Gynäkologische und allgemeine Gesundheit der bei OPU verwendeten Kälber

Von 59 im Versuch für OPU verwendeteten Kälbern wurden nachträglich 55 rektal und vaginoskopisch nach dem Untersuchungsprotokoll von ROSENBERGER (1993) untersucht.

Die Untersuchungen wurden mindestens drei Monate später vorgenommen. Von den fehlenden vier Tieren sind drei geschlachtet worden, zwei Tiere aufgrund von Verletzungen bzw. Brüchen. Ein Tier wurde wegen eines Mastdarmvorfalls verwertet. Ob dieser Mastdarmvorfall in Zusammenhang mit OPU stand, konnte nicht nachvollzogen werden.

Ein Kalb verendete aufgrund einer Lungenentzündung.

Von den 55 Tieren wurden palpatorisch bei zwei Tieren einseitige Verhärtungen und bei zwei Tieren beidseitige Verhärtungen der Ovarkapsel festgestellt. Zwei Tiere hatten eine einseitige geringgradige Verwachsungen des Ovars mit der Umgebung. Ein Tier wies beidseitige mittelgradige Verwachsungen des Ovars mit der Umgebung auf. Die palpatorischen Befunde waren bei der Ultraschalluntersuchung nicht sichtbar. Bei den übrigen 48 Tieren waren keine pathologischen Befunde feststellbar (Tabelle 15).

Tabelle 15: Befunde der bei der gynäkologischen Untersuchung auffällig gewordenen Kälber

NR. des Tieres Besondere Befunde 8236 L. O. u. R. O. Verw.++

8237 L. O. Verh +

8326 L. O. Verw.+

8334 R. O. Verw. +

8342 L. O. u. R. O. Verh.+

8372 L. O. u. R. O. Verh.+

7983 L. O. Verh. +

Abkürzungen: Nr.= Nummer; L. O. = Linkes Ovar; R. O. = Rechtes Ovar; Verh. = Verhärtungen der Ovarkapsel; Verw. = Verwachsungen des Ovars mit seiner Umgebung;

+ = geringgradig; ++ =mittelgradig; +++ =hochgradig

5 Diskussion

Die von PIETERSE et al. (1988) aus der Humanmedizin (DELLENBACH et al. 1985) auf das Rind übertragene Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion wird mittlerweile erfolgreich als Alternative zum konventionellen Embryotransfer mit Superovulation eingesetzt - speziell bei Spendertieren, die bei der Embryonenspülung nur unbefriedigende Ergebnisse liefern (KLOSSOK 1997, ROSCHLAU et al. 1997). Der Einsatz präpuberaler Kälber in der Zucht wird angestrebt, um das Generationsintervall zu verkürzen und damit den Zuchtfortschritt zu beschleunigen. Im Vergleich zu herkömmlichen Zuchtwertschätzungsverfahren würde die Verwendung von Jungrindern in einem modifizierten MOET-Verfahren (Multiple Ovulation Embryo Transfer) den genetischen Fortschritt um bis zu 22 % steigern können (LOHUIS 1995). Bei bisherigen erfolgreichen Arbeiten mit präpuberalen Spendertieren hat vor der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion eine intramuskuläre Injektion von Gonadotropinen stattgefunden (KUWER 1997; PRESICCE et al. 1997; FRY et al. 1998; MAJERUS et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurden neue Wege der Stimulation des Follikelwachstums beschritten, indem die Gonadotropine erstmals intraovariell verabreicht wurden. Die Methode der intraovariellen Injektion wurde bei Rindern schon früher zur Behandlung von persistierenden Gelbkörpern und zystösen Ovarien beschrieben (ZONDEK 1939; PAREDIS u. VANDEPLASSCHE 1953; PAREDIS 1963).

Ziel dieser Arbeit war es, bei der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion die intraovarielle Injektion von FSH bei präpuberalen Rindern zu etablieren, um die Ausbeute an entwicklungsfähigen Oozyten zu erhöhen. Dabei stand die Ermittlung der minimal effektiven FSH-Dosis im Vordergrund. Für die Untersuchung ist ein selbst hergestellter und an die besonderen anatomischen Gegebenheiten des Kalbes angepasster Sondenträger verwendet worden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Trächtigkeit aus den gewonnenen Oozyten, um zu zeigen, dass die Produktion von Kälbern über die intraovarielle Stimulation möglich ist. Der neue Sondenträger stellt eine erhebliche Verbesserung bei der praktischen Ausführung der Follikelpunktion bei Kälbern dar. Ein wesentlicher Fortschritt ist, dass der Operateur aufgrund der geringen Größe und der Handlichkeit des Gerätes die Follikel selbst punktieren kann und damit nur eine zweite

Person zur Spülung des Schlauchsytems notwendig ist. Bei Geräten, bei denen eine zweite Person zur eigentlichen Follikelpunktion notwendig ist, muss diese Person entsprechende Erfahrung und Sachkunde aufweisen. Ein beträchtlicher technischer und hygienischer Vorteil ist, dass durch Herausziehen der Punktionsstange die Nadel jederzeit ausgetauscht werden kann. Durch ein Auswechseln der Punktionsstange kann der Sondenträger zudem problemlos für die intraovarielle Injektion hergerichtet werden. Ferner kann der Sondenträger zur In-vivo-Gewinnung von Follikelflüssigkeit eingesetzt werden, indem die eingesetzte 1-ml-Spritze aspiriert wird. Dadurch könnten weitere Aufschlüsse über die Zusammensetzung der Follikelflüssigkeit von Kälbern und damit über die mangelnde Entwicklungskapazität ihrer Oozyten erhalten werden.

Bei der Etablierung der minimal effektiven FSH-Dosis wurde als Maßstab nicht die höchste Ausbeute an aspirierten Follikeln gewählt, sondern die höchste Ausbeute an IVP-tauglichen KOK. Um einen Abfall der Oozytenausbeute zu verhindern, wurde die FSH-Dosierung bei den meisten Versuchsgruppen nach Hälfte der Punktionen erhöht. Ein Abfall in der Oozytenausbeute könnte durch die Bildung von Antikörpern verursacht werden, die die FSH-Wirkung mindern. Diese Antigonadotropinwirkung ist bei wiederholten PMSG-Injektionen (Pregnant mare serum gonadotropin) nachgewiesen worden (JAINUDEEN et al.

1966). PMSG ist ein Gonadotropin mit starker FSH- und geringerer LH-Wirkung im Verhältnis von 14 bis 20:1 (LOUWERENS 1970). Beim Rind ist bisher eine Antikörperbildung nach FSH-Behandlung noch nicht beschrieben worden.

Bei der Ermittlung der minimal effektiven Dosis wurde schrittweise vorgegangen. Die verwendete Dosis von 1,25 mg FSH appliziert in beide Ovarien bei der ersten Hälfte der Punktionen und die Verdopplung der Dosierung in der zweiten Hälfte brachte die beste Oozytenausbeute. Diese FSH-Dosis beträgt nur 2,5 %, bzw. 5 % der intramuskulär applizierten Dosis (KUWER 1997). Diese Dosierung kommt wahrscheinlich der minimal effektiven Dosis der i.o.-Injektion zur Stimulation präpuberaler Kälber sehr nah. Mit dieser Dosierung konnten Oozytenzahlen erreicht werden, die mit vorangegangenen Arbeiten (KUWER 1997; FRANK 1999), in denen intramuskulär stimuliert wurde, vergleichbar waren. Allerdings zeigen die Ergebnisse starke Schwankungen zwischen den Einzeltieren, was die Resultate früherer Arbeiten bestätigt. (FRANK 1999; EIKELMANN 1999). Auch der Zeitpunkt der intraovariellen Injektion könnte für den Erfolg bedeutsam sein. Eine

Möglichkeit wäre die Injektion nicht 48 Stunden vorher durchzuführen, sondern zu einem späteren Zeitpunkt, das heißt zeitlich näher zum Punktionstermin. Dazu wären aber weitere Versuche notwendig.

Hauptvorteil der intraovariellen Injektion ist, dass nur eine geringe Menge Hormon benötigt wird und die Wirkung überwiegend lokal bleibt. Wie KÄMMERER (1964) an Schlachthofovarien zeigen konnte, gelangt aber nach der i.o.-Injektion ein Teil der injizierten Menge in die ableitenden Blutgefäße, so dass Effekte auf andere Gewebe wie das kontralaterale Ovar zu erwarten sind. Diese Vermutung wurde durch die Ergebnisse der vorliegenden Experimente unterstützt, in denen die intraovarielle Injektion nur in ein Ovar erfolgte. Die Zahl gewonnener Oozyten aus den kontralateralen Ovarien war in einer Versuchsgruppe sogar signifikant höher als in den Kontrollgruppen.

Als Hauptnachteil der intraovariellen Injektion ist der wesentlich höhere Aufwand gegenüber der intramuskulären Applikation anzusehen. Zusätzlich zur zweimal wöchentlichen Follikelpunktion muss für die intraovarielle Injektion eine rektale Palpation erfolgen, was bei halbjährigen Kälbern eine gewisse Belastung darstellen kann. Um Belastungen für die halbjährigen Kälber geringer zu halten, könnte die sechswöchige Versuchsdauer mit zwölf Punktionen auf sechs oder acht Punktionen reduziert werden. Die besten Oozytenausbeuten werden in der Regel bei den ersten Punktionen erreicht.

Die intraovarielle Injektion könnte auch bei adulten Rindern durchgeführt werden, um eine Superovulation für den herkömmlichen Embryotransfer auszulösen. Für einen erfahrenen Operateur wäre bei adulten Tieren aufgrund der Größe der Eierstöcke problemlos eine Injektion auch ohne Ultraschallkontrolle durchzuführen, wie es in der Praxis häufig bei einer Zystenbehandlung mit Hilfe der Punktionszange nach CLEMENTE (1964) geschieht.

Damit wäre auch in der Praxis ein Einsatz ohne den finanziellen Aufwand, der mit dem Kauf eines Ultraschallgerätes verbunden ist, möglich. Bei adulten Tieren ist die intraovarielle Injektion aufgrund der größeren Vagina und Beckenverhältnisse leichter möglich. Allerdings wären auch hier weitere Versuche notwendig, um die optimale Dosierung festzulegen. Eine weitere Einsatzmöglichkeit könnte in der hormonellen Stimulation des Pferdes liegen. Beim Pferd ist der Einsatz des Embryotransfers vor allem dadurch begrenzt, dass man bisher nicht in der Lage war, eine Superovulation wie beim Rind auszulösen. Bei der Stute werden nach Gonadotropin-Behandlung nur wenige

Ovulationen ausgelöst, so dass man hier besser von der Induktion multipler Ovulationen als von einer Superovulation spricht (Mc KINNON et al. 1988). Hier könnte die intraovarielle Stimulation eine Alternative darstellen. Auch der hergestellte Sondenträger wäre aufgrund seiner geringen Größe und Handlichkeit für den Einsatz beim Pferd gut geeignet. In der Humanmedizin wird die intraovarielle Injektion seit kurzem erfolgreich bei Patienten mit polyzystischen Ovarien angewendet (ALI et al. 2000).

Die bei OPU gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexe wurden auf ihre In-vitro-Entwicklungskompetenz geprüft. Die hierbei erzielten Reifungs- und Fertilisationsraten sowie der Anteil an Morulae und Blastozysten konnten durch die FSH-Behandlung nicht gesteigert werden. Ein Grund für die mangelnde IVP-Entwicklungskapazität der Oozyten präpuberaler Donoren könnte in ihrem geringen Durchmesser liegen. In dieser Untersuchung war der Oozyten-Durchmesser der Kontrollgruppe mit 116,7 µm etwa gleich groß wie in der FSH-Gruppe (117,2 µm). DUBY et al. (1996) stellten fest, dass die Durchmesser juveniler Oozyten signifikant kleiner sind als bei adulten Kühen mit 125,6 µm.

Oozyten, die kleiner als 120 µm sind, können wahrscheinlich nicht alle Schritte der Maturation durchlaufen. Dieser Unterschied im Durchmesser beträgt zwar nur 5 %, macht aber im Volumen der Oozyte etwa 10 % aus. Vermutlich laufen entscheidende Schritte beim Ablauf der mRNA- und Proteinsynthese unvollständig ab (SATO et al. 1990). Es besteht also eine gewisse Korrelation zwischen einem geringen Oozytendurchmesser und der mangelnden Entwicklungskompetenz (MAJERUS et al. 1999). STEVES et al. (1999) verglichen den Glucose- und Pyruvat-Gehalt boviner Oozyten präpuberaler und adulter Spendern während der In-vitro-Entwicklung. In den verschiedenen Entwicklungsstadien waren teilweise signifikante Unterschiede in den Gehalten von Glucose und Pyruvat zu finden. Wenn die Embryonen das Blastozystenstadium erreicht hatten, wurden keine Unterschiede bezüglich des Gehaltes von Glucose, Pyruvat und der Zellzahl mehr beobachtet. Während der ersten drei Stunden der Maturation ist bei Kälberoozyten ein geringerer Metabolismus von Glutamin und Pyruvat festgestellt worden (GANDOLFI et al.

1998).

In der vorliegenden Arbeit konnten nur Reifungsraten von 67,0 % bei der FSH-Gruppe und 60,6 % bei der Kontrollgruppe erzielt werden. Damit konnten die Ergebnisse von REVEL et al. (1995), die ähnliche Reifungsraten von Kälberoozyten wie für Oozyten adulter Tiere

beschrieben haben, nicht bestätigt werden. Für die mangelnde Reifung scheint in erster Linie ein Mangel an MPF und MAP-Kinase verantwortlich zu sein (SALAMONE et al.

2001). Nach DE VANTERY AREGHI et al. (2000) haben inkompente Oozyten zwar einen vergleichbaren Gehalt an MAPK und Cyclin B, der Gehalt an p34cdc2 ist aber bedeutend geringer. Auch ein quantitativer Proteinmangel in der Follikelflüssigkeit präpuberaler Kälber spielt bei der mangelnden Reifung eine Rolle (DRIANCOURT et al. 2001). In der Mehrzahl der Kälberoozyten scheinen demnach fast alle Faktoren, die in der Maturation eine entscheidende Rolle spielen, in nicht ausreichender Menge vorhanden oder aufgrund bestimmter qualitativer Mängel nicht in der Lage zu sein, die Reifung vollständig abzuschließen. In weiteren Forschungsarbeiten werden die biochemischen und molekularen Besonderheiten präpuberaler Oozyten weiter zu charakterisieren sein, um darauf aufbauend die IVP-Systeme zu verbessern.

In der vorliegenden Arbeit wurde bei den Oozyten der FSH-Gruppe eine Fertilisationsrate von 52,7 % und bei den Oozyten der Kontrollgruppe eine Fertilisationsrate von 55,6 % erreicht. Bei den befruchteten Oozyten trat bei 37,9 %, bzw. 20 % Polyspermie auf. Aus einer polyspermen Befruchtung hervorgehende Zygoten sind je nach Anzahl eingedrungener Spermien tri- bis polyploid. Diese genetische Imbalance führt meistens zu einem frühen embryonalen Absterben (YOSHIDA et al. 1993). In-vitro-Produktion von Embryonen ist mit einer signifikant höheren Anzahl an Chromosomen, die von der Norm abweichen verbunden. Ebenso weisen in vitro produzierte Blastozysten einen signifikant höheren Anteil an Mixoploidy auf als in vivo entwickelte Embryonen. Mixoploidy liegt vor, wenn der Embryo sowohl normale diploide als auch polyploide Zellen enthält. Nach der In-vitro-Fertilisation kommt es initial zu einer höheren Rate an „echter“ Polyploidie, das heißt, alle Zellen, die der Embryo enthält, sind polyploid. Polyploide Embryonen sterben ab, bevor sie das Acht-Zell-Stadium erreichen. In diesem Stadium tritt beim Rind die Umschaltung vom maternalen auf das embryonale Genom auf (HYTTEL et al. 2001).

FRANK (1999) steigerte durch eine reduzierte Sperma-Konzentration die Anzahl monosperm befruchteter Kälberoozyten bis zu einer Rate von 55 %. Eine weitere Reduktion war aber mit einem Ansteigen der Zahl unbefruchteter Oozyten verbunden. Trotz der Steigerung der Anzahl normal fertilisierter Oozyten lag jedoch der Anteil der Blastozysten zwischen 8 und 9 %. Ein Grund für die hohe Polyspermierate bei Kälberoozyten könnte die

mangelhafte Ca²⁺-Oszillation sein. Die Ca^2+-Freisetzungsmechanismen sind bedeutsam für die Aktivierung der Oozyte und eine monosperme Befruchtung (HE et al.1997). Eine pulsative Freisetzung von Kalzium ist ein wichtiger Prozess bei Reifung und Befruchtung (WASSARMANN 1994). Ferner wurden bei Kälberoozyten im Vergleich mit Oozyten adulter Tiere eine dünnere Zona pellucida und eine reduzierte Anzahl und Größe der kortikalen Granulazellhaufen beobachtet (MASCIOTTE et al. 1999). DUBY et al. (1996) führten die mangelnde Entwicklungskompetenz von Kälberoozyten auf die unvollständige Verteilung der Granula zurück. FRANK (1999) hingegen sah die Verteilung der Granula nicht als Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche In-vitro-Fertilisation an. Eine Analyse von Oozyten adulter und juveniler Spender auf ihre Granula-Verteilung mittels eines Konfokal Laser Mikroskops zeigte, dass 33 % der Kälberoozyten und 66 % der Oozyten adulter Tiere eine vermutlich physiologische Verteilung am Oolemm zeigten (FRANK 1999).

Für die In-vitro-Fertilisation von Kälberoozyten gilt ebenso wie für die Reifung, dass hier weitere Verbesserungen notwendig sind, um gute Ergebnisse und damit letztlich eine höhere Anzahl an transferfähigen Embryonen zu gewinnen. Eine Möglichkeit wäre, die Spermienkonzentration nicht nach einer Auszählung der Thoma-Kammer zu berechnen, da teilweise tote Spermien miteinbezogen werden, sondern anhand der zweiten Untersuchung der Spermien-Motilität. In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, dass die Spermien nach ihrer Aufbereitung durch das „Swim-up-Verfahren“ ihre Motilität verlieren. Bei der ersten Beurteilung unmittelbar nach dem Auftauen wurde eine Motilität von weniger als 80% nicht beobachtet, während nach der Spermienaufbereitung die Motilität selten mehr als 60 % erreichte.

In der vorliegenden Arbeit wurden ein nur relativ geringer Anteil an Morulae und Blastozysten erzielt. Hierbei zeigte sich, dass in fast allen Gruppen tendenziell, teilweise auch signifikant der Anteil an Morulae und Blastozysten, die aus Oozyten intraovariell FSH-stimulierter Kälber stammten, höher war als für die Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit anderen Arbeiten (KUWER 1997, PRESICCE et al. 1997).

Die Entwicklungsraten anderer Arbeitsgruppen zwischen 30 und 40 % konnten bei weitem nicht erreicht werden (IRVINE et al. 1993, KELLY et al. 1997, PRESICCE et al. 1997, MAJERUS et al. 1999). Wie in den meisten erfolgreichen Arbeiten wurde in der

vorliegenden Arbeit bei der In-vitro-Kultivierung das SOF-Medium verwendet, so dass methodisch bedingte Unterschiede wenig wahrscheinlich sind. Eine mögliche Erklärung wäre das Tiermaterial. In dieser Arbeit stand aufgrund einer Verkleinerung der Versuchsherde nur eine begrenzte Anzahl an Versuchstieren zur Verfügung. Bei vielen Kälbern handelte es sich um reine schwarzbunte Tiere oder um Kälber mit geringem HF-Anteil. HF-Kälber sind aufgrund ihrer frühreifen Entwicklung und Größe in der Regel besser geeignet für OPU und die intraovarielle Injektion als die altdeutschen schwarzbunten Kälber. Dies zeigte die Untergruppe der letzten Versuchsgruppe, in der vier ausgesuchte reine HF-Tiere verwendet wurden, die mit Abstand die höchste Oozytenausbeute (9,1 KOK/Tier/Punktion) lieferten. Für schwarzbunte Kälber konnte allerdings das Alterslimit für eine erfolgreiche Durchführung der Follikelpunktion von neun Monaten nicht bestätigt werden (RICK 1996). In dieser Arbeit konnten schwarzbunte Tiere im Alter von sechs Monate nach entsprechender Voruntersuchung und Selektion mit dem neuen Sondenträger ohne Probleme punktiert werden. Bei der nachfolgenden gesundheitlichen Untersuchung der bei OPU verwendeten Tiere wurden nur wenig pathologisch erscheinende Befunde festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen aber, dass die intraovarielle Injektion bei halbjährigen Kälbern bei sachgerechter Durchführung nur selten mit Spätfolgen verbunden ist. Die Ergebnisse stimmen mit denen anderer Arbeiten überein, bei denen geringe Verhärtungen am Ovar und hämorrhagische Follikel nach Anwendung von OPU bei adulten Tieren -festgestellt wurden (PIETERSE 1991; VAN DER SCHANS et al. 1991 ). Für den Erfolg von OPU ist die Unversehrtheit der Spendertiere sehr wichtig. OPU sollte nur bei Tieren durchgeführt werden, bei denen der Untersucher problemlos eine rektale Untersuchung durchführen kann und die eine ausreichend große Vagina besitzen (RICK 1996).

In der vorliegenden Arbeit wurden aufgrund der geringen Anzahl an Trägertieren und transferfähigen Embryonen nur zwei Transfers durchgeführt. Hierbei wurde eine Trächtigkeit erzielt, aus dem ein gesundes 45 kg schweres Bullenkalb resultierte. Die Geburt verlief problemlos und auf natürlichem Weg. Dieses Ergebnis zeigt, dass mit Hilfe der intraovariellen Injektion die Produktion von Kälbern möglich ist. Da nur ein Kalb mit Normalgewicht geboren wurde, kann zu der Problematik des „Large calf syndrome“, das häufig bei IVF-Kälbern auftritt, keine Aussage gemacht werden.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass die intraovarielle Injektion von Gonadotropinen bei Kälbern im Alter von sechs Monaten im Rahmen der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion möglich ist. Mit Hilfe des eigens für die intraovarielle Injektion und Follikelpunktion hergestellten Sondenträgers, konnte die i.o.-Injektion bei voruntersuchten Kälbern problemlos durchgeführt werden. Im Bezug auf die Oozytenausbeute konnten vergleichbare Ergebnisse wie mit der intramuskulären Stimulation erreicht werden. Von den getesteten Dosierungen kann eine beidseitige Dosis von 1,25 mg FSH, mit Verdoppelung der Dosis auf 2,5 mg nach sechs Punktionen als minimal effektive Dosis angesehen werden. Die mit der intraovariellen Injektion zusätzlich verbundene rektale Palpation kann eine zusätzliche Belastung für die Kälber darstellen. Mit der Geburt eines Kalbes wurde nachgewiesen, dass die Gewinnung entwicklungsfähiger KOK möglich ist und damit die intraovarielle Injektion eine Alternative zu den herkömmlichen Applikationsarten der Stimulation darstellen kann. Allerdings konnte das Problem der mangelnden In-vitro-Entwicklungskompetenz der Oozyten präpuberalerKälber noch nicht gelöst werden. Es wurden ähnliche Entwicklungsraten beobachtet wie in früheren Arbeiten, in denen eine intramuskuläre Stimulation stattgefunden hatte (KUWER 1997; FRANK 1999). Die mangelnde In-vitro-Entwicklungskompetenz der Kälberoozyten wird in der Hauptsache durch den geringen Oozytendurchmesser, mangelnde Reifung und die hohe Polyspermierate verursacht. Hierauf scheint die intraovarielle Injektion keinen positiven Einfluss zu haben. Solange die In-vitro-Entwicklungskapazität von Oozyten präpuberaler Rinder nicht verbessert wird, kann deshalb ein routinemäßiger Einsatz in der Praxis nicht stattfinden.

6 Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, bei halbjährigen Kälbern die intraovarielle Injektion von FSH für die ultraschallgeleitete transvaginale Follikelpunktion (OPU) zu etablieren und damit die Effizienz von OPU zu verbessern. Da keine Erfahrungswerte für die intraovarielle Injektion von FSH vorliegen, sollte die minimal effektive Dosis ermittelt werden, die anschließend durch entsprechende Wiederholung von OPU und der i.o.-Injektion bestätigt werden sollte. Insgesamt wurden 59 Kälber in Gruppen von 4-10 Tieren über einen Zeitraum von sechs Wochen zweimal wöchentlich punktiert. Die gewonnenen Oozyten wurden morphologisch in 6 Qualitätskategorien eingeteilt. Die Oozyten der Klasse I-III wurden als IVP-tauglich eingestuft und in vitro gereift, fertilisiert und bis zum Stadium der Morula oder Blastozyste kultiviert. Bei einem Teil der gewonnenen Oozyten wurde der Durchmesser der Oozyten gemessen sowie die Reifungs- und Befruchtungsraten ermittelt.

Bei Blastozysten und Morulae die aus Oozyten von FSH-stimulierten Kälbern stammten, wurde die Zellzahl bestimmt. Zwei der Embryonen wurden auf Empfängertiere übertragen.

Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:

1. Nach rechtsseitiger intraovarieller Stimulation von FSH und einer Dosis, die über zwölf Punktionen konstant blieb, wurden mit 5,5 KOK und 3,3 KOK der Klasse I-III/Tier/Punktion signifikant (P<0,01) mehr Oozyten als in der Kontrollgruppe gewonnen, mit 1,4 KOK und 0,8 KOK der Klasse I-III/Tier/Punktion. Auch die Morula-Blastozysten-Rate war mit 7,5 % signifikant (p<0,05) höher als in der Kontrollgruppe mit 0 %.

Linksseitig und rechtsseitig gewonnene Oozyten zeigten innerhalb der Gruppen bezüglich Oozytenausbeute und des Anteils der Morulae und Blastozysten keine signifikanten Unterschiede. Die Oozyten der jeweiligen Ovarien der FSH-Gruppe waren im Vergleich mit der Kontrollgruppe bezüglich der Oozytenausbeute und Oozytenqualität signifikant (P<0,01) besser.

2. Nach rechtsseitiger intraovarieller Stimulation von FSH und einer Verdopplung der Dosis nach sechs Punktionen wurden mit 3,8 KOK signifikant (p<0,05) weniger Oozyten gewonnen als in der Kontrollgruppe mit 5,5 KOK. Der Anteil der Morulae und Blastozysten