2.3.1 Methoden zur Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen
Bei der Gewinnung von Oozyten wird zwischen Post-mortem- und In-vivo-Methoden unterschieden. Post mortem ist das sogenannte „Slicing“ oder „Surface dissection“, eine effektive und gebräuchliche Methode. Verwendet werden Ovarien, die auf einem Schlachthof gesammelt wurden. Mit einem Vielklingenmesser, unter Verwendung von Kürschnerklingen, schneidet man sowohl längs als auch quer über die Ovaroberfläche. Die auslaufende Follikelflüssigkeit mit den darin enthaltenen KOK wird in einer Petrischale aufgefangen. Eine weitere Vorgehensweise bei Schlachthofovarien zur Gewinnung von Oozyten stellt die Follikelaspiration dar. Hierbei werden die Follikel mit einer Kanüle gezielt angestochen, und die Follikelflüssigkeit wird mit einer Vakuumpumpe oder einfach nur mit einer Spritze abgesaugt. In der Regel kommen Kanülen von einer Stärke von 18 G zum Einsatz. Bei Verwendung einer Vakuumpumpe liegt der Druck im Allgemeinen zwischen 50 und 120 mm HG (ECKERT 1994).
Bei der In-vivo-Gewinnung werden die Laparatomie, Laparoskopie und die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion, die man auch als OPU (Ovum pick up) bezeichnet,
unterschieden. Zunächst war die am häufigsten verwendete Methode die Laparatomie.
GREVE et al. (1984) führten diese Methode bei Jungrindern von der Linea alba durch. Ein günstigerer Zugang zu den Ovarien ist die Hungergrube (Fossa paralumbalis). Vorteil dieser Methode ist, dass sie mehrfach und auch bei trächtigen Tieren im ersten Drittel der Gravidität angewendet werden kann (SIRARD et al. 1985; RYAN et al. 1993).
TECHAKUMPHU et al. (2000) führten eine Laparotomie in der Linea alba bei präpuberalen Büffeln durch. Die Tiere wurden mit FSH und GnRH stimuliert. Bei der Punktion wurden im Durchschnitt 9,0 KOK pro Tier pro Punktion gewonnen, was einer Wiederfindungsrate von 56,3 % entsprach. Einen Monat später erhielten die Tiere eine erneute Stimulation mit PMSG und GnRH. Hierbei wurden durchschnittlich 8,4 KOK pro Tier pro Punktion bei einer Wiederfindungsrate von 51,9 % erzielt. DAHLHAUSEN et al.
(1981) setzten die Laparoskopie bei 2,5 Monate alten Kälbern zur Gewinnung von KOK ein. Nach In-vitro-Maturation erreichten 40-50 % der gewonnenen KOK die Metaphase II.
IVF wurde nicht durchgeführt. 1987 gewannen DUBY und ROBL durch Laparatomie Oozyten von superovulierten Kälbern und fanden nach IVF bei 56 % der KOK zwei Vorkerne. Diese Versuche zeigten, dass Kälber als Donoren entwicklungskompetenter Oozyten dienen können. Für die laparoskopische Gewinnung von Oozyten sind verschiedene Verfahren beschrieben worden. Der am häufigsten verwendete Zugang ist die
„Fossa paralumbalis“ (LAMBERT et al. 1983). Hierbei wird zunächst die Bauchwand mittels eines Trokar durchstoßen, um einen Zugang für das Endoskop zu erhalten. Die Fixierung der Eierstöcke erfolgt durch eine Fasszange. Unter Sichtkontrolle durch das Endoskop werden die Follikel punktiert und unter Verwendung eines Vakuums abgesaugt.
LAZZARI et al. (1996) konnten bei zwei bis drei Monate alten, mit eCG stimulierten Kälbern, 25 KOK aus 44 Follikeln gewinnen. TANEJA et al. (2000) führten eine Laparoskopie bei zwei bis drei Monate alten, mit Gonadotropin behandelten Kälbern durch und wiederholten diesen Vorgang im Alter von vier bis fünf Monaten. Sowohl bei der ersten als auch bei der zweiten Punktion verdoppelte sich nach der Stimulation die Anzahl der Follikel.
Trotz guter Ergebnisse sind sowohl Laparatomie als auch Laparaskopie wegen ihres hohen Aufwandes nur schwer durchführbar. Ferner erfüllen sie nicht den Anspruch, häufig wiederholbar und minimal invasiv zu sein (RATH 1993).
2.3.2 Die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion
Eine Alternative zur Laparoskopie und Laparatomie ist die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion (PIETERSE et al. 1991). Die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion, auch als OPU (Ovum pick up) bezeichnet, ist eine Alternative zum herkömmlichen Embryotransfer, insbesondere bei Tieren, bei denen nur wenige Embryonen gewonnen wurden (LOONEY et al. 1994; ROSCHLAU et al. 1997;
KLOSSOK 1997). Ferner bietet OPU die Möglichkeit, auch von präpuberalen Kälbern Oozyten zu gewinnen, was das Generationsintervall verkürzen und den züchterischen Fortschritt beschleunigen kann (LOONEY et al 1995; RICK 1996, KUWER 1997, FRANK 1999). Auch bei trächtigen Kühen ist OPU erfolgreich angewendet worden (BUNGARTZ et al. 1995; MEINTJES et al. 1995; REINDERS u. VAN WAGTENDONK-DE LEUW 1996;
ROSCHLAU et al. 1999; EIKELMANN 1999).
CALLESEN et al. (1987) beschrieben erstmalig eine Ultraschall geleitete Punktionsmethode. Die Ovarien wurden rektal per Hand fixiert und in die Nähe des von außen in der „Regio sacroischiadiaca“ angelegten Ultraschallkopfes gebracht. Von außen wurde dann nach Gabe eines Lokalänästheticums das Ovar mittels einer Nadel transcutan punktiert. PIETERSE et al. (1988) adaptierten das in der Humanmedizin eingesetzte Ovum pick up (OPU) bzw. die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion an die anatomisch-physiologischen Gegebenheiten des Rindes. Hierbei wird das Ovar rektal fixiert und der Ultraschallkopf mittels eines Sondenträgers transvaginal eingeführt. Die Punktion erfolgt unter Ultraschallkontrolle durch das Scheidendach. Die Punktionsnadel sitzt auch im Sondenträger und kann mittels einer Punktionsstange vor- und zurückbewegt werden. Die Aspiration der Follikelflüssigkeit erfolgt durch eine Vakuumpumpe. SANTL et al. (1998) verglichen die Laparoskopie mit der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion.
Die Anzahl der Oozyten der Kategorie I war bei der Laparoskopie signifikant niedriger. Bei der darauffolgenden In-vitro-Maturation und -Fertilisation waren die Teilungs- und Blastozystenraten ebenfalls signifkant niedriger. Diese Ergebnisse zeigten, dass für die In-vivo-Gewinnung von Oozyten die transvaginale Follikelpunktion nicht nur wegen der Stressminimierung für das Tier, sondern auch wegen der besseren Ergebnisse die Methode der Wahl darstellt.
Ein limitierender Faktor bei der Nutzung präpuberaler Kälber ist - neben der individuellen körperlichen Entwicklung des Tieres - die Größe des Punktionsgerätes. In Mariensee wurde ein Punktionsgerät entwickelt und eingesetzt, mit dem 5-6 Monate alte Kälber der Rasse HF punktiert werden können (KUWER 1997). FRANK (1999) verbesserte diesen Sondenträger durch eine noch kompaktere Bauweise, so dass dieser leichter in die Vagina des Kalbes eingeführt werden kann. Eine wichtige anatomische Vorraussetzung ist ein ausreichend entwickeltes Rektum, damit die Ovarien manuell fixiert werden können. Der Operateur sollte einen dünnen Arm, kleine Hände und entsprechende Erfahrung besitzen (RICK 1996).
FRY (1999) ging von einem Alterslimit bei Kälbern von vier Monaten aus. BROGLIATTI et al. (1995) adaptierten ein bis dahin nur in der Humanmedizin eingesetztes Punktionsgerät an sechs Wochen alte präpuberale Kälber. Es wurden zwar KOK sowohl aus stimulierten (5,6 aus 11,5 Follikeln) als auch aus unstimulierten Kälbern (0,6 aus 1,3 Follikeln) gewonnen, die manuelle Fixation der Ovarien gestaltete sich aber sehr schwierig. Der Versuch, das Problem mit einem rektal eingeführten Löffel oder einer laparoskopisch geleiteten Greifzange zu lösen, scheiterte. Eine Beschreibung des technischen Ablaufes von OPU ist in der Dissertation von KUWER (1997) zu finden.
2.3.3 Die Punktionsfrequenz bei de r Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion
GIBBONS et al. (1994) stellten fest, dass bei einmaliger und zweimaliger Punktion in der Woche die Resultate pro Punktion sich nicht unterschieden. Somit können mit zwei Punktionen in der Woche mehr KOK gewonnen werden.
GOODHAND et al. (1999) punktierten Rinder einmal oder zweimal in der Woche ohne FSH-Behandlung und einmal pro Woche mit FSH-Stimulation. Bei der einmaligen Punktion in der Woche ohne FSH-Stimulation wurden signifikant weniger Follikel gezählt und aspiriert. In der FSH-stimulierten Gruppe war die Anzahl der Oozyten der Kategorie I am höchsten. Der Anteil an Morulae und Blastozysten war bei zweimaliger Punktion in der Woche und bei einmaliger Punktion mit FSH-Behandlung signifikant höher als bei einmaliger Punktion ohne FSH-Stimulation. KUWER (1997) punktierte sechs Monate alte
Kälber zweimal in der Woche im Abstand von 3-4 Tagen. Er verabreichte 50 mg FSH jeweils 48 Stunden vor der Punktion und gewann 6,8 Oozyten pro Tier pro Punktion gegenüber 6,7 Oozyten der Kontrollgruppe. Vorteilhaft bei einem Punktionsintervall von 3-4 Tagen (zweimal in der Woche) ist, dass der dominante Follikel aspiriert und damit seine wachstumsinhibierende Wirkung auf die anderen Follikel aufgehoben wird (BUNGARTZ u.
NIEMANN 1994). Nachteilig besonders bei Kälbern ist die kürzere Erholungsphase zwischen den Punktionen. HANENBERG und VAN WAGTENDONK-DE LEEUW (1997) punktierten in einem Abstand von drei Tagen und erzielten eine höhere Anzahl an transferfähigen Embryos pro OPU-Termin als im Abstand von vier oder sieben Tagen.
Dieses wurde ebenfalls mit der Punktion des dominanten Follikels und dem Wegfall seiner inhibierenden Wirkung begründet.
2.3.4 Technische und materielle Aspekte der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion
Eine besondere Bedeutung für den Erfolg von OPU hat die Punktionsnadel. Wichtige Einflussfaktoren sind Durchmesser, Anschliff und Schärfe (PIETERSE et al. 1988). Es werden wiederverwendbare lange (60 cm) Nadeln oder Einwegnadeln eingesetzt. Nachteil der wiederverwendbaren Nadeln ist, dass sie regelmäßig nachgeschliffen werden müssen und trotz des erneuten Anschliffs die ursprüngliche Schärfe nicht mehr erreicht wird (SIMON et al.1993; BOLS et al. 1995). Der Anschliff der Nadel muss entsprechend kurz sein, da sonst beim Durchstechen der Follikelwand die Flüssigkeit ausläuft, bevor sie vollständig aspiriert worden ist. BOLS et al. (1997) erzielten mit einem flachen Anschliff bei Oozyten, die aus Schlachthofovarien stammten, eine Wiederfindungsrate von 80 %. Bei adulten Tieren werden in der Regel Einwegnadeln der Stärke 18 G (KLOSSOK 1997), bei Kälbern der Stärke 20 G eingesetzt (FRANK 1999). SALAMONE et al. (2001) benutzten bei Kälbern sogar Nadeln der Stärke 17 G. Auch die Rinderproduktion Nord setzt unter Feldbedingungen bei adulten Rindern großlumige Nadeln der Stärke 16 G ein (KUWER, persönliche Mitteilung). BALTUSSEN et al. (1992) stellten jedoch eine steigende Anzahl beschädigter Follikel bei der Verwendung großlumiger Nadeln fest. Ein wichtiger Parameter
bei OPU stellt die Höhe des Aspirationsvakuums dar, die in mm HG oder besser als Durchflussrate in ml/min. angegeben wird. Der tatsächlich an der Nadelspitze herrschende Unterdruck ist abhängig von Durchmesser und Länge des Schlauches und der Nadel (RATH 1993).
Entscheidend für den Unterdruck ist auch, ob man ein 1-Schlauch- oder 2-Schlauchsytem verwendet. Beim 1-Schlauchsytem wird vor der eigentlichen Punktion die Spülflüssigkeit PBS in den Schlauch aspiriert. Beim 2-Schlauchsytem sind zwei Schläuche über ein gemeinsames Y-Stück miteinander verbunden. Ein Schlauch davon ist für die Aufrechterhaltung des Vakuums zuständig, während mit dem anderen die Spülflüssigkeit PBS zugeführt wird (KLOSSOK 1997). Je mehr Verschlüsse und damit auch Verengungen oder Erweiterungen im Lumen des Systems zwischen Nadel und Auffanggefäß vorhanden sind, umso turbulenter ist die Strömung. Je turbulenter die Strömung, umso größer ist die Gefahr, dass die empfindlichen Kumuluszellen abgelöst werden und damit die Qualität der Oozyten beeinträchtigt wird. Daher wird das 1-Schlauchsystem dem 2-Schlauch-System vorgezogen. Ein weiterer entscheidender Punkt ist die Flexibilität des Schlauches. Je weicher und flexibler der Schlauch ist, um so schneller kommt es zu Abknickungen und Spiralenbildungen, die wiederum zu Turbulenzen in der Strömung führen. Wenn ein Schlauch wiederverwendet wird, darf er auch nach mehrmaliger Sterilisierung nicht porös werden (EIKELMANN, persönliche Mitteilung). Ein weiterer Vorteil ist es, wenn man das Auffangglas für die KOK auf eine niedrigere Ebene stellt, so dass aufgrund des hydrostatischen Druckes ein zügiger Abfluss gewährleistet ist (FRANK, mündliche Mitteilung). Aufgrund der aufgeführten Faktoren ist es sinnvoller, nicht den Druck auf der Anzeige der Vakuumpumpe, sondern die Durchflussrate in ml/min. anzugeben (RATH 1993).
BRUSSOW et al. (1997) untersuchten beim endoskopischen Ovum pick up beim Schwein verschiedene Durchflussraten und stellten fest, dass eine Durchflussrate zwischen 17 und 32 ml beim Schwein am besten für Wiederfindungsrate und Oozytenqualität ist. Bei Erhöhung des Druckes bzw. der Durchflussrate steigerte sich bis zu einem gewissen Grad die Wiederfindungsrate, aber die Qualität der KOK nahm durch Ablösung der Kumuluszellen ab. Bei Untersuchungen des Aspirationsdruckes im Zusammenhang mit dem Nadeldurchmesser bei der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion beim Rind
wurde festgestellt, dass bei einer 18G-Nadel und einem Druck von 40 mm HG die besten Oozytenqualitäten gewonnen werden. Das gleiche gilt für eine 21G-Nadel bei 80mm HG (HASHIMOTO et al.1999). WARD et al. (2000) untersuchten den Aspirationsdruck nicht nur im Hinblick auf Wiederfindungsrate und Oozytenqualität, sondern auch im Zusammenhang mit der In-vitro-Entwicklungskapazität boviner Oozyten. Die Gesamt-Wiederfindungsrate sank stark ab bei einem Druckanstieg über 50 mm HG. Parallel zum Druckanstieg sank die Wiederfindungsrate der Oozyten der Klasse I signifikant, während die Anzahl denudierter Oozyten signifikant zunahm. Der Anteil an Blastozysten sank signifikant bei einem Druck von über 50 mm Hg.
2.3.5 Einfluss der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion auf die Gesundheit der Spendertiere
Ein gebräuchlicher Parameter für die Geschlechtsgesundheit von Tieren, die einer Follikelpunktion unterzogen wurden, ist die Trächtigkeitsrate. LOONEY et al. (1995) punktierten präpuberale Rinder fünfmal und erzielten später bei diesen Tieren durch künstliche Besamung eine Trächtigkeitsrate von 93 %. Rick (1996) führte sogar eine Dauerpunktion über neun Monate durch, nach der acht von neun Tieren tragend wurden. Ein Tier musste wegen einer Bauchfellentzündung geschlachtet werden. PETYIM et al. (2000) stellten bei Milchkühen auch bei wiederholter Follikelpunktion zweimal in der Woche einen normalen Zyklus und eine normale Struktur des Corpus luteum fest. Sie fanden keine negativen Effekte auf die Funktion und die Struktur des Ovars.
Nach Schlachtung stellten PIETERSE et al. (1991) außer Verhärtungen an der „Tunica albuginea“ der Ovarien keine Veränderungen am Genitaltrakt fest. VAN DER SCHANS et al. (1991) fielen ebenfalls Veränderungen an der Ovarkapsel und stellenweise hämorrhagische Follikel auf. Ansonsten wurden keine pathologischen Veränderungen gefunden. Auch BUCHER et al. (1996) stellten nach zweimal wöchentlich durchgeführter Punktion nur eine erhöhte Anzahl an hämorrhagischen Follikeln und Läsionen an der Ovaroberfläche fest.
2.3.6 Gewinnung von Oozyten durch die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion bei adulten Spendertieren mit und ohne vorherige hormonale Stimulation
Während durch Applikation von Hormonen bei präpuberalen Kälbern bessere Ergebnisse erzielt werden können, ist der Einsatz bei adulten Donoren umstritten. PIETERSE et al.
(1992) verglichen unstimulierte mit PMSG vorbehandelten Spendern und stellten bei den hormonbehandelten Rindern zwar eine erhöhte Anzahl an Follikeln, aber eine niedrigere Gewinnungsrate als bei unstimulierten Donoren fest. BUNGARTZ et al. (1995) erzielten bei stimulierten Rindern (100 mg FSH) im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant höhere Anzahl an punktierten Follikeln, jedoch waren Menge der gewonnenen KOK, Gewinnungsrate und In-vitro-Entwicklungsraten nicht unterschiedlich. EIKELMANN (1999) stimulierte trächtige Rinder mit 200 mg FSH 72 Stunden vor jeder OPU-Sitzung.
Hierbei wurde zwar eine signifikant höhere Anzahl an Follikeln im Vergleich zur Kontrollgruppe aspiriert, die Ausbeute an KOK und IVP-tauglichen KOK unterschied sich nicht signifikant. GOODHAND et al. (2000) stimulierten eine Gruppe Spendertiere mit Progestagen und Östradiol 17-ß, eine zweite Gruppe wurde einmalig mit FSH behandelt und eine dritte Gruppe erhielt mehrfach Dosen an FSH. Bei der ersten Gruppe wurde weder auf die Anzahl der Follikel und Oozyten noch auf die Embryonen-Produktion ein positiver Effekt erzielt. Bei beiden FSH-Gruppen war die Anzahl der aspirierten Follikel und der gewonnenen Oozyten der Klasse I signifikant erhöht. RATH (1993) sah in der erhöhten Anzahl an großen Follikeln einen Vorteil für unerfahrene Operateure, da hierdurch die Aspiration einfacher sein sollte.
SCHERNTHANER et al. (1999) punktierten unstimulierte Rinder zweimal pro Woche, gewannen durchschnittlich 5 Oozyten und 0,8 transferfähige Embryonen pro Tier pro Punktion. BOLS et al. (1996) stimulierten drei Kühe (Blaue Belgier) mit FSH (500 µg) und LH (100 µg) und beobachteten eine signifikante Zunahme in der Anzahl punktierter Follikel, gewonnener KOK und der Blastozystenzahl pro Punktion, gegenüber Einzeltierpunktionen derselben unstimulierten Kühe. KONISHI et al. (1996) punktierten acht Japanese Black Kühe, bei denen vorher ein konventionelles Superovulationsprogramm erfolglos war. Die Kühe wurden mit Inhibin α aktiv immunisiert. Es gab große Variationen
in Anzahl und Qualität der gewonnenen KOK zwischen den einzelnen Spendern. Auch die Entwicklungskapazität nach IVF war sehr unterschiedlich. Die Resultate zeigten, dass die Reaktion der Tiere auf eine Stimulation vor Ovum pick up individuell sehr unterschiedlich ist. Sie zeigten aber auch, dass die Ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion eine Alternative zum herkömmlichen Embryotransfer mit Superovulation darstellen kann. Auch FRY et al. (1994) untersuchten neben der Anwendung von eCG (von 750 I.U. pro Woche) den Einsatz einer Vakzine gegen Inhibin und stellten im Vergleich mit unstimulierten Tieren einen hochsignifikant erhöhten Anteil an Follikel mit einem Durchmesser von 5 bis 9 mm und 10 mm fest. BURATINI et al. (2000) punktierten bei der Rasse Bos Indicus am fünften Tag des Zyklus den dominanten Follikel, nachdem die Tiere am zweiten Tag mit 320 mg rBST (rekombinantes bovines Somatotropin) behandelt worden waren. Die Punktion des dominanten Follikels führte zu einer Synchronisation der Follikelentwicklung, während die Stimulation mit rBST zu einer Erhöhung der peripheren IGF-I-Konzentration und zu einem Anstieg der Anzahl kleiner Follikel führte. BOLS et al. (1998) punktierten HF-Kühe über einen Zeitraum von 10 Wochen zweimal die Woche. Sie stimulierten eine Gruppe einmal in der Woche mit 640 mg rBST und verglichen diese mit einer Kontrollgruppe. Die rBST-Gruppe hatte eine signifikant höhere Anzahl an Follikeln. Bei der Wiederfindungsrate der KOK und beim Anteil an Blastozysten bestanden zwischen beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede. In der Übersicht 1 sind Untersuchungen zum Einfluß einer hormonaler Vorbehandlung adulter Spendertiere auf das Punktionsergebnis und die In-vitro-Entwicklungskapazität der gewonnenen Oozyten aufgeführt.
Übersicht 1: Einfluss hormonaler Vorbehandlung adulter Spendertiere auf das