Etablierung und Bewertung von Knochenstoffwechselparametern im Labor eines Krankenhauses mit Maximalversorgung

(1)

(Prof. Dr. E. Gurr) Klinikum

Links der Weser Bremen

Etablierung und Bewertung von

Knochenstoffwechselparametern im Labor eines Krankenhauses mit Maximalversorgung

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Franziska Katharina Lindemann aus Berlin

Hannover 2005

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover

am 20.03.2007

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Eberhard Gurr

Referent: Prof. Dr. med. Gerhard Schumann

Korreferenten: Prof. Dr. Henning Zeidler

Tag der mündlichen Prüfung: 20.03.2007

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Johannes Wilhelm Bigalke PD Dr. Gerhard Schumann

Prof. Dr. Michael Gebel

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Meinen Eltern und

Frau Dr. med. H. Lindemann

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1 Einleitung...1

1.1 Physiologie des Knochenstoffwechsels ...1

1.2 Physiologie des Knochenumbaus...2

1.2.1 Extrazelluläre Matrix ...2

1.2.2 Knochenzellen...3

1.2.3 Regulation des Knochenumbaus ...5

1.3 Klinisch-chemische Parameter des Knochenstoffwechsels...6

1.3.1 Saure Knochenphosphatase ...8

1.3.2 Alkalische Knochenphosphatase ...9

1.3.3 Kollagen-I-Telopeptide...10

1.3.4 Osteocalcin...11

1.3.5 Vitamin K und Marcumar ...12

1.4 Fragestellung...13

2 Material und Methoden ...15

2.1 Probanden und Patienten ...15

2.1.1 Probanden...15

2.1.2 Patienten unter Cumarintherapie ...16

2.1.3 Knochenszintigraphiepatienten...19

2.1.4 Votum der Ethikkommission und Patientenzustimmung...19

2.2 Untersuchungsmaterial...19

2.3 Verwendete Materialien ...19

2.4 Statistische Verfahren...25

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3.1 Impräzisionen ...26

3.2 Unrichtigkeit...32

3.3 Plausibilität der Referenzbereiche ...34

3.3.5 Vergleich der anabolen und katabolen Aktivität bei Normalprobanden ...39

3.4 Circadiane Rhythmen ...41

3.5 Intraindividueller Variationskoeffizient...42

3.6 Einfluss von Cumarinderivaten auf Knochenstoffwechselparameter...43

3.6.1 Vergleich der Parameter...46

3.7 Knochenszintigraphiepatienten...47

4 Diskussion ...49

4.1 Analytik...49

4.2 Referenzbereiche und circadiane Rhythmik...50

4.2.1 Plausibilität der Referenzbereiche ...50

4.2.2 Circadiane Rhythmik ...51

4.3 Cumarinderivate ...51

4.4 Knochenmetastasen...53

4.5 Schlußbetrachtung ...54

5 Zusammenfassung ...56

6 Literaturverzeichnis ...57

7 Lebenslauf...67

8 Erklärung ...68

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9.1 Abbildungsverzeichnis ...69

9.2 Tabellenverzeichnis...72

9.3 Ergebnistabellen / Rohdaten...73

9.3.1 Impräzisonen...73

9.3.2 Unrichtigkeit...75

9.3.3 Plausibilität der Referenzbereiche ...76

9.3.4 Circadiane Rhythmen ...77

9.3.5 Intraindividueller Varianzkoeffizient ...78

9.3.6 Marcumarisierung von Herzklappenpatienten...79

9.3.7 Knochenszintigraphiepatienten...81

9.3.8 Korrespondenz mit der Ethikkommission...82

10 Danksagung ...87

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AP Alkalische Phosphatase

Abb Abbildung

CA Karzinom

CFU-GM Colony Forming Units – Granulocyte / Macrophage CFU-F Colony Forming Units – Fibroblast

Glu Glutamat

INR International normalized ratio KHK Koronare Herzkrankheit

m männlich

OP Operation

PTH Parathormon

RANK Receptor-activator of NFκB RANKL Receptor-activator of NFκB-ligand RES Retikuloendotheliales System ROC Receiver Operating Characteristics

Tab Tabelle

THG Thorax-Herz-Gafäß-Chirurgie

TNF Tumornekrosefaktor

TRAP Tartrat-resistente alkalische Phosphatase

QC Qualitätskontrolle

w weiblich

WHI Womens Health Initiative WHO Weltgesundheitsorganisation

Z.n. Zustand nach

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1 Einleitung

1.1 Physiologie des Knochenstoffwechsels

Die metabolischen Knochenerkrankungen stellen klinisch und volkswirtschaftlich ein relevantes Problem dar. Osteoporose, primärer und sekundärer skelettaler Hyperparathyreoidismus, skelettaler Hypoparathyreoidismus, Ostitis deformans Paget sowie Knochenmetastasen zählen zu dieser Gruppe. Hervorzuheben ist die Osteoporose, deren Bedeutung aufgrund des immer höheren Durchschnittsalters der Gesamtbevölkerung zunimmt.

In Mitteleuropa ist im Laufe ihres Lebens jede dritte Frau und jeder fünfte Mann von der Osteoporose betroffen (51, 13). Neben Frauen in der Postmenopause betrifft die Erkrankung Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz, mit Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, mit altersbezogenem Hypogonadismus sowie Carcinom- Patienten.

Nach Definition der WHO von 1993 „ist die Osteoporose eine systemische Skeletterkrankung, charakterisiert durch Verminderung der Knochenmasse und Verschlechterung der Mikroarchitektur des Knochengewebes, mit hierdurch reduzierter Festigkeit und erhöhter Frakturgefahr“. Ein Substanzverlust von 40% stellt die Manifestationsgrenze dar, bei der mehr als 50 Prozent der Betroffenen schon bei geringer Beanspruchung eine Fraktur erleiden (70). Besonders betroffene Skelettanteile sind die Wirbelsäule und der Schenkelhals. Frakturen in diesen Bereichen schränken nicht selten das selbständige Leben und Versorgen der Patienten in entscheidendem Maße ein. Als Therapiemöglichkeiten stehen derzeit unter anderem eine medikamentöse Gabe von Vitamin D, Calcium, Bisphosphonaten oder Parathormon sowie eine Hormonersatztherapie zur Verfügung. Die Hormonersatztherapie ist insbesondere seit der 2002 in den USA durchgeführten und vorzeitig abgebrochenen Studie „Womens Health Initiative“ (WHI) umstritten. Weiterhin gibt es nicht- medikamentöse Maßnahmen, die den Verlauf der Erkrankung positiv beeinflussen. Hier sind insbesondere körperliche Aktivität und eine ausgewogene, vollwertige Ernährung zu nennen. Der Diagnostik kommt daher im Hinblick auf Prävention und Früherkennung metabolischer Knochenerkrankungen eine große Bedeutung zu (11).

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Bisherige diagnostische Möglichkeiten umfassen zum einen die Knochendichte- messung, deren Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit sehr vom jeweiligen Untersucher abhängen. Des Weiteren zeigt die Knochendichtemessung nur den augenblicklichen Status des Knochens und lässt keine Abschätzung der Dynamik des Prozesses zu.

1.2 Physiologie des Knochenumbaus

Das Skelettsystem erfüllt verschiedene Funktionen. Innere Organe und Weichteile finden innerhalb von Schädel, Thorax und Becken Schutz und funktionsgerechte Anordnung. Der Knochen beherbergt das hämatopoetische System und dient als Mineraldepot, insbesondere für Calcium und Phosphat. Um den wechselnden Anforderungen gerecht zu werden und seine Struktur zu erhalten, unterliegt der menschliche Knochen einem ständigen Aufbau (Knochenformation) und Abbau (Knochenresorption).

Ein Umbauzyklus am gesunden Knochen wird durch eine Resorptionsphase eingeleitet, gefolgt von einer Formationsphase. Abgeschlossen wird jeder Zyklus durch die Mineralisation der organischen Matrix des neu gebildeten Knochens.

Dieses System wird sowohl durch systemisch wirkende Hormone wie Parathormon, Calcitriol (1,25 Dihydroxy-Vitamin-D), Calcitonin, Wachstums- und Schilddrüsenhormone als auch durch lokal produzierte Mediatoren und Wachstumsfaktoren reguliert und im Gleichgewicht gehalten. Die zellulären Einheiten des Knochenmetabolismus sind eng umschriebene Areale auf der Knochenoberfläche, die sog. „bone metabolism units“ bzw.

„bone remodelling units“ (1).

1.2.1 Extrazelluläre Matrix

Die extrazelluläre Matrix (Knochengrundsubstanz) besteht zu etwa 50% aus anorganischen Bausteinen, zu 25% aus organischen Verbindungen (Osteoid) und zu etwa 25% aus Hydratationswasser.

Im anorganischen Teil findet man hauptsächlich Phosphat und Calcium, in Form von Apatitkristallen. Es überwiegt Hydroxylapatit, das den Kollagenfibrillen anliegt.

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Das Osteoid besteht zu über 90% aus Typ-l-Kollagen. Daneben findet man verschiedene Proteine, z.B. Osteonectin, Osteocalcin, Osteopontin sowie kleinere Proteoglykane bzw. Glykosaminoglykane.

Das Hydratationswasser liegt in Form eines Hydratmantels den Hydroxylapatitkristallen an. Es dient dem Ionenaustausch zwischen den Kristallen und der Umgebung und ist für die Einlagerung und Mobilisierung von Calcium relevant (94).

1.2.2 Knochenzellen

Drei unterschiedliche Zelltypen spielen für den Knochenstoffwechsel eine Rolle (23):

• Osteoklasten,

• Osteoblasten und

• Osteozyten.

Osteoklasten dienen der Knochenresorption. Es handelt sich um polymorphe, vielkernige Riesenzellen. Sie entstehen durch die Verschmelzung von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die der mononukleären Phagozytenreihe (Makrophagen, Granulozyten) angehören (27, 28, 52). Der Osteoklast bindet über das spezifische Integrin αvβ3 an die Knochenoberfläche. An der dem Knochen zugewandten Seite der Zelle entsteht die sog. „ruffled membrane“. Die Oberfläche ist hier unregelmäßig aufgefältelt und in dauernder Bewegung. So werden die Zelloberfläche und die aktiv resorbierenden Abschnitte vergrößert.

In den Zwischenraum der entstehenden Resorptionseinheit setzt der Osteoklast degradierende Substanzen wie Protonen, Proteasen (vor allem Cathepsin K) oder die Saure Phosphatase frei. Durch den Degradationsprozess entsteht eine Vertiefung in der Knochenoberfläche, die sogenannte Howship-Lakune.

Mittels Endozytose werden aus der Howship-Lakune Substanzen, wie Matrixfragmente und die degradierenden Enzyme selbst von den Osteoklasten aufgenommen und weiter degradiert. An der basolateralen Membran gelangen die Metabolite sowie Mineralien wie

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Calcium, Phosphat und Magnesium und aktive Enzyme in die Zirkulation. Ein Teil der Degradationsprodukte verbleibt im Knochen und wird der osteoblastären Rekalzifikation zugeführt (74).

Osteoblasten dienen der Knochenformation. Es handelt sich um Zellen mesenchymalen Ursprungs. Sie siedeln sich in Form eines einschichtigen Epithels nebeneinander in der von Osteoklasten geschaffenen Howship-Lakune an.

Osteoblasten produzieren knochenspezifische Alkalische Phosphatase, Matrixproteine wie Typ-l-Kollagen, Osteocalcin, Osteopontin, Osteonectin, „bone sialoprotein“ und Proteoglykane (25, 26).

Nach der Synthese des Osteoids setzt die primäre Mineralisation ein. Hierbei wird Calciumphosphat in Form von Hydroxylapatit eingelagert. Es schließt sich die sekundäre Mineralisation im Rahmen einer mehrwöchigen Ruhephase an (1).

Knochenmark ^CFU-GM ^CFU-F

Knochen

Osteoklasten Osteoblasten

Resorption Osteoblasten-

Invasion

Osteoidsynthese Mineralisation

Multizelluläre Basiseinheit (ca. 0.05 mm³) Resorption: 7-10 Tage Formation: 2-3 Monate

Abb. 1-1 Remodeling des Knochen (modifiziert nach Manolagas SC, Jilka RL (1995) NEJM 332: 305-311)

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Osteozyten gehen aus Osteoblasten hervor. Ein Osteoblast differenziert zum Osteozyt, wenn er vollständig von Knochengrundsubstanz umgeben ist. Osteozyten dienen dem Erhalt des Knochens, gehen sie zugrunde, wird die umgebende Matrix abgebaut.

Charakteristisch sind fadenförmige Fortsätze, die der Kommunikation mit benachbarten Osteozyten und Osteoblasten dienen. Bei veränderter Beanspruchung des Knochens können sie so die Knochenresorption und Knochenformation beeinflussen.

1.2.3 Regulation des Knochenumbaus

Die aktive Zelle des Knochenabbaus ist der Osteoklast. Die zentrale Zelle in der Regelung der Osteoblastenaktivität ist der Osteoblast bzw. die Stromazelle. Die Steuerung der Osteoblastenaktivität erfolgt endokrin über entsprechende Hormone wie Parathormon, D-Hormon und Calcitonin sowie über die dazugehörigen Rezeptoren des Osteoblasten. Als Resultat der Aktivierung werden Mediatoren gebildet, die parakrin auf monozytäre Vorläuferzellen oder Makrophagen wirken und zur Bildung von Osteoklasten führen.

Eine Proliferation der Makrophagen wird bewirkt durch M-CSF („macrophage colony stimulating factor“). Die Produktion von M-CSF wird durch Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor (TNF) angeregt und durch Estradiol gehemmt. Eine weitere Differenzierung zu Osteoklasten bewirkt das RANK-RANKL-System („receptor-activator of NFκB-ligand“). Zur Regulierung ist Osteoprotegerin als Antagonist am Rezeptor bekannt. Osteoprotegerin ruft nach Rezeptorbindung keine Signaltransduktion hervor und hemmt somit die Osteoklastenreifung (24,71). Durch die Degradation der Matrix werden Enzyme wie die knochenspezifische Saure und Alkalische Phosphatase sowie Fragmente der Matrix in die Zirkulation freigesetzt und können im Serum nachgewiesen werden (Abb. 1-2).

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endokrin

parakrin

zellulär

Matrix

M-CSF Osteoprotegerin, RANKL

Knochen-AP, TRAP αα

ααv β β β β3

PTH, PTHrP, D-Hormon, Calcitonin

Hypro, CTX, NTX ....

Osteoblast

RANK Makrophage

Osteoklast

Abb. 1-2 Regulation der Knochenresorption. Auf der rechten Seite sind den verschiedenen Regulationsebenen beispielhaft Analyte zugeordnet. PTH= Parathormon; PTHrP= parathormon related peptide; RANK, RANKL= receptor-activator of NFκB respektive dessen Ligand; CTX, NTX= C- respektive N-terminales Kollagen-I-Peptid (mod. nach S. Teitelbaum Science (2000) 289: 1504-1508)

1.3 Klinisch-chemische Parameter des Knochenstoffwechsels

Über den Nachweis von Enzymen, Hormonen oder Abbauprodukten des Knochenstoffwechsels im peripheren Blut und/oder im Urin wird versucht, Auskunft über die Dynamik von Knochenumbauprozessen zu erhalten. Da einer Störung des Gleichgewichtes im Knochenumbau eine Veränderung des Auf- oder Abbaus zugrunde liegen kann, sind für endokrine, parakrine, anabole und katabole Parameter Bestimmungsmethoden entwickelt worden (Tab. 1-1)

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Klinisch-chemische Parameter des Knochenstoffwechsels endokrin

⇒ Parathormon

⇒ cAMP

⇒ D-Hormon

⇒ Calcitonin

parakrin

⇒ Osteoprotegerin

⇒ RANKL (receptor-activator of NFκB ligand)

anabol

⇒ Alkalische Phosphatase

⇒ Knochenspezifische alkalische Phosphatase (Ostase®)

⇒ Osteocalcin

⇒ Procollagen-I-Telopeptide (PICP, PINP)

katabol

⇒ Tartratresistente saure Phosphatase (TRAP®)

⇒ Hydroxyprolin(e)

⇒ Hydroxylysin(e)

⇒ Pyridinium Crosslinks

o Pyridinoline (frei / gesamt)

o Desoxypyridinoline (frei / gesamt)

⇒ N-Telopeptide

o N-terminales Kollagen-I-Telopeptid (NTx )

⇒ C-Telopeptide

o C-terminales Kollagen-I-Telopeptid (β-Crosslaps®) o C-terminales Kollagen-I-Oktapeptid (CTx)

⇒ Ca²⁺, PO⁴3- (Serum, Urin)

Tab. 1-1 Klinisch-chemische Parameter des Knochenstoffwechsels

In dieser Arbeit sollen Parameter in einem Routinelabor etabliert und untersucht werden, die die Aktivität der Knochenzellen beschreiben und den Umbau der extrazellulären Matrix erfassen. Von den vier ausgewählten Analyten beschreiben jeweils zwei die anabole und zwei die katabole Aktivität des Knochenumbaus.

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• Saure Knochenphosphatase (Enzym des katabolen Knochenumbaus)

• Alkalische Knochenphosphatase (Enzym des anabolen Knochenumbaus)

• Osteocalcin (Matrixbestandteil des Osteoids)

• C-terminales Typ-I-Kollagen-Telopeptid (Abbauprodukt des Osteoids)

Dabei sollen die Knochenphosphatasen auf die Aktivität der am Umbau beteiligten Osteoblasten und Osteoklasten schließen lassen, während Osteocalcin und Cterminales Typ-I-Kollagen-Telopeptid für den Osteoidumsatz stehen (Abb. 1-2).

1.3.1 Saure Knochenphosphatase

Die Saure Knochenphosphatase gehört zur Gruppe der Sauren Phosphatasen, die ubiquitär im Körper vorkommen. Die unterschiedlichen Isoenzyme der Sauren Phosphatasen sind im Blut nachweisbar und stammen überwiegend aus Knochen, Prostata, den Blutzellen sowie der Milz. Fünf unterschiedliche Isoformen sind derzeit bekannt. Eine Einteilung kann nach der Hemmbarkeit durch Tartrationen erfolgen. Die Enzymaktivität des Prostata-Isoenzyms ist durch Tartrat hemmbar, das knochenspezifische Isoenzym ist nicht hemmbar. Das knochenspezifische Isoenzym wird auch als Tartrat resistente Saure Phosphatase (TRAP) bezeichnet. Es ist in der Osteoklastenmembran verankert und wird zur Knochenresorption freigesetzt. Identität und Wirksamkeit wurden von Oddie et al. nachgewiesen, die Osteoklasten in kortikalen Knochen kultivierten (33-35, 53). Durch Zugabe von AntiTRAP-Antikörpern wurde die in vitro Resorption des Knochens reduziert. Von den verschiedenen Isoformen der TRAP sind die Isoenzyme 5a und 5b im Rahmen der Knochenstoffwechseldiagnostik von besonderem Interesse. Der strukturelle Unterschied zwischen ihnen besteht in zusätzlichen Sialinsäureresten der Isoform 5a. Halleen et al. (2, 3) konnten nachweisen, dass Osteoklasten nur die Isoform 5b synthetisieren und freisetzen. Die einzigen Zellen, die bisher als TRAP 5a enthaltend identifiziert wurden, sind die von Makrophagen abgeleiteten Gaucherzellen der Milz bei M. Gaucher (75). Im Immunoassay reagieren TRAP 5a und 5b mit den gleichen Antikörpern. TRAP 5b kann neben TRAP 5a spezifisch bestimmt werden, wenn bei pH 6,1 dem Wirkoptimum der Isoform 5b gemessen wird (36-38, 40).

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Saure Knochenphosphatase wird von Osteoklasten in die Howship-Lakune sezerniert und trägt zur Degradation der Knochenmatrix bei. Nachgewiesen ist die Dephosphorylierung von Osteopontin (54).

1.3.2 Alkalische Knochenphosphatase

Vier verschiedene Gene, geclustert auf Chromosom 2q37.1, kodieren die Isoenzyme der Alkalischen Phosphatase (AP): gewebeunspezifische, intestinale, plazentare und Keimzellisoform (in Testes, Thymus und Lunge). Der quantitativ größte Anteil entfällt auf die gewebeunspezifische Alkalische Phosphatase, die überwiegend der Leber und dem Knochen entstammt. Aufgrund ihrer genetischen Herkunft haben beide die gleiche Proteinstruktur und unterscheiden sich nur in der durch posttranslationale Modifikation unterschiedlichen Glykosylierung (1, 43, 45, 46, 55-57). Beim gesunden, nicht schwangeren Erwachsenen mit normaler Leberfunktion liegt folgendes Isoenzymmuster im Serum vor:

⇒ Leber-AP : 45%

⇒ Knochen-AP : 45%

⇒ Dünndarm-AP : 10%

Die Alkalische Phosphatase ist ein Glykoprotein, das durch einen carboxy-terminalen Glykan-Phosphatidyl-Inositolanker der Zellmembran anhaftet. Die Knochen-AP ist ein direktes Zellprodukt der Osteoblasten. Sie wird als Dimer von der Zellmembran abgespalten, gelangt in die Zirkulation und hat dort eine Halbwertzeit von 1-2 Tagen.

Eliminiert wird die Knochen-AP über das retikuloendotheliale System (RES).

Die Schwierigkeit der Bestimmung liegt in der strukturellen Übereinstimmung der beiden dominierenden Isoenzyme. Zur Differenzierung wurden verschiedene Trennverfahren entwickelt. Hitzeinaktivierung, Weizenkeimlezithin-Präzipitation und elektrophoretische Trennung wurden in der Vergangenheit angewandt. Die Verfahren erforderten allerdings entweder einen hohen zeitlichen und/oder personellen Aufwand oder erwiesen sich als nicht ausreichend spezifisch für das Knochen-AP Isoenzym (41-44). Aufgrund der

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strukturellen Ähnlichkeit der Isoenzyme gelang es nicht, einen ausreichend spezifischen polyklonalen Antikörper zu entwickeln. (58-60).

Eine der ersten Beschreibungen von Immunoassays, bei denen monoklonale Antikörper verwendet wurden, stammt 1992 von Masuhara et al. Der verwendete Antikörper erkannte gewebeständige Knochen-AP, nicht jedoch Knochen-AP im Serum (44, 59).

Das erste kommerzialisierte Immunoassay (TandemR®Ostase), das im Serum zirkulierende Alkalische Phosphatase aus dem Knochen erkannte, wurde 1994 eingeführt. Man arbeitete mit zwei spezifischen monoklonalen Antikörpern.

Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass die Ergebnisse massebasierter Assays mit Aktivitätsbestimmungen korrelieren. In der Folge wurde ein Bestimmungsverfahren entwickelt, bei dem die Alkalische Knochenphosphatase über die Bindung an einen monoklonalen Antikörper isoliert und anschließend mit Hilfe einer Enzymaktivitätsbestimmung quantifiziert wurde.

1.3.3 Kollagen-I-Telopeptide

Typ-I-Kollagen-Telopeptide sind Abbauprodukte des Typ-l-Kollagens, die im Rahmen der physiologischen Knochenresorption entstehen (β-Crosslaps). Typ-l-Kollagen ist nicht knochen-spezifisch. Es kommt auch im Knorpel, in Bändern, in Sehnen, in der Haut und anderen Bindegeweben vor. Die Typ-l-Kollagenfibrille hat die Struktur einer Tripelhelix.

Sowohl am N-terminalen als auch am C-terminalen Ende liegen die drei Aminosäureketten in nicht-helikaler Struktur vor. Diese Enden werden als Telopeptide bezeichnet. Die Telopeptide sind bevorzugter Ort für Quervernetzungen zu den Aminosäuren der helikalen Region der nächsten Kollagenfibrille (47, 48).

Die carboxyterminalen Telopeptide werden von je einer α2-Kette und zwei α1-Ketten gebildet. Die α1-Ketten enthalten die Oktapeptidsequenz EKAHDGGR, wobei die Vernetzung über das Lysin (K) als Bindungspunkt erfolgt. Im Laufe der Reifung des Kollagens kommt es zu einer β-Isomerisierung der Asparaginsäure bei Asp-Gly (D-G).

Diese sogenannten isomerisierten Telopeptide sind spezifisch für den Abbau des im Knochen vorkommenden Typ I Kollagens.

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N

2. Serin(Cystin)-Proteasen 1. Collagenase

N C

α1 α1 α1 α1

α1 α1 α1 α1 α2 α2 α2

α2 α1α1α1α1

α1 α1α1 α1 α2 α2 α2 α2

Abb. 1-3 Kollagen-I-Spaltprodukte - Dargestellt sind Kollagenfibrillen mit Bezeichnung der α1-und α2Ketten. N und C bezeichnet das N- bzw C-terminale Ende der Fibrille. Weiterhin sind die Crosslinks zwischen den einzelnen Kollagenfibrillen dargestellt sowie die Angriffspunkte zweier Enzyme.

1.3.4 Osteocalcin

Osteocalcin (“boneGLA protein“) wurde 1976 von P. A. Price et al. erstmalig beschrieben (62). Es handelt sich um ein nicht-kollagenes Protein bestehend aus 49 Aminosäuren. Das Gen ist lokalisiert auf Chromosom 1. Die Expression des Osteocalcin-Gens wird unter anderem durch Vitamin D3, Östrogene und Glukokortikoide beeinflusst (30).

Osteocalcin ist ein calciumbindendes Protein, das ausschließlich von Odontoblasten und Osteoblasten während der Mineralisationsphase produziert wird (31). Nach der Freisetzung aus den Osteoblasten wird ca. 80% des Osteocalcins in die Knochenmatrix eingebaut, ca. 20% werden in die Blutzirkulation sezerniert. Der Serum- Osteocalcinspiegel steht somit mit der Knochenumsatzrate in Zusammenhang. Sowohl intaktes Osteocalcin (Aminosäuren 1-49) als auch Fragmente zirkulieren im Blut. Das intakte Osteocalcinmolekül wird zwischen Aminosäure 43 und 44 proteolytisch gespalten. Das entstehende große N-MID Fragment (Aminosäuren 1-43) ist im peripheren Blut stabiler.

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Posttranslational wird Osteocalcin Vitamin- K-abhängig an den Positionen 17, 21 und 24 γ-carboxyliert (Glu->Gla). Die γ-Carboxylierung ist notwendig für die Calciumbindungsfähigkeit des Moleküls (63). Serum-Osteocalcin folgt einer circadianen Rhythmik, die auf die physiologische Varianz des Kortisolspiegels zurückgeführt wird (73). Osteocalcin wird renal eliminiert.

Als orale Antikoagulantien/ Vitamin-K-Antagonisten stehen zwei Cumarinderivate zur Verfügung: Phenoprocoumon (Marcumar®) und Warfarin (Coumadin®). Bereits 1987 beschrieben Menon et al. (29) einen im Vergleich zum Normalkollektiv signifikanten Anstieg des nicht-carboxylierten Anteils des Osteocalcins bei Patienten, die als Vitamin- K-Antagonisten Warfarin erhielten.

In verschiedenen Studien wurden bei Patienten unter Therapie mit Vitamin-K- Antagonisten niedrigere Gesamt-Osteocalcinwerte als beim Normalkollektiv gefunden (14,15,16).

1.3.5 Vitamin K und Marcumar

Im Rahmen der posttranslationalen Modifikation von Proteinen wird durch γ-Carboxylierung aus Glutaminsäure (Glu) γ-carboxylierte Glutaminsäure (Gla) gebildet.

Gla-enthaltende Proteine sind durch ihre Fähigkeit, Calciumionen zu binden, unerlässlich für die plasmatische Gerinnung. Außer Osteonectin und Osteopontin wird dem knochenspezifischen Osteocalcin aufgrund seines Gla-Gehaltes eine Rolle in der Wechselwirkung zwischen Osteoid und mineralischer Knochenmatrix zugesprochen.

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Abb. 1-4 Die Rolle des Vitamin K bei der γ-Carboxylierung der Glutaminsäure.

Die Carboxylierung erfolgt enzymatisch durch eine γ-Carboxylase, die Vitamin K als Coenzym für die Reduktion am C4 der Glutaminsäure im ersten Schritt der Reaktion benötigt (95). Vitamin K wird dabei vom Hydrochinon zum Epoxid oxidiert (Abb. 1-4). In zwei Schritten wird die Epoxidform wieder zum Hydrochinon reduziert, wobei ein Chinon als Zwischenprodukt entsteht. Beide Reduktionsschritte des Vitamin K werden durch Cumarinderivate blockiert. Die Cumarinwirkung ist dosisabhängig. Eine vollständige Inhibierung des Vitamin K ist allerdings nicht möglich, da jedes Molekül mindestens eine Carboxylierungsreaktion katalysieren muss, bevor es auf der Stufe des Epoxids inhibiert werden kann.

1.4 Fragestellung

Aufgabe der vorliegenden Arbeit soll der Aufbau und die analytische Bewertung von kommerziell erhältlichen Reagenzien für die Bestimmung von Knochenstoffwechselparametern sein. Da sowohl anabole als auch katabole Prozesse beschrieben werden sollen, wurden die Alkalische Knochenphosphatase und die Saure

Cumarine Cumarine

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Knochenphosphatase als Parameter für die zelluläre Aktivität gewählt. Der Matrixumsatz soll mit Osteocalcin und Kollagen-I-Telopeptiden beschrieben werden.

Im Einzelnen handelt es sich um folgende, kommerziell erhältliche Tests:

• Alkalische Knochenphosphatase (Ostase®, BeckmanCoulter)

• Saure Knochenphosphatase (TRAP®, medac)

• Osteocalcin (Roche Diagnostics)

• β-Crosslaps (CTx, Roche Diagnostics)

Die analytische Auswertung soll in Form einer Kurzevaluation erfolgen, da es sich um schon publizierte Bestimmungsmethoden handelt. Es sollen Impräzision in der Serie und zwischen den Serien, circadiane Rhythmik, intraindividuelle Varianz und die Abschätzung der Plausibilität der Referenzbereiche enthalten sein.

In einer klinischen Fragestellung soll der Einfluss einer Marcumartherapie auf den Knochenstoffwechsel untersucht werden. Betrachtet werden hierzu sowohl Patienten in der Einstellungsphase als auch Patienten, die bereits langzeitmarcumarisiert sind. Eine weitere klinische Fragestellung soll nachvollziehen, ob bei Patienten mit szintigraphisch nachgewiesenen Knochenmetastasen, Veränderungen der Knochenstoffwechsel- parameter nachzuweisen sind.

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2 Material und Methoden

2.1 Probanden und Patienten

2.1.1 Probanden

Die Gruppe der gesunden Probanden besteht aus 39 Männern unter 40 Jahren. Davon sind 19 Normalprobanden (Gruppe 1N) im Alter von 22 bis 39 Jahren (durchschnittlich 30 Jahre) und durchschnittlicher körperlicher Aktivität sowie 20 professionelle Fußballspieler (Gruppe 1S) im Alter von 19 bis 34 Jahren (durchschnittlich 25 Jahre).

Allen Probanden wurde am Abnahmetag 1 morgens nüchtern Blut abgenommen. Vier der Probanden der Gruppe 1N wurde zusätzlich an je fünf Abnahmetagen morgens sowie an vier dieser Tage auch nachmittags Blut abgenommen; die Abnahmen erfolgten in wöchentlichem Abstand. Die Probanden wurden darauf hingewiesen, am Tag vor der Abnahme keinen Alkohol zu konsumieren und sich nicht überdurchschnittlich körperlich zu betätigen. Den Sportlern wurde einmalig morgens nüchtern innerhalb der Saison zwischen zwei Spieltagen Blut abgenommen.

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2.1.2 Patienten unter Cumarintherapie

Untersucht wurden 64 Patienten, die eine Therapie mit Cumarinderivaten erhielten.

Kollektiv 2M schließt 30 Patienten mit einer Cumarindauertherapie ein. Die Patienten waren zwischen 29 und 83 Jahren, durchschnittlich 72 Jahre alt. Das Kollektiv besteht aus 21 Männern und 9 Frauen. Patienten des Kollektivs 2M haben seit mindestens zwei Monaten, längstens seit 15 Jahren Cumarine eingenommen. Die durchschnittliche Dauer der Marcumartherapie betrug drei Jahre. Die Patienten wurden in den internistischen Praxen Dr. Dirk Havliza und Dres. Kallmeyer und Kollegen zur Überwachung ihres antikoagulativen Status betreut. Es wurden alle Patienten konsekutiv in die Studie eingeschlossen, die im Studienzeitraum zur Überwachung der Marcumartherapie die internistischen Praxen aufsuchten. Die Daten zu den Patienten des Kollektivs 2M sind in Tab. 2-1 dargestellt.

Kollektiv 2E (n=34) schließt Patienten ein, die nach einem kardio-chirurgischen Eingriff zum Herzklappenersatz auf ein Cumarinderivat eingestellt wurden. Die Patienten waren zwischen 27 und 88 Jahren, durchschnittlich 69 Jahre alt. Es handelt sich um 14 Frauen und 20 Männer. Dabei wurden alle Patienten berücksichtigt, die im Untersuchungszeitraum im Klinikum Links der Weser operiert wurden. Von den Patienten aus Kollektiv 2E erhielten 22 einen biologischen und 12 einen mechanischen Herzklappenersatz. Alle Patienten erhielten unfraktioniertes Heparin, das nach stabiler Antikoagulation mit einem Cumarinpräparat abgesetzt wurde. Den Patienten wurde präoperativ, vor Beginn der Marcumarisierung und bei Entlassung Blut entnommen. Die dritte Blutentnahme fand durchschnittlich am neunten postoperativen Tag statt. Die Daten der Patienten des Kollektivs 2E sind in Tab. 2-2 dargestellt.

Beide Gruppen unterscheiden sich in der Zusammensetzung von Alter (Wilcoxon Rank Test, p=0,387) und Geschlecht (Wilcoxon Rank Test, p=0,317) nicht signifikant. Sie sind vergleichbar.

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Id. Geschlecht Alter

Beginn der Marcumar-

therapie Quick INR Diagnose

M1 m 71 1997 10% 5,47 Z.n. Aortenklappenersatz

M2 m 73 1999 19% 3,12 absolute Arrhythmie bei Vorhofflimmern

M3 m 67 2002 20% 2,91 Z.n. tiefer Beinvenenthrombose mit Lungenembolie

M4 w 71 1987 11% 4,86 Z.n. Mitralvalvuloplastie

M5 m 67 1999 17% 3,28 Z.n. Mitralklappenersatz

M6 w 67 2001 26% 2,36 Z.n. tiefer Bein- und Beckenvenenthrombose

M7 m 75 1997 12% 4,54 absolute Arrhythmie bei Vorhofflimmern mit Z.n. Apoplex

M8 m 79 1996 16% 3,58 Z.n. tiefer Beinvenenthrombose (Rezidiv)

M9 m 82 1999 27% 2,28 Z.n. tiefer Beinvenenthrombose (Rezidiv)

M10 w 80 2002 16% 3,61 absolute Arrhythmie bei Vorhofflimmern

M11 m 74 1998 29% 2,19 Kardiomyopathie

M12 w 74 1999 21% 2,78 absolute Arrhythmie mit Z.n. Apoplex bzw.TIAs

M13 m 80 2001 22% 2,68 absolute Arrhythmie mit Z.n. Apoplex, A.carotis int.-Stenose

M14 m 65 2002 18% 3,13 absolute Arrhythmie mit Z.n. Apoplex

M15 m 66 1997 13% 4,15 absolute Arrhythmie bei Vorhofflimmern , Dilatative Kardiomyopathie

M16 m 82 2001 21% 2,78 absolute Arrhythmie bei Vorhofflimmern

M17 m 69 1999 63% 1,28 Aortenklappenersatz 1999

M19 m 77 2000 14% 3,90 Apoplex 2000

M20 m 71 1997 18% 3,25 Aortenklappenersatz

M21 w 71 2001 17% 3,32 Vorhofflimmern

M23 w 80 2001 28% 2,27 Vorhofflimmern

M24 m 54 1994 29% 2,20 Vorhofflimmern

M26 m 83 1999 33% 1,99 KHK, eingeschränkte linksventrikuläre Funktion

M27 m 29 2000 26% 2,64 Aortenklappenersatz

M29 w 66 1996 20% 2,96 Aortenklappenersatz

Mittelwerte 72 1999 22% 3,12

Tab. 2-1 Gruppe 2M: Patienten unter Cumarintherapie

(25)

Id. Geschlecht Alter Klappentyp

Post OP Tag des Therapiebeginns

E1 m 88 biologisch 7

E6 w 63 mechanisch 23

E7 m 60 mechanisch 5

E14 w 81 biologisch 6

Mittelwerte 69 9

Tab. 2-2 Gruppe 2E: Patienten in der Einstellungsphase auf Cumarine

(26)

2.1.3 Knochenszintigraphiepatienten

Bei 66 weiteren Patienten (Gruppe 3K) wurde zumeist im Rahmen einer Tumorsuche oder der Suche nach Metastasen eine Knochenszintigraphie durchgeführt und gleichzeitig Knochenstoffwechselparameter bestimmt. Die Indikation für die Knochenszintigraphie wurde im Rahmen der Patientenbehandlung, unabhängig von der vorliegenden Studie gestellt. Der Einschluss in die Studie erfolgte nach Indikationsstellung. Dabei wurden alle Patienten eingeschlossen, die sich im Untersuchungszeitraum konsekutiv einer Knochenszintigraphie unterziehen mussten.

Die Diagnosen zu dieser Gruppe sind in 9.3.7 angegeben.

2.1.4 Votum der Ethikkommission und Patientenzustimmung

Die Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer Bremen genehmigt (Studie Nr. 83, siehe auch 9.3.8). Von allen Patienten, bei denen zusätzlich Blut abgenommen werden musste (Gruppe 1N und 2M) lag eine schriftliche Einverständniserklärung vor.

Bei allen anderen Probanden und Patienten wurde Restblut von Routineaufträgen als Untersuchungsmaterial genutzt (Gruppe 1S, 2E und 3K). Im Rahmen der Studie wurden die Patienten anonymisiert.

2.2 Untersuchungsmaterial

Für alle Blutentnahmen wurden Serummonovetten und Einmalkanülen der Firma Sarstedt verwendet. Alle Proben wurden, sofern sie nicht direkt verwendet worden sind, bei –20°C und nicht länger als drei Wochen gelagert. Keine Probe wurde vor der Analyse aufgetaut und erneut eingefroren.

2.3 Verwendete Materialien

Neben den Standardlaborartikeln des Zentrallabors wurden folgende Materialien und Geräte verwendet:

• Mikrotiterplattenschüttler (Firma Heidolph), Schüttelfrequenz 950 Upm

• Mikrotiterplatten-Photometer (Firma Tecan), Filter für 405 nm, mit der

• Auswertungssoftware(EasyFIT®, Firma SLT Labinstruments))

• Aqua ad iniectibilia (Firma Braun) zur Herstellung von Waschpuffer und der Rekonstitution von Anti-TRAP-Antikörper, Standards und Kontrollen

• NaCl-Lösung 0,9% (Firma Braun) für Leerwerte

• ELECSYS 2010® (Firma Roche Diagnostics) mit folgenden Reagenzien:

(27)

Systemreagenzien (Cleancell, Procell, Syswash, Pipettenspitzen, Reaktionscups)

o β-Crosslaps (Bestellnummer: 192308) o Osteocalcin (Bestellnummer: 2149133) o PreciControl Bone 1, 2 und 3

• BONE TRAP ASSAY® (Firma medac; Bestellnummer 720)

• ACCESS® (Firma BeckmanCoulter, Inc.) mit folgenden Reagenzien:

o Systemreagenzien (LumiPhos®, Sample Diluent A, Access Substrate, Access Wash Buffer, Pipettenspitzen, Reaktionscups)

o Access Ostase (Bestellnummer: 37300) o Access Ostase QC ®

o Access Ostase Calibrators®

2.3.1 Saure Knochenphosphatase

Die Aktivität der Sauren Knochenphosphatase wurde mit dem konfektionierten Assay der Firma medac bestimmt (Bone TRAP Assay®).

Testprinzip

Die Saure Knochenphosphatase zirkuliert proteingebunden im Blut. Im Test wird sie durch Zugabe von Freisetzungsreagenz aus ihrer Proteinbindung gelöst und anschließend von an der Mikrotiterplatte immobilisierten Anti-TRAP-Antikörpern gebunden. Nichtgebundene Saure Phosphatasen werden durch Waschen entfernt. Die Aktivität der gebundenen Sauren Phosphatase wird enzymatisch mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat bestimmt.

Durchführung

Es werden in jede Kavität 100 µl Anti-TRAP-Antikörperlösung pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur und unter kontinuierlichem Schütteln (950 Upm) inkubiert. Dann wird sechsmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen. Anschließend werden 100 µl Standard, Kontrolle oder Probe pipettiert, und 50 µl des Freisetzungsreagenzes hinzugefügt. Es wird erneut 60 min bei Raumtemperatur und unter kontinuierlichem Schütteln (950 Upm) inkubiert und anschließend sechsmal mit 200 µl Waschpuffer gewaschen. Dann wird in jede Kavität 100 µl Substrat (p-Nitrophenylphosphat) gegeben und 60 min bei 37°C inkubiert. Schließlich werden 25 µl Stoplösung hinzugefügt und anschließend die Extinktion im Photometer gemessen.

(28)

Gemessen wurde in Serien. In jedem Lauf wurden drei Standards, eine Kontrolle und ein Leerwert vermessen. Alle Messungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.

Der Hersteller gibt folgenden Referenzbereich an: 2,50 – 5,11 U/l

2.3.2 Alkalische Knochenphosphatase

Die Alkalische Knochenphosphatase wurde mit einem konfektionierten Test der Firma BeckmanCoulter bestimmt (ACCESS Ostase Assay®, Chemilumineszenz- Immunoassay).

Testprinzip

Es handelt sich um einen Sandwichtest im Einschrittverfahren. Für Knochen-AP spezifische monoklonale Maus-Antikörper binden an paramagnetische Partikel, die mit polyklonalen Ziege-Anti-Maus-Antikörpern beschichtet sind. Nach einem Waschschritt wird die Aktivität der gebundenen Alkalischen Knochenphosphatase mit LumiPhos® 530 als Substrat gemessen. Für den Ostase-Immunoassay wurde eine Stabilität der Knochen-AP nach Lagerung bei -20°C oder -70°C über vier Jahre gezeigt (44).

Durchführung

Die Bestimmung wird mechanisiert im BeckmanCoulter® Access 2 durchgeführt. Dabei werden 25 µl der Probe gemeinsam mit dem Reagenz in ein Reaktionsgefäß pipettiert.

Es wird 5 bis 30 Minuten (die genaue Inkubationszeit wird vom Hersteller nicht offen gelegt) bei 36,5°C inkubiert. Anschließend wird dreimal mit je 500 µl Waschpuffer gewaschen, wobei die paramagnetischen Partikel von Magneten an der Wand des Reaktionsgefäßes festgehalten werden. Nach sechsminütiger Inkubation bei 36,5°C wird im Luminometer zehnmal für eine Sekunde das erzeugte Licht gemessen und der Mittelwert ermittelt.

Kalibriert wurde entsprechend den Vorgaben des Herstellers mit sechs Kalibratoren mindestens alle 42 Tage oder bei außerhalb des Zielbereiches liegenden Qualitätskontrollergebnissen. Gemessen wurde in Serien und in Einfachbestimmung. In jedem Lauf wurden zwei Qualitätskontrollen bestimmt.

Der Hersteller gibt folgenden Referenzbereich an: 3,70 – 20,90 µg/l.

(29)

2.3.3 Kollagen-I-Telopeptide

Die Kollagen-I-Telopeptide wurden mit einem konfektionierten Test der Firma Roche bestimmt (Elecsys 2010®, Elektrochemilumineszenz-Immunoassay ECLIA).

Testprinzip

Es handelt sich um einen kompetitiven Test, bei dem Antikörper gegen die β- isomerisierte Oktapeptidsequenz der α1-Kette des Kollagen-l-Peptids eingesetzt werden. Zwei α1-Ketten sind über Pyridinium Crosslinks bzw. Desoxypyridinium Crosslinks untereinander verbunden.

Eine Bindung des Antikörpers kann nur dann stattfinden, wenn die Bindung Asp-Gly (D-G) β-isomerisiert vorliegt (67). Es werden alle Fragmente des Kollagenabbaus quantifiziert, die das isomerisierte Oktapeptid β-8AA zweifach enthalten. Die detektierten Moleküle haben zwei posttranslationale Modifikationen durchlaufen (β-Isomerisation, Crosslinks), so dass nur aus der Resorption des reifen Knochenkollagens entstammende Kollagenfragmente erfasst werden. Der Knochenformation entstammende Kollagenfragmente sind größtenteils noch nicht β-isomerisiert (49) und werden vom Test nicht erfasst. Theoretisch können die gemessenen Fragmente auch von Kollagen anderer Gewebe stammen, die Untersuchungen von Christgau et al.

(1998) zeigen jedoch, dass unterschiedliche antiresorptive Therapien alle deutliche Effekte auf den Wert der β-Crosslaps haben. Die Autoren schließen daraus, dass die erfassten Kollagenmoleküle hauptsächlich dem Knochen entstammen (49). Die Menge der sezernierten Telopeptide ist direkt proportional zum Grad der Knochenresorption (1,4).

(30)

N-telopetides

α1α1 α1α1 α1α1 α1α1 α2α2α2α2

Helix C-telopetides

α1 (Ι):

α1 (Ι): SAGFDFSFLPQPPQEKAHDGGRYYRA

EKAHDβGGR

Abb. 2-1 Struktur und Lokalisation der β-isomerisierten Oktapeptidsequenz

Durchführung

Die Bestimmung wird im Elecsys 2010® (Roche) mechanisiert durchgeführt. Es werden 20 µl der Probe sowie ein Reagenz, das biotinylierte Antigene und den rutheniummarkierten Detektionsantikörper enthält, in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Es wird neun Minuten bei 37°C inkubiert, währenddessen Probenantigene und biotinylierte Antigene um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen am Antikörper konkurrieren. Im zweiten Schritt werden 40 µl der streptavidinbeschichteten Mikropartikel pipettiert.

Während der zweiten neunminütigen Inkubationsphase kommt es zu einer Biotin- Streptavidin Wechselwirkung mit Bildung von Immunkomplexen.

Das Reaktionsgemisch wird in die Messzelle gesaugt, wo die Mikropartikel durch magnetische Wirkung auf der Elektrodenoberfläche fixiert werden. Nicht gebundene Substanzen werden mit Procell entfernt. Durch Anlegen einer Spannung wird die Elektrochemilumineszenzemission induziert und im Photomultiplier gemessen.

Die Ergebnisse werden anhand einer Kalibrationskurve ermittelt. Diese wird durch eine 2-Punkt-Kalibration und eine mitgelieferte Masterkurve gerätespezifisch generiert.

Kalibriert wurde gemäß den Vorgaben des Herstellers alle 28 Tage oder bei außerhalb des Zielbereiches liegenden Qualitätskontrollen.

Gemessen wurde in Serien und in Einfachbestimmung. In jedem Lauf wurden drei Qualitätskontrollen (PreciControl 1, 2 und 3) mitbestimmt.

Der Hersteller gibt folgenden Referenzbereich an: 0,016 – 0,584 µg/l

(31)

2.3.4 Osteocalcin

Osteocalcin wurde mit einem konfektionierten Test der Firma Roche bestimmt (Elecsys 2010®, Elektrochemilumineszenz-Immunoassay ECLIA).

Testprinzip

Es handelt sich um einen Sandwich-Test, in dem ein biotinylierter Fängerantikörper und ein mit einem Rutheniumkomplex konjugierter Detektionsantikörper eingesetzt werden.

Der Fängerantikörper bindet an die Aminosäuresequenz 10 bis 17, der Detektionsantikörper an die Aminosäuresequenz 21 bis 29 (persönliche Mitteilung A.

Kyriatsoulis).

N

¹⁷

21 24

1 43 49

C

S-S

B Ru Peptidspaltung

Gla

N-Mid-Osteocalcin

Abb. 2-2 Osteocalcinmolekül. In der Abbildung ist schematisch das Osteocalcinmolekül mit seinem C- und N-terminalen Ende dargestellt. Von den 49 Aminosäuren sind die erste und letzte, die Aminosäure der Peptidspaltung sowie die Aminosäuren, die γ-carboxyliert werden

(Gla)markiert. Mit Ru ist die Bindungsstelle des Rutheniumkomplex konjugierten Antikörpers bezeichnet, mit B die Bindungsstelle des biotinylierten Antikörpers.

Sowohl das intakte Osteocalcinmolekül als auch das große N-MID Fragment werden im Immunoassay detektiert, das kleine C-terminale Fragment (Aminosäure 44-49) wird vom Antikörper nicht erkannt. Im carboxylierten Zustand nimmt das Molekül eine α-Helix Struktur ein, die im verwendeten Immunoassay erkannt wird. Die nicht carboxylierten Moleküle werden durch Zugabe eines Calciumsalzes in eine der α-helikalen Struktur ähnliche Konformation gebracht, und binden so an den Antikörper.

(32)

Durchführung

Die Bestimmung wird im Elecsys 2010® (Roche) mechanisiert durchgeführt.

Es werden 20 µl der Probe sowie das Reagenz mit dem biotinylierten Fängerantikörper und den rutheniummarkierten Detektionsantikörper in ein Reaktionsgefäß pipettiert und neun Minuten bei 37°C inkubiert. Im zweiten Schritt werden 40 µl einer Suspension mit streptavidinbeschichteten Mikropartikeln pipettiert. Während der zweiten neunminütigen Inkubationsphase kommt es zu einer Biotin-Streptavidin Wechselwirkung, durch die der Immunkomplex an die Festphase gebunden wird.

Das Reaktionsgemisch wird in die Messzelle gesaugt, wo die Mikropartikel durch magnetische Wirkung auf der Elektrodenoberfläche fixiert werden. Nicht gebundene Substanzen werden mit Procell entfernt. Durch Anlegen einer Spannung wird die Elektrochemilumineszenzemission induziert und im Photomultiplier gemessen.

Die Ergebnisse werden anhand einer Kalibrationskurve ermittelt. Diese wird durch eine 2-Punkt-Kalibration und eine mitgelieferte Masterkurve gerätespezifisch generiert.

Kalibriert wurde gemäß den Vorgaben des Herstellers alle 28 Tage oder bei außerhalb des Zielbereiches liegenden Qualitätskontrollergebnissen.

Gemessen wurde in Serien und in Einfachbestimmung. In jedem Lauf wurden drei Qualitätskontrollen (PreciControl 1, 2 und 3) mitbestimmt.

Der Hersteller gibt folgenden Referenzbereich an: 14 – 70 µg/l.

2.4 Statistische Verfahren

Die statistische Untersuchung der Messergebnisse erfolgte mit dem Mann-Whitney-U Test und dem Wilcoxon Rank Test (SPSS Software, Release 7.5, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Ein p-Wert wurde als signifikant angesehen, wenn er kleiner 0,05 war.

Methodenvergleiche wurden mittels nicht-parametrischer Regression nach Passing/Bablok (89,90) ausgewertet (Evapak, Release 3.0.1, Boehringer Mannheim GmbH).

(33)

3 Ergebnisse

3.1 Impräzisionen

Für die Ermittlung der Impräzisionen in der Serie wurden für jeden der vier Parameter mindestens zwei Poolproben, bezeichnet mit Pool 1 und Pool 2, hergestellt und jeweils elfmal vermessen. Die Poolproben wurden aus Restblutproben aus dem Routinelabor des Klinikums hergestellt. Zur Ermittlung der Impräzisionen zwischen den Serien wurden portioniert eingefrorene Kontrollproben in elf Serien vermessen.

3.1.1 Saure Knochenphosphatase

Bei der Ermittlung der Impräzision in der Serie für den Parameter TRAP wurden Werte zwischen 4,74 U/l und 5,58 U/l für den Pool 1 und zwischen 1,43 U/l und 1,78 U/l für den Pool 2 gefunden (Tab. 3-1). Die Variationskoeffizienten lagen bei 5,2 % (Pool 1) und 7,4 % (Pool 2).

Die Impräzision zwischen den Serien wurde mit der Packungskontrolle ermittelt, wobei in jeder Serie eine Doppelbestimmung durchgeführt wurde. Tab. 3-2 gibt die jeweiligen Einzelwerte (Kontrolle 1, Kontrolle 2) sowie den Mittelwert der Doppelbestimmungen (Kontrolle) an.

Pool 1 Pool 2

U/l U/l

1 5,48 1,78

2 5,57 1,75

3 5,58 1,68

4 5,27 1,53

5 5,02 1,60

6 5,19 1,63

7 5,21 1,43

8 5,13 1,54

9 4,74 1,50

10 5,30 1,59

11 4,90 1,77

Mittelwert 5,22 1,62

1S 0,27 0,12

Min 4,74 1,43

Max 5,58 1,78

Tab. 3-1 TRAP: Impräzision in der Serie

Kontrolle 1 Kontrolle 2 Kontrolle

U / l U / l U / l

1 2,72 2,91 2,81

2 2,77 3,25 3,01

3 3,11 3,34 3,22

4 2,61 2,50 2,55

5 3,46 3,78 3,62

6 2,52 2,95 2,74

7 2,80 3,03 2,92

8 2,68 2,99 2,84

9 2,76 3,07 2,92

10 2,94 3,29 3,12

11 3,13 2,83 2,98

Mittelwert 2,86 3,09 2,97

1S 0,27 0,33 0,28

Min 2,52 2,50 2,55

Max 3,46 3,78 3,62

Tab. 3-2 TRAP: Impräzision zwischen den Serien Die Einzelwerte der Kontrollen lagen zwischen 2,50 U/l und 3,78 U/l. Das Ergebnis der Berechnung der Variationskoeffizienten ist in Abb. 3-1 dargestellt. Berechnet wurde für

(34)

die Einzelbestimmungen ein Variationskoeffizient von 9,44 % und 10,68 % und für die Doppelbestimmung von 9,43 %.

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Saure Knochenphosphatase [U/l]

Variationskoeffizient

Impräzision in der Serie

Impräzision zwischen den Serien

Abb. 3-1 Impräzision der Sauren Knochenphosphatase. Aufgetragen ist der errechnete Variationskoeffizient gegen den Mittelwert der Messergebnisse für den jeweiligen Pool oder die jeweilige Kontrolle.

3.1.2 Alkalische Knochenphosphatase

Die Impräzision in der Serie wurde mit den Poolproben 1 und 2 sowie dem Kontrollserum (QC1) bestimmt (n=11). Die Ergebnisse dieser Messung sind in Tab. 3-3 dargestellt.

(35)

Pool 1 Pool 2 QC 1

µg / l µg / l µg / l

1 7,59 9,72 42,28

2 7,31 9,90 41,12

3 7,16 9,89 40,12

4 7,13 10,09 40,71

5 7,18 9,93 41,07

6 7,59 10,30 38,75

7 7,28 9,77 39,55

8 7,23 9,32 38,54

9 7,36 9,57 38,88

10 7,25 9,59 39,29

11 6,94 9,51 39,92

Mittelwert 7,27 9,78 40,02

1S 0,19 0,28 1,17

Min 6,94 9,32 38,54

Max 7,59 10,30 42,28

Tab. 3-3 Alkalische Knochenphosphatase:

Impräzision in der Serie

QC1 QC2

µg / l µg / l

1 10,61 39,43

2 10,23 35,26

3 9,70 36,40

4 9,06 34,63

5 10,32 37,76

6 9,83 42,80

7 10,48 44,43

8 9,33 40,58

9 10,24 39,10

10 9,23 40,59

11 10,87 40,71

Mittelwert 9,99 39,24

1S 0,60 3,05

Min 9,06 34,63

Max 10,87 44,43

Tab. 3-4 Alkalische Knochenphosphatase:

Impräzision zwischen den Serien Tab. 3-4 gibt die Impräzision zwischen den Serien an. Die Messwerte lagen zwischen 9,06 µg/l und 10,87 µg/l für QC1 und zwischen 34,63 µg/l und 44,43 µg/l für QC2. Es wurden Variationskoeffizienten von 6,0% und 7,8% gefunden (Abb. 3-2).

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Alkalische Knochenphosphatase [µg/l]

Abb. 3-2 Alkalische Knochenphosphatase: Variationskoeffizienten als Funktion der Konzentration am Access. Aufgetragen ist der errechnete Variationskoeffizient gegen den Mittelwert der Messergebnisse für den jeweiligen Pool oder die jeweilige Kontrolle.

(36)

3.1.3 Kollagen-I-Telopeptide

Für die Bestimmung der Impräzision in der Serie wurden zwei Poolseren eingesetzt, für die Werte zwischen 0,291 µg/l und 0,369 µg/l sowie 0,291 µg/l und 0,351 µg/l gefunden wurden (n=11). Die Variationskoeffizienten lagen bei 7,3% und 5,4% (Abb. 3-3).

Zur Bestimmung der Impräzision zwischen der Serie für β-Crosslaps (n=11) wurden für Bone 1 Werte zwischen 0,30 µg/l und 0,35 µg/l, für Bone 2 zwischen 0,65 µg/l und 0,83 µg/l und für Bone 3 zwischen 2,56 µg/l und 3,31 µg/l gefunden (Tab. 3-6). Die Variationskoeffizienten lagen zwischen 6,1% und 7,0% (Abb. 3-3).

Pool 1 Pool 2

µg / l µg / l

1 0,303 0,306

2 0,340 0,325

3 0,328 0,318

4 0,306 0,305

5 0,369 0,351

6 0,302 0,310

7 0,293 0,336

8 0,308 0,306

9 0,325 0,307

10 0,307 0,303

11 0,291 0,291

Mittelwert 0,316 0,314

1S 0,023 0,017

Min 0,291 0,291

Max 0,369 0,351

Tab. 3-5 β-Crosslaps: Impräzision in der Serie (Elecsys 2010)

Bone1 Bone2 Bone3

ng / ml ng / ml ng / ml

1 0,35 0,73 3,24

2 0,32 0,70 3,31

3 0,35 0,70 3,29

4 0,32 0,68 3,04

5 0,34 0,73 3,19

6 0,35 0,73 3,07

7 0,31 0,69 2,79

8 0,32 0,83 3,13

9 0,33 0,71 3,08

10 0,30 0,69 3,09

11 0,31 0,65 2,69

Mittelwert 0,33 0,71 3,08

Standardabw. 0,02 0,05 0,19

Min 0,30 0,65 2,69

Max 0,35 0,83 3,31

Tab. 3-6 β-Crosslaps: Impräzision zwischen den Serien (Elecsys 2010)

(37)

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Crosslaps [µg/l]

Abb. 3-3 Impräzision in der Serie und zwischen den Serien bei der Bestimmung der β-Crosslaps am Elecsys 2010. Aufgetragen ist der errechnete Variationskoeffizient gegen den Mittelwert der Messergebnisse für den jeweiligen Pool oder die jeweilige Kontrolle.

3.1.4 Osteocalcin

Die Impräzision in der Serie, dargestellt in der Tab. 3-7, wurde mit zwei Poolseren ermittelt. Im Pool 1 wurden Osteocalcinwerte zwischen 17,64 µg/l und 19,22 µg/l, im Pool 2 zwischen 17,18 µg/l und 20,97 µg/l gefunden. Die Variationskoeffizienten lagen bei 2,8% und 5,0% (Abb. 3-4).