Zusätzlich zu dem Faktor Spannung wurde die Luftfeuchtigkeit beider Einstellungs-Modi variiert.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten nur bei niedriger Spannung (6,4 kV, 10 kHz) eine signifikante (p < 0,05) Abhängigkeit der Reduktion von S. Typhimurium und L. monocytogenes von der Luftfeuchtigkeit des Arbeitsgases (Publikation 1). Beide Bakterienspezies wurden nach Erhöhung der Luftfeuchtigkeit signifikant (p < 0,05) schlechter reduziert.
Bei höherer Spannung (10 kV, 2 kHz) hingegen wurde kein Einfluss der Luftfeuchtigkeit auf die Höhe der Reduktion beider Bakterienspezies gezeigt (Publikation 1, Tabellen 2-5).
45 Vorangegangene physikalische Untersuchungen der terraplasma GmbH zeigten einen positiven Einfluss einer zusätzlichen Befeuchtung des Arbeitsgases auf die Generierung und die Langlebigkeit der radikalen Plasmaspezies wie ROS, RNS und der Hydroxylradikale (OH.) (HÄHNEL et al. 2010). Andere Studien wiesen weitere chemische Reaktionen von angeregten Elektronen und Ionen im Rahmen von Kaskadenreaktionen auch mit den Wassermolekülen des Arbeitsgases nach, die die Konzentration und das Spektrum um weitere radikale Plasmaspezies, wie z.B. der Hydroxylradikale und Wasserstoffperoxidmoleküle, erweitern (HÄHNEL et al. 2010;
LAROUSSI et al. 2012; WINTER et al. 2013).
Anders als für Hydroxyl- und Wasserstoffperoxid-Radikale beschrieben, korreliert die steigende Feuchtigkeitskonzentration jedoch negativ mit der Ozonkonzentration (WINTER et al. 2013). Die Ozonmoleküle dissoziieren durch die Reaktion mit den Wassermolekülen des Trägergases und verlieren dadurch ihre bakterizide Wirkung (DORAI u. KUSHNER 2003; HÄHNEL et al. 2010). Dieser sogenannte Quencher-Effekt („Auslöscheffekt“) bezeichnet den Prozess der strahlungslosen Abregung von radikalen Plasmaspezies und den damit verbundenen Verlust ihrer bakteriziden Wirkung (HIRSCHBERG 2017).
Die differierende Abtötung beider Bakterienspezies nach Anwendung der niedrigen Spannungseinstellung (6,4 kV, 10 kHz) in Abhängigkeit vom Feuchtigkeitsgehalt des Arbeitsgases könnte durch die beschriebene Reaktion des Ozons mit den Wassermolekülen erklärt werden. Unter der Annahme, dass bei der niedrigen Spannungseinstellung vorwiegend Ozon für die bakterizide Wirkung des kalten Plasmas gegenüber S. Typhimurium und L. monocytogenes auf Lachsschinken verantwortlich ist, würde eine erhöhte Luftfeuchtigkeit des Arbeitsgases in vermehrten Quencher-Effekten des Ozons resultieren. Durch diese Quencher-Effekte steht vermutlich eine verminderte Ozon-Konzentration für eine effektive Reduktion der Bakterien auf Lachsschinken zur Verfügung. Die signifikant höhere Reduktion beider Bakterienspezies nach Anwendung der niedrigen Spannung ohne eine zusätzliche Luftanfeuchtung kann diese Vermutung untermauern. Bei der verringerten Luftfeuchtigkeit der trockenen Plasma-Einstellung (6,4 kV, 10 kHz) werden wahrscheinlich weniger Ozonmoleküle in Folge einer geringeren H2O-Konzentrationen
46 durch den Quencher-Effekt inaktiviert und können ihre bakterizide Wirkung gegenüber den Bakterien ausüben. Die daraus resultierende höhere Ozonkonzentration bedingt offenbar die signifikant (p < 0,05) bessere Reduktion dieser Plasma-Einstellung (6,4 kV, 10 kHz, trocken), während durch das fehlende Ozon der nassen Plasma-Einstellung (6,4 kV, 10 kHz, nass) die Reduktion beider Bakterienspezies limitiert ist.
Die von dem Feuchtigkeitsgehalt des Arbeitsgases unabhängige Reduktion der Bakterienspezies S. Typhimurium und L. monocytogenes nach Anwendung der hohen Spannungseinstellung könnte durch die Plasmachemie bedingt sein.
Studien konnten darlegen, dass die durch die höhere Spannungseinstellung (10 kV, 2 kHz) resultierende höhere Konzentration radikaler Stickstoffspezies im Gegensatz zu den reaktiven Sauerstoffspezies (v.a. Ozon) nicht negativ mit dem Feuchtigkeitsgehalt des Arbeitsgases korreliert (LAROUSSI et al. 2012; HIRSCHBERG 2017). Ein positiver Einfluss der Erhöhung der Luftfeuchtigkeit auf die Langlebigkeit und die weiteren Kaskadenreaktionen radikaler Stickstoff-Plasmaspezies wird angenommen (LAROUSSI u. LEIPOLD 2003; HÄHNEL et al. 2010; HIRSCHBERG 2017).
In dieser Arbeit resultierte die Modulation der Plasmachemie durch die steigende Spannung der zweiten Plasma-Einstellung (10 kV, 2 kHz) vermutlich in einer vermehrten Bildung reaktiverer Stickstoffradikale, die unabhängig von der Luftfeuchtigkeit des Arbeitsgases eine starke bakterizide Wirkung gegenüber den Bakterien auf der Oberfläche des Lachsschinkens ausübten. Diese Feststellung könnte entscheidend für die Erklärung der signifikant höheren Reduktion beider Bakterienspezies unabhängig von dem Feuchtigkeitsgehalt des Arbeitsgases sein.
Ozon-Auslöscheffekte waren allenfalls von nachrangiger Bedeutung, da die Bakterien primär durch radikale Stickstoffspezies inaktiviert wurden.
Die effektivste Einstellung (10 kV, 2 kHz, nass) wurde für die folgenden Abtötungssversuche der Bakterien auf den Edelstahl-Keimträgern ausgewählt (Publikation 2). Für diese Versuche wurde die Luftfeuchtigkeit auf 90 % erhöht, da eine maximale Langlebigkeit der radikalen Plasmaspezies erzielt und die höhere Variabilität der Kaskadenreaktionen in dem Plasma-aktiviertem-Gas ermöglicht werden sollte.
47 4.3. Einfluss der bakteriellen Zellwand auf die Reduktion durch radikale Plasmaspezies
In allen Versuchen konnte unabhängig von der gewählten Matrix und Spannungseinstellung eine signifikant (p < 0,05) schlechtere Reduktion grampositiver Bakterien der Spezies L. monocytogenes, E. faecium und MRSA als der gramnegativen Bakterien der Spezies S. Typhimurium, E. coli und A. baumannii dargestellt werden. Eine Ausnahme stellte die gramnegative Bakterienspezies K. pneumoniae dar. K. pneumoniae wurde signifikant (p < 0,05) schlechter reduziert als die anderen Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae.
Zahlreiche Studien zeigten, dass die Wirkung radikaler Plasmaspezies durch den Zellaufbau und durch natürliche bakterielle Abwehrmechanismen beeinflusst werden kann, da Plasmaspezies an unterschiedlichen Strukturen der Bakterienzelle, wie z.B.
der Zellwand, intrazellulären Organellen oder der DNA, wirken (LAROUSSI et al. 2003;
G. FRIDMAN et al. 2007; HEINLIN et al. 2011). Ein unterschiedlich hohes bakterizides Potential der Plasmaspezies in Abhängigkeit ihres Wirkortes gegenüber verschiedenen Bakterienspezies wird angenommen (LAROUSSI et al. 2003; CHUN et al. 2009; FLYNN et al. 2015).
Gramnegative Bakterien weisen im Gegensatz zu grampositiven Bakterien eine dünnere Zellwand auf (LAROUSSI et al. 2003; ZIUZINA et al. 2014). Während die Zellwand von grampositiven Bakterien aus zahlreichen Mureinschichten (auch Peptidoglykanschichten genannt) besteht, sind es bei gramnegativen Bakterien nur sehr wenige. In der Peptidoglykanschicht grampositiver Bakterien sind zudem noch zahlreiche Zellwand-assoziierte Proteine verankert (CLAUDITZ et al. 2006). Die dünnere Peptidoglykanschicht gramnegativer Bakterien weist als äußere Begrenzung der Zelle eine Lipopolysaccharidschicht auf, die für die Aktivierung des Immunsystems verantwortlich ist (GREGORY FRIDMAN et al. 2008).
In der Literatur wird die verminderte Reduktion grampositiver Bakterien durch radikale Plasmaspezies auf die vielschichtige Peptidoglykanschicht zurückgeführt, die einen schützenden Einfluss gegenüber extrinsischen Faktoren bietet (CRITZER et al. 2007;
ALKAWAREEK et al. 2014; ZIUZINA et al. 2014).
48 Die höhere Reduktion gramnegativer Bakterienspezies S. Typhimurium, E. coli, Y. enterocolitica und A. baumannii könnte somit durch die dünnere Peptidoglykan-schicht bedingt sein, die einen geringeren Schutz gegenüber extrinsischen Faktoren wie den radikalen Plasmaspezies hat. Im Gegensatz dazu könnte die geringere Reduktion grampositiver Bakterienspezies wie L. monocytogenes, MRSA und E. faecium durch die dickere Peptidoglykanschicht bedingt sein, die eine längere Exposition gegenüber schädigenden radikalen Plasmaspezies ermöglicht. Damit kann auch die von anderen Enterobacteriaceae abweichende schwache Reduktion von K. pneumoniae erklärt werden, da K. pneumoniae eine zusätzliche extrazelluläre Peptidoglykanschicht ausbildet. Diese schützt das Bakterium wahrscheinlich, ähnlich wie die Peptidoglykanschicht der grampositiven Bakterienspezies, additiv vor exogenen Einflüssen (CESCUTTI et al. 2016).
Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Anwendung eines mit Luft betriebenen gepulsten Plasmajets erzielt. Rowan et al. (2007) wiesen eine höhere Reduktion gramnegativer Bakterienspezies S. Typhimurium, S. Enteritidis und verschiedener Campylobacter spp. Stämme nach, während L. monocytogenes als eine grampositive Bakterien-spezies die stärkste Resistenz gegenüber PlasmaBakterien-spezies zeigte (ROWAN et al. 2007).
Die Autoren führten diese Beobachtungen auf die Struktur der Peptidoglykanschicht zurück und argumentieren zudem mit der guten Anpassungsfähigkeit des Erregers L. monocytogenes an exogene letale Stressfaktoren (ROWAN et al. 2007; ROWAN et al. 2008).
Auch Laroussi et al. (2003) konnten durch elektronenmikroskopische Aufnahmen vor allem eine starke Schädigung der Zellwand der gramnegativen Bakterienspezies E. coli zeigen, während die grampositiven Bakterienzellen von Bacillus subtilis nach der Plasma-Behandlung keine morphologischen Änderungen aufwiesen (LAROUSSI et al. 2003). Sie bestätigten mit dieser Beobachtung einen Einfluss der Dicke der Zellwand auf die Diffusion der radikalen Plasmaspezies in den Intrazellularraum. Die Autoren schlussfolgerten daraus, dass die dünnere Zellwand den primären Angriffspunkt gramnegativer Bakterien darstellt, während bei grampositiven Bakterienspezies eine Schädigung der Bakterien durch eine intrazelluläre Zerstörung der DNA und Zellorganellen erfolgt (LAROUSSI et al. 2003).
49 Eine weitere mögliche Erklärung für die geringere Reduktion grampositiver Bakterienspezies ist das Vorkommen zusätzlicher sekundärer Pathogenitätsfaktoren in der Peptidoglykanschicht. Studien zeigten das Vorhandensein zusätzlicher sekundärer Pathogenitätsfaktoren, wie dem Staphyloxanthin, in der Peptidoglykan-schicht einiger S. aureus Spezies. Dieses zu den fettlöslichen Farbstoffen, den Lipochromen, gehörende Carotinoid, ist ein in der Zellwand integriertes natürliches Antioxidans, das einen wirksamen Schutz vor freien Radikalen bietet. Die Studie von Clauditz et al. (2006) zeigte, dass das in der Zellwand von S. aureus integrierte Staphyloxanthin mit seinen konjugierten Doppelbindungen freie Radikale abfangen kann, während die Wildtyp S. aureus-Mutante ohne Staphyloxanthine empfänglicher gegenüber freien Radikalen ist (CLAUDITZ et al. 2006). Einen weiteren schützenden exogenen Einfluss gegenüber radikalen Plasmaspezies konnten Joshi et al. (2010) in ihrer Studie nachweisen. Sie konnten zeigen, dass eine Vorbehandlung von E. coli mit dem antioxidativ-wirkenden α-Tocopherol (Vitamin E) die Bakterienzellen vor den radikalen Plasmaspezies schützen kann (JOSHI et al. 2010).
An Hand der festgestellten geringeren Reduktion der grampositiven Bakterienspezies und K. pneumoniae im Vergleich zu den in diese Studie einbezogenen gramnegativen Erregern ist ein Einfluss der Dicke der Doppellipidmembran gegenüber den radikalen Plasmaspezies anzunehmen.
Da die grampositiven Bakterienspezies L. monocytogenes, MRSA und E. faecium dennoch reduziert wurden, kann ein vollständiger Schutz einer dickeren Peptidoglykanschicht gegenüber radikalen Plasmaspezies ausgeschlossen werden.
Längere Behandlungszeiten grampositiver Bakterienspezies scheinen daher notwendig, um eine gleich hohe Reduktion von grampositiven und gramnegativen Bakterienspezies zu erzielen.
Die geringere Reduktion von K. pneumoniae stützt die oben genannte Vermutung. Die zusätzlichen Peptidoglykanschichten scheinen ebenfalls einen additiven protektiven Schutz gegenüber radikalen Plasmaspezies zu bieten und einen ähnlich hohen schützenden Effekt wie die Zellwand grampositiver Bakterienspezies aufzuweisen.
50 4.3.1. Intrazelluläre Interaktion der radikalen Plasmaspezies mit den Zellorganellen
Neben dem Einfluss der Bakterienzellwand wird in der Literatur auch eine unterschied-liche Wirkung radikaler Plasmaspezies in Abhängigkeit ihres energetischen Potentials gegenüber verschiedenen intrazellulären Zellstrukturen vermutet. So beschreiben mehrere Studien, dass eher schwach wirkende emittierende UV-Strahlung sowie die gegenüber reiner Strahlung etwas potenteren ROS vor allem Veränderungen an der Zellwand verursachen, während die deutlich potenter wirkenden reaktiven Stickstoffspezies nicht nur die Zellwand, sondern auch innere Zellorganellen und die im Zytoplasma befindliche DNA zerstören können (LAROUSSI et al. 2003; JOSHI et al. 2011; KORACHI u. ASLAN 2011; LU et al. 2013). Zudem zeigte die Studie von Song et al. (2009) eine oxidative Wirkung radikaler Plasmaspezies gegenüber den in der Zellwand vorkommenden ungesättigten Fettsäuren (SONG et al. 2009). Die daraus resultierende Lipidoxidation an der Zellwand kann dabei unter anderem zu einer Vernetzung der Fettsäureseitenketten führen und damit die Bildung transienter Poren fördern (ZIMMERMANN 2013). Die dadurch geförderte Ladungsanhäufung radikaler Plasmaspezies an der Außenseite der Zellwand führt zur Entstehung elektrostatischer Kräfte, die die Festigkeit der Zellwand herabsetzen und auch zur Zerstörung dieser beitragen können (LAROUSSI et al. 2003; YUSUPOV et al. 2013). Dieser Mechanismus wird auch als Elektroporation bezeichnet.
Eine Elektroporation der Zellwand von S. Typhimurium und L. monocytogenes erfolgt vermutlich unabhängig von der gewählten Spannungseinstellung. Erst eine höhere Konzentration der an der Zellwand sowie im Intrazellularraum stärker bakterizid wirkender radikaler Stickstoff-Spezies bedingt wahrscheinlich bei Anwendung der hohen Spannungseinstellung (10 kV, 2 kHz) eine genauso hohe Reduktion von S. Typhimurium wie von L. monocytogenes. Diese höhere Reduktion der grampositiven Bakterienspezies L. monocytogenes nach Erhöhung der Spannung könnte deswegen ein Hinweis auf eine intrazelluläre Schädigung der Bakterienzellen sein, die aus einer vermehrten Akkumulation energiereicher radikaler Stickstoffspezies im Zellinneren resultiert.
51 Sensenig et al. (2011) wiesen in ihrer Studie nach, dass energiereiche reaktive Stickstoff-Radikale nach Schädigung der Peptidoglykanschicht noch ausreichend Energie haben, um weitere Schäden im Intrazellularraum zu verursachen (SENSENIG et al. 2011).
Somit würde eine höhere Konzentration radikaler Stickstoffspezies einerseits in einer vermehrten Elektroporation der Zellwand resultieren, andererseits könnten aufgrund der vermehrten Porenbildung mehr energiereichere Radikale in den Intrazellularraum diffundieren und Zellorganellen und die DNA zerstören. Zudem ist anzunehmen, dass die energiereicheren radikalen Plasmaspezies nach der Reaktion mit der Zellwand noch genug Energie haben könnten, um mit den intrazellulären Zellbestandteilen zu reagieren. Laroussi und Leipold (2003) vermuteten in Folge dieser Diffusion der radikalen Plasmaspezies eine nicht selektive Zerstörung von Proteinen, in Folge dieser unter anderem die Zellatmung als auch die eigenen Reparationsprozesse der Bakterienzelle vermindert bzw. inaktiviert werden (LAROUSSI u. LEIPOLD 2003).
Diese Annahme wird auch durch die Studie von Perni et al. (2007) unterstützt. So wies diese Studie eine höhere Sensitivität von E. coli Knock-out Mutanten gegenüber radikalen Plasmaspezies nach (PERNI et al. 2007). Durch das Ausschalten des recA Gens, das mit der intrazellulären DNA-Reparatur assoziiert ist, wurde eine bessere Reduktion von E. coli durch die Behandlung mit einem Sauerstoff-Helium-Gemisch betriebenen Plasmajet demonstriert (PERNI et al. 2007). Ebenso zeigte diese Studie eine erhöhte Sensibilität von soxS E. coli Deletionsmutanten ohne eine natürliche Resistenz gegenüber NO-Radikalen gegenüber den gebildeten Plasmaspezies.
Diese Aussagen würden die Annahme stützen, dass die höhere Reduktion der grampositiven Bakterienspezies L. monocytogenes nach Anwendung der hohen Spannungseinstellung durch diese additive Zerstörung intrazellulärer Organellen und der DNA aufgrund der höheren Konzentration potenterer radikaler Stickstoff-Spezies erklärbar wäre.
Die in der Literatur erwähnten Wirkmechanismen bestätigen die Vermutung einer gleichhohen Reduktion von S. Typhimurium und L. monocytogenes nach Anwendung der hohen Spannungseinstellung (10 kV, 2 kHz) durch intrazelluläre Interaktionen der
52 Plasmaspezies mit Proteinen und der DNA (PERNI et al. 2007; LEIPOLD et al. 2010;
SENSENIG et al. 2011).
Aufgrund dieser Ergebnisse kann eine unterschiedliche Dicke der Zellwand als Angriffspunkt vieler Plasmaspezies angenommen werden. Kalte Plasmen mit einer höheren Konzentration energiereicherer Stickstoff-Spezies scheinen auf Grundlager der Ergebnisse zusätzlich zur Zellwand auch noch intrazelluläre Organellen sowohl gramnegativer als auch grampositiver Spezies schädigen zu können.