbt. Unter UV-Licht wurden die benötigten DNA-Banden kurz markiert, bei ausgeschaltetem UV-Licht ausgeschnitten und mit Hilfe des Geneclean- kit (Bio101 Inc., La Jolla, USA) gereinigt: Zu den ausgeschnittenen Agarosegelstreifen wurden 2.5 x (v/w) gesättigte Na-Jodid-Lösung zugegeben und solange bei 52 °C im Wasserbad inkubiert bis sich die Agarose gelöst hatte (ca.

10 min). Dann wurde das ganze mit 10 µl "Glasmilch" gut vermischt und 30 min unter gelegentlichem Aufschütteln bei RT inkubiert, wobei sich die von der Agarose befreite DNA an die Glasmilch binden sollte. Die Glasmilch wurde nun pelletiert (Eppendorf- Tischzentrifuge, volle Umdrehungszahl, RT, 5 s), der Überstand verworfen, der Rückstand dreimal mit 400 µl "New Wash"-Lösung gewaschen und in 10 µl sterilem destilliertem Wasser aufgenommen. Durch Inkubation von 2.5 min bei 52 °C wurde nun die DNA von der Glasmilch gelöst und durch Zentrifugation (Eppendorf- Tischzentrifuge, volle Umdrehungszahl, RT, 30 s) von ihr getrennt. Der DNA-haltige Überstand wurde nun in ein neues Röhrchen gegeben. Der Rückstand wurde noch einmal mit 10 µl Wasser resuspendiert und obige Extraktionsschritte ein zweites Mal wiederholt, so daß die DNA letztendlich in 20 µl Wasser gelöst war. Die Ausbeute dieser Reinigungsprozedur wurde durch Auftragen von 1 µl DNA-Lösung auf ein Agarose-Minigel bestimmt.

2.4.4 Abdauen und Auffüllen überstehender DNA-Enden

Manchmal war es nötig, "Sticky-Ends" in "Blunt-Ends" zu überführen. Dazu wurde das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli verwendet. Dieses Enzym ergänzt überstehende 5'-Enden zu einem Doppelstrang, während es überstehende 3'-Enden vollständig abdaut. Es besitzt also eine 5'-3'-Polymerase- und eine 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Für einen 30 µl-Ansatz wurden 20 µl DNA (in H2O), 6 µl 5 x-Puffer für Klenow-Fragment (MBI), 5 µl 1 mM dNTPs sowie 1 µl Klenow Enzym (1U/µl, Roche, Mannheim) zusammengegeben. Die Enzymreaktion lief 30 min bei 30 °C und wurde durch eine 10-minütige Inkubation bei 75 °C abgestoppt.

Anschließend wurde die DNA durch eine Ethanol / K-Acetat-Fällung gereinigt.

2.4.5 Dephosphorylierung von Vektorenden

Um die Ligation des Vektors mit sich selbst zu verhindern, war es oft notwendig, die Vektor-DNA zu dephosphorylieren. Dazu wurde die alkalische Phosphatase vom Kälberdarm verwendet, welche jeweils am 5'-Ende der DNA eine Phosphatgruppe entfernt. Ein Reaktionsansatz bestand aus 20 µl DNA, 2 µl 10 x Phosphatasepuffer sowie 2 µl alkalische Phosphatase (1U/µl, Roche, Mannheim). Die Reakt ion lief 2 h bei 37 °C und wurde durch eine 10-minütige Inkubation bei 75 °C abgestoppt.

Anschließend wurde die Phosphatase durch Gene-clean (s. 2.4.3) inaktiviert.

2.4.6 Ligation zweier DNA-Fragmente

Um zwei DNA-Fragmente miteinander zu ligieren, wurde das Enzym T4-DNA-Ligase verwendet. Der Ligationsansatz bestand aus 10 µl etwa äquimolarem DNA-Gemisch aus Vektor und einzuklonierendem Fragment, 1 µl 10 x Ligase-Puffer (incl. BSA und ATP, Roche, Mannheim) und 1 µl T4-DNA-Ligase (1U/µl, Roche, Mannheim). Die

Inkubationstemperatur betrug bei Blunt-End-Ligation 16 °C, bei Sticky-End-Ligation 12 °C; die Inkubationszeit betrug 16 Stunden. Um die Ausbeute zu erhöhen, wurde zum Ligationsansatz jeweils noch 1µl 13% (w/v) PEG zugegeben.

2.5 T

2.5.1 Transformation von E.coli (Methode nach Mandel und Higa, 1970)

Herstellung kompetenter Zellen: 50 ml LB-Medium wurden mit 0.3 ml einer Übernachtkultur der zu transformierenden E.coli-Zellen angeimpft und 3 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln angezogen. Nun sollte die Optische Dichte bei 550 nm (OD550) ungefähr 0.5 betragen. War dies der Fall, wurden die Zellen geerntet (Sorvall RC5, SS34, 1500 g, 4 °C, 10 min) und in 25 ml eiskaltem Transformationspuffer resuspendiert. Nach 15 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen abermals abzentrifugiert (gleiche Bedingungen wie oben), in 3 ml eiskaltem Transformationspuffer resuspendiert und in 500 µl-Portionen aliquotiert. Die kompetenten Zellen konnten so mehrere Wochen bei +4 °C oder als Glycerinkultur mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden.

Transformationspuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 50 mM CaCl2

10 mM MgSO4 10 mM MgCl2

Transformation: 100 µl kompetente Zellen (s. o.) wurden mit 5 µl DNA-Lösung vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein 2-minütiger Hitzeschock bei 42

°C. Nun wurden 400 µl LB-Medium zugegeben und die Bakterien 1 h lang bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurden geeignete Mengen davon auf selektive

LB-Agarplatten (s. 2.2.1) ausgestrichen und die gewachsenen Transformanten durch Plasmid-Minipräparationen (s. 2.3.2) überprüft.

2.5.2 Transformation von E.coli (Elektroporation)

Herstellung kompetenter Zellen: Mit 0.5 ml einer 50ml-Bakterien-Übernachtkultur wurden 500 ml SOB-Medium (s. u.) angeimpft und bei 37 °C bis zu einem OD550- Wert von 0.7-0.8 unter Schütteln inkubiert. Dann wurden die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 2600 g geerntet. Die Zellen wurden in 500 ml eiskaltem zweifach destilliertem Wasser resuspendiert und 15 min bei 2600 g abzentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt, der Rückstand wurde schließlich in 25ml eiskaltem 10% Glycerin in zweifach destilliertem Wasser aufgenommen. Nun wurden die Zellen noch einmal abzentrifugiert, der Überstand verworfen und der Rückstand in 2 ml eiskaltem zweifach destilliertem Wasser + 10% Glycerin resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden nun in 100 µl-Portionen aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Transformation: Pro Transformationsansatz wurden 100 µl kompetente Zellen auf Eis aufgetaut. Die Transformationsküvetten, (die wiederverwertet und deshalb in 70%

(v/v) Ethanol aufbewahrt wurden,) wurden gründlich mit destilliertem Wasser ausgespült, getrocknet und mindestens 2 Minuten auf Eis abgekühlt. Zu den kompetenten Zellen wurden nun 2 µl DNA gegeben, gemischt und für mindestens 2 Minuten auf Eis gestellt. Nun wurde die DNA-Bakterien-Mischung in die vorgekühlte Elektroporationsküvette eingefüllt; diese wurde ins Elektroporationsgerät (Cellject Basic, EquiBio, Angleur, Belgien) eingeführt, wo sie einem kurzen Stromstoß (2400 V, 410 A, 5.28 ms) ausgesetzt wurde. Sofort wurden dann 400 µl SOB- Medium (s. u.)+ 2 mM MgCl2 + 2 mM MgSO4+ 2 mM Glucose zugegeben und die Bakterien für 1 h bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurden geeignete Mengen davon auf selektive LB-Agarplatten ausgestrichen und die gewachsenen Transformanten durch Plasmid-Minipräparationen (s. 2.3.2) überprüft.

SOB-Medium:

20 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 mM NaCl

2.5 mM KCl pH 7.0

2.5.3 Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Herstellung kompetenter Zellen : 50 ml frisches LB-Medium wurden mit 2 ml einer 5 ml-Agrobakterien-Übernachtkultur angeimpft und in einem 250 ml-Kolben bei 28

°C so lange geschüttelt bis eine OD600 von 0.5 bis 1.0 erreicht war. Die Kultur wurde dann auf Eis abgekühlt und bei 3000 g 5 min bei 4 °C abzentrifugiert (Sorvall RC5, SS34). Die Zellen wurden in 1 ml CaCl2 (20 mM, eiskalt) resuspendiert, als 0.1 ml- Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Transformation : 0.1 ml kompetenter Agrobakterien wurden nun mit 1 µg Plasmid- DNA vermischt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Es folgte ein Hitzeschock bei 37 °C für 5 Minuten. Dann wurde 1 ml LB-Medium zugegeben und die Zellen wurden bei 28 °C für 2-4 h geschüttelt. Die Zellen wurden pelletiert (Eppendorf- Tischzentrifuge, RT) und in 0.1 ml frischem LB-Medium resuspendiert. Anschließend wurden geeignete Mengen davon auf selektive LB-Agarplatten (s. 2.2.1) ausgestrichen, diese für 3 Tage bei 25 °C inkubiert und die gewachsenen Transformanten durch Plasmid-Minipräparationen (s. 2.3.1) überprüft.

2.5.4 Transformation von Tabakblattstückchen mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens (nach Marton et al., 1979)

Eine 50 ml-Agrobakterien-Übernachtkultur (in LB+50 µg/ml Kanamycin, 25 °C) wurde durch Zentrifugation geerntet (Beckman TJ-6, 850 g, RT, 10 min) und in 25 ml frischem LB-Medium resuspendiert. Tabakblätter aus sterilen in-vitro-Kulturen wurden mit einer Schere in feine Streifen (ca. 5mm breit) geschnitten und diese 2 Minuten lang in der Agrobakterien-Suspension gebadet. Die Tabakblattstückchen wurden dann auf MS-Agarplatten + 30 g/l Saccharose (s. 2.2.3) gelegt, die Platten mit Parafilm geschlossen und 1 Tag bei Raumtemperatur im Licht inkubiert. In dieser Zeit sollten die Agrobakterien Pflanzenzellen an den Schnitträndern infizieren. Nach zwei Tagen wurden die Tabakblattstückchen auf selektive Wachstumsplatten (s. u.) umgesetzt und 16 h täglich mit etwa 15-20 µE/(m²s) belichtet. Einmal pro Woche wurden die Tabakblattstückchen auf neue Platten umgesetzt. Etwa nach Ende der 2.

Woche erschienen an den Schnittstellen der Blattstückchen die ersten Sprosse, die etwa nach 2 weiteren Wochen so groß waren, dass man sie abschneiden und in MS/

Saccharose-Gläser umsetzen konnte. Durch die nun fehlenden Phytohormone begannen die Pflänzchen nach etwa einer Woche, Wurzeln auszubilden.

Selektionsplatten:

MS-Medium, pH 5.6 + 0.9 % (w/v) Agar (s. 2.2.3) + 30 g/l Saccharose

+ 1 mg/l Benzylaminopurin (Phytohormon) + 0.2 mg/l Naphthylessigsäure (Phytohormon) + 500 mg/l Carbenicillin (tötet Agrobakterien ab)

+ 50 mg/l Kanamycin (Selektion transformierter Pflanzenzellen)

2.6 M

C

2.6.1 DNA-Sequenzierung (Methode nach Sanger et al., 1980) (* DIG-System, nicht radioaktiv, Roche, Mannheim)

2 µl (~2 µg) Großpräp-DNA (s. 2.3.1, S. 16) wurden mit 1 µl 5'-Digoxigenin- markierten DNA-Primern* (1 pmol/µl), 2 µl Reaktionspuffer*,14 µl sterilem destilliertem Wasser sowie 1 µl Taq-DNA-Polymerase* (3 U/µl, vermischt und auf 4 Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilt (je 4 µl). In jedes dieser Reaktionsgefäße wurden nun 4 µl basenspezifische Stopmischung* (enthält 25 µM dNTPs, 850 µM des spezifischen ddNTPs, 500 µM MgCl2, pH 7.5) zugegeben, bei der jeweils eine andere Base als ddNTP vorlag. Der Röhrcheninhalt wurde mit 10 µl Paraffinöl überschichtet und im PCR-Gerät (Autogene II, Grant Instruments Ltd., Cambridge) wie folgt inkubiert.

Vorbehandlung: 95 °C, 0.6 min

PCR-Zyklen: 45 °C, 0.6 min; 72 °C, 1.4 min; 95 °C, 0.6 min; 25 Zyklen Nachbehandlung: 14 °C

Auftrennung, Blotten und Detektion erfolgten mit Hilfe des GATC-1500-Direct- Blotting-Systems, (GATC GmbH, Konstanz) : Die DNA wurde auf ein Sequenziergel (4% Polyacrylamidgel) aufgetragen und während des Laufes (30 W (konstant), etwa 1900 V, 15 mA, in TBE-Puffer) in einem GATC-1500-DNA-Sequencer direkt auf eine GATC-Direct-Blotting-Membran übertragen. Nach Beendigung des Laufes wurde die Membran mit einem Föhn getrocknet und zur DNA-Fixierung anschließend 3-5 min mit der DNA-Seite nach oben unter UV-Licht gelegt. Dann wurde die Membran in eine GATC-Röhre gelegt und bei 30 °C und 3 Umdrehungen/ min 5 min in 150 ml zweifach destilliertem Wasser äquilibriert. Die weitere Detektion erfolgte nach dem Roche-DIG-System, beginnend mit der Zugabe von Maleinsäurepuffer, nach der Färbemethode (s. 2.7.7).

2.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Ref.: Mullis et al, 1986)

Spezifische 20 bp lange crtZ-Primer, komplementär zu Sequenzen mit gleichem A:T / C:G- Verhältnis am Anfang bzw. Ende des crtZ-Genswurden von der Firma MWG- Biotech, Ebersberg synthetisiert.

24 µl Master-Mix (s. u.) wurden auf Eis zu 6 µl Tabak-DNA (Präparation s. 2.3.5, 40 ng/µl in TE-Puffer) pipettiert und mit 10 µl Paraffinöl überschichtet. Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte im PCR-Gerät (Autogene II, Grant Instruments (Cambridge Ltd ) unter folgenden Bedingungen:

Vorbehandlung: 94 °C,4 min

PCR-Zyklen: 59 °C, 0.6min; 72 °C, 1.5 min; 94 °C, 0.6 min; 30 Zyklen Nachbehandlung: 59 °C, 0.6min; 72 °C, 5 min; 15 °C

Die durch PCR vervielfältigte DNA wurde anschließend auf einem 1.3% (w/v) Agarosegel aufgetrennt.

Master-Mix: bidest H2O 172.15 µl

10x-Taq-Pol.-Puffer 30 µl

MgCl2 (25 mM) 21.6 µl

dNTPs (5 mM) 12 µl

Primer (100 µM) je 1.5 µl

Taq-Polymerase (4 U / µl) 1.25 µl

2.6.3 DNA-DNA-Hybridisierung (Southern-Blot, nach Southern, 1975) (*DIG-System, nichtradioaktiv, Roche, Mannheim)

Herstellung der Sonden-DNA

Die Markierung der Sonden-DNA geschah während der PCR mit Hilfe der DIG-DNA- Labeling-Mixture (Roche, Mannheim). Dazu wurden 22 µl Master-Mix (s. 2.6.2) mit 3µl DIG-DNA-Labeling-Mixture (10 x) und 5 µl pT7-7+crtZ- Plasmid-DNA gemischt und eine PCR wie unter 2.8.2 beschrieben durchgeführt. Die Sonde wurde dann mit einem PCR-Reinigungs-Kit ("High Pure PCR Product Purification Kit", Roche, Mannheim) gereinigt und die Ausbeute an DIG-markierter DNA im Tüpfeltest mit DIG-markierter Kontroll-DNA* verglichen.

Übertragung der DNA auf eine Nylon-Membran

Die zu untersuchende DNA, präpariert nach der Methode 2.3.6 (mind. 20 µg / Slot) wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen vollständig verdaut und auf einem 0,8 % (w/v) Agarose-Gel aufgetrennt (s. 2.4.1). Nach Anfärbung des Agarosegels mit Ethidiumbromid wurde die DNA depuriniert, denaturiert und neutralisiert. Dazu wurde das Gel zunächst 10 min in 0.25 M HCl , dann 2 x 15 min in 0.5 M NaOH + 1.5 M NaCl und schließlich 2 x 15 min in 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 + 3 M NaCl geschwenkt.

Zwischen jedem Flüssigkeitswechsel wurde das Gel gründlich mit destilliertem Wasser gespült. Die DNA wurde dann durch Kapillarblot über Nacht auf eine Nylon- Membran (Pall, Dreieich, "Biodyne Plus Membrane") übertragen. Als Blotting-Puffer diente dabei 20 x SSC (3 M NaCl, 300 mM NaCitrat). Die Effizienz der DNA- Übertragung wurde durch erneutes Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid überprüft.

Die DNA wurde 45 Sekunden im UV-Licht auf der Membran fixiert.

Hybridisierung mit der DNA-Sonde

Die Nylonmembran wurde nun mit der DNA-Seite nach innen vorsichtig in eine gut ausgespülte Hybridisierungsröhre gelegt, welche 10 ml Hybridisierungslösung (1 % (w/v) Blocking-Reagenz in Maleinsäurepuffer (s. u.), 0.1 % (w/v) Laurylsarcosin, 0.02 % (w/v) SDS in 5 x SSC (s. o.)enthielt. Diese wurde für 2 h bei 65 °C im

Hybridisierungsofen (Mytron, Biometra) gerollt (Prähybridisierung). Während dessen wurde die Digoxigenin-markierte DNA-Sonde 10 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert, sofort 5 min auf Eis-NaCl-Gemisch abgekühlt und mit 10 ml Hybridisierungslösung (s. o.) verdünnt. Die Konzentration der Dig-Sonde sollte mindestens 25 ng / ml betragen. Nun wurde die Prähybridisierungslösung aus der Röhre entfernt und durch die verdünnte Sonde ersetzt. Die Hybridisierung lief 16 h bei 65 °C unter ständigem Rollen in obigem Hybridisierungsofen.

Maleinsäurepuffer: 100 mM Maleinsäure, pH 7.5 150 mM NaCl

Detektion

Nach erfolgter Hybridisierung wurde die sondenhaltige Hybridisierungslösung abgegossen und für weitere Hybridisierungen bei -20 °C aufbewahrt. Die Membran wurde 2 x 5min bei RT in 50 ml 2 x SSC + 0.1 % (w/v) SDS und anschließend 2 x 15min bei 65 °C in 0.1 x SSC + 0.1 % (w/v) SDS gewaschen. Alle nun folgenden Schritte liefen bei RT ab. Dann wurde die Membran 1 min in Maleinsäurepuffer (s. o.) und 30 min in Blocking-Reagenz (1 % in Maleinsäurepuffer) geschwenkt. Danach wurden 3 µl , mit alkalischer Phosphatase verknüpfte Anti-Digoxigenin-Antikörper*, zu 30 ml Maleinsäurepuffer gegeben und die Membran darin für 30 min geschüttelt.

Die Membran wurde nun 2 x 15 min in Maleinsäurepuffer + 0.1 % (w/v) Triton X100 (Sigma) gründlich gewaschen. Die Membran wurde dann 5 Minuten in AP-Puffer äquilibriert, auf eine Plastikfolie gelegt, mit 500 µl AP-Puffer + 5 µl CSPD (chemoluminiszierendes Substrat, Roche, Mannheim) gleichmäßig benetzt und im Dunkeln für etwa 5 Minuten inkubiert. Nun wurde die Membran mit Zellstoff trockengetupft, in eine neue Plastikfolie eingeschweißt und in eine Filmkassette geklebt. Ein Röntgenfilm (Hyperfilm ECL, Amersham, Braunschweig) wurde aufgelegt und bis zur gewünschten Schwärzung belichtet (10 min – 2 h).

AP-Puffer: 100 mM Tris, pH 9.5 100 mM NaCl

50 mM MgCl2

2.6.4 DNA-RNA-Hybridisierung (Northern-Blot)

(DIG-System, nicht radioaktiv, Roche, Mannheim) Vorbereitung des Gels

0.9 g sterile Agarose wurden mit 36.5 ml sterilem Wasser gekocht, bis sich die Agarose gelöst hatte. Dann wurden 5 ml 10 x MOPS-Puffer (s. u.) und 8.5 ml Formaldehyd (37%) zugegeben, gemischt und sofort auf einen Gelschlitten gegossen.

10 x MOPS-Puffer: 200 mM MOPS (4-Morpholinopropansulfonsäure) 50 mM Na Acetat x 3 H2O

10 mM EDTA pH 7.0

Vorbereitung der Proben

8 µl RNA pro Spur (Präparation s. 2.3.7, eingestellt auf 1µg / µl) wurden mit 35 µl Auftragslösung (s. u.) gemischt, 15 Minuten bei 65 °C denaturiert und 5 Minuten auf Eis abgekühlt. Vor dem Auftragen wurde zu jeder Probe 1 µl Ethidiumbromid (1µg / µl in Wasser) zugegeben.

Auftragslösung: 60 µl 10 x MOPS-Puffer (s. o.) (für 15 Proben) 300 µl Formamid (deionisiert)

105 µl Formaldehyd (37%)

45 µl Dye-Mix: 0.2% Bromphenolblau, 10 mM EDTA

50% (w/v) Glycerin Gellauf und Blot:

Die RNA-Proben wurden auf das oben gegossene RNA-Gel aufgetragen und in einer sterilen Gelkammer in 1 x MOPS-Puffer bei maximal 70 Volt aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das Gel im UV-Licht photographiert, 3 mal 10 min in sterilem Wasser gewaschen und 20 Minuten in 20 x SSC (s. 2.6.3) äquilibriert. Die Nylon-Membran (Roche, Mannheim), auf die die RNA geblottet werden sollte, wurde kurz in sterilem

Wasser angefeuchtet und dann für 10 Minuten in 2 x SSC äquilibriert. In einem Kapillarblot-Verfahren wurde die RNA über Nacht auf die Membran transferiert. Als Blotting-Puffer wurde 20 x SSC verwendet. Die RNA wurde durch UV-Bestrahlung (45 Sekunden) mit der Membran quervernetzt.

Hybridisierung:

Die Membran wurde nun vorsichtig mit der RNA-Seite nach innen in eine sterile Hybridisierungsröhre gelegt und in 10 ml High-SDS-Puffer (s. u.) 2 Stunden bei 50 °C vorhybridisiert. Die wie unter 3.6.3 beschrieben hergestellte Dig-markierte Sonden- DNA wurde in High-SDS-Puffer auf ein Konzentration von 25 ng markierter Sonde pro ml verdünnt und für 10 Minuten bei 68 °C denaturiert. Dann wurde die Vorhybridisierungslösung durch die Sonde ersetzt, die über Nacht bei 50 °C mit der RNA auf der Membran hybridisierte. Am nächsten Tag wurde die Membran 2 x 15 Minuten in 5 x SSC + 0.1 % SDS bei Raumtemperatur und anschließend für 2 x 15 Minuten in 2 x SSC + 0.1% SDS bei 60 °C gewaschen. Die weitere Detektion geschah wie unter 2.6.3 beschrieben, angefangen mit dem 1-minütigen Bad in Maleinsäurepuffer.

High-SDS-Puffer: 7% (w/v) SDS

50% Formamid, deionisiert 5 x SSC

2% (w/v) Blocking-Reagenz 50 mM Natriumphosphat, pH 7.0 0.1% Laurylsarcosin

2.7 P

W

-B

2.7.1 Überexpression des crtZ-Proteins in E. coli

Ausgehend von einer Einzelkolonie wurde eine 10 ml Übernachtkultur E. coli + pT7- 7-crtZ in LB + 250 µg Ampicillin dick angeimpft. Am nächsten Morgen wurde die gewachsene Bakterienkultur in zwei 500-ml-Kolben mit je 200 ml LB-Medium + 10 mg Ampicillin überführt und im Schüttler bei 37 °C bis zu einer OD₅₈₀ von 0,6 angezogen. Dann wurde die Proteinproduktion mit 0,5 mM IPTG induziert und die Bakteriensuspension weitere 4 h bei 37 °Cgeschüttelt. Die Ernte der Bakterien erfolgte durch Abzentrifugieren bei 6000g (GSA-Rotor, 5 min), das Pellet wurde eingefroren.

Zur Weiterverarbeitung wurde das Pellet in 20 ml eiskaltem PBS-Puffer (s. 2.7.7) suspendiert. Daraufhin wurden die Zellen durch Sonifizieren mit einem Ultraschallstab (Sonifier B-12, Branson Sonic Power Company, Danbury, Connecticut, USA) aufgeschlossen und dabei auf Eis gekühlt. Nun wurde 1% (v/v) Triton X-100 zugegeben und 30 Minuten unter Rühren auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (1200g, SS34, 10 min) wurde das Pellet mit 50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA, pH 8 gewaschen, getrocknet und eingefroren.

2.7.2 Aufreinigung des crtZ-Proteins

Zunächst wurde das oben erhaltene Pellet in einer geeigneten Menge 6M Harnstoff, 1% (v/v) Triton-X-100 in PBS auf Eis gelöst. Diese Lösung wurde nun mit der entsprechenden Menge Lämmli-Puffer (s. 2.7.6) versehen, gekocht und auf mehrere präparative 17,5 % SDS-Polyacrylamidgele (s. u.) verteilt.

Präparatives 17,5% SDS-Polyacrylamidgel (nach Lämmli 1970):

Trenngel (100 ml) Sammelgel (30 ml)

30% (w/v) Acrylamid 58,3 ml 5,0 ml

2% (w/v) Bisacrylamid 3,65 ml 1,95 ml

Tris/HCl 25 ml (1,5 M, pH 8,7) 3,75 ml (1M, pH 6,8)

H₂O 10,33 ml 18,15 ml

10% (w/v) APS 1,65 ml 750 µl

10% (w/v) SDS 1,0 ml 300 µl

TEMED 50 µl 30 µl

Die Auftrennung der Proteine auf dem Gel erfolgte über Nacht bei 100 Volt. Nach Anfärbung der Proteinbanden in Coomassie-Lösung (s. 2.7.6) wurde die überexprimierte crtZ-Bande ausgeschnitten und mit einem Elektro-Elutionsgerät (Electro-Eluter, Model 422, BioRad) nach Anleitung über Nacht eluiert. Das eluierte Protein wurde dann erneut gekocht und auf präparative Harnstoffgele (Rezept s. o., aber mit zusätzlich 3M Harnstoff) aufgetragen. Die crtZ-Bande wurde nun abermals ausgeschnitten und wie oben eluiert.

2.7.3 Herstellung eines Antikörpers im Hühnerei

Ein Huhn wurde im Abstand von 2 Wochen mit 500 µl gereinigtem crtZ-Protein (200 µg) + 500 µl RAS-Adjuvans immunisiert. Die Eier des immunisierten Huhns wurden eingesammelt und daraus die Antikörper nach der Methode von Gassmann (Gassmann et al., 1990) isoliert.

Dazu wurde der Eidotter vom Eiweiß getrennt und mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen. Nun wurde der Dotter vorsichtig geöffnet und die Dotterhaut mit einer Pinzette entfernt. Das Eigelb wurde nun in einen 100-ml-Standzylinder überführt, mit Eipuffer auf 30 ml aufgefüllt und mit 30 ml 7% (w/v) PEG6000 in Eipuffer vermischt.

Es folgte eine Zentrifugation (SS34, 14000 g, 10 min) sowie eine Filtration des Überstandes durch mehrere Lagen Zellstoff. Nun wurde 12 % (w/v) festes PEG6000

zugegeben und unter Rühren gelöst. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt (SS34, 14000 g, 5 min). Das entstehende Pellet wurde in 10 ml Eipuffer gelöst und mit 10 ml 24 % (w/v) PEG₆₀₀₀ in Eipuffer vermischt. Nach erneuter Zentrifugation (SS34, 14000 g, 5 min) wurde das Pellet in 10 ml Eipuffer resuspendiert und eingefroren.

Eipuffer:

0,01 M K-Phosphat-Puffer, pH 7,2 0,1 M NaCl

2.7.4 Herstellung eines Antikörpers im Kaninchen

Ein Kaninchen wurde im Abstand von 3 Wochen mit je 500 µl gereinigtem crtZ- Protein (200 µg) + 500 µl RAS-Adjuvans immunisiert. 10 Tage nach der Immunisierung wurde jeweils eine Blutprobe (2 ml) genommen. Das Blutserum wurde teilweise direkt für Western-Blots eingesetzt, teilweise zuvor mit einer denaturierten Tabakproteinlösung (Samsun, Wildtyp) gereinigt, um unspezifisch bindende Antikörper abzufangen.

2.7.5 Proteinextraktion aus Tabak

1-2 kleine Tabakblätter wurden in flüssigem Stickstoff geerntet, in flüssigem Stickstoff gemörsert und mit 300 µl Extraktionspuffer vermischt. Nach 5-minütiger Inkubation bei 100 °C wurde 10 Minuten in einer Tischzentrifuge bei maximaler Umdrehungszahl zentrifugiert, der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 4 Volumen Aceton vermischt. Die extrahierten Proteine wurden nun bei –20

°C gefällt, zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50-100 µl 1%

(v/v) Extraktionspuffer aufgenommen. Nach einer Proteinbestimmung wurden die Proben auf 10 µg Protein/ µl eingestellt.

Protein-Extraktionspuffer:

125 mM Tris/HCl, pH 6,8 4% (w/v) SDS

4% â-Mercaptoethanol 200 µM PMSF

2.7.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE, nach Lämmli, 1970) 50 µg Tabakprotein pro Slot (5 µl) wurden mit 5 µl 2x-Lämmli-Puffer (s. u.) gemischt, 10 Minuten gekocht und auf ein kleines 17,5 % SDS-Polyacrylamidgel (s. u.) aufgetragen. Das Proteingemisch wurde nun in einer mit 1x Laufpuffer gefüllten Elektrophoresekammer aufgetrennt. Danach wurde das Gel mit Coomassie-Lösung angefärbt und anschließend entfärbt.

2x Lämmli-Puffer:

100 mM Tris/ HCl, pH 6,8 10 % â-Mercaptoethanol 4 % SDS

0,02 % Bromphenolblau 20 % Glycerin

kleines 17,5 % SDS-Gel: Trenngel (10 ml) Sammelgel (5 ml)

30% (w/v) Acrylamid 5,83 ml 835 µl

2% (w/v) Bisacrylamid 365 µl 325 µl

Tris/HCl 2,5 ml (1,5 M, pH 8.7) 625µl (1M, pH 6.8)

H₂O 1033 µl 3025 µl

10% (w/v) APS 165 µl 125 µl

10% (w/v) SDS 100 µl 50 µl

TEMED 5 µl 5 µl

1x Laufpuffer:

25 mM Tris 250 mM Glycin 0,1 % (w/v) SDS Coomassie-Lösung:

450 ml Ethanol 100 ml Essigsäure 450 ml H₂O

2,5 g Brillant Blau R 250, Roth Entfärber:

= Coomassie-Lösung ohne Brillant Blau R250

2.7.7 Western-Blot

Die Proteine wurden wie oben beschrieben elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend aber nicht gefärbt, sondern 15 Minuten in Blotting-Puffer äquilibriert. Die Membran (Immobilon P, Millipore) wurde kurz in Methanol angefeuchtet, 2 min in H₂O und 10 min in Blotting-Puffer geschwenkt.

Blotting-Puffer:

32 mM Tris 250 mM Glycin

Der Transfer erfolgte in einer wassergekühlten Blotting-Apparatur (TE 22, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA) in Blotting-Puffer bei konstanter Stromstärke von 400 mA für 2 Stunden. Die Membran wurde 10 Minuten in Ponçeau- Rot (0,5 % (w/v) Ponçeau S in 1 % Essigsäure) gefärbt. Die Markerproteine wurden auf der Membran mit Kugelschreiber markiert. Anschließend wurde der überschüssige Farbstoff durch mehrmaliges Wässern entfernt. Dann wurde die Membran durch Schwenken in 1x PBS + 5 % (w/v) Milchpulver geblockt und das Milchpulver kurz mit 1x PBS abgespült. Es folgte eine Inkubation mit dem primären Antikörper (aus Huhn bzw. Kaninchen) in einer Verdünnung von 1:500 bis 1:5000 in 1x PBS über Nacht. Danach wurden die nicht gebundenen Antikörpermoleküle durch dreimaliges Schwenken in 1x PBS + 0,1 % Triton-x-100 entfernt. Nun wurde die Membran noch einmal für 15 Minuten in 1x PBS + 5 % (w/v) Milchpulver geblockt und dann mit dem sekundären Antikörper (Anti-Chicken-IgG + Alkalische Phosphatase 1:10000 bzw.

Anti-Rabbit-IgG + Alkalische Phosphatase 1:20000), verdünnt in 1x PBS für 2 Stunden inkubiert. Nun wurde die Membran wieder wie oben beschrieben dreimal 10 Minuten gewaschen, um den überschüssigen sekundären Antikörper zu entfernen. Zur Detektion der Antikörperreaktion wurde die Färbemethode (Böhringer, Mannheim) angewandt. Dazu wurde die Membran 5 Minuten in AP-Puffer äquilibriert und dann mit 20 ml AP-Puffer + 75 µl NBT (75 mg/ml Nitroblau-tetrazolium-Salz in 70 % Dimethylformamid) + 45 µl BCIP (50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Phosphat- Toloidinium-Salz in 100 % Dimethylformamid) angefärbt.

1x PBS:

137 mM NaCl 2,7 mM KCl

4,3 mM Na2HPO4 * 2 H2O 1,4 mM KH₂PO₄

AP-Puffer:

100mM Tris, pH 9,5 100 mM NaCl 50 mM MgCl2

2.8 M

C

2.8.1 Pigmentextraktion

Zur Pigmentextraktion wurden mit einem Korkbohrer Plättchen von 11 mm Durchmesser aus dem mittleren Bereich eines Tabakblattes ausgestochen und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Tabakblattstückchen wurden für mindestens 3 Tage lyophilisiert und das Trockengewicht bestimmt. Dann wurden sie nach Zugabe einer Spatelspitze NaCO₃ mit Hilfe einer stumpfen Pinzette in einem in flüssigen Stickstoff getauchten 1-ml-Reaktionsgefäß zu feinem Staub zerrieben. Zu dem Pulver wurden nun 200 µl 80% Aceton zugegeben, gut gemischt und für mindestens 1 Stunde im Dunkeln auf Eis inkubiert. Die Blattreste wurden nun durch Zentrifugation (15 Minuten, 4 °C, maximale Umdrehungszahl) pelletiert, der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Der Rückstand wurde noch einmal mit 100 µl reinem Aceton nachextrahiert und die Überstände vereinigt. Die Extrakte wurden mit Stickstoff überschichtet und bei –20 °C im Dunkeln gelagert.

2.8.2 Photometrische Pigmentbestimmung (nach Lichtenthaler und Wellburn, 1983) 30 µl Tabak-Extrakt (s. 2.8.1) wurden mit 970 µl 80% Aceton vermischt und die Absorption im Photometer bei 663 nm, 646 nm und 470 nm vermessen. Die Gehalte an Chlorophyll a, Chlorophyll b und Gesamtcarotinoid in den Extrakten konnten nun mit Hilfe der Lichtenthaler-Wellburn-Formel für 80% Aceton berechnet werden (s. u.).

C_a = 12.21A₆₆₃ – 2.81A₆₄₆ C_a = Chlorophyll a (µg/ml) C_b = 20.13A₆₄₆ – 5.03A₆₆₃ C_b = Chlorophyll b (µg/ml) C_c = (1000A₄₇₀ – 3.27C_a – 104C_b) / 229 C_c = Gesamtcarotinoid (µg/ml)