Kaltes Plasma als innovative Technologie zur
Haltbarkeitsverbesserung von Fleischerzeugnissen und Verbesserung der Exportaussichten
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Karolina Anna Lis
Hannover
Hannover 2018
-sicherheit Wissenschaftliche Fachbetreuung: Dr. Birte Ahlfeld
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
1. Gutachter: Prof. Dr. Corinna Kehrenberg, PhD 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Frerk Feldhusen Tag der mündlichen Prüfung: 26.10.2018
Das Projekt wurde finanziell von der Fritz-Ahrberg-Stiftung Hannover gefördert.
Meinen Eltern
“Messieurs, c’est les microbes qui auront le dernier mot. “
(“Gentlemen, it is the microbes who will have the last word.”) Louis Pasteur
Inactivation of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes on ham with nonthermal atmospheric pressure plasma
PLOS ONE, DOI: https: 10.1371/journal.pone.0197773
Lis K.A., Kehrenberg C., Boulaaba A., von Köckritz-Blickwede M., Binder S., Li Y., Zimmermann J.L., Pfeifer Y., Ahlfeld B.:
Inactivation of multidrug-resistant pathogens and Y. enterocolitica with cold atmospheric pressure plasma on stainless steel surfaces
International Journal of Antimicrobial Agents,
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2018.08.023
Lis K.A., Boulaaba A., Kehrenberg C., Klein G., Ahlfeld B. (2017):
Einfluss von kaltem Plasma auf Listeria monocytogenes und Salmonella Typhimurium auf Lachsschinken
Vortrag am 27.09.2017 im Rahmen der 58. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes
„Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Garmisch-Partenkirchen vom 26.09. bis 29.09.2017, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle (Sonderausgabe), ISSN 0945-3296
Lis K.A., Boulaaba A., Kehrenberg C., Ahlfeld B. (2017):
Einfluss von kaltem Plasma auf Listeria monocytogenes und Salmonella Typhimurium auf Lachsschinken – ein Vergleich unterschiedlicher Plasma-Einstellungen
Vortrag am 22.11.2017 im Rahmen des Doktorandenseminars am Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Lis K.A., Boulaaba A., Kehrenberg C., Ahlfeld B. (2018):
Einfluss zweier Einstellungs-Modi auf die Erzeugung des Nichtthermischen- Atmosphärendruckplasmas und der Effektivität gegen S. Typhimurium und L. monocytogenes auf Lachsschinken
In: 59. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Garmisch-Partenkirchen vom 25.09. bis 28.09.2018, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle (Sonderausgabe), ISSN 0945-3296
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 7
2. Schrifttum ... 10
2.1. Definition von Plasmen ... 10
2.2. Erzeugung des kalten Plasmas ... 11
2.3. Aufbau und Funktionsweise der Surface-Micro-Discharge Plasma-Quelle .... 15
2.4. Kaltes Plasma als nichtthermisches Haltbarmachungs- bzw. Sterilisationsverfahren ... 16
2.4.1. Anwendungsmöglichkeiten im medizinischen Sektor ... 16
2.4.2. Anwendungsmöglichkeiten im Lebensmittelbereich bzw. in der Lebensmittelhygiene... 17
2.5. Rechtliche Grundlagen ... 18
2.6. Der Rohschinken ... 19
2.7. Bakterielle Zoonoseerreger in Deutschland... 20
2.7.1. Listeria spp. ... 23
2.7.2. Enterobacteriaceae ... 24
2.7.3. Enterococcus faecium ... 27
2.7.4. Staphylococcus aureus ... 27
2.7.5. Acinetobacter baumannii ... 28
2.8. Bedeutung multiresistenter Erreger ... 29
2.9. Ziele der Studie ... 31
3. Publikationen ... 33
3.1. Publikation 1 ... 33
3.2. Publikation 2 ... 36
4. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion ... 41
4.1. Einfluss der Plasmachemie auf die Reduktion ... 41
4.2. Einfluss der Luftfeuchtigkeit auf die Zusammensetzung der Plasmachemie .. 44
4.3. Einfluss der bakteriellen Zellwand auf die Reduktion durch radikale Plasmaspezies ... 47
4.3.1. Intrazelluläre Interaktion der radikalen Plasmaspezies mit den Zellorganellen ... 50
4.4. Einfluss der Oberfläche auf die Reduktion ... 52
4.5. Einfluss der Zellform des Bakteriums auf die Abtötung ... 54
4.6. Einfluss der Lagerung auf die Reduktion von Bakterien ... 57
4.7. Einfluss der Bakterienzelldichte auf die Reduktion ... 61
4.8. Chemisch-physikalische Untersuchungen des plasmabehandelten Lachsschinkens ... 63
5. Schlussfolgerungen ... 68
6. Ausblick ... 70
7. Zusammenfassung ... 71
8. Summary ... 74
9. Literaturverzeichnis... 76
10. Anhang ... 96
10.1. Tabellenverzeichnis ... 96
11. Danksagung ... 97
Abkürzungsverzeichnis
ΔE-Wert delta E, Farbabstand
a*-Wert Rot-/Grünwert
Abb. Abbildung
Aw-Wert Wasseraktivität eines Lebensmittels
b*-Wert Gelb-/Blauwert
BEFFE Bindegewebseiweißfreies Fleischeiweiß
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
°C Grad Celcius
C Sättigung, engl. Chroma
CAP Cold atmospheric plasma
CIE Commission international de l’éclairage
cm2 Quadratzentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
DBD dielektrisch behinderte Entladung, engl. Dielectric- Barrier-Discharge
DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen
DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft
e Elektron
e- angeregtes Elektron
EFSA European Food Safety Authority
EG Europäische Gemeinschaft
EHEC Enterohämorrhagische E. coli
et al. et alii
EU Europäische Union
eV Elektronenvolt
g Gramm
GKZ Gesamtkeimzahl
H Buntton, engl. Hue
H2O Wassermolekül
H3O+ Hydronium-Ion
H2O2 Wasserstoffperoxidmolekül
HACCP Hazard analysis and critical control point
hPa Hektopascal
IDSA Infectious Diseases Society of America
IfSG Infektionsschutzgesetz
ISO International Organization for Standardization
K Kelvin
KbE Koloniebildende Einheit
(KbE/g) Koloniebildende Einheiten pro Gramm
kHz Kilohertz
KRINKO Kommission für Krankenhaushygiene und
Infektionsprävention
kV Kilovolt
L*-Wert Helligkeit
lg Logarithmus zur Basis 10
LMBestrV Lebensmittelbestrahlungsverordnung
m Meter
µm Mikrometer
min Minuten
ml Milliliter
MRGN Multiresistente gramnegative Erreger
ƞ Dichte
N2 Stickstoffmolekül
N2. Radikales Stickstoffmolekül
N. Stickstoff-Radikal
NIR Nahinfrarot-Spektroskopie
NO Stickstoffmonoxidmolekül
NO2 Stickstoffdioxidmolekül
NO3 Nitratmolekül
NRZ Nationales Referenzzentrum
NTP Nonthermal atmospheric pressure plasma
O. Sauerstoff-Radikal
O2 Sauerstoffmolekül
O3 Ozonmolekül
OH Hydroxylmolekül
OH. Hydroxyl-Radikal
ƿ Druck
PI Propidium Iodid
REGWQ Ryan-Einot-Gabriel-Welsch mit Q-Test
RKI Robert Koch-Institut
RNS Radikale Stickstoffspezies
ROS Radikale Sauerstoffspezies
RTE Ready-To-Eat
SMD Surface-Micro-Discharge
spp. Subspezies
XLD Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar
YOPIS young, old, pregnant, immunosuppressed
7 1. Einleitung
Seit vielen Jahren ist im Lebensmitteleinzelhandel ein Trend zu bereits aufgeschnittenen und vorverpackten Lebensmitteln zu beobachten. Zu diesen sogenannten Ready-To-Eat (RTE)-Produkten zählen auch die in Deutschland sehr beliebten Fleischerzeugnisse. Mehr als 66 % der Haushalte haben im Jahr 2014 Fleisch- und Wurstwaren in vorverpackter Form eingekauft (ANONYMOUS 2016g). Da die RTE-Produkte für den direkten Verzehr bestimmt sind, erfolgt nur selten eine Wärmebehandlung dieser Lebensmittel.
Durch den Schneideprozess und der damit verbundenen Vergrößerung der Oberfläche des Lebensmittels, sowie durch den nachfolgenden Verpackungsvorgang können unterschiedliche Pathogene ein RTE-Produkt kontaminieren (KESKINEN et al. 2008).
In den letzten Jahren berichtete die European Food Safety Authority (EFSA) eine stete Zunahme von lebensmittelbedingten Krankheitsausbrüchen, die vor allem durch Zoonose-Erreger verursacht wurden (ANONYMOUS 2015c). Das Robert Koch-Institut (RKI) bestätigte in seinem jährlichen infektionsepidemiologischen Jahrbuch 2016 diesen Trend (ANONYMOUS 2016f). So konnte verzeichnet werden, dass die Anzahl gemeldeter Salmonellosen leicht stagnierte, die Salmonellose mit jedoch fast 13.000 gemeldeten Erkrankungen die zweithäufigste bakterielle gastrointestinale Erkrankung in Deutschland ist (ANONYMOUS 2016f). Die Anzahl gemeldeter Listeriosen ist zunehmend. Im Jahr 2013 wurden knapp 1.800 Fälle an das Robert Koch-Institut (RKI) übermittelt. Bei diesen gemeldeten Infektionen handelte es sich um die schwere, invasive Form der Listeriose, die eine hohe Sterberate aufweist (ANONYMOUS 2015d).
Neben diesen beiden Zoonoseerregern können auch enterohämorrhagische Escherichia (E.) coli (EHEC), Yersinia spp. und Staphylococcus (S.) aureus lebensmittelbedingte Krankheitsausbrüche verursachen (MISRA et al. 2015;
ANONYMOUS 2016f).
8 Durch das Vorkommen auf Lebensmitteln können diese Erreger viele Konsumenten erreichen. Da die klinischen Krankheitsbilder sehr variabel sind, ist der Zusammenhang zur Aufnahme kontaminierter Nahrungsmittel häufig nicht sicher.
Somit ist auch davon auszugehen, dass die Dunkelziffer der tatsächlichen Erkrankungen weitaus höher liegt. Vor allem sind junge, alte, schwangere oder immunsupprimierte Personen (engl. young, old, pregnant, immunosuppressed;
YOPIS) prädisponiert, an einer Zoonose zu erkranken.
Neben den typischen Zoonoseerregern werden zunehmend auch pathogene Keime auf Lebensmitteln nachgewiesen, die nicht zu den typischen Zoonoseerregern gezählt werden (ONICIUC et al. 2015). Diese Erreger werden von der Society for Infectious Diseases of America (IDSA) als ESKAPE-Erreger zusammengefasst. Der Begriff ESKAPE umfasst die Bakterienspezies Enterococcus (E.) faecium, S. aureus, Klebsiella (K.) pneumoniae, Acinetobacter (A.) baumannii, Pseudomonas (P.) aeruginosa und die Familie der Enterobacteriaceae. Häufig sind diese Erreger durch das Vorhandensein von multiplen phänotypischen Resistenzen charakterisiert.
Die genauen Verbreitungswege der multiresistenten Erreger sind sehr vielfältig. Neben dem Vorkommen auf Lebensmitteln treten diese Erreger auch als Verursacher nosokomialer Infektionen zunehmend in Krankenhäusern in Erscheinung (ANONYMOUS 2016f). Hitze-sensible Medizingeräte, unzureichende bzw. nicht wirksame Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen sowie bereits kolonisierte Patienten werden als Quelle dieser Erreger angenommen (YAZAJI 2011; ONICIUC et al. 2015).
Diese Arbeit untersuchte die Wirkung des kalten Atmosphärendruck Plasmas als eine neue Technologie für ein nichtthermisches Verfahren zur Haltbarmachung von Lebensmitteln gegenüber einer Vielzahl von verschiedenen Erregern auf unterschiedlichen Matrices. Die zur Erzeugung des kalten Plasmas genutzte Surface- Micro-Discharge Quelle (SMD-Quelle) zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass sie mit Umgebungsluft als Arbeitsgas betrieben wird, relativ große Oberflächen sterilisiert werden und ein Einbau der Apparatur in Produktionsketten lebensmittel- verarbeitender Betriebe möglich ist. Somit sind die Grundvoraussetzungen für einen
9 weiten Einsatz in industriellen Prozessketten und an klinisch relevanten Knoten- punkten erfüllt.
Ziel einer ersten Versuchsreihe war, anhand der Reduktion von S. Typhimurium und L. monocytogenes auf Rohschinken vier unterschiedliche Plasma-Modi zu vergleichen. Als RTE-Produkt wurde dafür Lachsschinken (Typ Rohschinken) ausgewählt. Im Anschluss an die direkte Plasma-Behandlung, sowie während der Lagerung unter einer modifizierten Schutzgasatmosphäre, wurden die mikro- biologische Stabilität und die produkttypischen Eigenschaften untersucht, um die Wirkung des kalten Plasmas auf die Produktoberfläche zu untersuchen und eine gleichbleibende Produktqualität zu gewährleisten.
Im zweiten Teil der Untersuchungen wurde die Effizienz des effektivsten Plasma- Modus zur Reduktion von multiresistenten Keimen getestet. Die dabei genutzten Isolate stammten aus humanen Feldinfektionen oder wurden aus illegal eingeführten Lebensmitteln isoliert. Ausgewählt wurden multiresistente Isolate von E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii und E. coli. Anders als für S. Typhimurium und L. monocytogenes sind bisher nur wenige Studien über die Reduktion multiresistenter Erreger und Y. enterocolitica durch die Behandlung mit kaltem Plasma durchgeführt worden. Daher wurden die Abtötungsversuche zunächst auf standardisierten Edelstahl-Keimträgern durchgeführt. Edelstahl stellt eine typische Oberfläche dar, die sowohl in lebensmittelverarbeitenden Betrieben als auch in Krankenhäusern vorkommt. Übergreifend wurde der Einfluss der beiden unterschiedlichen Matrices Rohschinken und Edelstahl auf die Effektivität von kaltem Plasma untersucht.
10 2. Schrifttum
2.1. Definition von Plasmen
Unter Plasmen versteht man ionisierte bzw. teil-ionisierte leitfähige Gase. Bei steigender Energiezufuhr durchläuft Materie die Aggregatzustände von fest über flüssig zu gasförmig, bis die neutralen Atome und Moleküle in freie Ladungsträger wie Ionen, Elektronen, angeregte Atome/Moleküle und freie Radikale zerfallen. Daher werden Plasmen auch als der vierte Aggregatzustand beschrieben.
Plasmen werden auf Grundlage ihrer Temperatur in Hochtemperatur- und Niedertemperaturplasmen gegliedert (LAROUSSI et al. 2012).
Die Erzeugung von Plasmen erfolgt durch die Zufuhr von Energie zu einem Arbeitsgas, z.B. über ein elektrisches Feld. Unterschiedliche Plasmen werden moduliert durch Verwendung verschiedener Arbeitsgase, Gasdrücke, Spannungen und Entladungsdauern des elektrischen Feldes.
Bei den isothermischen Hochtemperaturplasmen befinden sich alle Teilchen (Elektronen, Ionen, Atome und Moleküle) in einem thermischen Gleichgewicht, da alle entstehenden Elektronen und Ionen durch ein Plasma-erzeugendes elektrisches Feld die gleiche Energiezufuhr erfahren. In der englischsprachigen Literatur wird daher die Bezeichnung Equilibrium Plasma verwendet (SEEGER 1973).
Hochtemperaturplasma („heißes“ Plasma) macht 99 % der sichtbaren Materie des Universums aus und weist Gastemperaturen von bis zu mehreren Millionen Kelvin (K) auf (LAROUSSI et al. 2012). Zu den terrestrischen und astrophysikalischen Plasmen werden u.a. Blitze, Polarlichter und Sonnenwinde gezählt. Auf der Erde selbst treten heiße Plasmen nur als künstlich erzeugte Plasmen auf. Diese finden in der Industrie, im medizinischen Sektor und in der Fusionsforschung ihren Einsatz (FRIDMAN et al.
2005).
Niedertemperaturplasmen hingegen sind nicht-isothermische Plasmen (engl. non- equilibrium plasma), da die Plasmateilchen in Abhängigkeit von ihrer Masse divergente Temperaturen haben. Die zur Erzeugung von Niedertemperaturplasmen angelegte Spannung ist um viele Potenzen niedriger als die zur Erzeugung der
11 Hochtemperaturplasmen. Dadurch wird dem Plasma nur so viel Energie zugeführt, dass zunächst die leichten Elektronen beschleunigt werden, diese durch Kollision mit dem Neutralgas Ionen erzeugen, wobei es zu keiner Angleichung der Temperaturen der Ionen, Atome und Moleküle des Gases kommt (HIRSCHBERG 2017;
TERRAPLASMA-GMBH 2018). Es liegen Elektronen mit hoher Energie von etwa 1 Elektronenvolt (eV) und schwere Atome und Moleküle mit geringerem kinetischen Energiegehalt vor.
2.2. Erzeugung des kalten Plasmas
Wenn keine Energiezufuhr erfolgt, befinden sich alle Atome oder Moleküle in ihrer energetisch günstigsten Konfiguration.
Grundvoraussetzung für die Entstehung eines Plasmas ist das Vorhandensein freier Elektronen, die durch ein elektrisches Feld beschleunigt werden können.
Um freie Elektronen zu erzeugen, muss an die Kathode eine ausreichend hohe Spannung angelegt werden, damit sich Elektronen aus der Kathode lösen können.
Diese gerade ausreichende Spannung wird als Durchbruchspannung bezeichnet (SEEGER 1973). Kann ein frei gewordenes Elektron im angelegten elektrischen Feld so stark beschleunigt werden, dass die kinetische Energie des Elektrons ausreicht, um mindestens ein weiteres Atom oder Molekül zu ionisieren, so ist die Plasmabildung initiiert. Man bezeichnet dies auch als Plasmazündung (LAROUSSI et al. 2012). Die Anzahl der freien Ladungsträger ist dann groß genug, um Neutralisationsreaktionen von Elektronen und neutralen Teilchen auszugleichen (z.B. durch Rekombination) und somit die Leitfähigkeit des Gases aufrecht zu erhalten. Die Durchbruchspannung ist dabei nach dem Paschen-Gesetz abhängig vom Gasdruck und dem Elektrodenabstand (SEEGER 1973).
Die anhaltende Beschleunigung der Elektronen durch das elektrische Feld führt zu einer zunehmenden Geschwindigkeit der Elektronen (FUßMANN 2003). Mit zunehmender Wegstrecke im elektrischen Feld steigt somit die kinetische Energie (Ee) der Elektronen.
Durch Kollisionsreaktionen mit weiteren Gasteilchen wie Atomen oder Molekülen werden die Elektronen im elektrischen Feld abgebremst. Sie verlieren in diesem
12 Moment einen Teil ihrer kinetischen Energie. Im Sinne des Energieerhaltungssatzes wird dieser Teil der Energie dabei auf das kollidierende Teilchen übertragen oder in Form von photoelektrischer Energie abgegeben (LAROUSSI et al. 2012).
Je nach Teilchendichte im elektrischen Feld können die Elektronen bis zu einer Kollision mit einem anderen Teilchen eine unterschiedlich lange Strecke beschleunigen und somit unterschiedlich hohe kinetische Energien aufbauen. Dabei ist die mittlere kinetische Energie abhängig von der mittleren freien Weglänge γme. Die mittlere freie Weglänge ist definiert als die Weglänge, die das Elektron im Durchschnitt zurücklegt, bis es mit einem weiteren Teilchen des Arbeitsgases zusammenstößt (SEEGER 1973).
Im Rahmen der Kollisionen kommt es in Abhängigkeit des Betrages von Ee und des Kollisionswinkels zu verschiedenen Formen der Energieübertragung. Freie Elektronen, die mit Hüllelektronen von Atomen/Molekülen kollidieren, können in Abhängigkeit des übertragenen Energiebetrages die Hüllelektronen in ein höheres Energieniveau versetzen (Stoßanregung) oder genug Energie übertragen, sodass sich die Hüllelektronen aus dem Atommantel lösen können (Stoßionisation) (EISNER et al.
2000).
Eine sogenannte Stoßanregung erfolgt (Gleichung 1), wenn ein Elektron der äußeren Schale zunächst nur in ein höheres Energieniveau versetzt wird, da die Elektronenenergie nicht ausreicht, um die Bindungsenergie des Elektrons an die Protonen im Atomkern zu überwinden. Das entsprechende Atom befindet sich nun in einem sogenannten angeregten Zustand (*).
𝐴+𝑍 + 𝑒 ↔ (𝐴+𝑍)∗+ 𝑒 (1)
A+Z = Atom im Grundzustand, e = Elektron, (A+Z)* = Atom in höherem Energieniveau
Wenn ein Gasteilchen durch ein Elektron angeregt ist, also eine Stoßanregung erfolgte, gibt es zwei Möglichkeiten der Energie-Weitertragung. Einerseits kann durch ein weiteres Elektron noch mehr Energie auf das angeregte Gasteilchen übertragen
13 werden, wodurch schlussendlich eine Stoßionisation erfolgt. Wenn aber andererseits zeitnah keine weitere Energieübertragung auf das angeregte Teilchen erfolgt, dann fällt das Elektron in den stabilen Grundzustand zurück und die dabei frei werdende Energie wird als Photon ausgesendet (FUßMANN 2003). Das Photon hat ebenfalls eine definierte Photonenenergie (EPhoton = ℎ𝑣), welche auf weitere Atome oder Moleküle übertragen werden und dabei wiederum Teilchen anregen oder ionisieren kann (sog. photoelektrischer Effekt, Gleichungen 2-3).
𝐴+𝑍 + ℎ𝑣 ↔ (𝐴+𝑍)∗ (2)
𝐴+𝑍+ ℎ𝑣 ↔ 𝐴+𝑍+1+ 𝑒 (3)
A+Z = Atom im Grundzustand, ℎ𝑣 = Photonenenergie, (A+Z)* = Atom in höherem Energieniveau, A+Z+1 = ionisiertes Atom, e = Elektron
Wenn die Hüllelektronen eine Energiezufuhr erfahren, die höher ist als die Bindungsenergie der Elektronen zu den Protonen im Atomkern, werden die Hüllelektronen aus der äußeren Elektronenschale gelöst. Da das entsprechende Teilchen durch den Verlust eines Elektrons einen negativen Ladungsträger abgibt und nun positiv geladen bzw. ionisiert ist, spricht man von einer Stoßionisation.
Bei der Stoßionisation entstehen somit durch das positiv geladene Ion und das nun frei gewordene Elektron zwei neue Ladungsträger, die wie die initial vorhandenen Elektronen im elektrischen Feld beschleunigt werden und dabei kinetische Energie aufbauen (Gleichung 4).
𝐴+𝑍+ 𝑒 ↔ 𝐴+𝑍+1 + 𝑒 + 𝑒 (4)
A+Z = Atom im Grundzustand, e = Elektron, A+Z+1 = ionisiertes Atom
Durch (Sekundär-) Kollisionen sind auch diese Teilchen in der Lage, durch erneute Stoßanregungen und Stoßionisationen Energie auf andere Teilchen zu übertragen.
14 Es entsteht somit eine Kettenreaktion im elektrischen Feld, die auch als Ladungsträgerlawine bezeichnet wird (FUßMANN 2003). Dabei kann durch ein einzelnes Elektron eine Ladungskaskade mit bis zu 600 weiteren Atomen bzw.
Molekülen initiiert werden (ZIMMERMANN 2013).
Im Rahmen der Zuführung kinetischer Energie auf Teilchen im elektrischen Feld und möglicher Umwandlung in kalorische Energie stellt sich die Frage nach der Temperatur der entstehenden Plasmen.
Im Zuge der Plasmazündung entstehen in dem elektrischen Feld primär nur Elektronen mit sehr hohen Temperaturen von etwa zehn Elektronenvolt (10 eV), während auf die neutralen Atome und Moleküle nur ein Bruchteil dieser Energie übertragen wird und sie somit nur eine geringe Erwärmung erfahren (LAROUSSI et al. 2012). Auch können Ionen-Neutralgasstöße zur Thermalisierung des Gases führen (TERRAPLASMA- GMBH 2018).
Für kalte Plasmen ist jedoch kennzeichnend, dass das erzeugte elektrische Feld um viele Potenzen niedriger ist als das elektrische Feld der thermischen Plasmen, wodurch meist nur ein Ion bzw. Elektron pro Milliarde neutraler Atome oder Moleküle ionisiert wird (TERRAPLASMA-GMBH 2018). Dadurch weist das Trägergas eine Temperatur nahe der Raumtemperatur (etwa 20 °C) auf, die um mehrere Größen- ordnungen niedriger ist, als die der ursprünglich erzeugten Elektronen (EHLBECK et al. 2010)
Somit besteht nur eine geringe Gefahr einer thermischen Schädigung von mit Plasma behandelten Proben. Messungen der Temperatur durch die terraplasma GmbH zeigten, dass auch die Temperatur des in diesen Versuchen (Publikation 1 und Publikation 2) bei Atmosphärendruck (bei 0 m über dem Meeresspiegel 105 Pa ~ 1013 hPa) erzeugten kalten Atmosphärendruck Plasmas die Raumtemperatur von etwa 20 °C nicht übersteigt (ZIMMERMANN 2013).
15 2.3. Aufbau und Funktionsweise der Surface-Micro-Discharge Plasma- Quelle
Die verwendete semidirekte Plasma-Quelle beruht auf einer sogenannten Oberflächenmikroentladungstechnologie [engl. Surface-Micro-Discharge-Technology (SMD-Technology)]. Die Generierung des kalten Plasmas erfolgt wie bei einem direkten Plasma durch das Anlegen einer Spannung an die Elektrode(n), jedoch fungiert die zu behandelnde Probe nicht als Gegenelektrode (HEINLIN et al. 2010).
Die SMD-Quelle besteht aus zwei zylindrischen Plasma-Quellen, bestehend aus jeweils zwei elektrisch voneinander isolierten Elektroden (TERRAPLASMA-GMBH 2018). Der genauere Aufbau ist aus der Publikation 1 (Figure 1) und der Publikation 2 (Figure 1) zu entnehmen. Das kalte Plasma wird in den beiden zylindrischen SMD- Plasma-Quellen, die in eine Elektrodenbox eingebettet sind, durch das Anlegen einer Spannung im Kilovolt- (kV) und einer Frequenz im Kilohertz- (kHz) Bereich mit Hilfe eines Hochspannungsverstärkers erzeugt.
Aus der mit der gewählten Spannung korrelierenden Energiezufuhr resultiert ein nur schwach ionisiertes nichtthermisches Plasma ohne ein thermodynamisches Gleichgewicht der einzelnen Plasmagas-Teilchen.
In diesem Versuchsaufbau wurde die günstigste Variante des Trägergases, nämlich Umgebungsluft, als Arbeitsgas ausgewählt. Die Zusammensetzung dieses Gasgemisches (~ 78 % Stickstoff, ~ 21 % Sauerstoff, ~ 0,09 % Argon, Wasserdampf und in verschiedenen Anteilen auch Kohlenstoffdioxid, Methan, etc.) variiert (FUßMANN 2003). Zudem ist die Teilchendichte dieses Gasgemisches nicht konstant.
Diese ist abhängig von der Temperatur, der Luftfeuchtigkeit und dem Luftdruck. Der Luftdruck wiederum ist abhängig von der Höhe über dem Meeresspiegel (SEEGER 1973; KONG et al. 2009; LAROUSSI et al. 2012).
Da Umgebungsluft aus verschiedenen Gasteilchen besteht, stellt sie ein inhomogenes Gas dar. Aus der somit punktuell unterschiedlichen Gaszusammensetzung resultiert eine nicht uniforme Plasmazündung an den Elektroden (LI et al. 2012). Die dabei erzeugten lokalen Mikroentladungen auf der Elektroden-Oberfläche haben ein fadenförmiges Aussehen und entstehen zufällig (SHIMIZU et al. 2011; ZIMMERMANN
16 2013). Die Länge dieser Mikroentladungen ist abhängig von der angelegten Spannung.
An den SMD-Quellen wird letztendlich ein inhomogenes Plasma-aktiviertes-Gas erzeugt. Veränderungen der Betriebsparameter wie Spannung, Frequenz und Luftfeuchtigkeit beeinflussen die Zusammensetzung des Plasmas, die sogenannte Plasma-Chemie, und können moduliert werden. Die weitere Plasmagenerierung folgt den in Abschnitt 2.2. beschriebenen physikalischen Grundlagen.
In anderen Studien werden häufig Edelgase als Trägergase genutzt. Diese haben den Vorteil einer homogenen Zusammensetzung und somit einer konstanten Teilchendichte (SEEGER 1973). Die konstante Teilchen- und Volumendichte des Edelgases führt zu einer uniformen Plasmazündung an den Elektroden (JEON 2014).
Die Wahrscheinlichkeit einer darauf folgenden Sekundärkollision der an der SMD- Elektrode erzeugten Elektronen mit einem weiteren Atom bzw. Molekül des Arbeitsgases ist proportional zur Dichte ƞ und damit zum Druck ƿ (SEEGER 1973;
HIRSCHBERG 2017). Je gleichmäßiger die Verteilung der Teilchen des Arbeitsgases ist, desto mehr Sekundärkollisionen entstehen (JEON 2014). Dadurch kann das Arbeitsgas vergleichsweise schneller ionisiert werden und beinhaltet eine eher höhere Konzentration energiereicherer radikaler Plasmaspezies. Somit kann ein stärkerer bakterizider Effekt ausgeübt werden.
2.4. Kaltes Plasma als nichtthermisches Haltbarmachungs- bzw.
Sterilisationsverfahren
Die Anwendung der kalten Plasmen gewann in der Medizin und später auch im Bereich der Lebensmittelhygiene in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung (ANONYMOUS 2016a). Als ein nichtthermisches Haltbarmachungs- bzw.
Sterilisationsverfahren eignet sich die Anwendung der kalten Plasmen vor allem zur Reduktion von mikrobiellen Kontaminanten auf belebten und unbelebten Oberflächen.
2.4.1. Anwendungsmöglichkeiten im medizinischen Sektor
In der Medizin etablierten sich zuerst heiße Plasmen. Diese werden im operativen Betrieb zur Kauterisation (Durchtrennung von Gewebestrukturen durch Hitze-
17 Anwendung), zur Koagulation (Blutstillung) und im postoperativen Bereich zur trockenen, heißen Sterilisation von medizinischen Gerätschaften verwendet (RAISER u. ZENKER 2006). Aufgrund der hohen Temperaturen ist das Anwendungsspektrum der heißen Plasmen jedoch stark limitiert.
Daher wurden zunehmend auch kalte Plasmen in der Anwendung in vielen verschiedenen Bereichen im Krankenhaussektor untersucht, da aufgrund der Temperatur (~ 20 °C) der kalten Plasmen ein breiteres Anwendungsspektrum möglich ist. So können hitze-sensitive Instrumente und Materialien effizienter sterilisiert werden. Weiterhin ist die Behandlung von chronisch infizierten Wunden möglich, ohne dass ein schädigender Einfluss auf das gesunde angrenzende Gewebe auftritt (G.
FRIDMAN et al. 2007; DOBRYNIN et al. 2009; HEINLIN et al. 2011). Hervorzuheben ist hier die Kombination der Abtötung von Bakterien und eine zeitgleiche Anregung der Gewebsproliferation (FRIDMAN et al. 2005; STOFFELS et al. 2008).
2.4.2. Anwendungsmöglichkeiten im Lebensmittelbereich bzw. in der Lebensmittelhygiene
Vor allem in der letzten Dekade begann sich der Forschungsschwerpunkt der Anwendung des kalten Plasmas auf Hygiene-, Desinfektions- und Konservierungsmaßnahmen von Lebensmitteln auszuweiten (BAIER et al. 2013;
BERMÚDEZ-AGUIRRE et al. 2013; LEE et al. 2015). Viele Lebensmittel- Haltbarmachungsverfahren sind mit einer Wärme- (z.B. Konservieren, Einmachen, Kochen) oder Druckzufuhr (High Pressure Processing) verbunden und führen zu organoleptischen Veränderungen des Lebensmittels (FRANKE 2000). Weiterhin bewirkt die Wärme- bzw. Druckzufuhr meist eine Veränderung des Nährstoffgehaltes des Lebensmittels (FRANKE 2000). Da Verbraucher zunehmend frische, jedoch bereits vorverpackte bzw. vorgeschnittene Lebensmittel mit einem hohen Gehalt an Nährstoffen präferieren, sind neue Haltbarmachungsverfahren notwendig (ANONYMOUS 2016g). Kaltes Plasma ist eine vielversprechende Technologie, die als neues nichtthermisches Haltbarmachungsverfahren zur Herstellung von mikrobiell nicht belasteten Lebensmitteln beitragen kann.
18 Die Kontaminationen von Arbeitsflächen oder Gerätschaften in lebensmittel- verarbeitenden Betrieben können den Eintrag lebensmittelpathogener Erreger während des Herstellungsprozesses auf Lebensmittel fördern (KESKINEN et al. 2008;
FRÖHLING et al. 2012). Unzureichende Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen, eine schlechte Schulung, oder wenig motiviertes Personal oder eine schleichende Entwicklung von Resistenzen der Mikroorganismen gegenüber den genutzten Desinfektionsmitteln können eine unerwünschte persistierende mikrobiologische Flora im Betrieb zur Folge haben, sodass neue Sterilisationsverfahren nötig sind, um dem vorzubeugen (BJORLAND et al. 2001; ANONYMOUS 2004).
Studien über die Anwendung von kaltem Plasma auf Lebensmitteln zeigten sowohl auf sehr unterschiedlichen Lebensmittelkategorien wie Früchten, Gewürzen, Fleisch, Nüssen und Samen als auch auf Industrie-assoziierten Oberflächen eine signifikante (p < 0,05) Keimreduktion unabhängig von den zu behandelnden Pathogenen wie Viren, Hefen, Schimmelpilzen sowie grampositiven und gramnegativen Bakterienspezies (KELLY-WINTENBERG et al. 1998; WELTMANN et al. 2008;
HÄHNEL et al. 2010; NORIEGA et al. 2011; FRICKE et al. 2012; ALKAWAREEK et al.
2014). Allerdings wurden für diese Studien mit Edelgasen-betriebene Plasma- Technologien wie z.B. der Plasma-Jet verwendet, die nur eine sehr geringe Oberfläche mit einem Durchmesser von wenigen Millimetern behandeln können (HEINLIN et al.
2011).
2.5. Rechtliche Grundlagen
Bisher liegen noch keine Studien und Ausarbeitungen zur rechtlichen Einordnung von mit kaltem Plasma behandelten Lebensmitteln vor.
In einer Stellungnahme der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zum Einsatz von Plasmaverfahren zur Behandlung von Lebensmitteln ist diskutiert worden, ob die mit kaltem Plasma behandelten Lebensmittel der Novel Food Verordnung zuzuordnen seien (ANONYMOUS 2012a). Am 01.01.2018 ist die neue Novel Food Verordnung (EU) 2015/2283 in Kraft getreten. Laut dieser Verordnung muss jedes neuartige Lebensmittel einem zentralen separaten Bewertungs- und Zulassungsverfahren durch die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) unterzogen werden (ANONYMOUS 2015e). Dabei sei noch zu prüfen, ob ein Bewertungs- und
19 Zulassungsverfahren für eine Plasma-Quelle samt der Einstellungen (Spannung, Frequenz, Arbeitsgas) ausreicht oder ob eine separate Prüfung jedes mit dieser Plasma-Quelle behandelten Lebensmittels notwendig ist (ANONYMOUS 2012a).
In der Verordnung über die Behandlung von Lebensmitteln mit Elektronen-, Gamma- und Röntgenstrahlung, Neutronen oder ultravioletten Strahlen (Lebensmittel- bestrahlungsverordnung, LMBestrV) ist die Behandlung von getrockneten aromati- schen Kräutern und Gewürzen durch die Elektronen-, Gamma- und Röntgenstrahlung in zugelassenen Bestrahlungsanlagen erlaubt (ANONYMOUS 2000). Zudem dürfen Trinkwasser, die Oberflächen von Gemüse- und Obsterzeugnissen sowie Hartkäse während der Lagerung zur Entkeimung einer direkten Behandlung mit ultravioletten Strahlen unterzogen werden. Durch eine Allgemeinverfügung nach § 54 des Lebensmittelmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB) dürfen bereits mit Elektronen-, Gamma- und Röntgenstrahlung in Frankreich behandelte Froschschenkel in Deutschland in den Verkehr gebracht werden (ANONYMOUS 2005a).
Im Gegensatz zur Anwendung von kaltem Plasma auf der Oberfläche von Lebensmitteln ist Ozon, u.a. ein Bestandteil des kalten Plasmas, bereits in Reinigungs- und Desinfektionsmitteln als Verarbeitungshilfsstoff zugelassen. Laut der Verordnung (EG) 2008/1333 ist ein „Verarbeitungshilfsstoff als ein Stoff definiert, der nicht als Lebensmittel verzehrt wird, aber bei der Verarbeitung von Rohstoffen, Lebensmitteln oder deren Zutaten aus technologischen Gründen während der Be- oder Verarbeitung verwendet wird und unbeabsichtigte, technische Rückstände des Stoffes oder seiner Derivate im Enderzeugnis hinterlassen kann, sofern diese Rückstände gesundheitlich unbedenklich sind und sich technologisch nicht auf das Enderzeugnis auswirken“
(ANONYMOUS 2008). Somit ist der Einsatz von Ozon im Rahmen der Lebensmittelherstellung zur Reinigung und Desinfektion von Gerätschaften und von Oberflächen aus lebensmittelrechtlicher und -hygienischer Sicht zugelassen.
2.6. Der Rohschinken
Lachsschinken ist der Kategorie Rohwürste zuzuordnen und wird- nach den Leitsätzen für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches- aus den
20 Kotelett-Strängen (lat. Musculus longissimus dorsi) vom Schwein erzeugt (ANONYMOUS 2015a). Lachsschinken ist ferner definiert als ein gepökelter Rohschinken, der von Knochen, Schwarte und sichtbarem Fettgewebe befreit ist und der selbst im zentralen Magerfleischanteil nicht mehr als 72 % Wasser beinhaltet (ANONYMOUS 2015a).
Der Prozess der Pökelung unterliegt der Hürdentheorie. Neben der Bildung des Pökelaromas wird die Lipidperoxidation verlangsamt und die Wasseraktivität (aw-Wert) des Fleisches gesenkt (WEBER 1996; JIRA 2004). Zu den weiteren Hürden zählen die Absenkung des Redoxpotentials und des pH-Wertes (LEISTNER u. RÖDEL 1976).
Die additive Wirkung der einzelnen Hürden führt dazu, dass Mikroorganismen effektiv reduziert werden können und ein mikrobiologisch sicherer, konservierter Rohschinken produziert wird (WEBER 1996).
Im Anschluss an die Herstellung wird der Schinken vakuumiert oder unter modifizierter Schutzgasatmosphäre verpackt, um organoleptischen Veränderungen vorzubeugen und die mikrobiologische Stabilität zu wahren. Während bei der Vakuumverpackung die umgebende Luft vollständig entzogen wird, wird bei der Verpackung unter Schutzgasatmosphäre ein Gasgemisch mit einem möglichst geringen Sauerstoffanteil genutzt (WEBER 2010). Hohe Konzentrationen an Stickstoff und Kohlenstoffdioxid der Schutzgasatmosphäre hemmen obligate anaerobe Mikroorganismen in ihrem Wachstum, sodass die Verpackungsart eine weitere Hürde zur Wahrung der mikrobiologischen Stabilität des Schinkens darstellt. Der Ausschluss von Sauerstoff aus der Schutzgasverpackung hemmt zudem den oxidativen Fettverderb des Lebensmittels (WEBER 1996).
2.7. Bakterielle Zoonoseerreger in Deutschland
Als durch Lebensmittel verursachte Erkrankungen werden laut WHO Krankheiten definiert, die durch infektiöse oder toxische Agentien ausgelöst werden (ANONYMOUS 2015b). Diese Erkrankungen haben in den letzten 30 Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen (SCHWARZMUELLER 2007). Vor allem ein verändertes Konsumverhalten durch eine erhöhte Nachfrage an RTE-Produkten, Veränderungen in der Produktion und im Handel (z.B. Einfuhr von Lebensmitteln aus
21 dem EU-Ausland und aus Drittländern), sowie Veränderungen der Erregereigenschaften tragen zum Anstieg bei (AMMON et al. 2000; NAGY et al. 2015;
ANONYMOUS 2016g, f; JANSEN et al. 2016).
Die Campylobakteriose (73.000 Erkrankungsfälle) und die Salmonellose (knapp 13.000 Erkrankungsfälle) sind die häufigsten bakteriellen gastrointestinalen Erkrankungen in Deutschland (ANONYMOUS 2016f). Tabelle 1 gibt einen Überblick über die gemeldeten Erkrankungsfälle der in der vorliegenden Arbeit genutzten Erreger. Laut aktuellen Erhebungen der EFSA verursachen diese Erkrankungen einen erheblichen finanziellen Schaden, welcher durch steigende Ausgaben im Gesundheitssektor und durch Lebensmittel-Rückrufe des Lebensmitteleinzelhandels bedingt ist (ANONYMOUS 2017c).
Die tatsächliche Anzahl der Erkrankungsfälle fieberhafter Gastroenteritiden durch die hier genannten Erreger ist jedoch kaum festzustellen, da bei weitem nicht jede Erkrankung dokumentiert wird (ANONYMOUS 2016f).
22
Tabelle 1. Übersicht über die gemeldeten Erkrankungsfälle der in diese Arbeit einbezogenen Bakterienspezies.
Erreger Gemeldete
Erkrankungsfälle 2016 RKI (Fallzahlen in Deutschland)
Gemeldete
Erkrankungsfälle 2016 EFSA (Fallzahlen in der EU)
Trend der gemeldeten Fallzahlen Salmonella
Typhimurium
12.969
(16 Fälle pro 100.000 Einwohner)
96.039
(20,9 Fälle pro 100.000 Einwohner)
MRSA 3.136
(3,8 Fälle pro 100.000 Einwohner)
- Yersinia enterocolitica 2.774
(3,4 Fälle pro 100.000 Einwohner)
6.861
(1,82 Fälle pro 100.000 Einwohner)
Listeria
monocytogenes
707
(0,9 Fälle pro 100.000 Einwohner)
2.536
(0,47 Fälle pro 100.000 Einwohner)
Enterococcus faecium 567 -
Klebsiella pneumoniae 144 - -
Escherichia coli Keine Fallzahlen dokumentiert
- -
Die dem RKI gemeldeten Erkrankungsfälle schließen sowohl die Lebensmittel-assoziierten als auch die nosokomialen Erreger ein und beziehen sich nur auf die Erkrankungsfälle innerhalb Deutschlands.
Die von der EFSA dargestellten Fallzahlen beziehen sich nur auf die typischen Lebensmittel- assoziierten Zoonoseerreger und gelten für die gesamte EU. Eine Angabe zu den Fallzahlen der nosokomialen Erreger ist von der EFSA nicht dokumentiert.
Vor allem die steigende Nachfrage der Konsumenten nach bereits vorverpackten und zum sofortigen Verzehr gedachten RTE-Produkten wird als mögliche Ursprungsquelle für eine Ansteckung diskutiert (SCHMIDT u. KAYA 1990; GOMBAS et al. 2003;
GILBERT et al. 2009; HARTMANN et al. 2013).
So kann der Schneide- und Verpackungsprozess des Lachsschinkens eine besonders hohe Kontaminationsquelle darstellen (KESKINEN et al. 2008; LEIPOLD et al. 2010).
Durch den Schneideprozess wird die Oberfläche des Lebensmittels deutlich vergrößert, wodurch das Risiko einer Oberflächenkontamination potenziert wird (WEBER 2010). Der Eintrag der Erreger auf diese Oberflächen kann auf mehreren
23 Wegen erfolgen. Über verunreinigte Schneide- und Verpackungsmaschinen können pathogene Keime die Oberfläche besiedeln (BECKER u. HOLZAPFEL 2000). Der Eintrag kann auch über bereits infizierte Tierkörper, kontaminierte Zutaten/Gewürze als auch über chronisch-infizierte und klinisch erkrankte Mitarbeiter erfolgen (NESBAKKEN et al. 1996; ANONYMOUS 2004; GAGLIO et al. 2016).
Durch die anschließende Kühllagerung des Produktes bei etwa 8 °C ± 0,5 °C können Salmonella spp. in ihrem Wachstum gehemmt werden, während bei einigen Stämmen des Erregers Listeria spp. ein Keimwachstum zu verzeichnen ist (WEBER 2010).
2.7.1. Listeria spp.
Bei Listerien handelt es sich um grampositive Stäbchen. Das natürliche Habitat von Listerien sind der Erdboden, Wasser und Abwässer sowie Pflanzen. Bei Menschen und Tieren zählen L. monocytogenes und L. invanovii zu den pathogenen Spezies.
Listerien haben Virulenzfaktoren, die ein Wachstum bei niedrigen Temperaturen und pH-Werten ermöglichen, sodass L. monocytogenes in kühlgelagerten Lebensmitteln vermehrungsfähig bleiben kann (CONTE et al. 1994).
Die minimale Infektionsdosis ist in der Literatur nicht eindeutig definiert. Es werden initiale Keimgehalte von 0 bis 100 KbE/g als Keimdosis für eine hohe Ausbruchswahrscheinlichkeit beschrieben (ANONYMOUS 2007).
Andere Studien hingegen berichten von Keimgehalten von bis zu 105 KbE/g die erforderlich sind, um bei gesunden Personen eine Listeriose auszulösen, während für die Risikogruppe YOPIS Keimgehalte von nur 102-104 KbE/g als infektiös gelten (ANONYMOUS 2016d).
Obwohl die Inzidenz der meldepflichtigen Listeriose laut Infektionsschutzgesetz (IfSG) von etwa 0,9 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner niedrig ist, ist die Listeriose durch eine hohen Mortalitätsrate von 9-30 % gekennzeichnet (ANONYMOUS 2016f). Die typischen Krankheitsanzeichen einer Listeriose sind grippeähnliche Symptome, bei YOPIS können Septitiden hinzukommen (ANONYMOUS 2016d).
Listeria spp. kann durch unzureichende Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen in einen Betrieb gelangen (NESBAKKEN et al. 1996; SAMELIS u. METAXOPOULOS 1999). Eintragungswege können zum Beispiel an Schuhen haftende Erdpartikel, ein Schadnagerbefall in der Produktionsstätte oder bereits kontaminierte Rohstoffe sein.
24 Kontaminierte Gewürze, frisches Obst und Gemüse, rohe Milchprodukte und (Fertig-) Salate gelten als Kontaminationsquellen für Listeria spp. Bereits verpacktes Fleisch und Fleischprodukte im Einzelhandel müssen ebenfalls als Eintragsquelle berücksichtigt werden, besonders da Listerien auch unter Verpackungsbedingungen mit einem reduzierten Sauerstoffgehalt optimale Wachstumsbedingungen haben (GILL u. JONES 1995; NESBAKKEN et al. 1996; BECKER u. HOLZAPFEL 2000;
HECHELMANN et al. 2002).
2.7.2. Enterobacteriaceae
Zur Familie der Enterobacteriaceae gehören die Bakterienspezies S. Typhimurium, E. coli und K. pneumoniae.
Alle drei Spezies kommen ubiquitär in der Umwelt v.a. im Erdboden vor und können über Mitarbeiter und Gerätschaften in einen Betrieb gelangen (ANONYMOUS 2017d).
Diese Mikroorganismen eignen sich daher als Indikatorkeime für die Überprüfung der Herstellungs- und Reinigungshygiene der Betriebe (ANONYMOUS 2005c).
In den letzten Jahren sind Isolate aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen worden, deren phänotypische Resistenzen Anlass zur Besorgnis geben (SALOMÃO et al. 2017). Ein Austausch von Resistenzdeterminanten ist häufig über Mechanismen des horizontalen Gentransfers möglich, sodass es zu einer schnellen Ausbreitung von Resistenzen kommen kann (BURAK 2007; ANONYMOUS 2011a).
Salmonella spp.
Salmonellen sind gramnegative Stäbchen (ANONYMOUS 2016e). Besonders S. enterica ssp. enterica hat eine klinische und epidemiologische Bedeutung als Zoonoseerreger (HATTENDORF 2000).
Eine Salmonellose ist bei Menschen und Tieren durch eine (klinische) Enteritis gekennzeichnet, die auch mit einem invasiven Krankheitsverlauf (u.a. Sepsis, Bakteriämie, Fieber, Organmanifestation) verbunden sein kann (ANONYMOUS 2016f). Im Jahr 2016 wurden dem RKI knapp 13.000 Erkrankungsfälle gemeldet, wobei davon auszugehen ist, dass bei vielen klinischen Gastroenteritiden kein Erregernachweis erfolgt und somit die Dunkelziffer der Erkrankungen eher höher ist (OOSTEROM J. 1991; ANONYMOUS 2016f).
25 Die Hauptquellen für Salmonella spp. Infektionen des Menschen stellen insbesondere nicht erkrankte, aber persistent infizierte landwirtschaftliche Nutztiere wie Schweine, Rinder und zum Teil auch Geflügel dar (ANONYMOUS 2016f). Durch bereits kontaminiertes Rohmaterial wie Schweinefleisch, gelangen Salmonellen in den lebensmittelverarbeitenden Betrieb und werden dort im Zuge der Lebensmittelverarbeitung oder durch unzureichende Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen der Gerätschaften und Oberflächen auf das produzierte Lebensmittel übertragen oder befinden sich bereits im Produkt, wie z.B. dem Ei (ANONYMOUS 2017d). Ebenfalls zu beachten ist die Eintragungsquelle über erkrankte Mitarbeiter, durch Schadnager oder Abwässer und Oberflächengewässer (TSCHÄPE u. BOCKEMÜHL 2014). Für eine Infektion werden Infektionsdosen von 4- 45 KbE bis hin zu 105-106 KbE in der Literatur beschrieben (ANONYMOUS 2016f). Die Höhe der Infektionsdosis ist abhängig von der Zusammensetzung des Lebensmittels und der Pathogenität des Stammes (D'AOUST 1994).
Escherichia coli
Gramnegative Bakterien der Spezies E. coli kommen als Kommensalen als Bestandteil der Mikrobiota im Gastrointestinaltrakt des Menschen und Tieres vor.
Neben diesen avirulenten Stämmen gibt es eine Vielzahl von darmpathogenen E. coli Stämmen.
Die Infektion erfolgt durch die orale Aufnahme der Erreger über kontaminierte Lebensmittel und/oder kontaminiertes Wasser sowie Milch und Milchprodukte. Eine Übertragung von E. coli kann direkt von Mensch-zu-Mensch oder durch fäkal-orale Schmierinfektionen bei mangelhafter Hygiene erfolgen (ANONYMOUS 2011b). Ein gehäuftes Auftreten von Infektionen wird bei Personen beobachtet, die beruflich in der Gastronomie und in der Lebensmittelverarbeitung tätig sind (ANONYMOUS 2017a).
Yersinia enterocolitica
Y. enterocolitica, ein gramnegatives Stäbchenbakterium, ist der Verursacher der meldepflichtigen Yersiniose. Laut IfSG ist dies eine mit dem Verzehr von kontaminiertem Schweinefleisch assoziierte Zoonoseerkrankung. In Schweine-
26 beständen persistiert der Erreger sehr lange, sodass erkrankte Mastschwein- populationen ein Hauptreservoir der Yersinien darstellen.
Da Y. enterocolitica als psychrophiler Erreger in einem Temperaturbereich von 4 °C bis 43 °C wachsen kann, verhindert eine Kühllagerung des Lebensmittels keine ausreichende Hemmung des Keimwachstums (MILLER et al. 1988; ANONYMOUS 1999).
In Europa und vor allem in Deutschland tritt Serovar : O3 am häufigsten auf. In dem Jahr 2016 wurde ein leicht steigender Trend der Erkrankungszahlen der Yersiniose vom RKI gemeldet (ANONYMOUS 2016f). Die Diagnose von insgesamt knapp 2.800 Yersiniosen entsprach somit einer Inzidenz von 3,4 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner. Vor allem Kinder bis zu einem Alter von fünf Jahren erkrankten an der Yersiniose (ANONYMOUS 2016f).
Yersinien sind Lebensmittel-assoziierte Erreger, die gastrointestinale Erkrankungen mit Erbrechen, Durchfall und Fieber nach dem Verzehr von kontaminiertem Fleisch bzw. kontaminierter Fleischprodukte und durch die Aufnahme von verunreinigtem Wasser oder Milch verursachen können (BOCKEMUEHL u. ROGGENTIN 2004;
MAYR u. ROLLE 2006; ANONYMOUS 2015g).
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella spp. sind gramnegative Bakterien, die als Kommensalen im Darm und im Erdboden, in Oberflächengewässern und in (Krankenhaus-) Abwässern vorkommen.
Als nosokomiale Erreger werden sie oft im Stuhl, im Rachen und auf den Händen der Patienten nachgewiesen (JASSOY u. SCHWARZKOPF 2013). Burak (2007) stellte in ihrer Studie heraus, dass die Kolonisationsrate mit der Länge des Krankenhausaufenthaltes zunimmt (BURAK 2007; WALTER et al. 2018). Eine schnelle Verbreitung dieses Erregers v.a. im Krankenhaus erfolgt über unbelebte Vektoren und das Personal und fördert die hohe Anzahl der Neuinfektionen nach einem stationären Aufenthalt (ROCK et al. 2014; ANONYMOUS 2016c).
K. pneumoniae produziert kapsuläre Polysaccharide, sogenannte K-Antigene, als einen wichtigen Pathogenitätsfaktor zum Schutz vor schädlichen Umwelteinflüssen (DOMENICO et al. 1994; CESCUTTI et al. 2016).
27 Viele Isolate von K. pneumoniae zählen laut der Kommission für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) zur Gruppe der gegenüber drei bzw. vier Wirkstoffklassen resistenten (multiresistenten) gramnegativen Stäbchenbakterien (3 MRGN bzw. 4 MRGN) (ANONYMOUS 2012c). Als Erreger nosokomialer Infektionen verursacht K. pneumoniae Bakteriämien und Septikämien, (beatmungsassoziierte) Pneumonien und Urinkatheter-assoziierte Harnwegsinfektionen (WALTER et al.
2018).
Auch aus Lebensmitteln konnte Klebsiella spp. isoliert werden. So erfolgte ein positiver Klebsiella spp. Nachweis u.a. aus Salaten, zubereiteten gekühlten Fleischerzeug- nissen und Milchnahrung (GUNDOGAN et al. 2011; ALI et al. 2017).
2.7.3. Enterococcus faecium
Enterococcus spp. sind grampositive, kokkoide Erreger, die in einer Vielzahl von natürlichen Habitaten wie z.B. in Sedimenten der Küsten- und Meeresgewässer und im Erdboden vorkommen (CITTTERIO et al. 2017). Ebenso sind sie als Kommensalen des Gastrointestinaltraktes des Menschen und Tieres bekannt (ANONYMOUS 2012b).
Deswegen dienen sie u.a. als Indikatorkeime für fäkale Verunreinigungen von Wasser und Lebensmitteln (BYAPPANAHALLI et al. 2012; GAGLIO et al. 2016). Auch als Verursacher von nosokomialen Infektionen sind Enterococcus spp. bekannt (KLARE et al. 2012; ANONYMOUS 2017b).
Studien zeigten, dass das Vorkommen von multiresistenten Enterococcus spp.
Isolaten auf Lebensmitteln wie Käse-, Milch- und Fleischprodukten, den Eintrag und die weitere Verbreitung im humanen Wirt begünstigt (HUMMEL et al. 2007; RIZZOTTI et al. 2009; GAGLIO et al. 2016; DE JONG et al. 2018). Eine Kreuzkontamination von Enterococcus spp. Starterkulturen zur Käse- oder Wurstherstellung mit resistenztragenden Enterococcus spp. sollte vermieden werden, um die Weitergabe der Resistenzgene an die Starterkulturen zu verhindern (FRANZ 2003; HUGAS 2003).
2.7.4. Staphylococcus aureus
Ein wichtiger Erreger der Familie Staphyloccocaceae ist S. aureus, der u.a. als Kommensale auf Haut und Schleimhäuten bei Mensch und Tier nachgewiesen wird (ANONYMOUS 2016f).
28 Eine große Bedeutung besitzt S. aureus aber auch als pathogener Keim. Im Jahr 2013 berichtete die EFSA über 386 Staphylokokken-assoziierte Ausbrüche in der EU, die durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln verursacht wurden (ANONYMOUS 2015b). Als nosokomiale Erreger sind vor allem multiresistente S. aureus Stämme von besonderer Bedeutung. Methicillin-resistente S. aureus Stämme sind laut dem RKI dadurch charakterisiert, dass sie eine Resistenz gegenüber Beta-Laktam-Antibiotika haben (ANONYMOUS 2016f). Das RKI berichtet von über 1.140 bestätigten MRSA-Fällen; dies entspricht einer auf 3,8 Fälle pro 100.000 Einwohner in Deutschland gefallenen Inzidenz (ANONYMOUS 2016f). Eine höhere Dunkelziffer durch unzureichende Untersuchungen und Nachweise v.a. im ambulanten klinischen Betrieb wird vom RKI allerdings angenommen (RUSCHER 2014; ANONYMOUS 2016c).
Als ursprünglich angenommener Krankenhauskeim in den 1960 iger Jahren wurde MRSA schon ein Jahrzehnt später auch in Tierhaltungen nachgewiesen (VAN LEEUWEN et al. 1995; VOSS et al. 2005; ONICIUC et al. 2015).
Sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin können Erkrankungen mit MRSA zu Haut- und Weichteilinfektionen, Abszessbildungen, Endokarditiden, nekrotisierenden Pneumonien und zu schweren systemischen Infektionen (u.a. auch Septikämien) führen (RUSCHER 2014; ANONYMOUS 2016f). Der Nachweis einer Übertragung von MRSA von kolonisierten Tieren auf den Menschen mit Tier- assoziierten klonalen Linien oder vice versa gilt als erbracht (GRAVELAND et al. 2011;
WENDLANDT et al. 2015; ANONYMOUS 2016f).
Eine Verbreitung von MRSA über Lebensmittel auf den Menschen oder der Eintrag durch den Menschen ins Krankenhaus ist somit unvermeidbar (GONZALEZ-ZORN u.
ESCUDERO 2012).
2.7.5. Acinetobacter baumannii
Die gramnegativen, kokkoiden Stäbchenbakterien können aus Bodenproben, Trinkwasser, Oberflächengewässern und Nahrungsmitteln isoliert werden und zeigen eine hohe Tenazität in trockener Umgebung (JAWAD et al. 1998). Sie überleben in Umgebungsluft und werden über diese übertragen (ALLEN u. GREEN 1987).
29 Aktuell an Bedeutung gewonnen haben Acinetobacter spp. durch das gehäufte Auftreten als Verursacher nosokomialer Infektionen verbunden mit dem Nachweis von Multiresistenzen (DIJKSHOORN et al. 2007; ANONYMOUS 2013). Auch in klinischen Abwässern und auf Lebensmitteln u.a. auf Geflügelschlachtkörpern werden Bakterien dieser Spezies nachgewiesen (DIJKSHOORN et al. 2007; FORSBERG et al. 2012).
Das RKI berichtet, dass Infektionen mit multiresistenten Acinetobacter spp., insbesondere mit A. baumannii, A. pittii und A. nosocomialis, mit erhöhten Mortalitätsrisiken bei Intensivpatienten einhergehen (SHORR 2009; ANONYMOUS 2013). Die klinischen Vektoren für die Übertragung sind unbelebte Gegenstände wie Dauer-Urinkatheter oder –Blutkatheter, Tubusse oder Endoskope. Eine Übertragung über Tastaturen medizinischer Geräte, Stationstelefone, etc. wird auch genannt (ANONYMOUS 2013). Eine Infektion mit dem Erreger kann u.a. Pneumonien, Bakteriämien, Septikämien und Wundinfektionen verursachen.
Durch die zunehmende Resistenz dieses Erregers gegenüber einer Vielzahl von Antibiotikaklassen wurde A. baumannii als ein 4 MRGN Erreger nach Definition der KRINKO eingestuft (ANONYMOUS 2012c).
2.8. Bedeutung multiresistenter Erreger
Zahlreiche Studien berichten über ein zunehmendes Auftreten multiresistenter Krank- heitserreger im klinischen Umfeld, in der Landwirtschaft und der Massentierhaltung (LANDERS et al. 2012; ANONYMOUS 2015f). Erkrankungen mit diesen Erregern stehen im Zusammenhang mit einem erheblichen finanziellen Schaden für die Gesundheitskassen sowie noch schwerwiegenderen Folgen für die erkrankten Patienten (COSGROVE u. CARMELI 2003; RICE 2008; ANONYMOUS 2016b). Diese gehen mit längeren Krankenhausaufenthalten der Patienten, einer erhöhten Morbidität und Mortalität einher (COSGROVE 2006). Das RKI meldete im Jahr 2016 insgesamt 1.568 Fälle nosokomialer Infektionen, von denen 10 % durch bakterielle Krankheitserreger verursacht wurden (ANONYMOUS 2016f).
Hergestellte Lebensmittel tierischer Herkunft von latent infizierten Tieren können die Verbreitung dieser Erreger über den Lebensmitteleinzelhandel ebenfalls fördern (LANDERS et al. 2012; TANG et al. 2017). Auch berichten erste Studien über einen
30 Nachweis von Resistenzen gegenüber Desinfektionsmitteln (VAN BREDA u. WARD 2017).
In Folge der stagnierenden Verfügbarkeit antibakteriell wirkender Chemotherapeutika sind alternative Ansätze zur Kontrolle und Behandlung nosokomialer Infektionen bzw.
zur antimikrobiellen Behandlung kontaminierter Lebensmittel dringend notwendig.
31 2.9. Ziele der Studie
Die immer komplexeren Warentransportketten über Landesgrenzen hinweg, sowie die steigende Nachfrage der Verbraucher nach frischen und verzehrfertigen Lebens- mitteln, machen immer bessere Haltbarmachungsverfahren notwendig, um lebens- mittelassoziierte Zoonoseerkrankungen zu minimieren.
Ziel dieser Arbeit war es daher…
(1) …erstmalig das neu entwickelte Plasmatube-System (SMD-Quelle) zur Reduktion von Lebensmittel-assoziierten Zoonoseerregern anzuwenden.
Dies beinhaltete folgende Zielsetzungen und die Bearbeitung der Fragestellungen:
- Untersuchungen zweier Plasma-Modi auf die Effektivität der Reduktion.
- Nachweis des Einflusses des Feuchtigkeitsgehaltes des Arbeitsgases auf die Wirkung des kalten Plasmas gegenüber S. Typhimurium und L. monocytogenes auf Lachsschinken.
- Können S. Typhimurium und L. monocytogenes effektiv auf der Matrix Lachs- schinken inaktiviert werden?
- Wird die Produktsicherheit plasmabehandelten Schinkens auch während einer anschließenden Lagerung unter modifizierter Schutzgasatmosphäre gewähr- leistet, sodass diese Produkte gelagert und exportiert werden können?
- Nimmt die Plasma-Behandlung Einfluss auf organoleptische Eigenschaften des Schinkens?
(2) …auf Grundlage dieser Ergebnisse das zu untersuchende Keimspektrum für den zweiten Versuchsansatz zu erweitern. Hierbei galt es, die Reduktion multiresistenter Erreger und von Y. enterocolitica durch kaltes Plasma auf der Oberfläche eines standardisierten Edelstahl-Keimträgers zu testen. Die ausgewählten Mikroorganismen dienten als Modellorganismen für eine Vielzahl pathogener Erreger, die im Krankenhaussektor als Problemkeime gelten und auch vermehrt aus Lebensmitteln isoliert werden.
32 Dabei wurden folgende Fragestellungen berücksichtigt:
- Können multiresistente Erreger durch kaltes Plasma inaktiviert werden?
- Welchen Einfluss haben die zu behandelnde Oberfläche und die Bakterienzelldichte auf die Effektivität der Reduktion?
- Kann eine subletale Schädigung der Bakterien nachgewiesen werden?
33 3. Publikationen
3.1. Publikation 1
Inactivation of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes on ham with nonthermal atmospheric pressure plasma
Karolina A. Lis1, Annika Boulaaba1*, Sylvia Binder2, Yangfang Li2, Corinna Kehrenberg1, Julia L. Zimmermann2, Günter Klein1†, Birte Ahlfeld1
1 Institute of Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
2 Terraplasma GmbH, Garching, Germany
* Corresponding author
E-Mail: annika.boulaaba@tiho-hannover.de (AB)
Link: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0197773 DOI: https: 10.1371/journal.pone.0197773
† Deceased
34 Abstract
The application of cold atmospheric pressure plasma (CAP) for decontamination of sliced ready-to-eat (RTE) meat products (in this case, rolled fillets of ham), inoculated with Salmonella (S.) Typhimurium and Listeria (L.) monocytogenes was investigated.
Cold atmospheric plasma (CAP) is an ionised gas that includes highly reactive species and ozone, interacting with cell membranes and DNA of bacteria. The mode of action of CAPs includes penetration and disruption of the outer cell membrane or intracellular destruction of DNA located in the cytoplasm.
Inoculated ham was treated for 10 and 20 min with CAP generated by a surface-micro- discharge-plasma source using cost-effective ambient air as working gas with different humidity levels of 45-50 and 90 %. The chosen plasma modes had a peak-to-peak voltage of 6.4 or 10 kV and a frequency of 2 and 10 kHz.
Under the tested conditions, the direct effectiveness of CAP on microbial inactivation was limited. Although all treated samples showed significant reductions in the microbial load subsequent to plasma treatment, the maximum inactivation of S. Typhimurium was 1.14 lg steps after 20 min of CAP-treatment (p<0.05), and L. monocytogenes was reduced by 1.02 lg steps (p<0.05) using high peak-to-peak voltage of 10 kV and a frequency of 2 kHz regardless of moisture content. However, effective inactivation was achieved by a combination of CAP-treatment and cold storage at 8 °C ± 0.5 °C for 7 and 14 days after packaging under sealed high nitrogen gas flush (70 % N2, 30 % CO2). Synergistic effects of CAP and cold storage for 14 days led to a clearer decrease in the microbial load of 1.84 lg steps for S. Typhimurium (p<0.05) and 2.55 lg steps for L. monocytogenes (p<0.05). In the case of L. monocytogenes, subsequent to CAP- treatment (10 kV, 2 kHz) and cold storage, microbial counts were predominantly below the detection limit. Measurement showed that after CAP-treatment, surface temperature of ham did not exceed the room temperature of 22 °C ± 2 °C. With the application of humidity levels of 45-50 %, the colour distance ΔE increased in CAP treated samples due to a decrease in L* values.
In conclusion, effectiveness of CAP-treatment was limited. However, the combination of CAP-treatment and cold storage of samples under modified-atmospheric-conditions
35 up to 14 days could significantly reduce microorganisms on RTE ham. Further investigations are required to improve effectiveness of CAP-treatment.
36 3.2. Publikation 2
Inactivation of multidrug-resistant pathogens and Y. enterocolitica with cold atmospheric pressure plasma on stainless steel surfaces
Karolina A. Lisa, Corinna Kehrenberga, Annika Boulaabaa, Maren von Köckritz- Blickwedeb, Sylvia Binderc, Yangfang Lic, Julia L. Zimmermannc, Yvonne Pfeiferd, Birte Ahlfelda*
a Institute for Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30173 Hannover, Germany
E-Mail addresses: Karolina.Lis@tiho-hannover.de, Corinna.Kehrenberg@tiho- hannover.de, Annika.Boulaaba@tiho-hannover.de, Birte.Ahlfeld@tiho-hannover.de
b Department of Physiological Chemistry & Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D- 30559 Hannover, Germany
E-Mail address: Maren.von.Koeckritz-Blickwede@tiho-hannover.de
c terraplasma GmbH, D-85748 Garching, Germany
E-Mail addresses: Binder@terraplasma.com, Li@terraplasma.com, Zimmermann@terraplasma.com
d Robert Koch-Institute, FG 13 Nosocomial Pathogens and Antibiotic Resistance, D- 38855 Wernigerode, Germany
E-Mail address: PfeiferY@RKI.de
37
* Corresponding author: Birte Ahlfeld
University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation Institute for Food Quality and Food Safety
Bischofsholer Damm 15 D-30171 Hannover, Germany
E-Mail: Birte.Ahlfeld@tiho-hannover.de
Link:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924857918302498?via%3Dihub DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2018.08.023
38 Abstract
Objective: To investigate the impact of cold atmospheric pressure plasma (CAP) produced by a Surface-Micro-Discharge (SMD) plasma source as a new strategy to combat the transmission of five multidrug-resistant pathogens and Y. enterocolitica on typical hospital- and food-producing surfaces, like stainless steel.
Methods: Approximately 106 CFU/cm2 vancomycin-resistant Enterococcus (E.) faecium, methicillin-resistant Staphylococcus (S.) aureus, Klebsiella (K.) pneumoniae, Acinetobacter (A.) baumannii, extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia (E.) coli and Yersinia (Y.) enterocolitica were inoculated on a 3.14 cm2 stainless steel surface. Bovine serum albumin (3 %) was used as a natural disruptive factor simulating natural organic material. The inoculated surfaces were subsequently exposed to CAP, generated by a peak-to-peak voltage of 10 kV with sinusoidal waveform and a frequency of 2 kHz, for 5, 10 and 20 min, respectively. Fluorescent staining with propidium iodide and SytoTM 9 were used to demonstrate the manner of bacterial cell damage.
Results: Significant (p < 0.05) inactivation of 1.68 ± 0.17 up to 2.80 ± 0.17 lg steps was achieved after 5 min of CAP-treatment. However, bacterial reduction could be increased to 3.35 ± 0.1 up to 5.17 ± 0.67 lg steps after a 20 min CAP-treatment.
Bacterial cells covered with serum albumin were statistically significant, but less inactivated by CAP. Fluorescent staining showed a predominant level of orange- stained sublethal damaged bacterial cells after 10 min of CAP-treatment.
Conclusion: CAP has the ability to inactivate multidrug-resistant bacterial pathogens on stainless steel surfaces. Further research required to investigate the clinical features of CAP.
Keywords: hospital environment, surface-micro-discharge plasma, non-thermal, plasma-sterilisation
39 Highlights:
- Y. enterocolitica and multidrug-resistant VRE, MRSA, carbapenemase- resistant K. pneumoniae and A. baumannii, and ESBL producing E. coli were inactivated by cold atmospheric plasma treatment in a time-dependent manner.
- Different response of Gram-negative and Gram-positive bacteria towards CAP was observed.
- Fluorescent microscopy showed a high amount of sublethal bacterial cells.
- CAP could be a suitable alternative sterilization method for heat sensitive devices and surfaces.
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