Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Effizienz der Ultraschallgeleiteten, transvaginalen Follikelpunktion bei
präpuberalen Rindern durch intraovarielle Verabreichung von Gonadotropinen
INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Michael Wieking
aus Neustadt
Hannover 2001
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Niemann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2001
2 LITERATUR 9
2.1 Oogenese 9
2.1.1 Oozytenreifung 10
2.1.1.1 Kern- und Zytoplasmareifung 10
2.1.1.2 Oozytenreifung bei präpuberalen Rindern 15
2.2 Follikulogenese 16
2.2.1 Morphologie der Follikelentwicklung 16
2.2.2 Hormonelle Regulation des Follikelwachstums bei Wiederkäuern 20
2.2.3 Follikeldynamik bei adulten Tieren 23
2.2.4 Follikeldynamik bei Kälbern 24
2.3 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen 25
2.3.1 Methoden zur Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen 25 2.3.2 Die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion 27 2.3.3 Die Punktionsfrequenz bei der Ultraschall geleiteten,
transvaginalen Follikelpunktion 28
2.3.4 Technische und materielle Aspekte der Ultraschall geleiteten,
transvaginalen Follikelpunktion 29
2.3.5 Einfluß der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion
auf die Gesundheit der Spendertiere 31
2.3.6 Gewinnung von Oozyten durch die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion bei adulten Spendertieren mit
und ohne vorherige hormonale Stimulation 32
2.3.7 Gewinnung von Oozyten durch OPU bei präpuberalen Kälbern
mit und ohne vorherige hormonale Stimulation 35
2.4 Die intraovarielle Injektion 38
2.4.1 Die intraovarielle Injektion beim Rind 38
2.4.2 Die intraovarielle Injektion bei anderen Spezies 39 2.5 In-vitro-Entwicklungskapazität von Oozyten präpuberaler
Spendertiere 40
3.2 Technische Ausrüstung für die Ultraschall geleitete
Follikelpunktion 44
3.3 Eingesetzte Hormone zur Stimulation des Oozytenwachstums 49 3.4 Durchführung der Ultraschall geleiteten, transvaginalen
Follikelpunktion 49
3.5 Durchführung der intraovariellen Injektion 50
3.6 Gewinnung der Oozyten 52
3.6.1 Oozytenklassifizierung 52
3.7 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen 53
3.7.1 In-vitro-Maturation der Kumulus-Oozyten-Komplexe 53
3.7.2 Maturationsmedium 53
3.7.3 In-vitro-Fertilisation 54
3.7.4 Fert-TALP 54
3.7.5 Swim-Up-Verfahren 54
3.7.6 Sperm-TALP 55
3.7.7 In-vitro-Kultivierung 56
3.7.8 SOF-Medium 57
3.8 Messung des Durchmessers der Oozyten 58
3.9 Fixation und Färbung der Oozyten und Embryonen 58
3.10 Embryotransfer 59
3.11 Statistische Auswertungen 59
3.12 Versuchsaufbau 60
4 ERGEBNISSE 62
4.1 Follikelpunktion nach einseitiger intraovarieller Injektion von FSH in das rechte Ovar in einer Dosierung von 2,5 mg FSH
(Versuchsgruppe I) 62
4.3 Follikelpunktion nach beidseitiger intraovarieller Injektion von FSH in einer Dosierung von 2,5 mg FSH in den Punktionen 1-6
und 3,8 mg FSH in den Punktionen 7-12 (Versuchsgruppe III) 66 4.4 Follikelpunktion nach beidseitiger intraovarieller Injektion von
FSH in einer Dosierung von 1,9 mg FSH in den Punktionen 1-6
und 2,5 mg FSH in den Punktionen 7-12 (Versuchsgruppe IV) 67 4.5 Follikelpunktion nach beidseitiger intraovarieller Injektion von
FSH in einer Dosierung von 1,25 mg FSH in den Punktionen 1-6
und 2,5 mg FSH in den Punktionen 7-12 (Versuchsgruppe V) 69
4.6 Bestimmung der Entwicklungskompetenz 71
4.6.1 Reifungsraten 71
4.6.2 Fertilisationsrate 71
4.6.3 Zellzahlbestimmung der Morulae und Blastozysten 72
4.6.4 Oozytendurchmesser 72
4.6.5 Trächtigkeiten nach Transfer in vitro produzierter Embryonen 73 4.7 Gynäkologische und allgemeine Gesundheit der bei OPU
verwendeten Kälber 74
5 DISKUSSION 75
6 ZUSAMMENFASSUNG 83
7 SUMMARY 85
8 LITERATURVERZEICHNIS 89
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 129
1 Einleitung
Der erste Embryotransfer (E T) wurde bereits 1891 vom englischen Wissenschaftler Walter HEAPE erfolgreich beim Kaninchen durchgeführt (BETTERIDGE 1981). Im Jahre 1951 wurde von WILLET et al. vom ersten erfolgreichen Transfer einer befruchteten Eizelle beim Rind berichtet. 1964 wurde dann der erste unblutige Embryotransfer beim Rind beschrieben (BETTERIDGE et al. 1989). In den 70-er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde begonnen, Rinderembryonen mit der In-vitro-Maturation, Fertilisation und Kultivierung zu entwickeln (SREENAN 1970). Die Produktion des ersten Kalbes aus IVF gelang 1981 aus einer in vivo gereiften Oozyte (BRACKETT et al. 1982). 1987 wurden erstmals erfolgreich unreife Oozyten in vitro maturiert, fertilisiert und bis zum Stadium transfertauglicher Embryonen kultiviert und übertragen (LU et al. 1987). In den 80-er Jahren des 20. Jahrhunderts wurden Verfahren zur Entnahme von Oozyten aus lebenden Tieren entwickelt, wie die Laparatomie und Laparoskopie (GREVE et. al. 1984; LAMBERT et al. 1983). Diese Methoden wurden aber nicht dem Anspruch gerecht, häufig wiederholbar und minimal invasiv zu sein (RATH 1993).
1985 berichteten DELLENBACH et al. erstmals über die transvaginale Follikelpunktion in der Humanmedizin. Diese Methode wurde 1988 von PIETERSE et al. erfolgreich in der Veterinärmedizin eingesetzt. Die auch als OPU (Ovum pick up) bezeichnete Methode wurde zunächst hauptsächlich bei adulten Tieren und sogar in der kommerziellen Rinderzucht angewandt (LOONEY et al. 1994; HASLER et al. 1995). Um das Generationsintervall noch wirkungsvoller zu verkürzen (BETTERIDGE et al 1989 ), begann man Jungrinder (BUNGARTZ et al. 1995; NIBART u. MARQUANT-LEGUIENNE 1995) und präpuberale Kälber (PRESICCE et al. 1995; BROGLIATTI et al. 1995a; FRY et al.
1997; RICK et al. 1996) für die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion zu nutzen. Die Ultraschall geleitete Follikelpunktion kann mit dem in Mariensee entwickelten Gerät bereits bei Kälbern von einem Alter von ca. 6 Monaten eingesetzt werden (KUWER 1997). Um Anzahl und Entwicklungsfähigkeit der aus präpuberalen Rindern gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) zu steigern, müssen Gonadotropine zugeführt werden, die überwiegend intramuskulär verabreicht wurden (KUWER 1997). Über die intraovarielle
Applikation von Gonadotropin bei Kälbern und ihre Anwendung auf die Entwicklungsfähigkeit der KOK ist noch nicht berichtet worden. Auch nach Einsatz von Gonadotropinen fallen die Entwicklungsraten von Oozyten gegenüber solchen von adulten Spendern wesentlich geringer aus.
Eine kommerzielle Nutzung präpuberaler Rinder würde der Zucht erhebliche Vorteile bringen. Wertvolle Tieren können schon vor Eintritt der Zuchtreife wirtschaftlich genutzt werden. Wenn schon in jüngerem Alter eine hohe Nachkommenzahl von einem Tier besteht, kann die Nachzucht entsprechend früh auf ihre Leistung geprüft werden. Das Muttertier, aus dem ansonsten nur eine begrenzte Zahl an Nachkommen produziert werden kann, gewinnt durch die höhere Nachkommenschaft züchterisch an Bedeutung.
In der vorliegenden Arbeit wurde das FSH-Präparat Folltropin in einer FSH-Dosis zwischen 1,25 und 3,9 mg direkt ins Ovar injiziert. Ziel war es, bei 6 Monate alten Kälbern durch diese intraovarielle Injektion von FSH das Follikelwachstum zu stimulieren und für diese Injektion die minimal effektive Dosis festzulegen. Hierfür wurde ein spezieller
„Carrier“ entwickelt, der sowohl für OPU als auch für die i.o.–Injektion verwendet werden kann. Die gewonnenen Oozyten wurden auf ihre In-vitro-Entwicklungskompetenz geprüft.
Ferner wurden Aspekte wie Effizienz und die allgemeine Geschlechtsgesundheit der Tiere untersucht.
2 Literatur
2.1 Oogenese
Als Oogenese wird die Vermehrung und Reifung der Urgeschlechtszellen (Gonozyt) bis zur befruchtungsfähigen Eizelle bezeichnet (MOSIMANN u. KOHLER 1990). Beim weiblichen Säugetier beginnt die Oogenese bereits in der frühembryonalen Phase mit der aktiven amöboiden Wanderung der primordialen Keimzellen aus dem Dottersack des Embryos zu den sich später differenzierenden Gonadenanlagen (GORDON 1994). Zu diesem Zeitpunkt werden sie als Oogonien bezeichnet. Die Anzahl der Oogonien nimmt durch Zellwachstum und mitotische Teilungen rasch zu und bei Eintritt der Zellen in die Prophase der ersten Reifeteilung verlieren die Oogonien ihre Vermehrungsfähigkeit und werden als primäre Oozyten bezeichnet (BYSKOV 1982). Zwischen dem 75. und 80. Tag nach der Befruchtung setzt die erste mitotische Teilung ein (LAVOIR et al. 1992). Während dieser ersten mitotischen Teilung kommt es in der Prophase zum Austausch genetischer Information durch chromosomales Crossing over. Es kommt nur zu einer unvollständigen Trennung der Chromosomen, denn sie bleiben durch Chiasmata miteinander verbunden. Die Chromosomen drängen räumlich auseinander, wodurch ein großer blasiger Kern mit deutlichem Nukleolus gebildet wird, den man als Germinalvesikel bezeichnet (Mc LAREN 1982, BAKER u. FRANCHI 1967). Zum Zeitpunkt der Geburt besitzt das Kalb durchschnittlich 235000 Oozyten (ERICKSON 1966), die sich in der Prophase der ersten meiotischen Teilung befinden. In diesem als Dictyotän bezeichneten Stadium wird der Zellzyklus unterbrochen, der erst in der präovulatorischen Phase durch Einsetzen der Meiose wiederaufgenommen wird. Nach Vollendung der ersten meiotischen Teilung bezeichnet man das Stadium der Oozyte als sekundär.
Die Ursachen für die Unterbrechung des Zellzyklus sind immer noch weitgehend unbekannt (BEVERS et al. 1997). Die Arretierung der Meiose soll von Faktoren der Follikelflüssigkeit ausgehen, deren Wirkung durch den „second messenger cAMP“ vermittelt wird (SATO et al. 1985). Aus dem Follikel isolierte Kaninchenoozyten konnten in einfachen Kulturmedien ihre Reifung abschließen (PINCUS u. ENZMANN 1935). WASSARMAN und ALBERTINI (1994) postulierten daher, dass die Arretierung der Meiose von inhibierenden Faktoren der somatischen Zellen des Follikels ausgeht. Trotz Ruhephase finden aber
Wachstum und Metabolismus statt, vergleichbar mit der G1-Phase des Zellzyklus somatischer Zellen (MOTLIK u. FULKA 1986). Die Meiose wird mit Einsetzen der Pubertät fortgesetzt, bedingt durch die Freisetzung der hypophysären Gonadotropine FSH und LH (DÖCKE 1994). Hierbei löst sich die Kernmembran der Oozyte auf (GVBD = germinal vesicle breakdown). Die gereifte Eizelle kann dann befruchtet werden und es kommt zur zweiten meiotischen Teilung. Parallel zum Wachstum der Oozyte erfolgt ein linearer Anstieg in der Synthese verschiedener Proteine (WASSARMAN et al. 1981).
Offensichtlich werden aber diese Proteine erst später bei der Maturation, Fertilisation und frühembryonalen Entwicklung benötigt (MOOR u. GANDOLFI 1987; MOTLIK u.
KUBELKA 1990). Die Glycoproteine, die für die Bildung und Funktion der Zona pellucida verantwortlich sind, wurden intensiv untersucht (WASSARMAN et al. 1981). Diese Proteine spielen bei der Fertilisation eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Polyspermieblocks. Die Zona pellucida stellt ein Maschenwerk aus den drei Glycoproteinen ZP 1, ZP 2, ZP 3 dar (KRUIP et al. 1983).
2.1.1 Oozytenreifung
2.1.1.1 Kern- und Zytoplasmareifung
Der eigentliche Prozeß der Oozytenreifung umfasst zwei interagierende Funktionsabläufe:
die Kernreifung und die zytoplasmatische Reifung (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Die Oozytenreifung umfasst den GVBD (Germinal vesicle breakdown), das Fortschreiten zur Metaphase I und die Arretierung in der Metaphase II. Diese Vorgänge werden vom
„Maturation Promoting Factor“ (MPF) und der MAP-Kinase (Mitogen Activated Protein) reguliert (GORDO et al. 2001).
Die Oozyten treten während der fetalen Entwicklung oder unmittelbar postnatal in die meiotische Teilung ein und durchlaufen die verlängerte Prophase der ersten Reifeteilung bis zum späten Diplotän. In diesem Stadium kommt es aus noch unbekannten Gründen zur Arretierung der meiotischen Teilung (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Diesen Vorgang bezeichnet man auch als „First meiotic arrest“ (GURAYA 1985). Diese Arretierung der
Meiose erfolgt durch eine Hemmung der cAMP-abhängigen Protein Kinase. Die inhibitorischen Faktoren werden von den Theka-Zellen freigesetzt und regulieren die cAMP-abhängige Protein Kinase in den Kumuluszellen (RICHARD et al. 1997). Die Kumuluszellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Germinal- Vesikel-Stadiums. Theka-Zellen sind in vitro in der Lage, die Meiose boviner Oozyten zu arretieren (RICHARD u. SIRARD 1996).
Erste charakteristische Veränderungen, die mit der präovulatorischen Wiederaufnahme der Meiose einhergehen, sind die Auflösung der Kernmembran (Germinal vesicle breakdown = GVBD), für die eine Proteinsynthese notwendig ist, und die Kondensation der Chromosomen. Für diese Vorgänge ist der „Maturation Promoting Factor“ (MPF) verantwortlich, der von anderen Faktoren reguliert wird (SIMON et al. 1989). Bei der Reifung boviner Oozyten kommt es zu spezifischen Veränderungen in der Synthese und der Phosphorylierung von Proteinen (KASTROP et al. 1990). Auch Phospholipide spielen eine Rolle bei der spontanen Wiederaufnahme der Meiose (HOMA et al. 1991).
Während der Metaphase I ordnen sich die homologen Chromosomen in der Äquatorialebene entgegengesetzt an und werden dann in der ersten Anaphase zum jeweils entgegengesetzten Pol gezogen. Nun folgt die Abschnürung des ersten Polkörpers in den perivitellinen Raum.
Im Ooplasma verbliebene Chromosomen ordnen sich erneut in Form einer Metaphasenplatte an und verbleiben in diesem als „Second meiotic arrest“ bezeichneten Zustand. Zum Zeitpunkt der erneuten Arretierung findet in vivo die Ovulation statt (HYTTEL et al. 1997). Eine entscheidende Rolle bei der Arretierung der Metaphase II in bovinen Oozyten spielt die Mitogen aktivierte Proteinkinase (MAPK), die auch die Aktivität des Maturation Promoting Factor aufrecht erhält. Wird die Aktivität der MAPK in vitro blockiert, kommt es zu einer mangelhaften Organisation der M II-Spindel (GORDO et al.
2001). MAPK und MPF werden ungefähr zur selben Zeit wie der GVBD aktiviert (WEHREND u. MEINECKE 2001). Bei der Maus erfolgt die Beeinflussung der Metaphasenspindel über das Protein SPIN. Hierbei handelt es sich um ein Substrat des Mos-MAP-Kinase-Weges. Die Phosphorylierung von SPIN ist essentiell für die Interaktion mit der Metaphasen-Spindel (OH et al. 1998). Die inaktive MAPK wird ebenfalls durch eine Phosphorylierung aktiviert. Diese Phosphorylierung wird in Ratten-Oozyten durch Protein Kinase C, cAMP und Protein Phosphatase Modulatoren reguliert. In porcinen Oozyten ist
die inaktive Form von MAPK im GV-Stadium (Germinal vesicle) nachweisbar, beim GVBD geht sie in die aktive Form über und verbleibt in dieser bis zum Ende der Maturation (SATO 1998). MAPK wird von verschiedenen Kinasen phosphoryliert, wobei aber das Protooncogen c-Mos die Hauptrolle spielt (NEBREDA u. HUNT 1993, POSADA et al.
1993; SAGATA et al. 1989).
MPF ist ein Komplex aus den Proteinen Cyclin B und der cyclin-dependent-Kinase cdk1 (p34cdc2). MPF wird auch als Histone H1-Kinase bezeichnet (LIU u. YANG 1999).
Oozytenreifung und Arretierung in der Metaphase II werden durch eine wechselnde MPF- Aktivität reguliert (WU et al. 1997). Die Aktivität von MPF wird durch eine Vielzahl von Faktoren reguliert. In murinen Oozyten spielt MPF sogar eine Rolle bei der fertilitätsinduzierten Ca2+-Oszillation (DENG u. SHEN 2000). Der Ca2+-Anstieg, ausgelöst durch das fertilisierende Spermium, trifft mit der Arretierung der Oozyten in der Metaphase II (FUJIWARA et al. 1993; MEHLMANN u. KLINE. 1994 ; JONES et al. 1995) und mit einem Anstieg des Inositol 1,4,5–tris-phosphate Receptors (IP3Rs) (MEHLMANN et al.
1996; HE et al. 1997) zusammen. IP3R ist ein bedeutender Faktor für die Ca2+-Oszillation.
Die Anzahl der IP3R ist wichtig für die meiotische Kompetenz von Oozyten (OZIL 1990;
COLLAS et al. 1993). Ein Molekül, das bei der Regulation der MPF-Aktivität in bovinen Oozyten beim Übergang von MI zu MII mitwirkt, ist die PI 3-kinase (Phosphatidylinositol 3-Kinase) (ANAS et al. 2000). Durch spezifische Inhibitoren der PI 3-Kinase kann der indirekte Beweis geliefert werden, dass die PI3-Kinase in der bovinen Oozyte eine Rolle beim Fortschreiten der Meiose über die Metaphase I hinaus spielt (ANAS et al. 1998). Ein Schlüsselfaktor für den Maturationsprozess bei Vertebraten ist das Molekül Mos. Hierbei handelt es sich um eine Serin-threonin-Kinase, die die MAPK-Kaskade aktiviert (GEBAUER u. RICHTER 1997). FISSORE et al. (1996) injizierten Mos-RNA, was zu einem rapiden Anstieg der MAPK-Aktivität führte. Daraus resultierte eine Beschleunigung des GVBD und die Wiederaufnahme der Meiose. Diese Versuche zeigten, dass die MAPK- aktivierte Kaskade von Mos wesentlich initiiert wird.
Mos ist ein Produkt des C-mos-proto-oncogen und wird in bovinen Oozyten im M II- Stadium synthetisiert. Wenn die Oozyten die Fähigkeit zur Synthese von Mos verlieren, scheint der optimale Zeitpunkt zur Fertilisation vorzuliegen (WU et al. 1997). Ein wichtiges Kriterium für die Wiederaufnahme der Meiose in bovinen Oozyten ist die Menge des Cyclin
B (LEVESQUE u. SIRARD 1996). In der Interphase ist die Syntheserate von Cyclin B höher als die Abbaurate. Cyclin B lagert sich mit p34cdc2 zum Prä-MPF zusammen. Prä- MPF wird zu MPF aktiviert und die durch MPF aktivierten Enzyme bauen unter anderem auch Cyclin B ab, so dass gleichzeitig die Inaktivierung von MPF eingeleitet wird (NIEMANN u. MEINECKE 1993). KUBELKA et al. (2000) stellten fest, dass für die Chromosomen-Kondensation während der ersten Meiose in bovinen Oozyten keine Aktivität von p34cdc2-Kinase und MAP-Kinase erforderlich ist. Bei der Metaphase II und beim „second meiotic arrest“ zeigen beide Kinasen volle Aktivität. YOSHIDA et al. (2000) verglichen molekulare Mechanismen der Oozytenreifung in Amphibien und veröffentlichten ein Modell über die Initiation der Oozytenreifung (siehe Abbildung 1).
Als Faktoren, die eine Wiederaufnahme der Meiose induzieren können, wurden verschiedene Sterole isoliert und charakterisiert (BYSKOV et al. 1997). Diese Sterole befinden sich in der Follikelflüssigkeit und werden als FF-MAS (Follicular fluid Meiosis- activating-Sterol) bezeichnet. FF-MAS stimuliert in vitro die Maturation humaner Oozyten.
MAS besitzt einen positiven Einfluss auf die Kernreifung (GRONDAHL et al. 2000). FSH und Amphotericin B (Induktion von MAS) können die Wiederaufnahme der Meiose in murinen Oozyten einleiten, sind aber sehr wahrscheinlich von der Akkumulation von MAS in der Oozyte abhängig. MAS spielt also eine physiologisch relevante Rolle als Auslöser der Wiederaufnahme der Meiose (LU et al. 2000). Eines der ersten elektronenmikroskopisch wahrnehmbaren Anzeichen der Zytoplasmareifung ist die Vergrößerung des perivitellinen Spaltraumes, die vermutlich auf eine Kontraktion des Ooplasmas zurückzuführen ist (NIEMANN u. MEINECKE 1993).
Eine weitere strukturelle Veränderung ist die perlschnurartige Aufreihung der kortikalen Granula an der Peripherie des Oolemms. Diese Lokalisation an der Peripherie spielt eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung des Polyspermieblocks. Ihr Auftreten erfolgt 21-22 Stunden nach dem LH-Peak (KRUIP et al. 1983; CRAN et al. 1989; HYTTEL et al. 1989).
Als ein entscheidendes Reifungskriterium ist die Expansion des Kumulus zu betrachten. Die Expansion wird in vivo durch einen leichten FSH-Anstieg ausgelöst, der den präovulatorischen LH-Peak begleitet. Aufgrund des FSH-Anstiegs sezernieren die Kumuluszellen Hyaluronsäure (BALL et al. 1983; EPPIG 1991). Vermutlich wird der
Einfluss des FSH auf die Kumuluszellen durch den Second messenger cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat) vermittelt.
Die „Gap junctions“ zwischen der Oozyte und den Zellen der Corona radiata werden ca. 10 Stunden nach LH-Peak gelöst. Ein vollständiger Abschluss der Kumulusexpansion erfolgt nach ca. 15 Stunden nach dem LH-Peak (HYTTEL et al. 1989). Die Kumuluszellen sezernieren Faktoren, die die Auflösung der „Gap junctions“ und die Kumulusexpansion regulieren (ISOBE und TIRADA 2001). Durch die Expansion erhalten die Kumulus- Oozyten-Komplexe eine erhöhte Viskosität, was die Aufnahme in den Fimbrientrichter und den Eileitertransport erleichtert (FIRST u. PARRISH 1987). Bei der Befruchtung stellt eine nicht erfolgte Expansion des Kumulus ein erhebliches mechanisches Hindernis für die Spermien dar (BEDIRIAN et al. 1975).
Modell für die Initiation der Oozytenreifung in Amphibien (nach YOSHIDA et al.
2001):
c-MOS-mRNA MOS MAPK
Progesteron Prä-MPF
Cyclin-BmRNA CycB MPF
Cdc2
Abbildung 1: Die Cyclin B-Synthese wird durch Progesteron induziert und ist unersetzlich für den Beginn der Oozyten-Reifung bei allen Amphibien (YAMASHITA et al. 1995). MPF wird durch eine Stimulation der Cyclin-B-Synthese gefördert (BALLANTHYNE et al.
1997; DE MOOR u. RICHTER 1997, 1999; YAMASHITA 1998). Die Aktivität von Prä- MPF erleichtert die Maturation. Diese Aktivität wird durch die Cyclin-B-Synthese initiiert.
Der MOS/MAP-Kinase-Weg fördert diese Reaktion durch Akkumulierung von Cyclin B, durch Stimulation der Translation und Stabilisierung des Proteins (YOSHIDA et al. 2000).
2.1.1.2 Oozytenreifung bei präpuberalen Rindern
Die Reifungskompetenz von Oozyten präpuberaler Rinder ist gegenüber Oozyten adulter Tieren wesentlich geringer. SALAMONE et al. (2001) verglichen in vitro die Reifung zwischen Oozyten präpuberaler und adulter Donoren. Die Aktivität von MPF und MAPK und IPR3 war in Kälberoozyten signifikant niedriger als in adulten Oozyten. Dies unterstützt die Hypothese, dass die reduzierte Entwicklungskapazität präpuberaler Oozyten auf der Unfähigkeit beruht, die zytoplasmatische Reifung vollständig zu durchlaufen. In vitro wurde bei Kälberoozyten während der ersten drei Stunden der Maturation eine geringere Metabolisierung von Glutamin und Pyruvat gemessen als bei Oozyten adulter Rinder. Erst nach 24 Stunden wurde das gleiche Niveau wie bei adulten Oozyten erreicht. Ein signifikanter Abfall der Proteinsynthese wurde bei juvenilen Oozyten schon nach 9 Stunden beobachtet, während er bei adulten Oozyten erst nach 24 Stunden einsetzte (GANDOLFI et al. 1998). Die Konzentrationen der für die Maturation benötigten Kinasen H1 und MAP steigen während der Maturation an. Dieser Anstieg tritt auch bei Oozyten präpuberaler Spender auf, jedoch liegt die Gesamtaktivität nur bei 50 % der Konzentration von adulten Tieren (DAMIANI et al. 1998). KHATIR et al. (1998) beobachteten nur geringe Unterschiede zwischen der Qualität und Quantität der synthetisierten Proteine von Kälbern und Kühen, dagegen fanden sie einen deutlichen Unterschied im Ablauf der Kernreifung.
Nach 20 Stunden In-vitro-Kultur war die Anzahl der Oozyten adulter Spender, die die Metaphase II erreicht hatten, signifikant höher als bei den Kälberoozyten. DRIANCOURT et al. (2001) stellten fest, dass die Follikelflüsssigkeit von Kühen quantitativ mehr Proteine synthetisiert als die von drei Monate alten Kälber. Sie schlossen daraus, dass dieser quantitative Proteinmangel mitverantwortlich für die geringere Reifung der Oozyten und Follikel ist.
MAJERUS et al. (1999) stellten bei präpuberalen Kälbern einen Zusammenhang zwischen Oozytendurchmesser und Reifungskompetenz fest. 30 % der Oozyten mit einem
Durchmesser zwischen 110 und 119 µm entwickelten sich bis zum Stadium der Metaphase II Oozyten mit einem geringeren Durchmesser als 110 µm entwickelten sich nicht bis zur Metaphase II, während 55 % der Oozyten mit einem größeren Durchmesser als 120 µm sich bis zu diesem Stadium entwickelten. Die bovine Oozyte erhält mit einem Durchmesser von ca. 100 µm die Kompetenz zur Fortsetzung der Meiose (FAIR et al. 1995). Mit ca. 110 µm ist sie in der Lage, die meiotische Reifung abzuschließen. Kälberoozyten sind im Durchschnitt signifikant kleiner als Oozyten von adulten Tieren (DUBY et al. 1996).
Oozyten mit einem kleineren Durchmesser als 120 µm können die Maturation nicht vollständig durchlaufen, da vermutlich wesentliche Schritte der mRNA- und Proteinsynthese unvollständig ablaufen (SATO et al. 1990).
2.2 Follikulogenese
Die Follikelentwicklung ist eng mit der Oogenese verknüpft und vollzieht sich wie die Oozytenentwicklung in verschiedenen Stadien.
2.2.1 Morphologie der Follikelentwicklung
Die Follikulogenese beginnt mit der Entwicklung der Primordialfollikel in den Ovarien, wobei jeder Follikel aus einer Oozyte in der ruhenden Prophase I der Meiose besteht und umgeben ist von einschichtigen, undifferenzierten und flachen Granulosazellen (ERICKSON 1986). Die ersten wachsenden Follikel erscheinen auf dem fetalen Ovar um den 180. Tag der Trächtigkeit und bestehen hauptsächlich aus primären und sekundären Follikeln. Einige antrale Follikel sind bereits um den 220. Tag der Gravidität erkennbar (WANDJI et al. 1992). Zum Zeitpunkt der Geburt ist der Pool an Primordialfollikeln vollständig ausgebildet. In dieser Form kann der Follikel jahrelang verharren, bis er unter Gonadotropineinfluss in seine Wachstumsphase eintritt, die parallel zur Oogenese verläuft.
Die Follikelreifung ist ein dynamischer Prozeß, bei dem sich ständig Primordialfollikel zu vesikulären Stadien entwickeln (SCHNORR 1989). Vom Primordialfollikel erfolgt die Entwicklung ins Stadium des Primärfollikels. Diese Form ist charakterisiert durch ein
einschichtig-kubisches Follikelepithel. In dieser Phase lassen sich bereits FSH-Rezeptoren an den Granulosazellen nachweisen (AMSTERDAM u. ROTTMENSCH 1987). Die geringe Anzahl an Primärfollikeln läßt vermuten, dass dieses Stadium nur wenige Tage andauert (MOSIMANN u. KOHLER 1990). Die Oozyte des Primärfollikels ist in diesem Zustand eine der am wenigsten stoffwechselaktiven Zellen des Organismus (Mc LAREN 1982).
Aufgrund mitotischer Teilungen wird das Follikelepithel mehrschichtig und der Follikel wird als Sekundärfollikel bezeichnet. Die Epithelzellen sind mehrlagig, in der Form polyedrisch und sehr kernreich. Nur die innerste Schicht, die man als „Stratum granulosum“
bezeichnet, besitzt eine hochprismatische Form. Die umgebenden Granulosazellen haben ein strahlenförmiges Aussehen und werden deshalb als Corona Radiata bezeichnet (MOSIMANN u. KOHLER 1990). Die Zona pellucida entsteht zwischen Granulosazellen und Oozyte durch Proteine, die von der Oozyte sezerniert werden (BLEIL u.
WASSARMAN 1980). Nach Bildung der „Theca folliculi“ geht der Follikel ins Stadium des Tertiärfollikels über; es entsteht ein mit Liquor gefüllter Hohlraum, den man als Antrum bezeichnet (ERICKSON et al. 1985). Die Flüssigkeit des Antrum enthält verschiedene gelöste Stoffe wie Hyaluronsäure, Steroidhormone und proteolytische Enzyme (MOSIMANN u. KOHLER 1990). Die Größe des Follikels beträgt zu diesem Zeitpunkt 140 bis 280 µm (LUSSIER et al. 1987). Die „Theca folliculi“ ist zweilagig und besitzt eine
„Theca interna“ und „externa“. Die Granulosazellen der Theca differenzieren sich zu einem wandständigen „Stratum granulosum“ und den Kumuluszellen, die die Oozyte vielschichtig umgeben. Zwischen diesen Schichten und der Oozyte bestehen „Gap junctions“, die einen wichtigen Bestandteil der Zellkommunikation darstellen (EPPIG 1991). Ein früher antraler Follikel benötigt etwa 40 Tage für die Entwicklung zum präovulatorischen Follikel (LUSSIER et al. 1987). An den Thekazellen des späten Sekundär- und des frühen Tertiärfollikels lassen sich erstmals LH-Rezeptoren nachweisen (AMSTERDAM u.
ROTTMENSCH 1987).
Parallel zur Flüssigkeitsansammlung erfolgt die Entwicklung zum reifen oder Graafschen Follikel mit einem Durchmesser von bis zu 28 mm. Innerhalb der Granulosazellen sind zwei morphologisch unterschiedliche Untereinheiten erkennbar: die wandständigen Granulosazellen, die die Follikelwand auskleiden, und die Granulosazellen des Cumulus oophorus, die die Eizelle umgeben (EPPIG 1991; HSUEH et al. 1984). Unter Einfluss des
FSH-Anstieges sezernieren Kumuluszellen Hyaluronsäure, was zu einer Erweiterung der Zellzwischenräume führt (EPPIG 1991). Diesen Vorgang bezeichnet man als Kumulusexpansion, weil sich die Corona radiata als eine wolkig aufgelockerte Struktur darstellt (SCHELLANDER et al. 1989; SUZUKI et al. 1996). Etwa 28 bis 30 Stunden nach dem LH-Anstieg findet beim Rind die Ovulation statt (NIEMANN u. MEINECKE 1993).
Die Mitoserate der Granulosazellen sinkt und die Kerne der Kumuluszellen werden pyknotisch (CHANG et al. 1978). Durch erhöhte Produktion von „Liquor folliculi“ nimmt das Follikelvolumen zu. Der Follikel verlagert sich an die vorwölbende Oberfläche des Eierstocks. Dieser umschriebene Bereich wird auch als Stigma bezeichnet. In der Gefäßschicht der „Theca interna“ kommt es zunächst zu einer Vasokonstriktion mit erhöhter Kapillarpermeabilität, die nachfolgende Vasodilatation führt zur lokalen Ischämie. Dieser Vorgang schafft die Vorausetzungen für die gewebeaufweichende Wirkung der Kollagenasen der Follikelflüssigkeit. Histamin wird infolge entzündlicher Infiltrate von Leukozyten ausgeschüttet (MOSIMANN u. KOHLER 1990). Der Nachweis von Entzündungszellen in der Granulosazellschicht sowie die Produktion von Prostaglandin E2
und F2a und des Zytokins Interleukin 1 sprechen für eine entzündungsähnliche Reaktion (DE LOOS et al. 1991; KOKIA et al. 1992; ESPEY 1994). Eine schematische Darstellung der Follikelentwicklung ist in Abbildung 2 gegeben.
Abbildung 2: Schematische Abbildung der Follikelentwicklung und eines Tertiärfollikels modifiziert nach HAFEZ (1993).
2.2.2 Hormonelle Regulation des Follikelwachstums bei Wiederkäuern
Die Gonadotropine FSH (Follikel stimulierendes Hormon) und LH (Luteinisierendes Hormon) werden im Hypophysenvorderlappen gebildet. Ihre Freisetzung erfolgt durch Ausschüttung von GnRH (Gonadotropin Releasing Hormon), das aus dem Hypothalamus stammt. Gonadotropine sind hochmolekulare Glykoproteide mit einem Zuckeranteil zwischen 10 und 50 % (FORTH et al. 1987). Das Molekulargewicht wird für FSH speziesabhängig mit 30000-70000 und für LH mit 26000-30000 angegeben (GRUNERT u.
BERCHTOLD 1995). FSH und LH bestehen jeweils aus zwei Ketten, die man jeweils als α- und ß-Untereinheit bezeichnet, wobei die α–Untereinheit derselben Spezies identisch ist, während die ß-Untereinheit für die hormonspezifische Wirkung verantwortlich ist (PIERCE u. PARSONS 1982). Die Gonadotropine fördern das Follikelwachstum und die Antrumbildung durch Induktion der Zellteilung der Granulosazellen sowie durch Erhöhung des intraovariellen Blutdrucks (GREENWALD u. ROY 1994). Ferner regulieren sie die Steroidbiosynthese. FSH stimuliert die Östrogensynthese und bewirkt die Ausbildung von Östrogenrezeptoren (RICHARDS u. BOGORICH 1981; GORE-LANGTON u.
ARMSTRONG 1988). Unter LH-Einfluss wird in den durch LH-Rezeptoren sensibilisierten Zellen der Theca interna aus Cholesterin Androstendion synthetisiert (HANSEL u.
CORVEY 1983).
Lange Zeit ging man davon aus, dass die hormonelle Regulation des Follikelwachstums ausschließlich von Gonadotropinen gesteuert wird. Heute weiß man, dass am Wachstum von Oozyte und Follikel zahlreiche autokrine und parakrine Mediatoren beteiligt sind. Der
„Transforming Growth factor α“ (TGF α), ein Strukturanalogon zum Epidermal Growth factor, wird in bovinen Thekazellen exprimiert und stimuliert die Proliferation kleiner Follikel in einer Phase, in der Gonadotropine noch keinen Einfluss haben. In vitro besteht zwischen Insulin und TGF α eine Interaktion, die Proliferation und Differenzierung der Granulosazellen stimuliert (CAMPBELL et al. 1996). TGF α wird in vivo von großen bovinen Follikeln produziert und hemmt lokal die Östradiol-Synthese der Granulosazellen.
DERRAR et al. (2000) steigerten in vitro den Anteil der Primärfollikel durch Zugabe von TGF α und zeigten damit, dass TGF α eine wichtige Rolle in der Regulation des Primärfollikels spielt. In vitro verändert die Zugabe von IGF-I (Insulin-like Growth factor),
EGF (Epidermal Growth factor), bFGF (basischer Fibroblast Growth factor) und TGF-ß die Aktivität der Primärfollikel, während die Morphologie der Primär-und Sekundärfollikel unbeeinflusst bleibt. TGF ß und Aktivin stimulieren die zelluläre Differenzierung mit der Produktion von Östrogen und Inhibin (FRANCHIMONT 1992). Der Einfluss auf das Wachstum durch Gonadotropine beginnt erst im Stadium des Sekundärfollikels.
Entsprechende Rezeptoren wurden jedoch schon in Granulosazellen von Primärfollikeln nachgewiesen ( AMSTERDAM u. ROTTMENSCH 1987). EGF (Epidermal Growth Factor) stimuliert in vitro bei bovinen Oozyten allein oder zusammen mit IGF I die Kumulusexpansion und fördert die Kernreifung (LORENZO et al. 1994).
GH (Growth Hormone = Wachstumshormon) ist ein Hypophysenhormon, das Wachstum, Metabolismus, Laktation und Reproduktion beeinflusst. In Wiederkäuern ist das in der Leber gebildete IGF-I (Insulin like Growth factor I) in erster Linie als Mediator für die Wirkung von Growth Hormone verantwortlich. IGF-I ist ein mitogenes Polypeptid (CHAKRAVORTY et al. 1993). Es wird in der Leber und im Ovar synthetisiert (LUCY et al. 1999). IGF-I spielt bei der Follikelregulation eine zweifache Rolle: Erstens agiert IGF-I zusammen mit FSH als autokriner Regulator des Granulosazellwachstums, zweitens reguliert IGF-I als parakriner Regulator die Proliferation der Kumuluszellen in kleinen antralen Follikeln (ARMSTRONG et al. 1996). Beim Rind sinkt die IGF-I-Produktion der Granulosazellen in Anwesenheit von Insulin, EGF, Östradiol und bFGF signifikant ab (SPICER u. CHAMBERLAIN 2000). IGF-II scheint keine physiologische Wirkung auf die Ovarfunktion zu besitzen (EINSPANIER et al. 1993).
FGF ist zusammen mit VEGF (Vascular endothelial Growth factor) an der Proliferation der Kapillaren beteiligt, die begleitend bei der Selektion der präovulatorischen Follikel stattfindet; ferner unterstützen FGF und VEGF das Wachstum des dominanten Follikels (BERISHA et al. 2000). Interaktionen zwischen bFGF, EGF, Insulin und und IGF-I spielen eine erhebliche Rolle in der basalen und LH-modulierten Steroidogenese und Mitogenese während der Follikelentwicklung beim Rind (SPICER u. STEWART 1996).
Ein weiterer Mediator bei der hormonalen Regulation des bovinen Ovars ist HGF (Hepatocyte Growth factor). Er wird in den Theka-Zellen produziert und spielt eine entscheidende Rolle bei der hormoninduzierten Granulosazellproliferation. HGF stimuliert direkt die Proliferation, indirekt inhibiert HGF verschiedene Funktionen der
Granulosazellen (PARROTT u. SKINNER 1998). Ebenfalls wird KGF (Keratinocyte Growth Factor) in den Thekazellen produziert. Als parakriner Mediator stimuliert KGF das Wachstum der Granulosazellen. KGF steigert das Niveau der basalen und FSH-stimulierten Aromatase-Aktivität in bovinen Granulosazellen. Östrogen und LH stimulieren das Follikelwachstum zum Teil durch eine gesteigerte lokale Produktion von KGF (PARROTT u. SKINNER 1998). Eine bedeutende Rolle als lokaler Wachstumsfaktor bei der Kontrolle der Proliferation des Oberflächenepithels des Ovars spielt Kit Ligand (KL). KL stimuliert das Oberflächenepithel des Ovars in ähnlicher Weise wie EGF (PARROTT et al. 2000). KL wird in Granulosazellen produziert und steigert in vitro die Anzahl der Thekazellschichten primärer Follikel (PARROTT u. SKINNER 2000).
Inhibine sind heterodimere Glykoprotein-Hormone. Inhibin A besteht aus einer α- Untereinheit und einer ßA-Untereinheit; Inhibin B besteht aus einer α-Untereinheit und einer ßB-Untereinheit (VALE et al. 1988). Die Hauptquelle biologisch aktiven Inhibins bei nicht trächtigen Wiederkäuern liegt in den Granulosazellen der Ovarfollikel (FINDLAY et al. 1991). Bei Schafen stimuliert Inhibin A die Gonadotropin-induzierte Steroidproduktion der Granulosa- und Thekazellen. Durch Behandlung mit Inhibin-Antiserum kann die FSH- stimulierte Östrogenproduktion verhindert werden. CAMPBELL und BAIRD (2001) schlossen daraus, dass Inhibin A einen Marker für die Reaktion der Granulosazellen für die FSH-stimulierte Zelldifferenzierung darstellt. Auf die Anzahl der Granulosa- und Thekazellen nimmt es keinen Einfluss (CAMPBELL et al 1999).
Aktivine sind dimere Glykoprotein–Hormone, die aus zwei Inhibin-ß-Untereinheiten bestehen (VALE et al. 1988). Aktivin ist ein Granulosazellprodukt (FINDLAY et al.1990).
Es kann aus der Follikel-Flüssigkeit isoliert werden, als ein Faktor, der die FSH-Freisetzung aus der Hypophyse stimuliert. Aktivin kann in vitro in der Anwesenheit von Insulin die Anzahl der Granulosazellen steigern. Dieser Vorgang kann durch Follistatin, ein Activin- Binding-Protein, blockiert werden (LI et al. 1995). Aktivin ist ein intragonadaler Faktor, der in vivo während der präantralen und frühen antralen Stufen der Follikulogenese Gonadotropine moduliert und Zellfunktionen reguliert (SMITZ et al. 1998). In der präantralen Follikulogenese steigert Aktivin die Anzahl der FSH-Rezeptoren in Abwesenheit von FSH (FINDLAY et al. 1993). Follistatin (ein FSH-unterdrückendes Protein) besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette, die erstmals bei der Reinigung von
Inhibin aus boviner Follikular-Flüssigkeit isoliert wurde (ROBERTSON et al. 1987). Es kann die Wirkung von Aktivin an undifferenzierten Granulosazellen aufheben. Die Aromatase-Aktivität wird gehemmt und die Stimulation der FSH-Rezeptor-Synthese durch Aktivin unterbunden (XIAO et al. 1990; XIAO u. FINDLAY 1991). Follistatin ist an der Luteinisierung des dominanten Follikel und der Atresie der restlichen Follikel beteiligt (FRANCHIMONT 1992). GONG et al. (1991) untersuchten einen möglichen Effekt von rbSt (rekombinanten bovinen Somatotropin) auf die Follikulogenese. Färsen, die mit rbSt behandelt wurden, hatten signifikant mehr antrale Follikel als die Tiere der Kontrollgruppe.
SPICER und STEWART (1996) stellten fest, dass pharmakologische Dosen von rbST die Östradiolsynthese der Granulosazellen bei Rindern reduzierten, während physiologische Dosen von rbSt die Steroidsynthese der Thekazellen förderte. Daraus schlossen sie, dass rbSt keine entscheidende Rolle bei der Funktion der Granulosazellen spielt, wohl aber bei der Funktion der Thekazellen.
2.2.3 Follikeldynamik bei adulten Tieren
Die Follikeldynamik verläuft beim Rind wellenförmig, wobei jede Welle in drei Phasen unterteilt wird: a) Rekrutierungsphase, b) Selektionsphase, c) Dominanzphase. Der Zyklus eines Rindes besteht aus zwei oder drei Wellen von Follikelwachstum. Zwischen der Dauer des östrischen Zyklus und der Anzahl der Follikelwellen besteht eine positive Korrelation (ADAMS 1999). Bei einem Zwei-Wellenzyklus (Ovulation = Tag 0) erfolgt die zweite Welle um den Tag 10 herum, während bei einem Drei-Wellenzyklus die zweite Welle etwa an Tag 9 und die dritte Welle etwa an Tag 16 erfolgt (GARCIA et al. 1999). Auch bei präpuberalen und trächtigen Rindern verläuft das Follikelwachstum wellenförmig (ROCHE u. BOLAND 1991). Trächtigkeit, die präpuberale Periode und der saisonale Anöstrus sind charakterisiert durch eine reguläre, periodische Ausschüttung von FSH und das Auftauchen anovulatorischer Follikelwellen. Jede Welle beginnt mit der Rekrutierung eines Pools wachsender Follikel, von denen letztlich nur einer, der dominante Follikel, sein Wachstum fortsetzt. Das Auftauchen einer neuen Follikelwelle ist mit einer periodischen Ausschüttung von zirkulierendem FSH verknüpft (ADAMS 1999). An der Selektion des dominanten
Follikels sind verschiedene Mediatoren beteiligt. Inhibin ist an der Unterdrückung der FSH- Sekretion in der Wachstumsphase des dominanten Follikels während der frühen Lutealphase beteiligt (KANEKO et al. 1997). Bei bovinen Follikeln sind Rekrutierung und Selektion mit einer vermehrten Expression der mRNA für LH-Rezeptoren und die Aromatase in den Granulosazellen verbunden (BAO et al. 1997). Selektion und Dominanz hängen stark von der Androgenproduktion der Thekazellen und der Aromatisierung des Androgens zu Östradiol durch die Granulosazellen ab (FORTUNE 1994). Beim dominanten Follikel der ersten Welle wird die Kapazität, Östradiol zu produzieren, gesteigert und die Konzentation an IGF-Binding-Protein wird auf einem niedrigen Niveau gehalten (AUSTIN et al. 2001).
Eine fortschreitende pulsatile Ausschüttung von LH ist wesentlich für die Unterstützung der Endphase des dominanten Follikelwachstums. Androgene und Östradiol spielen eine entscheidende Rolle in der Kontrolle der FSH-Sekretion während des wellenförmigen Follikelwachstums. Parallel zum Wachstum des dominanten Follikels kommt es zu einem Anstieg der Sekretion von Androgen und Östradiol (EVANS et al. 1997). Progesteron unterdrückt die LH-Sekretion und das Wachstum des dominanten Follikels (ADAMS 1999).
Während der verschiedenen Stufen der ersten Follikelwelle kommt es zu einem Anstieg der mRNA-Expression des LH-Rezeptors, während die Expression von FSH-Rezeptor-mRNA konstant bleibt (XU et al. 1995). Beim Rind führt der LH/FSH-Anstieg zu einem schnellen Absinken der Androgen- und Östradiol-Produktion und zu einem starken Anstieg der Progesteron und Oxytocin-Biosynthese (BERNDTSON et al.1995).
2.2.4 Follikeldynamik bei Kälbern
Bereits bei zwei Wochen alten Kälbern wurde ein wellenförmiges Follikelwachstum beobachtet (EVANS et al. 1994). Der Beginn einer neuen Welle ist durch einen FSH- und LH-Anstieg gekennzeichnet, aber ohne exogene Applikation von LH findet keine Ovulation statt. ADAMS et al. (1994) beobachteten präpuberale acht Monate alte Rinder sonographisch und konnte bei allen Tieren drei anovulatorische Wellen innerhalb eines Zyklus feststellen. Die Anzahl der Follikel erreicht im 4-6 Monat ihr Maximum, verringert sich bis zum achten Monat und bleibt von diesem Zeitpunkt an etwa konstant. Kälberfollikel
mit einem kleineren Durchmesser als 9 mm produzieren nur wenig Östradiol. Ferner ist die Aromatase-Aktivität der Granulosazellen sehr niedrig. In der Follikelflüssigkeit der Kälber sind zwar die beiden wichtigsten Inhibin-Formen (α und β) enthalten, aber eine 34 kDa Inhibin α-Form fehlt. Die Menge dimerischen Inhibins ist zwar zwischen Kühen und Kälbern ähnlich, Kälberfollikel enthalten aber mehr Aktivin (DRIANCOURT et al. 2001).
Zwischen der Konzentration von Östradiol und der Anzahl an ovulierenden Follikeln besteht bei Kälbern eine positive Korrelation (TESTART et al. 1977). EVANS et al. (1994) stellten bei Hereford-Kälbern fest, dass die erste Ovulation im Durchschnitt im Lebensalter von 56 Wochen eintrat. Das Durchschnittsgewicht betrug 391,9 kg. Auf die erste Ovulation folgte ein Zyklus von durchschnittlich nur 7,7 Tagen, an den sich ein Zyklus von normaler Länge (20,3 Tagen) anschloss.
2.3 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen
2.3.1 Methoden zur Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen
Bei der Gewinnung von Oozyten wird zwischen Post-mortem- und In-vivo-Methoden unterschieden. Post mortem ist das sogenannte „Slicing“ oder „Surface dissection“, eine effektive und gebräuchliche Methode. Verwendet werden Ovarien, die auf einem Schlachthof gesammelt wurden. Mit einem Vielklingenmesser, unter Verwendung von Kürschnerklingen, schneidet man sowohl längs als auch quer über die Ovaroberfläche. Die auslaufende Follikelflüssigkeit mit den darin enthaltenen KOK wird in einer Petrischale aufgefangen. Eine weitere Vorgehensweise bei Schlachthofovarien zur Gewinnung von Oozyten stellt die Follikelaspiration dar. Hierbei werden die Follikel mit einer Kanüle gezielt angestochen, und die Follikelflüssigkeit wird mit einer Vakuumpumpe oder einfach nur mit einer Spritze abgesaugt. In der Regel kommen Kanülen von einer Stärke von 18 G zum Einsatz. Bei Verwendung einer Vakuumpumpe liegt der Druck im Allgemeinen zwischen 50 und 120 mm HG (ECKERT 1994).
Bei der In-vivo-Gewinnung werden die Laparatomie, Laparoskopie und die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion, die man auch als OPU (Ovum pick up) bezeichnet,
unterschieden. Zunächst war die am häufigsten verwendete Methode die Laparatomie.
GREVE et al. (1984) führten diese Methode bei Jungrindern von der Linea alba durch. Ein günstigerer Zugang zu den Ovarien ist die Hungergrube (Fossa paralumbalis). Vorteil dieser Methode ist, dass sie mehrfach und auch bei trächtigen Tieren im ersten Drittel der Gravidität angewendet werden kann (SIRARD et al. 1985; RYAN et al. 1993).
TECHAKUMPHU et al. (2000) führten eine Laparotomie in der Linea alba bei präpuberalen Büffeln durch. Die Tiere wurden mit FSH und GnRH stimuliert. Bei der Punktion wurden im Durchschnitt 9,0 KOK pro Tier pro Punktion gewonnen, was einer Wiederfindungsrate von 56,3 % entsprach. Einen Monat später erhielten die Tiere eine erneute Stimulation mit PMSG und GnRH. Hierbei wurden durchschnittlich 8,4 KOK pro Tier pro Punktion bei einer Wiederfindungsrate von 51,9 % erzielt. DAHLHAUSEN et al.
(1981) setzten die Laparoskopie bei 2,5 Monate alten Kälbern zur Gewinnung von KOK ein. Nach In-vitro-Maturation erreichten 40-50 % der gewonnenen KOK die Metaphase II.
IVF wurde nicht durchgeführt. 1987 gewannen DUBY und ROBL durch Laparatomie Oozyten von superovulierten Kälbern und fanden nach IVF bei 56 % der KOK zwei Vorkerne. Diese Versuche zeigten, dass Kälber als Donoren entwicklungskompetenter Oozyten dienen können. Für die laparoskopische Gewinnung von Oozyten sind verschiedene Verfahren beschrieben worden. Der am häufigsten verwendete Zugang ist die
„Fossa paralumbalis“ (LAMBERT et al. 1983). Hierbei wird zunächst die Bauchwand mittels eines Trokar durchstoßen, um einen Zugang für das Endoskop zu erhalten. Die Fixierung der Eierstöcke erfolgt durch eine Fasszange. Unter Sichtkontrolle durch das Endoskop werden die Follikel punktiert und unter Verwendung eines Vakuums abgesaugt.
LAZZARI et al. (1996) konnten bei zwei bis drei Monate alten, mit eCG stimulierten Kälbern, 25 KOK aus 44 Follikeln gewinnen. TANEJA et al. (2000) führten eine Laparoskopie bei zwei bis drei Monate alten, mit Gonadotropin behandelten Kälbern durch und wiederholten diesen Vorgang im Alter von vier bis fünf Monaten. Sowohl bei der ersten als auch bei der zweiten Punktion verdoppelte sich nach der Stimulation die Anzahl der Follikel.
Trotz guter Ergebnisse sind sowohl Laparatomie als auch Laparaskopie wegen ihres hohen Aufwandes nur schwer durchführbar. Ferner erfüllen sie nicht den Anspruch, häufig wiederholbar und minimal invasiv zu sein (RATH 1993).
2.3.2 Die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion
Eine Alternative zur Laparoskopie und Laparatomie ist die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion (PIETERSE et al. 1991). Die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion, auch als OPU (Ovum pick up) bezeichnet, ist eine Alternative zum herkömmlichen Embryotransfer, insbesondere bei Tieren, bei denen nur wenige Embryonen gewonnen wurden (LOONEY et al. 1994; ROSCHLAU et al. 1997;
KLOSSOK 1997). Ferner bietet OPU die Möglichkeit, auch von präpuberalen Kälbern Oozyten zu gewinnen, was das Generationsintervall verkürzen und den züchterischen Fortschritt beschleunigen kann (LOONEY et al 1995; RICK 1996, KUWER 1997, FRANK 1999). Auch bei trächtigen Kühen ist OPU erfolgreich angewendet worden (BUNGARTZ et al. 1995; MEINTJES et al. 1995; REINDERS u. VAN WAGTENDONK-DE LEUW 1996;
ROSCHLAU et al. 1999; EIKELMANN 1999).
CALLESEN et al. (1987) beschrieben erstmalig eine Ultraschall geleitete Punktionsmethode. Die Ovarien wurden rektal per Hand fixiert und in die Nähe des von außen in der „Regio sacroischiadiaca“ angelegten Ultraschallkopfes gebracht. Von außen wurde dann nach Gabe eines Lokalänästheticums das Ovar mittels einer Nadel transcutan punktiert. PIETERSE et al. (1988) adaptierten das in der Humanmedizin eingesetzte Ovum pick up (OPU) bzw. die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion an die anatomisch-physiologischen Gegebenheiten des Rindes. Hierbei wird das Ovar rektal fixiert und der Ultraschallkopf mittels eines Sondenträgers transvaginal eingeführt. Die Punktion erfolgt unter Ultraschallkontrolle durch das Scheidendach. Die Punktionsnadel sitzt auch im Sondenträger und kann mittels einer Punktionsstange vor- und zurückbewegt werden. Die Aspiration der Follikelflüssigkeit erfolgt durch eine Vakuumpumpe. SANTL et al. (1998) verglichen die Laparoskopie mit der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion.
Die Anzahl der Oozyten der Kategorie I war bei der Laparoskopie signifikant niedriger. Bei der darauffolgenden In-vitro-Maturation und -Fertilisation waren die Teilungs- und Blastozystenraten ebenfalls signifkant niedriger. Diese Ergebnisse zeigten, dass für die In-vivo-Gewinnung von Oozyten die transvaginale Follikelpunktion nicht nur wegen der Stressminimierung für das Tier, sondern auch wegen der besseren Ergebnisse die Methode der Wahl darstellt.
Ein limitierender Faktor bei der Nutzung präpuberaler Kälber ist - neben der individuellen körperlichen Entwicklung des Tieres - die Größe des Punktionsgerätes. In Mariensee wurde ein Punktionsgerät entwickelt und eingesetzt, mit dem 5-6 Monate alte Kälber der Rasse HF punktiert werden können (KUWER 1997). FRANK (1999) verbesserte diesen Sondenträger durch eine noch kompaktere Bauweise, so dass dieser leichter in die Vagina des Kalbes eingeführt werden kann. Eine wichtige anatomische Vorraussetzung ist ein ausreichend entwickeltes Rektum, damit die Ovarien manuell fixiert werden können. Der Operateur sollte einen dünnen Arm, kleine Hände und entsprechende Erfahrung besitzen (RICK 1996).
FRY (1999) ging von einem Alterslimit bei Kälbern von vier Monaten aus. BROGLIATTI et al. (1995) adaptierten ein bis dahin nur in der Humanmedizin eingesetztes Punktionsgerät an sechs Wochen alte präpuberale Kälber. Es wurden zwar KOK sowohl aus stimulierten (5,6 aus 11,5 Follikeln) als auch aus unstimulierten Kälbern (0,6 aus 1,3 Follikeln) gewonnen, die manuelle Fixation der Ovarien gestaltete sich aber sehr schwierig. Der Versuch, das Problem mit einem rektal eingeführten Löffel oder einer laparoskopisch geleiteten Greifzange zu lösen, scheiterte. Eine Beschreibung des technischen Ablaufes von OPU ist in der Dissertation von KUWER (1997) zu finden.
2.3.3 Die Punktionsfrequenz bei de r Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion
GIBBONS et al. (1994) stellten fest, dass bei einmaliger und zweimaliger Punktion in der Woche die Resultate pro Punktion sich nicht unterschieden. Somit können mit zwei Punktionen in der Woche mehr KOK gewonnen werden.
GOODHAND et al. (1999) punktierten Rinder einmal oder zweimal in der Woche ohne FSH-Behandlung und einmal pro Woche mit FSH-Stimulation. Bei der einmaligen Punktion in der Woche ohne FSH-Stimulation wurden signifikant weniger Follikel gezählt und aspiriert. In der FSH-stimulierten Gruppe war die Anzahl der Oozyten der Kategorie I am höchsten. Der Anteil an Morulae und Blastozysten war bei zweimaliger Punktion in der Woche und bei einmaliger Punktion mit FSH-Behandlung signifikant höher als bei einmaliger Punktion ohne FSH-Stimulation. KUWER (1997) punktierte sechs Monate alte
Kälber zweimal in der Woche im Abstand von 3-4 Tagen. Er verabreichte 50 mg FSH jeweils 48 Stunden vor der Punktion und gewann 6,8 Oozyten pro Tier pro Punktion gegenüber 6,7 Oozyten der Kontrollgruppe. Vorteilhaft bei einem Punktionsintervall von 3- 4 Tagen (zweimal in der Woche) ist, dass der dominante Follikel aspiriert und damit seine wachstumsinhibierende Wirkung auf die anderen Follikel aufgehoben wird (BUNGARTZ u.
NIEMANN 1994). Nachteilig besonders bei Kälbern ist die kürzere Erholungsphase zwischen den Punktionen. HANENBERG und VAN WAGTENDONK-DE LEEUW (1997) punktierten in einem Abstand von drei Tagen und erzielten eine höhere Anzahl an transferfähigen Embryos pro OPU-Termin als im Abstand von vier oder sieben Tagen.
Dieses wurde ebenfalls mit der Punktion des dominanten Follikels und dem Wegfall seiner inhibierenden Wirkung begründet.
2.3.4 Technische und materielle Aspekte der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion
Eine besondere Bedeutung für den Erfolg von OPU hat die Punktionsnadel. Wichtige Einflussfaktoren sind Durchmesser, Anschliff und Schärfe (PIETERSE et al. 1988). Es werden wiederverwendbare lange (60 cm) Nadeln oder Einwegnadeln eingesetzt. Nachteil der wiederverwendbaren Nadeln ist, dass sie regelmäßig nachgeschliffen werden müssen und trotz des erneuten Anschliffs die ursprüngliche Schärfe nicht mehr erreicht wird (SIMON et al.1993; BOLS et al. 1995). Der Anschliff der Nadel muss entsprechend kurz sein, da sonst beim Durchstechen der Follikelwand die Flüssigkeit ausläuft, bevor sie vollständig aspiriert worden ist. BOLS et al. (1997) erzielten mit einem flachen Anschliff bei Oozyten, die aus Schlachthofovarien stammten, eine Wiederfindungsrate von 80 %. Bei adulten Tieren werden in der Regel Einwegnadeln der Stärke 18 G (KLOSSOK 1997), bei Kälbern der Stärke 20 G eingesetzt (FRANK 1999). SALAMONE et al. (2001) benutzten bei Kälbern sogar Nadeln der Stärke 17 G. Auch die Rinderproduktion Nord setzt unter Feldbedingungen bei adulten Rindern großlumige Nadeln der Stärke 16 G ein (KUWER, persönliche Mitteilung). BALTUSSEN et al. (1992) stellten jedoch eine steigende Anzahl beschädigter Follikel bei der Verwendung großlumiger Nadeln fest. Ein wichtiger Parameter
bei OPU stellt die Höhe des Aspirationsvakuums dar, die in mm HG oder besser als Durchflussrate in ml/min. angegeben wird. Der tatsächlich an der Nadelspitze herrschende Unterdruck ist abhängig von Durchmesser und Länge des Schlauches und der Nadel (RATH 1993).
Entscheidend für den Unterdruck ist auch, ob man ein 1-Schlauch- oder 2-Schlauchsytem verwendet. Beim 1-Schlauchsytem wird vor der eigentlichen Punktion die Spülflüssigkeit PBS in den Schlauch aspiriert. Beim 2-Schlauchsytem sind zwei Schläuche über ein gemeinsames Y-Stück miteinander verbunden. Ein Schlauch davon ist für die Aufrechterhaltung des Vakuums zuständig, während mit dem anderen die Spülflüssigkeit PBS zugeführt wird (KLOSSOK 1997). Je mehr Verschlüsse und damit auch Verengungen oder Erweiterungen im Lumen des Systems zwischen Nadel und Auffanggefäß vorhanden sind, umso turbulenter ist die Strömung. Je turbulenter die Strömung, umso größer ist die Gefahr, dass die empfindlichen Kumuluszellen abgelöst werden und damit die Qualität der Oozyten beeinträchtigt wird. Daher wird das 1-Schlauchsystem dem 2-Schlauch-System vorgezogen. Ein weiterer entscheidender Punkt ist die Flexibilität des Schlauches. Je weicher und flexibler der Schlauch ist, um so schneller kommt es zu Abknickungen und Spiralenbildungen, die wiederum zu Turbulenzen in der Strömung führen. Wenn ein Schlauch wiederverwendet wird, darf er auch nach mehrmaliger Sterilisierung nicht porös werden (EIKELMANN, persönliche Mitteilung). Ein weiterer Vorteil ist es, wenn man das Auffangglas für die KOK auf eine niedrigere Ebene stellt, so dass aufgrund des hydrostatischen Druckes ein zügiger Abfluss gewährleistet ist (FRANK, mündliche Mitteilung). Aufgrund der aufgeführten Faktoren ist es sinnvoller, nicht den Druck auf der Anzeige der Vakuumpumpe, sondern die Durchflussrate in ml/min. anzugeben (RATH 1993).
BRUSSOW et al. (1997) untersuchten beim endoskopischen Ovum pick up beim Schwein verschiedene Durchflussraten und stellten fest, dass eine Durchflussrate zwischen 17 und 32 ml beim Schwein am besten für Wiederfindungsrate und Oozytenqualität ist. Bei Erhöhung des Druckes bzw. der Durchflussrate steigerte sich bis zu einem gewissen Grad die Wiederfindungsrate, aber die Qualität der KOK nahm durch Ablösung der Kumuluszellen ab. Bei Untersuchungen des Aspirationsdruckes im Zusammenhang mit dem Nadeldurchmesser bei der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion beim Rind
wurde festgestellt, dass bei einer 18G-Nadel und einem Druck von 40 mm HG die besten Oozytenqualitäten gewonnen werden. Das gleiche gilt für eine 21G-Nadel bei 80mm HG (HASHIMOTO et al.1999). WARD et al. (2000) untersuchten den Aspirationsdruck nicht nur im Hinblick auf Wiederfindungsrate und Oozytenqualität, sondern auch im Zusammenhang mit der In-vitro-Entwicklungskapazität boviner Oozyten. Die Gesamt- Wiederfindungsrate sank stark ab bei einem Druckanstieg über 50 mm HG. Parallel zum Druckanstieg sank die Wiederfindungsrate der Oozyten der Klasse I signifikant, während die Anzahl denudierter Oozyten signifikant zunahm. Der Anteil an Blastozysten sank signifikant bei einem Druck von über 50 mm Hg.
2.3.5 Einfluss der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion auf die Gesundheit der Spendertiere
Ein gebräuchlicher Parameter für die Geschlechtsgesundheit von Tieren, die einer Follikelpunktion unterzogen wurden, ist die Trächtigkeitsrate. LOONEY et al. (1995) punktierten präpuberale Rinder fünfmal und erzielten später bei diesen Tieren durch künstliche Besamung eine Trächtigkeitsrate von 93 %. Rick (1996) führte sogar eine Dauerpunktion über neun Monate durch, nach der acht von neun Tieren tragend wurden. Ein Tier musste wegen einer Bauchfellentzündung geschlachtet werden. PETYIM et al. (2000) stellten bei Milchkühen auch bei wiederholter Follikelpunktion zweimal in der Woche einen normalen Zyklus und eine normale Struktur des Corpus luteum fest. Sie fanden keine negativen Effekte auf die Funktion und die Struktur des Ovars.
Nach Schlachtung stellten PIETERSE et al. (1991) außer Verhärtungen an der „Tunica albuginea“ der Ovarien keine Veränderungen am Genitaltrakt fest. VAN DER SCHANS et al. (1991) fielen ebenfalls Veränderungen an der Ovarkapsel und stellenweise hämorrhagische Follikel auf. Ansonsten wurden keine pathologischen Veränderungen gefunden. Auch BUCHER et al. (1996) stellten nach zweimal wöchentlich durchgeführter Punktion nur eine erhöhte Anzahl an hämorrhagischen Follikeln und Läsionen an der Ovaroberfläche fest.
2.3.6 Gewinnung von Oozyten durch die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion bei adulten Spendertieren mit und ohne vorherige hormonale Stimulation
Während durch Applikation von Hormonen bei präpuberalen Kälbern bessere Ergebnisse erzielt werden können, ist der Einsatz bei adulten Donoren umstritten. PIETERSE et al.
(1992) verglichen unstimulierte mit PMSG vorbehandelten Spendern und stellten bei den hormonbehandelten Rindern zwar eine erhöhte Anzahl an Follikeln, aber eine niedrigere Gewinnungsrate als bei unstimulierten Donoren fest. BUNGARTZ et al. (1995) erzielten bei stimulierten Rindern (100 mg FSH) im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant höhere Anzahl an punktierten Follikeln, jedoch waren Menge der gewonnenen KOK, Gewinnungsrate und In-vitro-Entwicklungsraten nicht unterschiedlich. EIKELMANN (1999) stimulierte trächtige Rinder mit 200 mg FSH 72 Stunden vor jeder OPU-Sitzung.
Hierbei wurde zwar eine signifikant höhere Anzahl an Follikeln im Vergleich zur Kontrollgruppe aspiriert, die Ausbeute an KOK und IVP-tauglichen KOK unterschied sich nicht signifikant. GOODHAND et al. (2000) stimulierten eine Gruppe Spendertiere mit Progestagen und Östradiol 17-ß, eine zweite Gruppe wurde einmalig mit FSH behandelt und eine dritte Gruppe erhielt mehrfach Dosen an FSH. Bei der ersten Gruppe wurde weder auf die Anzahl der Follikel und Oozyten noch auf die Embryonen-Produktion ein positiver Effekt erzielt. Bei beiden FSH-Gruppen war die Anzahl der aspirierten Follikel und der gewonnenen Oozyten der Klasse I signifikant erhöht. RATH (1993) sah in der erhöhten Anzahl an großen Follikeln einen Vorteil für unerfahrene Operateure, da hierdurch die Aspiration einfacher sein sollte.
SCHERNTHANER et al. (1999) punktierten unstimulierte Rinder zweimal pro Woche, gewannen durchschnittlich 5 Oozyten und 0,8 transferfähige Embryonen pro Tier pro Punktion. BOLS et al. (1996) stimulierten drei Kühe (Blaue Belgier) mit FSH (500 µg) und LH (100 µg) und beobachteten eine signifikante Zunahme in der Anzahl punktierter Follikel, gewonnener KOK und der Blastozystenzahl pro Punktion, gegenüber Einzeltierpunktionen derselben unstimulierten Kühe. KONISHI et al. (1996) punktierten acht Japanese Black Kühe, bei denen vorher ein konventionelles Superovulationsprogramm erfolglos war. Die Kühe wurden mit Inhibin α aktiv immunisiert. Es gab große Variationen
in Anzahl und Qualität der gewonnenen KOK zwischen den einzelnen Spendern. Auch die Entwicklungskapazität nach IVF war sehr unterschiedlich. Die Resultate zeigten, dass die Reaktion der Tiere auf eine Stimulation vor Ovum pick up individuell sehr unterschiedlich ist. Sie zeigten aber auch, dass die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion eine Alternative zum herkömmlichen Embryotransfer mit Superovulation darstellen kann. Auch FRY et al. (1994) untersuchten neben der Anwendung von eCG (von 750 I.U. pro Woche) den Einsatz einer Vakzine gegen Inhibin und stellten im Vergleich mit unstimulierten Tieren einen hochsignifikant erhöhten Anteil an Follikel mit einem Durchmesser von 5 bis 9 mm und 10 mm fest. BURATINI et al. (2000) punktierten bei der Rasse Bos Indicus am fünften Tag des Zyklus den dominanten Follikel, nachdem die Tiere am zweiten Tag mit 320 mg rBST (rekombinantes bovines Somatotropin) behandelt worden waren. Die Punktion des dominanten Follikels führte zu einer Synchronisation der Follikelentwicklung, während die Stimulation mit rBST zu einer Erhöhung der peripheren IGF-I-Konzentration und zu einem Anstieg der Anzahl kleiner Follikel führte. BOLS et al. (1998) punktierten HF-Kühe über einen Zeitraum von 10 Wochen zweimal die Woche. Sie stimulierten eine Gruppe einmal in der Woche mit 640 mg rBST und verglichen diese mit einer Kontrollgruppe. Die rBST-Gruppe hatte eine signifikant höhere Anzahl an Follikeln. Bei der Wiederfindungsrate der KOK und beim Anteil an Blastozysten bestanden zwischen beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede. In der Übersicht 1 sind Untersuchungen zum Einfluß einer hormonaler Vorbehandlung adulter Spendertiere auf das Punktionsergebnis und die In-vitro-Entwicklungskapazität der gewonnenen Oozyten aufgeführt.
Übersicht 1: Einfluss hormonaler Vorbehandlung adulter Spendertiere auf das Punktionsergebnis und den Anteil an Blastozysten
Autor Behandlungsschema KOK/
Tier/
Punktion
Anteil IVP- taugl. KOK´s
Anteil an Blastozysten in %
BUNGARTZ et al. 1994
100 mg FSH 7,0 52,1 % 22,7
BOLS et al. 1996 FSH 500 µg u.
LH 100 µg
6,1 k.A. 0,4 Embr./Tier/
Punkt.
BOLS et al. 1998 640 mg rBST unstimuliert
6,4 6,0
k.A.
k.A.
22,0 25,0 SIRARD et al.
1999
20 mg FSH
FSH in abfallender Dosis
Unstimuliert
9,1 7,7
3,3
94 % 82 %
58 %
k.A.
k.A.
k.A.
EIKELMANN 1999
200 mg FSH 6,0 3,5 20,6
GOODHAND et al. 2000
Einzeldosis FSH 9,0 mg Mehrfache Dosen FSH, 9,0 mg insgesamt 3 mg Progestagen u.
5 mg Östradiol 17 ß
5,3 5,9
5,3
k.A.
k.A.
k.A:
1,9 2,5
2,4
Embr./Tier/ Punkt.
Abkürzungen: k.A = keine Angaben; Embr. = Embryo; Punkt. = Punktion;
IVP-taugl.= IVP-tauglich
2.3.7 Gewinnung von Oozyten durch OPU bei präpuberalen Kälbern mit oder ohne vorherige hormonale Stimulation
Die meisten erfolgreichen Arbeiten an Kälbern haben gemeinsam, dass vor der Punktion eine hormonelle Stimulation stattgefunden hat. Bisher wurde lediglich von einer Trächtigkeit berichtet, die aus dem Transfer von Embryonen unstimulierter Kälber stammte.
Das 71 kg schwere Kalb verstarb beim Auszug (KUWER 1997). Auch DE ROVER et al.
(1998) konnte Oozyten mit Hilfe von OPU aus unstimulierten Kälbern gewinnen und zur Blastozyste weiterentwickeln. RICK (1996) erzielte bei unstimulierten präpuberalen Rindern zwischen dem sechsten und neunten Lebensmonat bei zweimaliger Punktion in der Woche im Durchschnitt 5,5 KOK aus 10,1 Follikeln. MAJERUS et al. (1999) punktierten unstimulierte Kälber zweimal wöchentlich zwei Monate vor und einen Monat nach der Pubertät. Der Durchschnitt lag bei 3,8 Follikeln vor und bei 6,8 Follikeln nach der Pubertät pro Tier pro Punktion. Die Anzahl gewonnener Oozyten lagen vor der Pubertät bei 1,9 und danach bei 3,8.
KUWER (1997) erzielte mit einer Stimulation von 50 mg FSH eine signifikant höhere Ausbeute von Oozyten guter bis sehr guter Qualität als bei nicht behandelten Kontrolltieren.
HWANG et al. (1997) untersuchten bei Kälbern zur FSH-und PMSG-Stimulation die Wirksamkeit einer bST Behandlung. Diese Zusatzbehandlung erhöhte zwar die Anzahl aspirierter Follikel, die kleiner als 5 mm waren, Wiederfindungsrate und der prozentuale Anteil IVP-tauglicher KOK unterschieden sich aber nicht signifikant. PRESICCE et al.
(1997) gewannen bei 20 gleichaltrigen Kälbern Oozyten durch Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion im Alter von fünf, sieben, neun und elf Monaten. Ein Teil der Tiere wurde mit Gonadotropinen stimuliert. Bei den unstimulierten Kälbern nahm die Anzahl der gewonnenen Oozyten mit dem Alter ab, während sie bei den stimulierten Tieren weitgehend konstant blieb. Der prozentuale Anteil IVP-tauglicher Oozyten war bei den stimulierten fünf und sieben Monate alten Kälbern gegenüber den unstimulierten Tieren signifikant erhöht. BROGLIATTI et al. (1997) setzten FSH allein und in Kombination mit LH bei 26 Wochen und 38 Wochen alten Kälbern ein. Sie fanden zwischen den Behandlungen keine signifikanten Unterschiede, bezogen auf die Anzahl der Follikel (< 4
mm), Follikeldurchmesser, Anzahl aspirierter Follikel und Gewinnungsrate. Eine GnRH- Behandlung nach Gonadotropin-Stimulation bei fünf Monate alten Kälbern führte zu einer erhöhten Anzahl an Follikeln und aspirierten Follikeln (FRY et al. 1998). Die Anzahl gewonnener Oozyten und IVP-tauglicher KOK blieb unbeeinflusst. DUFOUR et al. (1999) untersuchten drei Monate alte Kälber mit zwei unterschiedlichen Behandlungsschemata.
Der ersten Gruppe wurde 13 Tage lang Kochsalz-Lösung gespritzt, während der letzten drei Tage erfolgte eine zusätzliche Applikation von FSH. Die zweite Gruppe wurde 13 Tage mit einem GnRH-Agonisten behandelt, in den letzten drei Tagen wurde FSH injiziert. Die FSH- Behandlung führte zu einer signifikant erhöhten Anzahl an Follikeln zwischen 3,0 und 5,4 mm und größer als 5,4 mm, während die Anzahl an Follikeln kleiner als 3 mm konstant blieb. Die Atresie-Rate bei Follikeln zwischen 3,0 und 5,4 mm war nach FSH-Behandlung signifikant reduziert. In der Übersicht 2 sind Untersuchungen zum Einfluß einer hormonalen Vorbehandlung der präpuberalen Spendertiere auf das Punktionsergebnis und den Anteil der Blastozysten aus den gewonnenen Kälberoozyten aufgeführt.
Übersicht 2: Einfluß hormonaler Vorbehandlung präpuberaler Spendertiere auf das Punktionsergebnis und auf die In-vitro-Entwicklungskompetenz der gewonnenen Kälberoozyten
Autor Behandlungs-
schema
Gewinn.- Rate in % KOK/Foll.
KOK/Tier /Punktion
Anteil IVP- Taugl. KOK
Anteil an Mo.
u. Bla.
in %
FRANK 1999 50 mg FSH k.A. 5,9 3,6 9,3
FRY et al.
1998
FSH, PMSG, GnRH Unstimuliert
49,1
77,3
10,8
10,9
6,5
4,1
9,4
8,0 HWANG et
al. 1997
75 mg FSH u.
500mg bST 1000 I.U. PMSG u. 500 mg bST FSH
50,8
52,9
41,8
k.A.
k.A.
k.A.
41,9 %
47,2 %
44,5 %
k.A.
k.A.
k.A.
KUWER 1997
50 mg FSH Unstimuliert
63,0 64,0
6,8 6,7
61,3 % 51,2 %
12,2 4,2 PRESICCE et
al. 1997
250 I.U. eCG u.
24 mg FSH Unstimuliert ( 5 Mon. alt )
75,2
78,2
18,0
15
92 %
49 %
10,0
0
Abkürzungen: k.A.= keine Angaben; Gewinn.-Rate= Gewinnungsrate;
IVP-taugl.= IVP-tauglich; Foll.=Follikel; Mo.= Morulae; Bla.= Blastozysten.
Mon.= Monate,
2.4 Die intraovarielle Injektion
2.4.1 Die intraovarielle Injektion beim Rind
Die intraovarielle Injektion wurde bei Nutztieren bisher wenig eingesetzt. GRUNERT und BERCHTOLD (1995) berichteten über erfolgreiche Behandlungen von Ovarialzysten durch eine intrazystale Applikation mit hCG. Gegenüber der intramuskulären, subkutanen oder intravenösen Behandlung war die Dosierung bei gleicher Wirksamkeit erheblich reduziert.
PAREDIS und VANDEPLASSCHE (1953) injizierten Gonadotropine intrazystal und erzielten bei 70 % der Rinder mit zystösen Ovarien eine normale Brunst. Auch ZONDEK (1939) berichtete von einer intraovariellen Injektion von P.U (Pregnancy Urine), bei der die Hälfte der intravenös verabreichten Dosis ausreichte, um eine Follikelreifung herbeizuführen. Bei einer Injektion in die Zyste kann nicht ausgeschlossen werden, dass ein Teil des Präparates von der Zyste in die Bauchhöhle zurückfließt (SCHEEL 1963) PAREDIS (1963) sah in der Entscheidung für eine Applikationsart vorwiegend eine Kostenfrage und hielt die intrazystale Injektion aufgrund der geringen Dosis für eine kostengünstige Variante. Trotz des Abflusses in die Bauchhöhle kommt es zu einer Gelbkörperbildung im Anschluss an die Injektion, was für die lokale Wirkung spricht.
CLEMENTE (1964) entwickelte für diese Art der Applikation eine spezielle Zystenpunktionszange. Als Nachteil dieser Behandlung wird die Gefahr einer Verschleppung von Eitererregern aus der Scheide in die Bauchhöhle angesehen (GRUNERT u. BERCHTOLD 1995 ). ROBERTS (1971) umging das Problem, indem er die Injektion von außen durchführte. Der Einstich erfolgte etwa zwei Handbreit kaudal des Hüfthöckers. FRIEDMANN (1932) sah den Vorteil der i.o.-Injektion in der lokalen Wirkung des Hormons. Die Bildung von Luteingewebe wird durch reife Follikel des unbehandelten Ovars nicht gestört. KÄMMERER (1964) injizierte Plastoid nach einer von SCHUMMER (1951) beschriebenen Methode in Ovarien frisch geschlachteter Rinder.
Plastoid wurde direkt ins Ovargewebe verabreicht. Das entstandene Mazerationspräparat zeigte, dass das Ovargewebe die Injektionsflüssigkeit wie ein Schwamm aufsog, die Kapillarsysteme und sogar ein Teil der zu- und abführenden Gefäße sich füllten. Auch Follikelwand und Gelbkörper zeigten besondere Ausgusskonturen.
