Skript der histologischen Färbungen

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Skript der histologischen Färbungen

Theorie, Durchführung & Rezepte der wichtigsten histologischen Färbungen.

Erstellt für den praktischen Unterricht an der MTLA-Schule Dortmund.

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Inhaltsverzeichnis der wichtigsten Färbungen

1.Übersichtsfärbungen

1.1 HE-Färbung (Hämatoxylin Eosin) 1.2 Giemsa-Färbung

2.Fettfärbungen 2.1 Sudan III 2.2 Sudanschwarz B 2.3 Scharlachrot 2.4 Öl-rot

3.Bindegewebsfärbungen 3.1 Van Gieson-Färbung 3.2 Masson-Goldner-Färbung

3.3 AZAN-Färbung (Azokarmin-Anilinblau)

4.Darstellung des Elastischen Bindegewebes 4.1 EVG (Elastika- van Gieson)

4.2 Orcein nach Unna

4.3 Resorcin-Fuchsin nach Weigert

5.Nachweismethoden

5.1 Amyloidnachweis nach Bennhold

5.2 Fibrinnachweis: 5.2.1 Fibrinnachweis nach Ladewig 5.2.2 Fibrinnachweis MSB nach Lendrum 5.3 Kalknachweis nach Kossa

5.4 Pilznachweis nach Grocott

5.5 Nachweis von säurefesten Stäbchen (TB) Kinjoun 5.6 Warthin Starry Nachweis von Helicobacter

6.Darstellung von retikulären Fasern 6.1 Imprägnation nach Gomori

7.Darstellung von Nervengewebe 7.1 Toluidinblau

7.2 Olivecrona (Markscheidendarstellung) 7.3 Klüver-Barrera

8.Histochemie

8.1 Berlinerblau (Eisennachweis)

8.2 PAS-Reaktion (Perjosäure-Schiff‘sches Reagenz) für neutrale MPS 8.3 ABVG (Alcianblau- van Gieson) für saure MPS

8.4 Nachweis von Kohlenhydraten & Glykokonjugaten mit Hilfe von Lektinen 9.Zytologie

9.1 Papanicolaou-Färbung

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Die Färbung als Baukastensystem verstehen / Färbevorgang

Jede Färbung besteht aus verschiedenen „Bausteinen“, die sich immer wiederholen. Wichtig ist dabei, dass bestimmte Reihenfolgen im Auge behalten werden. Das Grundgerüst einer Färbung kann man sehr gut an der HE-Färbung erklären.

Der erste Baustein besteht immer aus einer Entparaffinierung mit Xylol zum Herauslösen des umgebenden Wachsmediums.

Arbeiten Sie nicht mit Paraffinschnitten, sondern mit gefrorenem Frischgewebe, entfällt dieser Schritt natürlich.

Der zweite Baustein besteht aus einer Hydrierungsreihe (Wasserzufuhr). Hierzu wird Alkohol absteigender Konzentration verwendet (96% & 70% Alkohol). Da die meisten Farbstoffe wässrig angesetzt sind muss man dem Gewebe langsam wieder Wasser zuführen, wenn es vorher wasserfrei war. Auch hier bedeutet dies bei Gefrierschnitten, dass eine Hydrierung nicht notwendig ist. Sie enthalten noch genug eigenes Gewebewasser.

Der dritte Baustein stellt die Anfärbung der Zellkerne dar.

Der vierte Baustein ist die Anfärbung des Zytoplasmas.

Die eigentliche Färbung ist jetzt abgeschlossen. Das gefärbte Präparat soll aber haltbar &

archivierbar sein, daher muss das Präparat mit einem Deckglas versehen werden, dass

aufgeklebt wird. Der Klebstoff ist wasserfrei, also muss unser Präparat noch weiterbearbeitet werden.

Der fünfte Baustein besteht aus der Dehydrierungsreihe (Wasserentzug). Auch hier werden Alkohole diesmal aufsteigender Konzentration verwendet.

Der sechste Baustein ist das Vorbereiten auf das Deckglasaufkleben = Eindecken. Da unser Klebstoff (Eukitt) Xylol löslich ist, verwenden wir hierfür Xylol.

1. Xylol I Xylol II

2. 96% Alk.

70% Alk.

Aqua dem

3.Kernfärbung H2O

4.Zytoplasma- färbung Aqua dem

5. 70% Alk.

96% Alk.

100% Alk.

6. Xylol III Xylol IV Eukitt

→Der mittlere Teil einer Färbung ist der Variable. Die Positionen 3 & 4 können ausgetauscht oder erweitert werden.

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1.Übersichtsfärbungen 1.1HE-Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung)

Ziel & klinische Relevanz

Es ist notwendig ein Übersichtsbild des Gewebes zu erstellen. Eventuell um pathologische Veränderungen zu erkennen & weitere Spezialfärbungen anordnen zu können. Alle

eingehenden Gewebe werden daher in der Pathologie zuerst HE gefärbt.

Farbstoffe

 Hämalaun nach Mayer

 Eosin

pH-empfindlicher Farblack zur Kernfärbung; positiv geladen, färbt einzeitig, indirekt durch Elektroadsorption saurer, negativ geladener Farbstoff zur

Zytoplasmafärbung, färbt direkt durch Elektroadsorption 1.Hämatoxylin

Es handelt sich beim Hämatoxylin um einen Naturfarbstoff, der durch Ätherextraktion aus dem Blauholz eines tropischen Baumes gewonnen wird.

Er bildet gelbliche Kristalle, die in kaltem Wasser schlecht, aber in heißem Wasser & in Alkohol gut löslich sind.

Der eigentliche Farbstoff ist nicht das Hämatoxylin, sondern ein Oxidationsprodukt, das Hämatein. Es entsteht durch Oxidation mit dem Luftsauerstoff (natürliche Reifung über 6 Wochen) oder durch Zusatz von Oxidationsmitteln (z.B. Na-Jodat = künstliche Reifung).

Bei der Oxidation verliert das Hämatoxylin 2 Wasserstoffatome & wird so zum Hämatein.

Jetzt muss darauf geachtet werden, dass es nicht zu einer Überreifung des Farbstoffes kommt, da die Luftoxidation weiter abläuft. Das dabei entstehende Oxihämatein ist für die Färbung unbrauchbar.

2.Hämatein

Hämatein ist ein schwach negativ geladener Farbstoff mit einem Bindungsoptimum von pH 6,5. Für die histologische Färbung daher ohne Nutzen. Erst der Zusatz von

verschiedenen Alaunsalzen lässt Hämatoxylinlacke entstehen, die stark positiv geladen sind & sich daher gut zur progressiven Anfärbung von vor allem im Zellkern enthaltenen negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA eignen.

Bei der Bildung von Farblacken kommt es zur Komplexverbindung zwischen dem Hämatein & den jeweiligen Metallionen der Alaune (Aluminium, Chrom, Eisen, usw.).

Essigsäure oder Zitronensäure bestimmen den pH-Wert der Lösung & Chloralhydrat, Glycerol oder Ethylenglykol dienen als Stabilisator, um eine Überoxidation oder einen Bakterienbefall zu verhindern.

Gefärbt wird in saurer Lösung & durch das nachträgliche „Bläuen“ in Leitungswasser werden starke Farbstoffbindungen & die eigentliche Blaufärbung der Kerne erzielt.

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5 3.Hämalaun

Nur die Hämatoxylinlacke des Aluminiums, die mit Kalialaun gebildet werden bezeichnet man als Hämalaune (Mayer´s, Harris´s, Gill´s, Cole´s & Delafield´s), diese eignen sich zur Kernfärbung die der HE-Färbung.

Die Farbe des Lackes ist pH-abhängig. Bei einem pH-Wert <5 erscheint die Lösung rotbraun (Rotwein). Bei höheren pH-Werten tritt die bekannte blaue Färbung auf, daher überführt man die Präparate nach der Färbung in Leitungswasser oder eine schwache Base zum „Bläuen“. Dies bedeutet zugleich eine Fixierung der Färbung, da die Hämateinlacke bei höheren pH-Werten schlecht löslich sind. Differenziert werden können die Zellkerne daher in sauren Lösungen wie z.B. HCL-Alkohol oder 2%ige Essigsäure.

Die Empfindlichkeit der Hämalaune auf Säuren macht sie daher unbrauchbar für manche Spezialfärbungen mit stark sauren Farblösungen. Hier greift man dann auf stabilere Eisenhämatoxyline zurück.

Hämalaune können progressiv oder regressiv zur Färbung verwendet werden.

Farbstoffbindung von Hämalaunen

Bindung an DNA: In stark saurem Milieu reagieren Kernsäuren basophil (negativ geladen) & lassen sich durch positiv geladene Hämalaune gut anfärben. Es

kommt zu einer Bindung des Aluminiums an zwei benachbarte oder auch nur ein Phosphor-Atom der DNA. Der Farbstoff Hämatein reagiert wahrscheinlich auch mit den Histonen des Chromatins.

4.Eosin

Das synthetische Tetrabrom-Fluorescein gehört zu den Xanthenfarbstoffen & ist der gebräuchlichste Plasmafarbstoff. Er wird in einer Konzentration von 1% -0,1% in wässriger oder in alkoholischer Lösung angeboten. Es handelt sich um einen sauren Farbstoff, dessen Färbeoptimum bei einem pH-Wert von 4,0-4,5 liegt. Dieser wird mittels Essigsäure vorher eingestellt.

Es kommt zur Ionenbindung zwischen negativ geladenen anionischem Farbstoff & den positiv geladenen kationischen Plasmaproteinen. Eine reine Plasmafärbung gibt es dabei nicht, denn es werden auch Bindegewebe & Kollagenfasern rot bis rosa dargestellt. Auch Kernstrukturen können den Farbstoff annehmen, wodurch die violette Mischfarbe der Kerne entsteht. Um die Färbkraft zu erhöhen wird die Farblösung mit einem Tropfen Eisessig auf 100ml versetzt, Eosin kann auch in alkoholischer Lösung zur Plasmafärbung verwendet werden. In starker Verdünnung zeigt es eine gelbgrünliche Fluoreszenz.

Die Färbung erfolgt regressiv & wird in Wasser & 70&igem Alkohol differenziert.

Werden im Farbstoffmolekül Brom gegen Jodatome ausgetauscht, erhält man das

Erythrosin, das alternativ zu Eosin eingesetzt werden kann. Die Farbstoffbindung erfolgt mit diesem sauren Farbstoff auch mittels Elektroadsorption.

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6 Allgemeines

Die HE-Färbung ist die gebräuchlichste Übersichtsfärbung in der Histologie. Man erhält mit dieser Färbung einen guten Überblick über Struktur & Qualität des zu untersuchenden Gewebes. Die Färbung ist schnell, unkompliziert & ermöglicht meistens schon eine

diagnostische Aussage. Bei nicht so klaren Befunden können dann gezielt Spezialfärbungen angeordnet werden.

Es handelt sich um eine Zweifachfärbung, d.h. es werden zwei Farbstoffe angeboten.

Das Hämalaun ist ein basischer Farblack & stellt die Kerne blau dar.

Das Eosin ist ein saurer Farbstoff & färbt Zytoplasma, Bindegewebe & Muskulatur in verschiedenen Rosatönen.

Die Farbstoffe werden hintereinander angeboten, daher handelt es sich um eine suczedane Färbung. Die Farbstoffbindung erfolgt durch Elektroadsorption.

Färbeablauf

Nach der Entparaffinierung der Gewebeschnitte mit Xylol & Hydrierung mit Alkoholen absteigender Konzentration, werden diese zur einzeitigen indirekten Kernfärbung in das Hämalaun nach Mayer überführt. Die Färbung ist progressiv, d.h. es wird bis zum Optimum gefärbt.

Nach der Kernfärbung erfolgt der Bläuungsvorgang in Leitungswasser. Es schließt sich nun die Zytoplasmafärbung mit Eosin an, einem schwach sauren Farbstoff.

Im Gegensatz zur Kernfärbung ist die Plasmafärbung regressiv & direkt. Es kommt zu einer leichten Überfärbung, die mit Hilfe von 70%igem Alkohol differenziert werden kann.

Durch die anschließende aufsteigende Alkoholreihe wird dem Gewebeschnitt Wasser entzogen, bevor die Schnitte in Xylol überführt werden.

Xylol ist das Lösungsmittel für Eukitt & wirkt als Intermedium zwischen dem Alkohol &

dem Eindeckmedium.

Das Eindeckmedium dient als Klebstoff für das Deckgläschen, wodurch die Präparate mikroskopier bar & haltbar gemacht werden.

Diese Eindeckmedien, die von verschiedenen Firmen zu beziehen sind, müssen den Schnitt transparent machen & den gleichen Brechungsindex haben wie das Glas.

Ansatz der Lösungen 1.Hämalaun nach Mayer

1g 1l 0,2g 50g 50g 1g

Hämatoxylin Aqua dest.

Kaliumiodat (KJO3) zur künstlichen Reifung = Oxidation zu Hämatein Aluminium-Kaliumsulfat (Beize, Metallionenanteil)

Kurz erwärmen oder über Nacht bei RT stehen lassen.

Chloralhydrat zur Stabilisierung Zitronensäure zur pH-Wert- Senkung 2.Eosin 1%ige wässrige Stammlösung

5g 500ml

Eosin Aqua dem.

→ lösen.

→ Vor Gebrauch auf 0,1% herunterverdünnen & 0,1-0,2ml Eisessig pro Küvette zugeben. Der pH-Werte sollte zwischen 4 & 4,5 liegen.

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HE-Färbung

Durchführung / Ablauf Färbezeiten

Entparaffinierung 1. Xylol I

2. Xylol II Hydrierung 3. Alkohol 96%

4.Alkohol 70%

5. Aqua dem.

Kernfärbung 6.Hämalaun

7.H2O warm, bläuen

(Für den Automaten 3x H2O in Wasch I – III, je 2 & zum Schluss 5 Min.) Zytoplasma- & Bindegewebsfärbung 8. Eosin 0,1%

9. Aqua dem.

Dehydrierung 10. Alkohol 70%

11. Alkohol 96%

12. Alkohol 99% (Isopropylalkohol 100%) Intermedium

13. Xylol III 14. Xylol IV

Eindecken mit Eukitt (luftblasenfrei!)

5 Min.

3 Min.

10 Min.

5 Min.

1 Min.

gründlich spülen

kurz kurz 2 Min.

5 Min.

Färbeergebnis Kerne:

Zytoplasma &

Bindegewebe:

blau

unterschiedliche Rosatöne

Zu jeder Färbung wird eine Präparatebeurteilung des tatsächlichen Färbeergebnisses vorgenommen.

Sie sollte folgende Punkte beinhalten:

 Beurteilung der Schnittqualität

 Beurteilung der Färbequalität & des Färbeergebnisses

 Gewebe oder Organdiagnose mit Beschreibung der typischen

differenzialdiagnostischen Merkmale, die Sie zu dieser Diagnose gebracht hat.

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1.2Färbung nach Giemsa

Darstellung von Blut- & Knochenmarkszellen, Helicobacter pylori & Parasiten.

Die Färbung eignet sich wegen der scharfen Differenzierung & der reichen

Farbtonabstufungen, besonders bei den Blautönen, nicht nur für hämatologische Präparate sondern auch als Übersichtsfärbung besonders bei Organen des lymphatischen Systems &

bei der Lymphomdiagnostik.

Farbstoffe

 Giemsalösung Simultanes Farbstoffgemisch aus den basischen Farbstoffen Methylenblau, Azur A & B mit polychromatischen

Eigenschaften, sowie dem sauren Zytoplasmafarbstoff Eosin.

Die Färbung erfolgt direkt, einzeitig, simultan & regressiv mittels Elektroadsorption.

Färbeablauf

Der Giemsafarbstoff zählt zur Gruppe der Romanowsky-Farbstoffe, es handelt sich um ein Gemisch aus Eosin, Methylenblau, Azur A & B, gelöst in Methanol & Glycerin zur Stabilisierung.

Die Flaschen müssen stets gut verschlossen sein, da Methanol leicht flüchtig ist & der Farbstoff so ausfallen kann. Luftdichtverschlossen kann die Farbstofflösung (Stammlösung) unbegrenzt aufbewahrt werden. Heute verwendet man hauptsächlich gekaufte Lösungen (Merck). Kurz vor Gebrauch wird die Stammlösung verdünnt, damit der Farbstoff seine Wirkung entfalten kann.

Jeder der basischen Farbstoffe kann mit Eosin (saurer Farbstoff) ein Salz bilden, z.B.

Methylenblau-Eosinat / Azur-Eosinat.

Mischungen dieser beiden basischen Teerfarbstoffe & deren Eosinatsalze färben das Zytoplasma & die Zellkerne der Blutzellen je nach pH-Wert an.

Der neutrale Farbstoff (Mischung aus basischen & sauren Farbstoffen) bringt eine eigene rötlich-violette Anfärbung des Chromatins von Leukozyten zustande. Die Bindung des basischen Azur B an die DNA & Bindung von saurem Eosin an das bereits gebundene Azur B wird als Romanowski-Giemsa-Effekt oder Polychromasie bezeichnet.

Wichtig für die Färbung ist der pH-Wert der Farbstofflösung. Hat die Farbstofflösung einen niedrigeren pH-Wert um 4, gehen die Farbtöne mehr ins rötliche, durch eine stärkere Farbstoffbindung des Eosins, als sauren Farbstoff im Zytoplasma & eine selektivere Anfärbung des Kernchromatins.

Ein höherer pH-Wert (5-6) ergibt eine dichtere Zellkernfärbung & eine Basophilie des Zytoplasmas. Der beste pH-Wert für FFPE-Gewebe liegt bei 4.

Die Anfärbung erfolgt mittels Elektroadsorption. Es handelt sich um eine Mehrfach - Simultanfärbung bei der, polychromatische Effekte bei der Anfärbung mitwirken.

Die Anfärbung erfolgt regressiv & einzeitig.

Wichtig ist die anschließende Differenzierung mit mikroskopischer Kontrolle. Bei der regressiven Färbung kommt es zuerst zur Überfärbung des Gewebes, die danach durch Differenzierung mit Essigwasser (0,5%) & 96%igem Alkohol wieder herausgelöst wird. Bei sehr blauem Ergebnis wird mit Essigwasser gespült, bei sehr rotlastigem Gewebe mit

96%igem Alkohol.

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Giemsafärbung

2. Xylol II Hydrierung 3.Alkohol 96%

4. Alkohol 70%

5. Aqua dem.

Färbung der Zellen

6. Giemsalösung (70ml Giemsa + 20ml Ampuwa) → nach der Färbung die Rückseite der Objekt- träger mit Zellstoff vom Farbstoff befreien.

Differenzieren

7. Essigwasser ca. 1%ig 8. Alkohol 96%

Stoppen der Differenzierung 9. Isopropanol

Dehydrierung 10. Isopropanol 11. Isopropanol Intermedium 12. Xylol III 13 Xylol IV

5 Min.

2 Min.

20 Min.

Kurz Kurz

Mikroskopische Kontrolle; ggf.

nachfärben oder differenzieren Kurz

Kurz

5 Min.

Basophile Granula:

Eosinophile Granula:

Neutrophile Granula:

Azurgranula:

Epithelzellen & BGW:

Zytoplasma Lympho / Mono:

Zytoplasma Granulozyten:

Thrombozyten:

Erythrozyten:

Bakterien:

Nukleolen:

Mastzellgranula & Schleim:

Kalk:

Kollagen & Keratin:

Knorpelmatrix:

blau-rot-violett violett-blau rot

braun-rot purpurrot

hellrot bis rotorange blau

rötlich

blau mit violettem Innenkörper blassrötlich

blau

rotviolett bis dunkelblau purpurrot

ungefärbt rosa violett

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2.Fettfärbungen 2.1Lipid-Darstellung

Lipide allgemein

Bei Lipiden handelt es sich um eine Sammelbezeichnung von wasserunlöslichen

(hydrophoben) Stoffen, die sich sehr gut in lipophilen Lösungsmitteln wie Xylol & Hexan lösen. Durch lange Kohlenwasserstoffreste, welche fast alle Lipide besitzen, sind sie wasserunlöslich.

Im lebenden Organismus werden Lipide als Bestandteil von Zellmembranen, als Energiespeicher oder Baufett verwendet.

Sie werden meist als Fette bezeichnet, wobei Fette nur eine Untergruppe der Lipide darstellen.

Einteilung der Lipide in:

 Fettsäuren (Brennstoff)

 Triglyceride (Energiespeicher)

Sie machen 90% der Nahrungslipide aus & sind ein wichtiger Energielieferant.

Triglyceride bilden den wichtigsten Energiespeicher des Körpers. Sie sind ein guter Kälte- & Verletzungsschutz in der Haut. Alle wichtigen Organe werden von einem Fettmantel geschützt.

Sie sind weiterhin ein Lösungsmittel für fettlösliche Stoffe, z.B. Vitamine.

 Membranbildende Lipide

 Phospholipide (Membranbausteine)

 Sphingolipide (Nervengewebe)

 Glycolipide (Außenseite biologischer Membranen mit einem

Kohlenhydratanteil, spielen eine Rolle bei der Kommunikation & Interaktion von Zellen)

 Isoprenoide

 Steroide (Hormone)

 Carotinoide (Pigmenten)

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2.2Fettfärbungen

Nachweis krankhafter Gewebeverfettungen (z.B. Fettleber), Nachweis von Fetteinlagerungen in der Gefäßwand (Arteriosklerose), Nachweis von Tumoren des Fettgewebes (Lipome oder Liposarkome) & Nachweis von Fettembolien (Todesursache).

Eine Aussage über die Gruppenzugehörigkeit der Fette ist mit den gebräuchlichsten Fettfarbstoffen nicht möglich.

Mit Hilfe der metachromatischen Nilblausulfatfärbung ist allerdings eine Unterscheidung zwischen sauren Lipoiden (Fettsäuren = blau Färbung) & Neutralfetten (Triglyceriden = rot Färbung) möglich.

Neutralfette werden mit Sudanfarbstoffen dargestellt.

Lipofuzine bei der Pigmentdifferenzierung & Myelinscheiden der Nervenfasern als neurologische Struktur.

Allgemeine Richtlinien bei den Fettfärbungen

1. Alle Fettfärbungen sind progressiv, d.h. es wird bis zur gewünschten Farbintensität gefärbt. Eine Differenzierung mit Alkohol ist aufgrund der Löslichkeit der Fette in Alkohol nicht möglich.

2. In der Regel sollten Alkoholkonzentrationen von 60% nicht überschritten werden.

3. Da bei der Paraplasteinbettung hochprozentige Alkohole zur Entwässerung eingesetzt werden, eignen sich für die Fettdarstellung nur Gefrierschnitte oder in Gelatine eingebettetes Gewebe

4. Eine Fixierung des Gewebes mit wässrig angesetzten Fixierern ist möglich. Allerdings muss die Fixierlösung vor dem Einfrieren des Gewebes gut ausgewaschen werden.

5. Da sich die Fettfarbstoffe in instabiler Lösung befinden, muss auf den Verschluss der Flaschen (braun) & Färbegefäße geachtet werden. Durch das Verdunsten schon geringer Mengen an Lösungsmittel (Alkohol) kann es zu Farbniederschlägen kommen.

6. Alle Fettfarbstoffe sollten kurz vor Gebrauch filtriert werden & evtl. je nach Vorschrift mit einem hochprozentigen Alkohol oder Wasser versetzt werden, um Niederschläge während des Färbevorganges zu vermeiden.

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12 Farbstoffe

Sudan schwarz Sudan III Öl-rot

Scharlachrot

Färbeergebnis der Fettdarstellung Fett schwarz

Fett goldgelb bis orange Fett leuchtend rot Fett leuchtend rot

Eine Kerngegenfärbung erfolgt je nach verwendetem Farbstoff mit Kernechtrot oder Hämalaun nach Mayer.

 Alle Fettfarbstoffe

 Kernechtrot

 Hämalaun nach Mayer

sind indifferente Farbstoffe ohne Ladung; Färbevorgang physikalisch nach dem Prinzip der Löslichkeit. Anfärbung ist progressiv, einzeitig & direkt

saurer Farbstoff mit Metallionenanteil (AL) daher positiv geladen; Anfärbung einzeitig, indirekt & progressiv pH-empfindlicher Farblack zur Kernfärbung; positiv geladen, färbt einzeitig, indirekt durch Elektroadsorption Färbeablauf

1.Physikalischer Färbevorgang Färbung durch Löslichkeit

Die zur Färbung verwendeten Fettfarbstoffe sind sowohl in Alkohol, besser jedoch in Fett löslich (lipophil). In Wasser sind sie unlöslich (hydrophob).

Der eigentliche Färbevorgang läuft nach rein physikalischem Prinzip ab. Der hydrophobe, lipophile Fettfarbstoff wird zunächst in Alkohol gelöst, aber mit einer so großen Menge an Wasser versetzt, dass er gerade noch in Lösung bleibt (instabile Lösung).

Bei der Gewebefärbung diffundiert der Farbstoff nun aus dem schlechteren Lösungsmittel Alkohol in das für ihn bessere Lösungsmittel Fett, wenn dies im Gewebe vorhanden ist, löst es sich darin & färbt es so an.

Zur besseren Gewebeübersicht sollte nach der Fettdarstellung noch eine Kernfärbung mit wasserlöslichen Kernfarbstoffen erfolgen.

Nach der Kernfärbung werden die Präparate in Wasser gespült & mit einem wasserlöslichen Eindeckmedium, z. B. Glyzeringelatine eingedeckt.

Soll ein Präparat sehr lange Zeit aufbewahrt werden, kann man das Deckglas noch zusätzlich mit Nagellack umranden, um das Eindringen von Bakterien & Pilzen zu vermeiden.

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13 2.Chemischer Färbevorgang & gleichzeitig Fixierung mit Osmiumsäure

Normalerweise können Fette nicht fixiert werden. Bei der Fixierung werden die Fette nur räumlich stabilisiert, weil das sie umgebene Gewebe fixiert wird (Fettzelle). Nach der Einbettung bleibt ein leerer Raum (ein Loch) übrig.

Die einzige Möglichkeit Fette zu fixieren & auch gleichzeitig zu färben ist die Anwendung von Osmiumtetroxid (Osmiumsäure).

Wird nicht in der Routine eingesetzt, nur in der Forschung im Rahmen der Elektronenmikroskopie!

Osmium ist fettlöslich & bildet durch Anlagerung an die Doppelbindungen (-C=C) der ungesättigten Fettsäuren, Reaktionsprodukte, die die Fette vernetzen, damit fixieren &

gleichzeitig schwarz darstellen.

Man verwendet Osmiumsäure als Stückfärbung für Fett- & Nervengewebe & zur Kontrastierung & Fixierung in der Elektronenmikroskopie.

Nachteile: Osmium ist sehr giftig & daher kann nur unter einem Abzug mit Handschuhen damit arbeiten. Weitere Nachteile sind der hohe Preis & die Entsorgungskosten.

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14

Fettfärbungen

1.Fettfärbung mit Sudan III

→ Herstellung von Gefrierschnitten

→ Bei der Verwendung von fixiertem Material die Schnitte vor der Fixierung 5 Min.

antrocknen lassen!

Fixierung

1. Formalin 4%ig 2. Aqua dem 3. Alkohol 50%

Fettfärbung 4. Sudan III 5. Alkohol 50%

6. Aqua dem.

Kernfärbung

7.Hämalaun nach Mayer 8. H2O

Eindecken mit wasserlöslichem Eindeckmedium (luftblasenfrei!)

5 Min.

Spülen Wenige Min.

30 Min.

Kurz Kurz

5 Min.

5-10 Min. bläuen

Fett:

blau

orange-goldgelb Ansatz der Lösungen

0,3g Sudan III wird mit 100ml 60°C warmen 70%igen Alkohol übergossen.

30Min. bei 60°C wird der Farbstoff gelöst.

Farbe erkalten lassen & vor Gebrauch filtrieren!

Zur Intensivierung des Färbeeffektes werden zu 100ml Stammlösung 3-4ml Aqua dem.

Hinzugegeben, dabei tritt evtl. eine leichte Trübung auf.

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15

2.Fettfärbung mit Scharlachrot

antrocknen lassen!

Fixierung

1. Formalin 4%ig 2. Aqua dem 3. Alkohol 50%

Fettfärbung

4.Aceton-Scharlachrot 5. Alkohol 50%

6. Aqua dem.

Kernfärbung

7. Hämalaun nach Mayer 8. H2O

5 Min.

Spülen 2-5 Min.

20 Min.

Kurz Kurz

5-10 Min.

10 Min. bläuen

Fett:

blau rot

Ansatz der Lösungen

50ml Aceton & 50ml 70&igen Alkohol mischen.

0,3g Scharlachrot in dieser alkoholischen Lösung lösen, filtrieren.

Vor gebrauch nochmals gut filtrieren & unmittelbar vor der Färbung 2ml Aceton zum Filtrat geben!

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16

3.Fettfärbung mit Sudanschwarz B

antrocknen lassen!

Fixierung

1. Formalin 4%ig 2. Aqua dem Fettfärbung 3.Sudanschwarz B 4. Alkohol 40%

5. Aqua dem.

Kernfärbung 6. Kernechtrot 7. Aqua dem.

5 Min.

Spülen

30 Min.

Kurz Kurz

20 Min.

kurz

Fett:

rot

schwarz-blau Ansatz der Lösungen

0,1g Sudanschwarz in 100ml 70%igen Alkohol geben & kochen. Vorsicht! Abkühlen lassen

& vor Gebrauch filtrieren.

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17

4.Fettfärbung mit Öl-rot-O

antrocknen lassen!

Fixierung

1. Formalin 4%ig 2. Aqua dem 3. Isopropanol 60%

Fettfärbung 4. Öl-rot O Lösung 5. Isopropanol 60%

6. Aqua dem.

Kernfärbung

7. Hämalaun nach Mayer 8. H2O

5 Min.

Spülen 5 Min.

10 Min.

Kurz Spülen

5 Min.

10 Min. bläuen

Färbeergebnisse Kerne:

Fett:

blau rot Ansatz der Lösungen 1.Stammlösung

0,5g Oil-Red-O in 100ml Isopropanol lösen

2.Gebrauchslösung

60ml Stammlösung & 40ml Aqua dem. mischen & 24 Std. stehen lassen & kurz vor Gebrauch filtrieren.

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18

3.Bindegewebsfärbungen 3.1Trichromfärbung nach van Gieson

Selektive Darstellung von kollagenen Fasern, Muskeln & Zytoplasma.

Häufige Kombination mit der Elastika-Färbung = EVG Farbstoffe

 Eisenhämatoxylin nach Weigert

 Säurefuchsin

 Pikrinsäure

pH-stabiler, basischer Farblack zur Kernfärbung, positiv (Fe-Ionen) geladen

Färbung einzeitig, progressiv indirekt durch Elektroadsorption Zytoplasmafärbung, Muskulatur & Bindegewebe

Saurer, negativ geladener Farbstoff; Bestandteil der PS- Lösung, grobdispers, direkte Simultanfärbung, progressiv durch Elektroadsorption

Zytoplasmafärbung, Muskulatur & Bindegewebe

Saurer, negativ geladener „Farbstoff“, Bestandteil der PS- Lösung, feindispers, direkte Simultanfärbung, progressiv durch Elektroadsorption

Färbeablauf

Trichromfärbung → 3 Farbstoffe werden angeboten

Nach der Entparaffinierung & Hydrierung der Gewebeschnitte werden diese zur einzeitigen indirekten Kernfärbung in das Fe-Hämatoxylin nach Weigert überführt. Die Färbung ist progressiv, d.h. es wird bis zum Optimum gefärbt.

1.Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin nach Weigert

Einsatz eines pH-stabilen Farblackes, da die nachfolgenden Zytoplasmafarbstoffe stark sauer sind.

Es handelt sich um eine einzeitige regressive oder progressive Lackfärbung. Das in der Lösung vorhandene Eisen-(III)-chlorid wirkt hier als Beize. Die Anfärbung erfolgt durch Elektroadsorption d.h. durch die positiven Ladungen des Eisenhämatoxylins kommt es zur Anlagerung an die negativ geladenen Phosphatgruppen des Zellkernchromatins.

Nach mikroskopischer Kontrolle kann eine Differenzierung mit HCL-Alkohol 1%ig durchgeführt werden, ist aber meist nicht nötig.

Nach der Kernfärbung der Bläuungsvorgang im Leitungswasser. Durch das für den Zellkern alkalische Leitungswasser (pH 7,5) kommt es zu einer Stabilisierung der Farbstoffbindung.

Es schließt sich nun die Zytoplasmafärbung & Bindegewebsfärbung mit PS-Lösung an, einem simultan färbenden Farbstoffgemisch aus Pikrinsäure & Säurefuchsin.

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19 2.PS-Lösung (Pikrinsäure-Säurefuchsin) Simultanfärbung

Hierbei handelt es sich um eine teils physikalische Färbemethode nachdem Prinzip der Dispersität.

Es werden zwei unterschiedlich disperse Farbstoffe zur Färbung angeboten. Sie befinden sich in einer Farbstofflösung (Simultanfärbung).

Die Pikrinsäure liegt in feindisperser Phase vor & färbt in der vorgegebenen Zeit das gesamte Gewebe. Das Säurefuchsin ist grobdispers & färbt in dieser Zeit nur die groben Bindegewebsstrukturen.

Daher ist die kurze Färbezeit unbedingt einzubehalten, sonst kommt es zu einer Farbüberlagerung der mit Pikrinsäure angefärbten feinen & dichten Gewebestrukturen (Zytoplasma & Muskulatur). Das Präparat wird rotstichig! Im Gegensatz zur Kernfärbung ist die Plasma- & Bindegewebsfärbung progressiv & direkt.

Da die Farblösung Pikrinsäure enthält, müssen drei Bänder 96&iger Alkohol eingesetzt werden, um die überschüssige Pikrinsäure aus den Schnitten zu entfernen, da sonst die Schnitte nach einiger Zeit ausbleichen würden, wenn Reste im Gewebe verbleiben.

Die Alkohole dienen auch gleichzeitig als Dehydrierung.

Ansatz der Lösungen

1.Eisenhämatoxylin nach Weigert

Die gebrauchsfertige Farbstofflösung wird frisch aus 2 Stammlösungen (Weigert 1 &

Weigert 2) hergestellt. Diese Stammlösungen sind, in dunklen Flaschen gelagert, jahrelang haltbar.

Die beiden Lösungen werden zu gleichen Teilen 1:2 (1+1) gemischt.

Da wir für eine Küvette 80 ml benötigen also: 40 ml Lösung 1 + 40 ml Lösung 2

Diese Mischung ist ca. eine Woche haltbar!

Also wird die Küvette mit dem Ansatzdatum beschriftet!

Stammlösung Weigert 1: 1g Hämatoxylin in 100ml 96%igem Alkohol lösen.

Stammlösung Weigert 2: 1,16 g EisenIIIchlorid in 98 ml aqua dem lösen.

dazu 1 ml 25%ige HCL

2. P-S-Lösung (Pikrinsäure-Säurefuchsin)

Auch diese Lösung besteht aus 2 Stammlösungen

1. Säurefuchsin 1%ig: 1g Säurefuchsin in 100 ml aqua dem lösen

2. Pikrinsäure 1,2%ig: 1,2 g Pikrinsäure in 100 ml aqua dem lösen (gesättigt) Das Mischungsverhältnis kann variiren!

Ausgetestet für unser Schullabor mischen wir: ½ + 9 ½ Teile = 4 ml Lsg 1 + 76 ml Lsg 2 = 4 ml Säurefuchsin + 76 ml Pikrinsäure

Vor Gebrauch filtrieren!

Die fertige Farbstofflösung ist lange haltbar!

(20)

20

Trichromfärbung nach van-Gieson

4. Alkohol 70%

Kernfärbung

5. Eisenhämatoxylin nach Weigert 6. H2O

7. H2O warm, bläuen

Färbung des Bindegewebes & der Muskulatur 8. PS-Lösung (Pikrinsäure-Säurefuchsin)

10. Alkohol 96%

11. Alkohol 96%

12. Alkohol 99%

Intermedium 13. Xylol III 14. Xylol IV

5 Min.

2 Min.

10-15 Min.

Kurz 5-10 Min.

30 Sek.

(Einhaltung der Färbezeit sehr wichtig!!!)

Kurz

Kurz, auswaschen überschüssiger Pikrinsäure

2 Min.

5 Min.

Zytoplasma &

Muskulatur:

Bindegewebe:

braun gelb rot

(21)

21

3.2Trichromfärbung nach Masson-Goldner

Selektive Darstellung von kollagenen Fasern & allgemein von Bindegewebe.

Bindegewebsfärbungen werden eingesetzt, um das Verhältnis von Binde- & Funktionsgewebe besser darzustellen. Es sollen krankhafte Veränderungen, Narbengewebe, Leberzirrhose oder andere Erkrankungen, die mit dem Umbau von Funktions- zu Bindegewebe einhergehen, besser erkennbar sein.

Farbstoffe

Sie wird zu den Trichromfärbungen gezählt, obwohl 6 verschiedene Farbstoffe zum Einsatz kommen  daher müsste man eher von einer suczedan-simultan Mehrfachfärbung sprechen.

 Azophloxin

 Ponceau S

 Orange G

 Lichtgrün

pH-stabiler, basischer Farblack zur Kernfärbung, positiv geladen, Färbung einzeitig indirekt durch Elektroadsorption Zytoplasmafärbung, Muskulatur & Bindegewebe

Saurer, negativ geladener Farbstoff; Bestandteil der Masson- Lösung, grobdispers, direkte Simultanfärbung; Elektroadsorption Zytoplasma- & Muskulaturfärbung

Bestandteil der Masson-Lösung, feindispers, saurer negativ geladener Farbstoff, direkte Simultanfärbung, Elektroadsorption Zytoplasma- & Muskulaturfärbung

Bestandteil der Masson-Lösung, feindispers, saurer negativ geladener Farbstoff, direkte Simultanfärbung, Elektroadsorption Zytoplasmafärbung; Bestandteil der PO-Lösung, Beizung des Bindegewebes, feindispers, saurer, negativ geladener Farbstoff, Färbung direkt durch Elektroadsorption

Bindegewebsfärbung; grobdispers, saurer negativ geladener Farbstoff, Färbung indirekt zweizeitig nach Beizung mit Phosphormolybdänsäure, Elektroadsorption

Färbeablauf

1.Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin nach Weigert

Die Gebrauchslösung (Farblack) wird aus Hämalaun & Eisen-(III)-chlorid (A & B oder I & II) hergestellt, indem man sie zu gleichen Teilen mischt (für eine Küvette 40ml I + 40ml II). Die frisch hergestellte Gebrauchslösung ist ca. 10 Tage haltbar (Datum bei Ansatz auf der Küvette vermerken!).

Durch den Fe-Anteil erhält der Farbstoff seine positive Ladung.

Es handelt sich um eine einzeitige regressive Beizenfärbung. Das in der Lösung vorhanden Eisen-(III)-chlorid wirkt als Beize. Die Anfärbung erfolgt mittels

Elektroadsorption d.h. durch die positive Ladung des Eisenhämatoxylins kommt es zur Anlagerung an die negativ geladenen Phosphatgruppen des Zellkernchromatins.

(22)

22 Nach mikroskopischer Kontrolle kann eine Differenzierung mit HCL-Alkohol 1%ig

durchgeführt werden, ist aber nicht grundsätzlich notwendig.

2.Bläuung

Die Schnitte werden für 5 Minuten in warmem Leitungswasser gebläut. Das Wasser hat einen pH-Wert von ca. 7,4.

Der IeP des Zellkerns liegt bei pH-Wert 3,5, hier sind die Ladungen ausgeglichen. Durch die Alkalisierung werden H⁺-Ionen ausgeschleust, der Kern ist jetzt negativ geladen & die Farbstoffbindung mit dem Farblack wird noch stärker. Die Wärme beschleunigt diesen Vorgang. Die Kerne sind jetzt schwarz-blau, werden aber nach der PS-Lösung schwarz- braun sein.

3.Zytoplasma- & Muskulaturfärbung mit dem Masson--Gemisch

Das Masson-Gemisch besteht aus 3 sauren roten Farbstoffen unterschiedlicher Dispersität (Säurefuchsin, Azophloxin & Ponceau S) & wird als Simultanfarbstoff eingesetzt. Das Säurefuchsin färbt dabei das Bindegewebe, da es grobdispers ist. Die beiden anderen sind feindispers & färben Muskulatur & Zytoplasma. Die Farbstoffe sind negativ geladen &

binden daher an positiv geladenen Gewebebestandteil.

Es handelt sich um eine direkte Simultanfärbung.

4.Beizung mit PO-Gemisch

Das Bindegewebe wird gebeizt, d.h. Farbstoffanlagerungen durch das Masson-Gemisch müssen entfernt werden, sonst kann keine saubere Bindegewebsfärbung mit Lichtgrün stattfinden. Es kommt durch die positiv geladenen Metallionen der

Phosphormolybdänsäure zu einer Rückverteilung der negativ geladenen Farbstoffmoleküle vom groben Bindegewebe an die Metallionen in der Lösung.

Hier sollte eine mikroskopische Kontrolle des Bindegewebes erfolgen. Bei zu langer Einwirkung der Beize würden sich auch feine Strukturen wieder entfärben (Muskulatur &

Zytoplasma), daher sollte die Zeit nicht unnötig verlängert werden. Beim Orange G handelt es sich um einen sauren, negativ geladenen, feindispersen Zytoplasmafarbstoff.

5.Bindegewebsfärbung

Hierzu verwendet man Lichtgrün oder Anilinblau als grobdisperse Bindegewebsfarbstoffe.

Beide Farbstoffe sind sauer & daher negativ geladen & binden daher gut, durch Elektroadsorption an die positiv geladenen Metallionen der beize, die sich an das Bindegewebe angelagert haben. Bei Einhaltung der Färbezeit erhält man eine gute Anfärbung des Bindegewebes. Die grobdispersen Farbstoffmoleküle können bei längerer Einwirkzeit auch feinere Strukturen färben, daher sollte eine Überschreitung der Färbezeit vermieden werden.

Es handelt sich um eine progressive, zweizeitige, indirekte Beizenfärbung.

Zwischen den einzelnen Lösungen wird mit 1%iger Essigsäure gespült, um einem sauren pH-Wert während der Färbung zu gewährleisten.

(23)

23 Ansatz der Lösungen

1. Eisenhämatoxylin Stammlösungen:

Weigert I und Weigert II werden zu gleichen Teilen gemischt (40ml + 40ml).

Die entstandene Gebrauchslösung ist ca. 10 Tage haltbar.

2. Masson-Gemisch

Es setzt sich aus 3 Farbstoffen zusammen:

A. Ponceau-Säurefuchsin 0,2g Ponceau de Xylidine 0,1g Säurefuchsin lösen in 300ml Aqua dem und

0,6ml Eisessig dazugeben (96%ige Essigsäure) B. Azophloxin

0,5g Azophloxin in 100ml Aqua dem lösen 0,2ml Eisessig dazugeben C. 0,2%ige Essigsäure

0,2ml Eisessig auf 100ml Aqua dem →Gebrauchslösung:

10ml Lösung A 2ml Lösung B 88ml Lösung C

3. Phosphormolybdän-Orange G 4g Phosphormolybdänsäure und 1,5g Orange G in

100ml Aqua dem lösen 4. Lichtgrün 0,1%ig 0,1g Lichtgrün in

100ml Aqua dem lösen und 0,2 ml Eisessig dazugeben

→ Alle Farbstoffe werden vor Gebrauch filtriert!

(24)

24

Trichromfärbung nach Masson-Goldner

4. Alkohol 70%

Kernfärbung

5. Eisenhämatoxylin nach Weigert 6. H2O warm, bläuen

7. Aqua dem.

Zytoplasmafärbung 8. Masson-Gemisch 9. Essigsäure 1%

Beizen des Bindegewebes

10. Phosphormolybdän-Orange G 11. Essigsäure 1%

Bindegewebsfärbung 12. Lichtgrün 0,1%

13. Essigsäure 1%

Dehydrierung 14. Isopropanol 3x Intermedium 15. Xylol III 16. Xylol IV

5 Min.

3 Min.

15 Min.

10 Min.

Kurz

7 Min.

Spülen

10 Min.

Spülen

mit mikroskopischer Kontrolle (BGW sollte entfärbt sein)

10 Min.

5 Min. Gesamtbildkontrolle

Je 1 Min.

5 Min.

Zytoplasma:

Bindegewebe:

Muskulatur:

braun rot-orange grün rötlich

(25)

25

3.3AZAN-Färbung nach Heidenhain

Selektive Darstellung von kollagenen Fasern & allgemein von Bindegewebe. Entwickelt hat diese Färbung der deutsche Anatom Martin Heidenhain (1864-1949). Heute gibt es mehrere Abwandlungen von der Originalmethode.

Sie gehört zu den histologischen Übersichts- & Bindegewebsfärbungen, die eingesetzt werden, um das Verhältnis von Binde- & Funktionsgewebe besser darzustellen. Es sollen krankhafte Veränderungen, Narbengewebe, Leberzirrhose oder andere Erkrankungen, die mit dem Umbau von Funktionsgewebe zu Bindegewebe einhergehen, besser erkennbar sein.

Farbstoffe

 Orange G (orange-gelb)

 Anilinblau

 Azokarmin (rot)

Zytoplasmafärbung, Bestandteil des Simultan-AZAN-Gemisches, wässrig, Fluorescin-Farbstoff, grünstichig: feindispers, saurer, negativ geladener Farbstoff, Färbung direkt durch Elektroadsorption Bindegewebsfärbung, wässrig, grobdispers, saurer, negativ

geladener Farbstoff, progressiv, Färbung indirekt zweizeitig nach Beizung mit Phosphorwolframsäure, Elektroadsorption

Kernfarbstoff, synthetisch, wässrig, sauer, negativ geladen, feindispers, färbt direkt & regressiv die Histone der DNA & das übrige Gewebe durch Elektroadsorption

Färbt bei 56°C, da hier alle Farbstoffkristalle gelöst sind

Die AZAN-Färbung gehört zu den Trichrom-Bindegewebsfärbungen. Es handelt sich um eine simultane Mehrfachfärbung mit Beize (indirekt & zweizeitig).

Die Abkürzung AZAN lässt sich von den verwendeten Farbstoffen Azokarmin & Anilinblau ableiten.

Zellkerne, Zytoplasma, Bindegewebe & Muskulatur lassen sich in einer gut differenzierten Färbung darstellen.

(26)

26 Färbeablauf

Bei der AZAN-Färbung handelt es sich um eine simultane Mehrfachfärbung mit Beize.

Nach der Entparaffinierung & Hydrierung des Gewebes bis zum Aqua dem., wird der saure Kernfarbstoff Azokarmin angeboten.

Die Färbung erfolgt bei 56°C, da nur in der Wärme alle Farbstoffkristalle gelöst sind & somit der Färbung zur Verfügung stehen.

Die Farbstofflösung hat einen pH-Wert von 2, d.h. da es sich bei den Histonen

(Verpackungssystem der DNA, basische Kernproteine) um Proteine handelt, werden diese einen IeP von ca. pH 3,5 haben. Bei einem pH-Wert der Farbstofflösung von 2, würden dann die Histone H⁺ aufnehmen, so eine positive Gesamtladung tragen & eine Anfärbung mit einem sauren, negativ geladenen Farbstoff ermöglichen.

Die Färbung mit Azokarmin erfolgt regressiv. Da es sich um einen sauren, sehr feindispersen Farbstoff handelt, werden auch Bindegewebe, Muskulatur & Zytoplasma mit angefärbt.

Ein Teil der Überfärbung wird durch Differenzierung mit Anilinalkohol entfernt. Ziel ist es die Kerne rot auf rotem Hintergrund zu erkennen. Das Zytoplasma wird rosa.

Die Differenzierung wird durch Essigalkohol gestoppt.

Da keine vollständige Entfärbung des Bindegewebes & der Muskulatur gelingen kann, erfolgt jetzt eine Beizung mit PWS (=Phosphorwolframsäure). PWS ist nicht in der Lage in den Zellkern einzudringen, dieser bleibt daher gefärbt, während vor allem Bindegewebe & auch teilweise die Muskulatur wieder entfärbt werden.

Dabei verhält sich die sich die Phosphorwolframsäure wie ein saurer, grobdisperser Farbstoff

& verdrängt so das Azokarmin aus dem Bindegewebe, Dies sollte auf jeden Fall mikroskopisch kontrolliert werden.

Nach abgeschlossener Beizung (Bindegewebe entfärbt) erfolgt die progressive Färbung mit dem AZAN-Gemisch, eine Simultanfärbung mit dem grobdispersen, sauren Anilinblau (Bindegewebe) & dem feindispersen sauren Orange-G. Nach abgeschlossener Färbung erfolgt die Dehydrierung & Vorbereitung auf das Eindeckmedium.

(27)

1.Azokarmin (Kernfarbstoff)

1g Azokarmin in 1000ml Aqua dem. lösen & zum Kochen bringen. Auf RT abkühlen lassen & filtrieren.

Zum Filtrat gibt man 10ml Eisessig (96%ige Essigsäure).

Die Lösung ist lange haltbar.

2.Anilin-Alkohol 0,1%

1ml Anilinöl (giftig) auf 1000ml 90%igen Alkohol

3.Essig-Alkohol 1%

10ml Eisessig auf 1000ml 96%igen Alkohol

4.Phosphorwolframsäure

5g Wolframatophosphorsäure in 100ml Aqua dem. lösen

5.AZAN-Stammlösung 5g

20g 1000ml 80ml

Anilinblau wasserlöslich &

Orange G

Aqua dem lösen &

Eisessig dazugeben

Die Lösung wird aufgekocht & nach dem Erkalten filtriert.

Gebrauchslösung: Die Stammlösung wird 1:2 vor Gebrauch mit Aqua dem. verdünnt. Sie ist dann ca. 1 Woche haltbar

→ Die Lösungen 1,4 & 5 werden vor Gebrauch filtriert!

(28)

28

AZAN-Färbung

2. Xylol II Hydrierung

3. Anilin-Alkohol 0,1%

4. Alkohol 96%

5. Aqua dem.

Kernfärbung 6. Azokarmin 7. Aqua dem.

Differenzierung der Kerne 8. Anilin-Alkohol 0,1%

9. Essigsäure-Alkohol 1%

Beizen des Bindegewebes 10. PWS 5%

11. Aqua dem.

Färbung Bindegewebe & Zytoplasma 12. AZAN-Gemisch (Anilinblau-Orange G) 13. Aqua dem.

15. Alkohol 96%

16. Alkohol 99%

5 Min.

1 Min.

2 Min.

20 Min.bei 56°C/10Min.Abkühlung Spülen, kurze mikroskopische

Kontrolle

Differenzierung, kurz, Stoppen der Differenzierung, mikroskopische Kontrolle (Kerne rot auf rotem Hintergrund)

30-45 Min.

Spülen, mikroskopische Kontrolle, Bindegewebe soll entfärbt sein, bei Bedarf zurückgehen

10-30 Min.

Spülen

Kurz, Vorsicht, entzieht blaue Farbe Kurz

2 Min.

5 Min.

Zytoplasma & Erythrozyten:

Retikuläres / kollagenes BGW &

Schleim:

Muskulatur:

rot

orange-rot blau rot-violett

(29)

29

4.Darstellung der elastischen Fasern

Allgemein

Elastische Fasern liegen als Begleitstrukturen der kollagenen Fasern im Bindegewebe, in Organkapseln, in der Lunge, in der Wand herznaher Arterien, in der Haut & im elastischen Knorpel. Reine elastische Strukturen sind kaum zu finden.

Die Elastika-Färbung kann gut mit der van-Gieson-Färbung kombiniert werden, man muss nur darauf achten, dass der Farbstoff Resorcin-Fuchsin gut ausdifferenziert wird, bevor die van-Gieson-Färbung sich anschließt um eine Mischfarbe zu verhindern. Ansonsten folgt nach der Färbung der elastischen Fasern eine Kerngegenfärbung mit Eisenhämatoxylin nach Weigert.

Bei der Verwendung von Aldehydfuchsin setzt man Kernechtrot als Kerngegenfärbung ein.

Bei der Färbung mit Orcein nach Unna eine Kerngegenfärbung mit blauem Polychrom.

4.1EVG-Färbung (Elastika-van-Gieson)

Selektive Darstellung von elastischen Fasern im Kontrast zum Bindegewebe.

Untersuchung aller Gewebe mit hohem Anteil elastischer Fasern, um krankhafte

Veränderungen zu erkennen. Gewebekönnten sein: Blutgefäßwände, Lungengewebe & Haut.

Farbstoffe

 Resorzin-Fuchsin

 Pikrinsäure

einzeitige, indirekte Beizenfärbung der elastischen Fasern mit basischem Farbstoff positiv geladen; Färbung durch Grenzflächen- & Elektroadsorption

pH-stabiler, basischer Farblack zur Kernfärbung, positiv (Fe- Ionen) geladen, Färbung einzeitig indirekt durch

Elektroadsorption, progressiv

Zytoplasmafärbung, Muskulatur & Bindegewebe, saurer negativ geladener Farbstoff, Bestandteil der PS-Lösung, grobdispers, direkte Simultanfärbung, Elektroadsorption, progressiv

Zytoplasmafärbung, Muskulatur & Bindegewebe, saurer, negativ geladener „Farbstoff“, Bestandteil der PS-Lösung, feindispers, direkte Simultanfärbung durch

Elektroadsorption, progressiv

(30)

30 Färbeablauf

1.Elastische Fasern

Ein für die Färbung wichtiger Bestandteil ist das Elastomuzin, das in der Hüllschicht der Fasern vorhanden ist. Dieses Elastomuzin hat einen wichtigen Anteil daran, dass die elastischen Fasern zu den dichtesten & widerstandsfähigsten Strukturen des Körpers gehören. Durch einen Schleimanteil ist die Anfärbbarkeit der Fasern reduziert.

Als Farbstoffe kommen das Orcein, ein natürlicher Farbstoff, der aus einer Flechte gewonnen wird, das Resorzin-Fuchsin oder das Aldehydfuchsin in Frage. Da die Fasern nur eingeschränkt anfärbbar sind, lässt Resorzin-Fuchsin sich besonders gut einsetzen.

Resorzin wirkt als Beize, die die Hüllschicht der Fasern aufraut. An diese vergrößerte Oberfläche kann sich nun der basische Farbstoff Fuchsin durch die

Grenzflächenadsorption an die Fasern anlagern.

Grenzflächenadsorption & elektropolare Farbstoffbindung mit einer einzeitigen Beizenfärbung.

Resorzin wirkt als Beize & Fuchsin färbt das Elastomuzin regressiv.

2.Kernfärbung mit Hämatoxylin nach Weigert

Es handelt sich um eine einzeitige progressive Beizenfärbung. Das in der Lösung vorhandene Eisen-(III)-chlorid wirkt hier als Beize. Die Anfärbung erfolgt durch Elektroadsorption d.h. durch positive Ladungen des Eisenhämatoxylins kommt es zur Anlagerung an die negativ geladenen Phosphatgruppen des Zellkernchromatins. Nach mikroskopischer Kontrolle kann eine Differenzierung mit HCL-Alkohol 1%ig erfolgen.

3.PS-Lösung (Pikrinsäure-Säurefuchsin)

Hierbei handelt es sich um eine physikochemische & physikalische Färbemethode, nach dem Prinzip der Dispersität.

Es werden zwei unterschiedlich disperse Farbstoffe simultan & progressiv zur Färbung angeboten. Die Pikrinsäure liegt in feindisperser Phase vor & färbt in der vorgegebenen Zeit das gesamte Gewebe. Das Säurefuchsin ist grobdispers & färbt in dieser Zeit nur die groben Bindegewebsstrukturen. Daher ist die kurze Färbezeit unbedingt einzuhalten, sonst kommt es zu einer Farbüberlagerung der mit Pikrinsäure angefärbten feinen &

dichten Gewebestrukturen (Zytoplasma & Muskulatur). Das Präparat wird rotstichig.

Haben die Farbstoffe die Gewebestrukturen erreicht, kommt es zu einer elektropolaren Farbstoffbindung (z.B. negativ geladene Farbstoffmoleküle binden an positiv geladene Gewebestrukturen).

(31)

1.Eisenhämatoxylin nach Weigert

Die gebrauchsfertige Farbstofflösung wird frisch aus 2 Stammlösungen (Weigert 1 &

Weigert 2) hergestellt. Diese Stammlösungen sind, in dunklen Flaschen gelagert, jahrelang haltbar.

Die beiden Lösungen werden zu gleichen Teilen 1:2 (1+1) gemischt.

Da wir für eine Küvette 80 ml benötigen also: 40 ml Lösung 1 + 40 ml Lösung 2

Diese Mischung ist ca. eine Woche haltbar!

Also wird die Küvette mit dem Ansatzdatum beschriftet!

Stammlösung Weigert 1: 1g Hämatoxylin in 100ml 96%igem Alkohol lösen.

Stammlösung Weigert 2: 1,16 g EisenIIIchlorid in 98 ml aqua dem lösen.

dazu 1 ml 25%ige HCL

2. P-S-Lösung (Pikrinsäure-Säurefuchsin)

Auch diese Lösung besteht aus 2 Stammlösungen

1. Säurefuchsin 1%ig: 1g Säurefuchsin in 100 ml aqua dem lösen

2. Pikrinsäure 1,2%ig: 1,2 g Pikrinsäure in 100 ml aqua dem lösen (gesättigt) Das Mischungsverhältnis kann variiren!

Ausgetestet für unser Schullabor mischen wir: ½ + 9 ½ Teile = 4 ml Lsg 1 + 76 ml Lsg 2 = 4 ml Säurefuchsin + 76 ml Pikrinsäure

Vor Gebrauch filtrieren!

Die fertige Farbstofflösung ist lange haltbar!

(32)

32

EVG-Färbung

4. Alkohol 70%

Färbung der elastischen Fasern 5. Resorzin-Fuchsin

6. Aqua dem.

Differenzieren der Fasern 7. Alkohol 80%

8. Alkohol 96%

Kernfärbung

9. Eisenhämatoxylin nach Weigert 10. H2O

11. H2O warm, bläuen

Färbung Bindegewebe & Muskulatur 12. PS-Lösung (Pikrinsäure-Säurefuchsin) Dehydrierung

13. Alkohol 80%

14. Alkohol 96%

15. Alkohol 96%

16. Alkohol 99%

5 Min.

2 Min.

20 Min.

2x Spülen, kurze mikroskopische Kontrolle

Kurz Kurz

10-15 Min.

Spülen, mikroskopische Kontrolle, bei Bedarf mit HCL-Alkohol differenzieren

5-10 Min.

30 Sek.

Kurz

Kurz, auswaschen überschüssiger Pikrinsäure 2 Min.

5 Min.

Zytoplasma &

Muskulatur:

Bindegewebe:

elastische Fasern:

braun gelb rot

schwarz-violett (aubergin)

(33)

33

5.Qualitative Nachweisverfahren 5.1Amyloidnachweis

Ziel & klinische Relevanz Nachweis von Amyloid.

Allgemeines zur Amyloidose:

Amyloid wird als homogene, eosinophil-anfärbbare Masse (β-Fibrillen) im Verlauf

pathologischer Prozesse im Gewebe extrazellulär abgelagert. Es handelt sich um Proteine, die durch ihre strukturelle Veränderung nicht mehr abgebaut werden können.

Die Amyloidablagerungen zerstören die Architektur der Organe & führen dadurch zu Funktionsstörungen. Bei Ablagerungen im peripheren Nervensystem kommt es zu Polyneuropathien. Bei Einlagerungen in den Gelenken kommt es zu arthritischen Beschwerden.

Namensgebend war das griechische Wort Amylon, das Stärkemehl bedeutet, da sich Amyloid wie Stärke mit Lugolscher Lösung braun anfärbt.

Es handelt sich um einen Protein-Polysaccharid-Komplex, der nur unter pathologischen Bedingungen entsteht, d.h. von unterschiedlichen Stoffwechseldefekten ausgelöst werden kann.

Je nach Art können einzelne Organe oder systemisch der ganze Körper betroffen sein.

Betroffen sind häufig ältere Patienten ab 65 Jahre, auch mit intensiver Behandlung verläuft die systemische Erkrankung nach ca. 1-2 Jahren tödlich.

Bei der sekundären Amyloidose kann es zur Ausheilung kommen, wenn die Ursache eine Infektion ist.

 Eine sekundäre Amyloidose kann auftreten nach:

chronischer Eiterbildung (TBC, Syphilis, rheumatoide Arthritis, Colitis ulcerosa, Osteomyelitis, Lepra, Hypernephron, Morbus Hodgkin)

hier tritt Amyloid Typ A bzw. als Vorstufe Serum-Amyloid A auf

 Eine primäre Amyloidose kann auftreten beim:

Plasmozytom, M. Waldenström (Makroglobulinämie) & anderen Gammopathien Heutzutage sind sieben verschiedene Amyloidproteine bekannt, die entsprechend behandelt werden. Typen: AA, AL, AE, AB, AP, AS & ATTR

Diagnose:

Die Symptome sind oft unspezifisch. Bei einer bestehenden Proteinurie, Kardiomyopathie, Neuropathie & Lebervergrößerung sollte auch immer an eine Amyloidose gedacht werden &

ggf. durch eine Gewebebiopsie abgeklärt werden. Biopsien können aus allen betroffenen Organen gewonnen werden.

Untersuchungsmaterial:

FFPE-Biopsien von verdächtigen Organen.

In vielen Fällen wird die Diagnose erst nach dem Tod durch den Pathologen gestellt.

Eine übergroße Zunge & derbe Unterhautschwellungen geben erste Hinweise. Die betroffenen Organabschnitte verhärten & werden speckig glänzend & dann als Speckleber, Speckmilz (Schinkenmilz) oder Speckniere bezeichnet

(34)

34 Einteilung früher

Früher wurden die Amyloidosen wie folgt eingeteilt:

Typ Häufigkeit Details

Primäre Amyloidose selten keine Assoziation zu anderen

Grunderkrankungen; Ursache unbekannt, meist Ablagerungen vom sog. A-Typ

Familiäre Amyloidose selten tritt gehäuft in Kombination mit vererbten Erkrankungen auf, z.B. familiäres

Mittelmeerfieber, meist Ablagerungen vom AA- Typ, v.a. Niere betroffen

Sekundäre Amyloidose am

häufigsten

ausschließlich bei anderen Grunderkrankungen auftretend, z.B. chronisch infektiöse &

nichtinfektiöse Entzündungen, Tumore des lymphatischen Systems, längere Dialyse;

Ablagerungen verschiedener Amyloid-Subtypen Altersamyloidose häufig im Alter ohne zugrundeliegende Erkrankung

auftretend; Ablagerungen v.a. von AS-Amyloid, hauptsächlich Herz & Gehirn betroffen

Farbstoffe

 Kongorot

 Hämalaun nach Mayer

Saurer Diazofarbstoff, Färbung durch Salzbildung & Anlagerung an Proteinfibrillen

Beim Arbeiten mit Kongorot Handschuhe tragen!

Entsorgung in spezieller Abfallflasche!

pH-empfindlicher basischer Farblack zur Kernfärbung, positiv geladen, färbt einzeitig indirekt durch Elektroadsorption

Amyloid-Nachweismöglichkeiten

 Histologische Färbung

die histologisch aufbereiteten Proben werden mit Kongorot z.B. nach Bennhold gefärbt

Amyloid bindet den Farbstoff Kongorot durch Salzbildungen, der sich dann an sie parallel angeordneten Amyloidfibrillen anlagert

im polarisierten Licht wird Amyloid grünlich leuchtend sichtbar

 Immunhistologisch

mit AK gegen Amyloid

 Elektronenmikroskopisch

Erkennen des Aufbaus aus Proteinfibrillen

 Histochemisch

→da es häufig mit Polysacchariden vergesellschaftet ist, kann auch die PAS-Färbung positiv reagieren

(35)

35

Amyloidnachweis nach Bennhold

4. Alkohol 70%

5. Aqua dem.

Färbung des Amyloids

6. Kongorotlösung 1%, wässrig 7. Alkohol 80%

8. Aqua dem.

Kernfärbung

9. Hämalaun nach Mayer 10. H20 warm, bläuen Dehydrierung 11. Alkohol 80%

12. Alkohol 96%

13. Alkohol 99%

5 Min.

2 Min.

15-20 Min.

Spülen, bis keine Farbwolken mehr abgehen

Spülen

10 Min.

5-10 Min.

Kurz Kurz 2 Min.

5 Min. Schnitte gewinnen an 5 Min. Transparenz

Färbeergebnis Amyloid:

Hyalin & Kolloid:

Kerne:

rot, an Schnitten bis 10µm kommt es zu einem grünlichen Schimmer ungefärbt

blau

(36)

36

5.2Fibrindarstellung

Nachweis von pathologischen Fibrinablagerungen.

Bei Fibrin handelt es sich um den aktivierten, vernetzten „Klebstoff“ der plasmatischen Blutgerinnung. Es handelt sich um ein Protein, das durch die Einwirkung des Enzyms Thrombin aus den fadenförmigen löslichen Vorstufen, dem Fibrinogen, gebildet wird. Das Fibrin polymerisiert anschließend & bildet ein Netz, das die Wunde verschließt.

Man findet Fibrin auch als Ablagerungen in Tumoren & spricht extravasalen Fibrineinlagerungen in Tumoren eine wachstumsfördernde Wirkung zu.

Außerhalb des Gefäßsystems tritt Fibrin als homogene, eosinophile Ablagerung auf die sich nach Verletzungen auf Wunden & bei Entzündungen als entzündliches Fibrinoid in der Muskulatur (Herzinfarkt) bilden kann.

Außerdem spielt es bei Schockzuständen in den Lungen eine Rolle, da es sich durch Änderungen des Strömungswiderstandes in der Peripherie, in den Lungenbläschen an die Alveolarwand anlagert & durch eine Verdickung der Alveolarwand den Gasaustausch erschwert. Es entsteht das Bild der Schocklunge.

In der PAS-Färbung reagiert es positiv, in der AZAN-Färbung wird es rot, in der Ladewig- Färbung leuchtend rot. Keine dieser Färbungen ist jedoch spezifisch. Fibrinoid wird beim Gewebezerfall frei, liegt extrazellulär & verhält sich färberisch wie Fibrin.

(37)

37

1.Nachweis nach Ladewig

Farbstoffe

 Anilinblau

 Orange G

pH-stabiler, basischer Farblack zur Kernfärbung, positiv geladen; Färbung einzeitig indirekt durch Elektroadsorption Zytoplasmafärbung, Fibrinfasern & Bindegewebe; sauer, negativ geladener Farbstoff, Bestandteil der Ladewig- Lösung, grobdispers, direkte Simultanfärbung, Elektroadsorption

Bindegewebe, sauer, negativ geladener Farbstoff, indirekte Simultanfärbung, Elektroadsorption

Zytoplasmafärbung, Bestandteil der Ladewig-Lösung, sauer, negativ geladener Farbstoff, feindispers, Färbung direkt, Simultanfärbung, Elektroadsorption

Färbeablauf

Die Ladewig-Färbung ist eine Spezialfärbung für Fibrin. Fibrin wird durch einen sauren Farbstoff rot dargestellt (Säurefuchsin), wobei das übrige Bindegewebe blau angefärbt wird (Anilinblau). Der genaue Anfärbemechanismus ist nicht bekannt.

Es konkurrieren zwei grobdisperse Farbstoffe in einer Lösung miteinander; Säurefuchsin färbt Bindegewebe & Fibrin an, Anilinblau überfärbt nur das Bindegewebe  Fibrin bleibt rot.

Notwendig ist eine vorherige Beizung des Bindegewebes. Es handelt sich also um eine zweizeitige Beizenfärbung.

Bindegewebe, Fibrin & Zytoplasma werden mit einer Lösung angefärbt, in der sich drei Farbstoffe befinden; Anilinblau, Säurefuchsin & Orange G.

Es handelt sich also um eine Simultanfärbung, bei der vor der eigentlichen Färbung die Anlagerung der Metallionen (Phosphorwolframsäure) an das Bindegewebe erfolgt.

Man nimmt an, dass die Wolfram-Ionen nur mit den Bindegewebsfasern & nicht mit Fibrin reagieren & es daher nicht zu einer Anlagerung von Anilinblau auf den Fibrinfasern kommen kann.

Ansatz der Lösungen 1.Eisenhämatoxylin

Weigert I & Weigert II zu gleichen Teilen mischen

2.Phosphorwolframsäure

5g Wolframtophosphorsäure in 100ml Aqua dem. lösen

3.Ladewiglösung 0,5g

2g 1g 100ml 8ml

Anilinblau wasserlöslich Orange G

Säurefuchsin in

Aqua dem. lösen, kurz aufkochen, abkühlen lassen, filtrieren &

Eisessig dazugeben

(38)

38

Fibrinfärbung nach Ladewig

4. Alkohol 70%

Kernfärbung

5. Eisenhämatoxylin nach Weigert 6. Aqua dem.

Beizen

7. Phosphorwolframsäure 5%ig 8. Aqua dem.

Fibrin-& Bindegewebsfärbung 9. Ladewig-Lösung

10. Aqua dem.

Differenzierung 11. Alkohol 96%

Stoppen der Differenzierung 12. Isopropanol

5 Min.

3 Min.

10 Min.

Kurz spülen

5 Min.

Spülen, gründlich

5-10 Min.

Spülen, mikroskopische Kontrolle

Kurz bis 1 Min., mikroskopische Kontrolle

Kurz

2 Min.

5 Min.

Fibrin:

Zytoplasma:

Bindegewebe:

Muskulatur:

schwarz-braun rot

orange-rot blau grau