Die Lagerung im Anschluss an die Plasma-Behandlung diente dazu, die Vermehrungs-fähigkeit plasmabehandelter, vermutlich subletal geschädigter Bakterienzellen unter handelsüblichen Lagerungs- und Transport- bzw. Exportbedingungen zu überprüfen.
Dafür wurden die Proben nach der Plasma-Behandlung unter einer modifizierten Schutzgasatmosphäre (30 % CO2, 70 % N2) verpackt und für 14 Tage bei 8 °C ± 0,5 °C gelagert.
Nach sieben- und 14- tägiger Lagerung konnte eine signifikante (p < 0,05) Zunahme der Reduktion der Plasma-behandelten Bakterienspezies S. Typhimurium und L. monocytogenes nachgewiesen werden (Publikation 1, Figure 3).
58 Die Reduktion der Keimzahl zeigte eine Abhängigkeit von der gewählten Spannungseinstellung und von der Behandlungsdauer. Eine längere initiale Behandlungsdauer sowie eine längere Lagerung resultierten zudem bei allen Plasma-behandelten Versuchsgruppen in einer signifikanten (p < 0,05) Zunahme der Reduktion. S. Typhimurium und L. monocytogenes wurden nach Behandlung mit der hohen Spannungseinstellung (10 kV, 2 kHz) sowohl nach sieben- als auch nach 14-tägiger Lagerung unabhängig vom Feuchtigkeitsgehalt des Plasmagases signifikant (p
< 0,05) höher inaktiviert als nach der Behandlung mit der niedrigeren Spannungseinstellung (Publikation 1, Tabelle 2-5).
Zudem wurde die mit einer geringeren Ausgangskeimkonzentration inokulierte Bakterienspezies L. monocytogenes bei Anwendung der hohen Spannungseinstellung unabhängig vom Feuchtigkeitsgehalt des Arbeitsgases (10 kV, 2 kHz, nass und trocken) nach sieben- und 14-tägiger Lagerung signifikant (p < 0,05) höher reduziert als die Bakterienspezies S. Typhimurium. Die Bakterienspezies S. Typhimurium wurde dabei um bis zu 1,84 ± 0,13 lg-Stufen reduziert, während L. monocytogenes um bis zu 2,55 ± 0,67 lg-Stufen bis unterhalb der Nachweisgrenze (definiert als 5 KbE/g bzw. < lg 0,7) reduziert wurde.
Nach 14-tägiger Lagerung im Anschluss an die Plasma-Behandlung mit der niedrigen, trockenen Spannungseinstellung (6,4 kV, 10 kHz, trocken) zeigte sich ein ähnliches Ergebnis. Die Bakterienspezies S. Typhimurium wurde um 1,25 ± 0,19 lg-Stufen reduziert, während die Bakterienspezies L. monocytogenes um 1,68 ± 0,70 lg-Stufen reduziert wurde.
Aufgrund der signifikanten (p < 0,05) Zunahme der Reduktion beider Bakterienspezies während der Lagerung ist davon auszugehen, dass durch die Plasma-Behandlung die Bakterienspezies subletal geschädigt wurden. Während der Lagerung konnten sich die Bakterienspezies nicht erholen und wurden vermutlich letal geschädigt.
Die unbehandelten Kontrollgruppen zeigten während der Lagerung keine oder eine nur sehr geringe Reduktion der Zellzahlen, die auf die natürliche Absterbekinetik von Bakterienspezies während der Lagerung unter einer modifizierten Schutzgas-atmosphäre zurückzuführen ist (WEBER 2010).
59 Um diese initiale subletale Schädigung der Bakterienzellen durch radikale Plasmaspezies zu untersuchen, wurden fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen durchgeführt (Publikation 2).
Nach 10-minütiger Plasma-Behandlung wiesen alle untersuchten Bakterienspezies E. faecium, MRSA, K. pneumoniae, A. baumannii, E. coli und Y. enterocolitica einen überwiegend hohen Anteil orange fluoreszierender Bakterienzellen auf (Publikation 2, Figure 4). Somit konnte bei allen untersuchten Bakterienspezies eine subletale Schädigung nach 10-minütiger Plasma-Behandlung nachgewiesen werden, wie sie auch bei den Bakterienspezies auf der Oberfläche des Lachsschinkens anzunehmen ist.
Eine Überführung von subletal geschädigten Bakterienzellen nach einer Stressexposition, wie z.B. der Plasma-Behandlung, in eine Nährbouillon führt zu einer Wiederherstellung der bakteriellen Zellwand aufgrund von intrazellulären Reparaturmechanismen (MESSELHÄUßER 2010).
Im Gegensatz zur Nährbouillon bietet die Schutzgasatmosphäre den Bakterien durch eine sauerstofffreie Atmosphäre keine optimalen Lebensbedingungen. Unter anderem hemmt der in der Schutzgasatmosphäre enthaltene Stickstoff das Wachstum aerober Mikroorganismen (WEBER 2010). Somit könnten sich die subletal geschädigten Bakterienzellen von S. Typhimurium und L. monocytogenes während der Lagerung nicht mehr erholt haben und wurden letal geschädigt.
Die Lagerung beinhaltet noch weitere schädigende Faktoren. Durch die kühle und dunkle Lagerung wurde die Halbwertszeit der radikalen Plasmaspezies womöglich verlängert, sodass auch nach der Plasma-Behandlung eine anhaltende bakterizide Wirkung bestand.
Die Halbwertszeit des gebildeten Wasserstoffperoxids wird durch eine kühle und dunkle Lagerung verlängert, da die Dissoziation des Wasserstoffperoxids dadurch verlangsamt wird (HAN et al. 2016). Auch Han et al. (2016) führen die Zunahme der Reduktion nach ein- bzw. 24-stündiger Lagerung auf eine verzögerte Interaktion der Bakterienspezies mit radikalen Plasmaspezies aufgrund einer verlängerten Halbwertszeit zurück (HAN et al. 2016).
60 In der Literatur werden weitere Mechanismen beschrieben, die eine zusätzliche Schädigung der Bakterienzellen während der Lagerung bedingen. Song et al. (2009) führen eine weitere Reduktion von L. monocytogenes auf Schinken und Käse nach einwöchiger Lagerung auf eine initial erzeugte und im Verlauf zunehmende Oxidation ungesättigter Membranlipide der bakteriellen Zellwand zurück. Die Autoren vermuten, dass sich die Oxidation während der Lagerung über die gesamte Zellwand ausweiten kann. Sie beschreiben damit einen weiteren möglichen Aspekt der subletalen Schädigung von Bakterienzellen, wie das Fortschreiten eines initial gesetzten Schadens unabhängig einer anhaltenden Exposition gegenüber radikalen Plasmaspezies (SONG et al. 2009).
In dieser Arbeit resultierte eine längere initiale Plasma-Behandlung mit der höheren Spannungseinstellung (10 kV, 2 kHz) in einer signifikant (p < 0,05) höheren Reduktion von S. Typhimurium und L. monocytogenes auch während der Lagerung. Die mit dieser Einstellung vermehrt erzeugten stärker bakterizid wirkenden radikalen Stickstoff-Spezies könnten einen größeren initialen Schaden der Zellwand verursacht haben, sodass insbesondere nach Anwendung der hohen Spannungseinstellung die Kapazität der Reparaturmechanismen überstiegen und die Bakterien während der Lagerung zusätzlich zu dieser Schädigung unter suboptimalen Umweltbedingungen zu einem größten Teil letal geschädigt wurden.
Ziel der Plasma-Behandlung mit anschließender Lagerung war neben der Überprüfung der Vereinbarkeit von Lagerung bzw. des Exports des Plasma-behandelten Schinkens, auch die Überprüfung der mikrobiologischen Stabilität.
Als Beurteilungsgrundlage diente hierfür die EU-Verordnung 2073/2005 (ANONYMOUS 2005c). In dieser Verordnung sind die mikrobiellen Grenzwerte für die einzelnen Lebensmittelkategorien genannt, die vom Lebensmittelunternehmer eingehalten werden müssen. L. monocytogenes darf demnach in verzehrfertigen Lebensmitteln, die die Vermehrung von L. monocytogenes begünstigen, einen Grenzwert von 100 KbE/g während der Haltbarkeitsdauer nicht überschreiten.
Salmonella spp. dürfen in Fleischerzeugnissen, die zum Verzehr in rohem Zustand bestimmt sind, in einer 25 g Probe während der gesamten Haltbarkeitsdauer nicht nachweisbar sein.
61 Trotz der Reduktion beider Plasma-behandelter Bakterienspezies während der Lagerung könnten die in der Verordnung vorgegeben Grenzwerte bei beiden Bakterienspezies nicht eingehalten werden.
Nur für die initiale Keimkonzentration von L. monocytogenes in Höhe von 103 KbE/g wurde nach der Plasma-Behandlung und anschließender 14-tägiger Lagerung ein mikrobiologisch verkehrstaugliches Lebensmittel nach der VO (EG) 2073/2005 erzielt.
Im Gegensatz zu L. monocytogenes wurde S. Typhimurium während der Lagerung nicht auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze reduziert (definiert als 5 KbE/g bzw. < lg 0,7), wie sie in der VO (EG) 2073/2005 vorgeschrieben sind.