diagnostische Bedeutung und - Stoffwechsel Bestimmung

Einfache turbidimetrische Mikrolitermethode

zur Bestimmung der Sulfationenkonzentration im Serum und Urin - Referenzwerte, Stoffwechsel und diagnostische Bedeutung

Simple turbidimetric microliter method for determining the sulfate concentration in serum and urine - Reference values, metabolism and diagnostic relevance

F. Dreßler

Europäisches Institut für angewandte medizinische Forschung und Lehre, Kreischa/Sachsen

Zusammenfassung:

Es wird eine neuartige und einfache turbidimetrische Mikrolitermethode zur Bestim- mung der Sulfationenkonzentration im Serum und Urin beschrieben. Zur Sulfatpräzipi- tierung wird 4-Chloro-4'-aminodiphenyl benutzt, und die Trübungsmessung erfolgt photometrisch. Ergebnisse zur Präzision, Wiederfindung sowie Referenzwerte werden dargestellt und die diagnostische Bedeutung von Sulfat (Niereninsuffizienz, Proteo- glycan-/Glycosaminoglycansynthese, Biotransformation) diskutiert.

Schlüsselwörter:

Sulfat- Serum - Urin - Turbidimetrie - Referenzwerte - Diagnostik Summary:

A new and simple turbidimetric microliter method for the determination of the sulfate concentration in serum and urine is described. For the sulfate precipitation 4-chloro-4'- aminodiphenyl is used and the turbidity can be detected with a photometer. Resufts of the precision, recovery and reference values are described and the diagnostic relevance of sulfate (renal disease, synthesis of proteoglycane/glycosaminoglycane, and biotrans- formation) is discussed.

Keywords:

Sulfate - serum - urine- turbidimetry- reference value- diagnostics

Einleitung

Klinische Bedeutung

Sulfatanionen sind ein wichtiges Substrat für verschie- dene biochemische Prozesse bzw. Strukturkomponenten im Organismus. So .erfolgt die Biotransformation be- stimmter endogener Substanzen (Catecholamine, Tyra- min, Serotonin, Glucocorticoide, Androgene, Östrogene, Gallensäuren) sowie exogener Stoffe bzw. therapeuti- scher Xenobiotica (steroidale Antikonzeptiva, Analgetica, antiinflammatorischer Pharmaka, adrenergische Stimu- lantien und Blocker) auch durch Sulfatkonjugation (4, 13, 17,29, 38, 52, 60, 61,66). Desweiteren wird das Anion zur Synthese von Proteoglycanen bzw. Glycosaminoglycanen (2, 20, 24, 31, 34, 42) bestimmter Bindegewebsstrukturen, insbesondere der Knorpelmatrix und von Cerebrosiden der Myelinmembran im Gehirn (52, 57) benötigt. Die be- sondere Bedeutung des Sulfates während der Entwick- lungs- und Wachstumsphase wird durch den Sachverhalt

hervorgehoben, daß die Serumkonzentrationen von schwangeren Frauen, Föten, Säuglingen und Kindern (<3 Jahre) größer ist als bei Erwachsenen (7, 8, 10, 47, 64).

Die Sulfatkonjugation bzw. Sulfatierung erfolgt über das

„aktive Sulfat", das heißt über die Bildung von Phospho- Adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat (PAPS) unter Be- teiligung von Sulfotransferasen. Die intrazelluläre PAPS- Synthese erfordert neben Energie (2 Mol ATP) ein ausrei- chendes Angebot an Sulfationen, die vermutlich mit Hilfe eines Carriers aktiv im Austausch gegen Chlorid aus dem Serum entnommen werden können (3, 20, 51, 53, 57). Das vom Organismus benötigte Sulfat wird entweder durch enterale Resorption von anorganischen Sulfatsalzen oder von schwefelhaltigen Proteinen bzw. Aminosäuren (Me- thionin, Cystin bzw. Cystein) und Oxidation des Schwefels zu Sulfat (37, 53, 57, 64) gewonnen.

Die Ausscheidung des Sulfates erfolgt über die Niere. In

Analogie zum Creatinin kommt es bei Einschränkung der

glomerulären Filtrationsrate zu Hypersuifatämien (18, 22,

üooul(ioo) s«r IM +100 1(?0) 1,392 mol/1 PCS

Urin (RLW.St) tlOOOpl 0.255 mol/1 PCS mischen

*entrifugieren 7 ( ) überstand

»500 1(20 ) HiO (St)

50ul Oberstand

• HaO

200 1(100) Verdünnung 4·200 1(100) CAO-RL

in Küvette mischen nach O.5-1 m i n Messung der scheinbaren Extinktion

be i =430nm, d=lcm

Abb. 1: Analysenschema zur Bestimmung der Sulfationenkonzen- tration im Serum und Urin (RLW: Reagenzienleerwert, St: Stan- dard, PCS: Perchlorsäure, in Klammern Volumina bei Kapillarblut- abnahme)

45). Erhöhte Serumkonzentrationen werden auch bei Hyperthyreoidismus, in der Mitte des Menstruationscyc- lus, nach Proteinaufnahme, oraler Zufuhr von wäßrigen Sulfatlösungen (11, 43, 64) und möglicherweise nach Schwefelbädern (16) gefunden.

Erniedrigte Sulfatkonzentrationen im Serum verschiede- ner Tierspezies und beim Menschen werden durch be- stimmte Medikamente, insbesondere Salicylate und Para- cetamol, über eine erhöhte Sulfatausscheidung oder ver- mehrten Verbrauch bei der Sulfatkonjugation verursacht (19, 33, 35, 36, 48, 49, 67, 68, 71). Ein ungenügendes Sul- fatangebot beeinträchtigt die Synthese von wichtigen Strukturkomponenten in den Chondrozyten des Knorpels negativ. Es kommt zur Untersulfatierung der Glycosami- noglycane, das heißt die Proteoglycane enthalten weniger

Extinktion

150 S04 üL/moI/l]

Abb. 2: Einfluß der Perchlorsäure-Konzentration auf Sulfat-Stan- dardkurven ( Serum, D H

0, + 0,06 m, O 0,12 m, 0,23 m PCS;

Ansatz: WO Sulfatlösung + WO CAD-RL)

Extinktion

0,5 - 0,4 - 0,3 - 0,2 - 0,1 -

C-S04

20010 400

20 600

30 Serum jpmol/l]

Urin [mmol/Q

Abb. 3: Sulfat-Bezugskurven (+ Serum, Urin, Ansatz nach Abb. 1)

Chondroitinsulfat- und mehr nichtsulfatierte Chondroitin- Ketten (2, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 34, 42, 68, 70).

Sulfatanalytik

Zur Sulfatbestimmung wurden bisher viele Methoden und Techniken, wie Photometrie (21, 62, 63, 69), Turbidimetrie (1,12,14,40,55), Flammenphotometrie (39), Atomabsorp- tionsspektrometrie (44), Radiometrie (46, 64), einfache Anionenaustauschchromatographie (6, 25, 56, 58) sowie HPLC (30, 50) entwickelt bzw. eingesetzt. Diese Verfahren sind aber für den routinemäßigen Einsatz, insbesondere in kleineren Laboratorien, auf Grund der notwendigen Spezialtechnik sowie des zum Teil hohen Arbeits- und Zeitaufwandes nur wenig geeignet. Außerdem bereitet die Sulfatbestimmung im Serum durch die notwendige Enteiweißung sowie Störungen von Fremdionen und an- deren Substanzen häufig Schwierigkeiten, so daß die bis- her getesteten photometrischen und turbidimetrischen Methoden nicht unproblematisch sind. Auch das von De Vries und Mitarbeitern (69) sehr ausgereift modifizierte Verfahren der photometrischen Sulfatbestimmung über Benzidin (kanzerogen).ist nicht sehr anwenderfreundlich und enthält mehrere und zum Teil schwierige Analysen- schritte.

Bei den turbidimetrischen Methoden mit Bariumionen ist die Niederschlagsbildung nur gering reproduzierbar und erfordert Zusätze zur Präzipitatbildung und -Stabilisierung (55). Demgegenüber scheint die Verwendung von 4-Chlo- ro-4'-aminodiphenyl (CAD) als Fällungsreagenz bezüglich Präzision, Empfindlichkeit sowie loneninterferenzen bes- ser geeignet zu sein. Allerdings ist die von Coleman und Mitarbeiter beschriebene Methode (12) nur für Sulfatbe- stimmungen in wäßrigen Lösungen geeignet. Eine Ana- lyse eiweißhaltiger Lösungen bzw. Serum ist derart nicht möglich.

Im folgenden wird eine schnelle und präzise Mikroliter-

methode mit CAD zur Bestimmung der Sulfationenkon-

106 Lab.med. 17: 106 (1993)

Tab. 1: Pr zision von Sulfatbestimmungen im Serum und Urin in der Serie

(n = 12)

Serumpool

* [μιτιοΙ/Ι]

s [μηηοΙ/Ι]

s [%]

SP1241 8,43,5

SP2372 9,82,6

von Tag zu Tag (n = 20) SP1245

12,6 5,1

SF2377 19,65,2

Urinpool

* [mmol/l]

s [mmol/ll

in der Serie

22,70,82 3,6

zentration im Serum und Urin vorgestellt, wobei die Tr - bungsmessung mit einem einfachen Photometer erfolgen kann. Desweiteren werden Referenzwerte sowie Ergeb- nisse zum Vergleich der Serumkonzentrationen von Sulfat und Creatinin mitgeteilt.

Material und Methoden

Reagenzien und L sungen

- Perchlors ure

(PCS): 1,392 mol/l (Serum); 0,255 mol/l (Urin)

- Natriumsulfat

-Standard: 50 μηηοΙ/Ι (Serum); 25 mmol/l (Urin)

- Pr zisionskontrollmaterialien: gepoolte Seren mit Sul- fationenkonzentrationen <300 μηηοΙ/Ι (SPD und >300 μηηοΙ/Ι (SP2); bei -20°C ber Monate haltbar

- 4-Chloro-4'-aminodiphenyl

-Reagenzl sung (CAD-RL):

12,2 mmol/l CAD in 0,05 mol/l Salzs ure

; bei Raum- temperatur ber Monate haltbar, gelegentlich filtrieren

1

Merck AG, Darmstadt

Eigensynthese Analysenschema

Das Verfahren ben tigt nur wenige und unproblematische Analysenschritte (Abb. 1). Die Enteiwei ung und Verd n- nung wird einfach angesetzt, w hrend die Pr zipitatbil- dung von (CAD)

SO

in der K vette mehrfach durchge- f hrt werden kann und nach 30-60 sec abgeschlossen ist.

Bei der Bestimmung im Serum mu auf einen internen Standard und bei Urin auf einen w rigen Vergleichsstan- dard bezogen werden.

Ergebnisse und Diskussion

Analytik

Trotz vieler bekannter Varianten zur Enteiwei ung berei- tet die Adaption der Probenaufbereitung, insbesondere von Serum, an .die nachfolgende Pr zipitation der Sulfat- ionen erhebliche Schwierigkeiten (geringe Wiederfin- dung, Erh hung der L slichkeit des Pr zipitats durch S u- ren, Sulfatverunreinigung). Am besten geeignet erwies sich eine Deproteinisierung mit Perchlors ure, wobei al- lerdings einige Besonderheiten zu beachten sind. Einer- seits wird zur Enteiwei ung von Serum eine Mindestkon- zentration an Perchlors ure von ca. 0,232 mol/l ben tigt und andererseits tritt die L slichkeitsbeeinflu ung erst bei einer PCS-Konzentration von 0,05 mol/l nicht mehr auf (Abb. 2). Aus diesen Sachverhalten und aus Empfindlich- keitsgr nden darf daher bei der Serumanalyse nur ein kleines Volumen an Perchlors ure mit entsprechend ho-

her Konzentration zugesetzt werden, das anschlie end durch Wasserzugabe auf die zur Pr zipitierung notwen- dige S urekonzentration verd nnt wird. Die durch den Volumen-Verdr ngungs-Effekt (Verlust des Volumenan- teils der Proteine) auftretende Konzentrierung ist bei Ver- gleich mit Sulfatwerten, die ohne Enteiwei ung bestimmt wurden bzw. wo dieser Effekt zu vernachl ssigen ist, zu beachten und kann korrigiert werden (ca. 5% (59)). Eine weitere Besonderheit bei der Sulfatbestimmung im Serum ist der Bezug auf einen internen Standard, da der Anstieg im Serum gegen ber einer w rigen Sulfat- l sung etwas steiler verl uft. Dieser kann durch Zugabe einer Sulfatl sung, z.B. 50 μηηοΐ/l, statt Wasser zum ent- eiwei ten berstand hergestellt werden, oder der Bezug erfolgt auf einen eingestellten Serumpool bzw. ein Kon- trollmaterial mit bekannter Konzentration.

Die Sulfat-Eichkurven verlaufen im Serum bis ca. 800 μηηοΙ/Ι bzw. im Urin bis ca. 50 mmol/l linear. Bei h heren Konzentrationen wird mit Wasser entsprechend weiter verd nnt (Abb. 3).

Untersuchungen zur Pr zision des Verfahrens (Tab. 1) ergaben prozentuale Standardabweichungen in der Serie

<5% und von Tag zu Tag um 5%. Die Wiederfindung f r zum Serumpool 1 zugesetztes Sulfat betrug 103% (SP1 + 91 μΓηοΙ/Ι) bzw. 97% (SP1 + 182 μΓηοΙ/Ι).

Referenzwerte

Zur Erhebung von Referenzwerten wurden im Rahmen von Gesundheitskontrollen Sulfatanalysen im Serum (morgentliche N chternblutabnahme) von 443 m nnliche Personen durchgef hrt. F r Erwachsene von 18-50 Jahre (nichtsignifikante Unterschiede der Altersgruppen) wurde ein Referenzwert von 268±35 μηιοΙ/Ι mit einem 2s-Bereich von 198-338 μηποΙ/Ι gefunden, was gut mit anderen Auto- ren bereinstimmt (30, 44, 58,64). Die Werte sind normal- verteilt (Abb. 4). Ein deutlicher Anstieg mit dem Alter, wie von Meier und Mitarbeiter (43) f r 25-65 Jahre beschrie- ben wird, kann derart nicht best tigt werden bzw. erfolgt erst ab 50 Jahre (Abb. 5). bereinstimmend zu Cole und Mitarbeiter (5) entsprechen die Serumwerte von Jugend- lichen (13-17 Jahre: 258±32 μπιοΙ/Ι) nahezu denen von Erwachsenen.

F r 24h-Sammelurin von erwachsenen M nnern (n = 24) wurde ein Referenzwert von 28,2±6,4 mmol/d ermittelt, der mit anderen Ergebnissen (40, 54) gut vergleichbar ist.

Sulfat-Creatinin-Vergleich

Von 160 Patienten mit Verdacht oder bekannter Nieren-

insuffizienz wurden die Serumkonzentrati nen von Sulfat

H ufigkeit

, 100η

20-

160 200 240 280 320 360 400 SO4 [μΓΤΐθΙ/1]

Abb. 4: H ufigkeitsverteilung von Serumsulfat bei Erwachsenen (18-50 Jahre)

3600 3000-

2600-

2000- 1600- 1000-

8O4 fyjmol/l]

Y(SO4)= 330 + 1,61X(CREA) r- 0.85 200 400 600 1000 1200 1400

CREA 0/mol/l]

Abb. 6: Korrelation der Serumkonzentrationen von Sulfat und Creatinin (Creatinin >ΊΟΟμΓηοΙ/1)

und Creatinin (Prikrins uremethode) bestimmt. Die ermit- telte Regressionsgerade (Abb. 6; Creatinin >100 μιτιοΙ/Ι) von y(S0

) = 330 + 1,61x(Crea) mit einem Korrelations- koeffizient von 0,85 entspricht denen anderer Autoren (18, 45). Demgegen ber existiert im Creatininnormbereich keine Korrelation zum Sulfat (r = 0,07). Hierbei ist bemer- kenswert, da auff llig viele Sulfatwerte oberhalb der ge- fundenen 2s-Referenzgrenze liegen (Abb. 7). Dies stimmt mit Ergebnissen von H nze (22) berein, wonach Sulfat bereits bei Einschr nkung der glomerul ren Filtrations- rate (Creatininclearence) unter 75ml/min 1,75m

, das hei t fr her als Creatinin, ansteigen soll. Hingegen fand Michalk bei Bezug auf die Inulinclearence (45) analog zum Creatinin einen Anstieg des Serumsulfates ab 50 ml/min 1,75m

.

Die entwickelte turbidimetrische Mikrolitermethode ist auf Grund der einfachen und schnellen Analysendurchf h- rung sowie der Verwendung eines photometrischen Me - prinzips (scheinbare Extinktion) sehr gut f r den routine-

400 350 300 250 200

100

SO4 [μΓηοΙ/Ι]

^_^^

_^-~^~*

+2s . — ~~"^

c ^^^____^^

^

n 89 142 103 85 25

13-17 18-30 31-40 41-50 51-60 Alter [Jahre]

Abb. 5: Alterseinflu und 2s-Referenzbereich von Serumsulfat ·

m igen Einsatz in Laboratorien geeignet. Pr zision und Wiederfindung entsprechen den analytischen Anforde- rungen an klinisch-chemische Methoden. Die Analyse kann mit 100 μΐ Serum durchgef hrt werden, was Kapillar- blutabnahmen und damit geringere Belastungen, insbe- sondere bei Neugeborenen und Kindern sowie bei h ufi- gen Abnahmen, gestattet. Eine Teilautomatisierung der Analyse nach der Enteiwei ung ist m glich. Folgende An- wendungsbereiche von Sulfatbestimmungen k nnen f r Klinik und Forschung von Bedeutung sein:

- Bestimmungen bei Patienten mit glomerul rer Nieren- insuffizienz in Erg nzung zum Creatinin, insbesondere bei Verwendung der Pikrins uremethode, da diese durch viele St rfaktoren und Unspezifit ten beeinflu t wird (65).

- Kontrollanalysen bei Dialysepatienten bez glich der Einsch tzung der Sulfateliminierung (18, 30, 41), da er-

ftfi

C/Yl

ΛΛΛ

ΟΛΛ

200

1ΠΠ

3

S04 fei mol/l]

•

β ·

; v ;ί§ - . , - . « .

• · · · · ·

• " ; *· · -" ' " ·-

·- * · - ' . . ' : · : - -

.

5' 45 55 65 75 85 95 CREA fy/mol/l]

Abb. 7: Korrelation der Serumkonzentration von Sulfat und Crea- tinin (Creatinin <100μηιοΙ/Ι)

höhte Sulfationenkonzentrationen im Serum einen Ab- fall des ionisierten Calciums bewirkt (bei 1 mmol/l Sul- fat verringern sich die Calcium-lonen um 0,017mmol/l (9)), und außerdem wird die renale Reabsorption von Calcium und Magnesium inhibiert (15), was insgesamt zur Entstehung der renalen Osteopathie beitragen kann.

Überprüfungen zum Einfluß verschiedener Medika- mente (vor allem nichtsteroidale antiinflammatorische Pharmaka) sowie Reduktionsdiäten (Elekrolyt- und Pro- tein- bzw. SH-Ammosäure-Mangel) auf das Serumsul- fat da diese zu Hyposulfatämien führen können und nach Maroudas und Mitarbeiter (42) bei Konzentratio- nen <200 / untersulfatierte und damit minderwer- tige Proteoglycane bzw. Glycosaminoglycane im huma- nen Knorpel synthetisiert werden (2, 24, 31, 34).

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Anschrift des Verfassers:

Dr. rer. nat. Frank Dreßler

Europäisches Institut für angewandte medizinische Forschung und Lehre

Klinik Bavaria

August-Bebel-Straße 12 O-8216 Kreischa/Sachsen

110

Lab.med. 17: 110(1993)

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