Untersuchungen zu Zytostatikarückständen in Serum und Urin bei Hunden mit Tumorerkrankungen während und nach Chemotherapie

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zu Zytostatikarückständen in Serum und Urin bei Hunden mit Tumorerkrankungen

während und nach Chemotherapie

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anna Katharina Felicitas Knobloch Brilon

Hannover 2010

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

Klinik für Kleintiere Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2010

Das Projekt, in dessen Rahmen diese Arbeit entstanden ist, wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG SI 1412/1-1, HA 3343/2-1).

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MEINEN LIEBEN ELTERN

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Diese Dissertation basiert auf zwei Veröffentlichungen in international anerkannten wissenschaftlichen Zeitschriften mit Gutachtersystem (peer review).

INHALT:

I. Einleitung ... 1

II. Zusammenfassung der Ergebnisse beider Studien ... 4

III. Übergreifende Diskussion ... 7

IV. Publikationen ... 16

1. Drug residues in serum of dogs receiving anti-cancer chemotherapy 2. Cytotoxic drug residues in urine of dogs receiving anti-cancer chemotherapy V. Zusammenfassung (englisch) ... 17

VI. Zusammenfassung (deutsch)... 19

VII. Schrifttumsverzeichnis ... 21

VIII. Abkürzungsverzeichnis ... 32

IX. Verlagsbestätigungen ... 33

X. Weitere Publikationen im Rahmen dieser Arbeit ... 34

XI. Danksagung ... 35

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I. Einleitung

Chemotherapien werden zur Behandlung chemosensitiver Tumorerkrankungen, als adjuvante Therapie bei mikroskopischer Tumorerkrankung und als Sensitizer in der Radiotherapie eingesetzt (CHUN et al. 2001). Auf Grund dieser vielfältigen Einsatzgebiete werden Chemotherapien auch in der Veterinärmedizin zunehmend häufiger zur Behandlung einer Vielzahl von Neoplasien eingesetzt (ALBRECHT 1992, HAHN u. RICHARDSON 1995). Die Verteilung der Zytostatika im Organismus, ihr Metabolismus und schließlich ihre Ausscheidung unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Art des Chemotherapeutikums (MOORE u. ERLICHMAN 1998).

In der Humanmedizin haben verschiedene Studien gezeigt, dass Krankenhauspersonal auf onkologischen Stationen zytotoxischen Substanzen ausgesetzt sein kann (SESSINK et al. 1992, 1994; ENSSLIN et al. 1994, 1997;

BURGAZ et al. 1999; PETHRAN et al. 2003; FRANSMAN et al. 2004, 2005, 2007).

Der Kontakt kann sowohl teratogene (SELEVAN et al. 1985; STÜCKER et al. 1990) als auch mutagene (WAKSVIK et al. 1981; POHLOVÀ et al. 1986; MILKOVIC- KRAUS u. HORVAT 1991; SARDAS et al. 1991; GOLONI-BERTOLLO et al. 1992;

SESSINK et al. 1994) Effekte hervorrufen. Die zunehmend häufigere Durchführung von Chemotherapien in der Kleintiermedizin wirft die Frage auf, inwieweit Zytostatikarückstände in Se- und Exkreten entsprechend behandelter Patienten potentielle Gesundheitsrisiken für den Menschen und Umweltgefahren darstellen.

In Ermangelung veterinärmedizinischer Studien über Rückstände dieser Substanzen basieren Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin derzeit auf Empfehlungen für die Humanmedizin. In einem ersten Dokument für die Veterinärmedizin hat das European College of Veterinary Internal Medicine of Companion Animals (ECVIM-CA) entsprechende Protokolle für den Umgang mit Zytostatika und dabei anfallenden Abfallprodukten veröffentlicht. Diesen Protokollen liegen humanmedizinische Richtlinien, unter anderem des NIOSH (National Institute for Occupational Safety on Health) und des MARC (Management and Awareness of Risks of Cytotoxic Handling) zugrunde (ECVIM-CA 2007).

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Wegen der guten Wirksamkeit von Chemotherapien beim malignen Lymphom und bei metastasierten Mastzelltumoren des Hundes stellen diese Tumorerkrankungen häufige Indikationen für die Anwendung von Zytostatika in der Veterinärmedizin dar.

Das Lymphom ist eine der häufigsten Neoplasien des Hundes (DORN et al. 1968;

DORN et al. 1970). Diverse Chemotherapieprotokolle zur Behandlung dieser neoplastischen Erkrankung wurden bis heute veröffentlicht (ZEMANN et al. 1998;

CHUN et al. 2000; BOYCE u. KITCHELL 2000; MOORE et al. 2001; GARRETT et al.

2002; SIMON et. al. 2006, SIMON et al. 2008). Viele dieser Kombinationschemotherapieprotokolle enthalten unter anderem die Zytostatika Asparaginase, Cyclophosphamid, Vincristin und Doxorubicin.

Mastzelltumoren repräsentieren den zweithäufigsten Tumor beim Hund und den häufigsten Hauttumor des Hundes (DORN et al. 1968; PRIESTER 1973; VAIL 1996).

Da bis zu 40% dieser Tumoren high-grade oder undifferenziert sind (HOTTENDORF u. NIELSEN 1967; BOSTOCK 1973; PATNAIK et al. 1984), und für undifferenzierte Mastzelltumoren eine Metastasierungsrate bis zu 96% (BOSTOCK 1973; VAIL 1996) beschrieben ist, haben diverse Studien den Einsatz von Chemotherapien zur Behandlung von Mastzelltumoren untersucht (THAMM et al. 1999; DAVIES et al.

2004; THAMM et al. 2006; CAMPS-PALAU et al. 2007; MARCONATO et al. 2008;

RASSNICK et al. 2008). Auch wenn zu erwarten ist, dass die Entwicklung von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren als alternative Behandlungsmethode von high-grade Mastzelltumoren die Einsatzhäufigkeit reduzieren wird, werden sich Patientenbesitzer, oftmals aus finanziellen Gründen, auch weiterhin für eine Chemotherapie entscheiden (HAHN et al. 2008).

Die meisten Chemotherapieprotokolle, sowohl zur Behandlung von Lymphomen, als auch in der Therapie von Mastzelltumoren, sehen vor, dass die Patienten eine Woche nach der Chemotherapie zur Laborkontrolle vorgestellt werden. Das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum chemotherapeutisch behandelter Hunde würde für Tierärzte und Laborpersonal durch den Umgang mit den Blutproben eine potentielle Kontaminationsgefahr und infolgedessen das Risiko einer Gesundheitsgefährdung bedeuten. Um derartige Risiken in Zukunft besser erfassen

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und beurteilen zu können, verfolgt die erste Studie das Ziel, durch eine quantitative Analyse das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum von Hunden sieben Tage nach der Chemotherapie zu untersuchen.

Da die Patienten die Klinik in der Regel nach der Behandlung mit ihren Besitzern verlassen, könnte weiterhin das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Urin der Tiere eine Gefährdung für Beitzer und andere Personen mit Kontakt zu derart behandelten Hunden darstellen. Daher befasst sich die zweite Studie, die in diese Arbeit einfließt, mit der Untersuchung von Zytostatikarückständen im Urin zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Chemotherapie.

Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen sollen zur Charakterisierung möglicher Gesundheitsrisiken im Zusammenhang mit dem Einsatz von Chemotherapien in der Veterinärmedizin beitragen.

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II. Zusammenfassung der Ergebnisse beider Studien

Serum

Es wurden 33 Serumproben, die wenige Minuten nach der Chemotherapie gewonnen wurden, analysiert. Diese dienten als Vergleichsmessungen für die Proben, die sieben Tage nach erfolgter Behandlung entnommen wurden. Die gemessenen Zytostatikakonzentrationen variierten in Abhängigkeit der jeweiligen Substanz. Die medianen Serumkonzentrationen lagen nach Vincristin bei 37,0 µg/L (range: 11,0-87,0 µg/L), nach Vinblastin bei 13,0 µg/L (range: 13,0-35,0 µg/L), nach Cyclophosphamid bei 2484,0 µg/L (range: 1209,0-2778,0 µg/L) und nach Doxorubicin bei 404,0 µg/L (range: 234,0-528,0 µg/L).

Insgesamt wurden 81 Serumproben analysiert, die entweder sieben Tage nach der Applikation von Vincristin, Doxorubicin oder Cyclophosphamid (Lymphompatienten), oder sieben Tage nach der intravenösen Applikation von Vinblastin und gleichzeitig ein bis zwei Tage nach der oralen Gabe von Cyclophosphamid (Mastzelltumorpatienten) gewonnen wurden. Von diesen Proben konnten in einer Probe Vinblastinrückstände in einer Konzentration von 7,0 µg/L und in zwei Proben Cyclophosphamidrückstände in den Konzentrationen 7,0 µg/L und 8,0 µg/L nachgewiesen werden. In allen anderen Proben lagen die Rückstandskonzentrationen unter der Nachweisgrenze.

Urin

Insgesamt wurden 666 quantitative Analysen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Applikation der Substanzen Vincristin, Vinblastin, Doxorubicin und Cyclophosphamid durchgeführt.

Cyclophosphamid: 203 Proben wurden auf Rückstände von Cyclophosphamid untersucht. 174 Proben waren von Hunden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der intravenösen Injektion von 200 mg/m²Cyclophosphamid gewonnen worden. 29 Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach oraler Cyclophosphamidgabe (50 mg/m²) entnommen. Die mediane Cyclophosphamidkonzentration wenige

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Minuten nach intravenöser Injektion betrug 398,2 µg/L (range: 1,2-2582,7 µg/L).

Schon an den Tagen 1, 2 und 3 nach der Chemotherapie lagen die medianen Urinkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze. Die medianen Konzentrationen von Cyclophosphamidrückständen 1-2 Tage nach oraler Applikation lagen ebenfalls unter der Nachweisgrenze.

Vincristin: Es wurden 235 Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der intravenösen Injektion von 0,7 mg/m² Vincristin untersucht. Die mediane Vincristinkonzentration im Urin lag wenige Minuten nach der Chemotherapie bei 53,8 µg/L (range: 3,9-149,2 µg/L). An den Tagen 1, 2 und 3 lagen die medianen Konzentrationen der gemessenen Vincristinrückstände bei 20,2 µg/L (range: 1,2-63,2 µg/L), 11,4 µg/L (range: 1,0-36.3 µg/L) und 6,6 µg/L (0,5-25,5 µg/L). An den Tagen 7, 10, 14 und 21 nach der Chemotherapie befanden sich die medianen Vincristinurinkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze.

Vinblastin: Insgesamt wurden 33 Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der intravenösen Injektion von Vinblastin in einer Dosierung von 2 mg/m² auf Vinblastinrückstände untersucht. Die mediane Vinblastinurinkonzentration direkt nach der Chemotherapie betrug 144,9 µg/L (range: 77,9-305,3 µg/L). An den Tagen 1, 2 und 3 nach der Vinblastinapplikation konnten mediane Vinblastinkonzentrationen von 70,8 µg/L (range: 36,6-111,3 µg/L), 35,6 µg/L (range: 25,2-115,3 µg/L) und 18,7 µg/L (range: 13,2-34,4 µg/L) im Urin gemessen werden. Sieben Tage nach der Chemotherapie mit Vinblastin betrug die mediane Urinkonzentration der gemessenen Vinblastinrückstände 3,7 µg/L (range: 0,5-8,3 µg/L). Eine einzelne Probe, die 14 Tage nach der Vinblastinapplikation gewonnen worden war, enthielt Vinblastinrückstände in Höhe von 0,5 µg/L.

Doxorubicin: 195 Urinproben nach intravenöser Injektion von 30 mg/m² Doxorubicin standen zur Untersuchung auf Doxorubicinrückstände zur Verfügung. Wenige Minuten nach der Infusion von Doxorubicin lag die mediane Doxorubicinkonzentration bei 354,0 µg/L (range: 102,5-3630,7 µg/L). An den Tagen 1, 2 und 3 nach der Doxorubicininfusion betrugen die medianen Rückstandskonzentrationen 165,6 µg/L (range: 61,4-762,0 µg/L), 156,9 µg/L (range:

53,4-475,1 µg/L) und 158,2 µg/L (range: 13,8-469,8 µg/L). An Tag 7 konnten im

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Median Doxorubicinkonzentrationen von 26,9 µg/L (range: 0-106,1 µg/L) und an den Tagen 10, 14 und 21 Konzentrationen von 16,2 µg/L (range: 2,5-73,5 µg/L), 2,5 µg/L (range: 0-40,5 µg/L) und 2,5 µg/L (range: 0-2,5 µg/L) nachgewiesen werden. Alle Urinproben, die an den Tagen 22-28 nach der Chemotherapie mit Doxorubicin gewonnen worden waren enthielten keine nachweisbaren Doxorubicinrückstände.

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III. Übergreifende Diskussion

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Zytostatikarückständen im Serum und im Urin von Hunden in Zusammenhang mit der Durchführung von Chemotherapien in der Veterinärmedizin. Chemotherapien werden in der Veterinärmedizin zumeist ambulant durchgeführt, so dass entsprechend behandelte Patienten nach der Chemotherapie die Klinik oder Praxis mit ihren Besitzern verlassen. Daher könnten Zytostatikarückstände im Urin in erster Linie ein potentielles Gesundheitsrisiko für Besitzer und andere Personen mit Kontakt zu derart behandelten Hunden bedeuten. Es war zu erwarten, dass Urin von chemotherapeutisch behandelten Hunden, ebenso wie es für Urin von chemotherapeutisch behandelten Menschen gezeigt werden konnte (FRANSMAN et al. 2004), Rückstände der eingesetzten Substanzen enthalten würde. Dennoch sind bis heute keine systematischen klinischen Studien veröffentlicht worden, in denen Rückstände von Chemotherapeutika in Se- und Exkreten von veterinärmedizinischen Patienten untersucht wurden.

Das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum chemotherapeutisch behandelter Hunde wurde in dieser Studie vor allem im Hinblick auf ein potentielles Kontaminationsrisiko für Tierärzte und Laborpersonal untersucht, welches durch den Umgang mit Blutproben dieser Hunde bestehen könnte.

In der Humanmedizin beschreiben diverse Studien, über welche Wege Klinikpersonal in Kontakt mit zytotoxischen Substanzen kommen kann. Sowohl über die Haut während der Vorbereitung und Durchführung von Chemotherapien (KROMHOUT et al. 2000, FRANSMAN et al. 2004, 2005), als auch via Inhalation (DE WERK et al.

1983, MC DEVITT et al. 1993, KROMHOUT et al. 2000, KIFFMEYER et al. 2002) können entsprechende Substanzen von betroffenen Personen inkorporiert werden.

Außerdem bestätigen FRANSMAN et al. (2004, 2005) in zwei Studien das Vorliegen eines Expositionsrisikos beim Umgang mit Urin von chemotherapeutisch behandelten Patienten. Ebenso kann Personal beim Waschen entsprechender Patienten und bei der Bettenreinigung auf onkologischen Stationen Zytostatikarückständen ausgesetzt sein (FRANSMAN et al. 2004, 2005).

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In der Humanmedizin wird häufig Cyclophosphamid als exemplarische Substanz gewählt, um die Exposition gegenüber antineoplastischen Substanzen zu messen (SESSINK et al. 1992; McDEVITT et al. 1993; ENSSLIN et al. 1994; SESSINK et al.

1994; BURGAZ et al. 1999; KROMHOUT et al. 2000; KIFFMEYER et al. 2002;

FRANSMAN et al. 2004, 2005, 2007). Cyclophosphamid wird häufig eingesetzt, und es stehen sensitive Analysemethoden zur Konzentrationsbestimmung von entsprechenden Rückständen zur Verfügung (FRANSMANN et al. 2007). Im Gegensatz zu diesen Studien erlaubt die in der aktuellen Studie angewandte LC/MS/MS-Methode die simultane Messung der vier Zytostatika Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin im µg/L-Bereich (HAMSCHER et al.

2010). Diese Substanzen sind Bestandteil vieler Kombinationschemotherapie- protokolle in der Veterinärmedizin (ZEMANN et al. 1998; THAMM et al. 1999; CHUN et al. 2000; BOYCE u. KITCHELL 2000; MOORE et al. 2001; GARRETT et al. 2002;

DAVIES et al. 2004; SIMON et. al. 2006, THAMM et al. 2006; CAMPS-PALAU et al.

2007; RASSNICK et al. 2008; SIMON et al. 2008), so dass der Analyse ihrer Residuen wegen der häufigen Anwendung besondere Bedeutung zukommt. Durch die zeitgleiche Analyse von Rückständen der vier genannten Zytostatika können zu jedem Messzeitpunkt innerhalb einer Kombinationschemotherapie Rückstände aller vier Substanzen nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zur Rückstandsanalyse von Zytostatika im Serum zeigen, dass Zytostatikarückstände im Serum chemotherapeutisch behandelter Hunde direkt im Anschluss an die Behandlung nachgewiesen werden können. Diese messbaren Konzentrationen in Serumproben wenige Minuten nach der Chemotherapie variierten, wie erwartet, je nach applizierter Substanz.

Blutproben, die zu diesem Zeitpunkt gewonnen werden, stellen daher ein Kontaminationsrisiko dar. Variationen in den Messwerten lassen sich zum Teil durch geringe Schwankungen in den Zeitintervallen vom Ende der Applikation der Zytostatika bis zur anschließenden Entnahme der Blutprobe erklären. Diese Schwankungen sind abhängig von der individuellen Verteilung und vom jeweiligen Metabolismus im Patienten und von der Arbeitsweise des behandelnden Tierarztes.

Auch wenn es sich hierbei nur um Schwankungen von wenigen Minuten handelt,

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könnten gewisse Variabilitäten in den Serumkonzentrationen zu diesem Zeitpunkt von diesem Faktor beeinflusst worden sein. Dennoch stimmen die Ergebnisse dieser Studie mit früheren pharmakokinetischen Studien überein. Eine jüngere Studie über die Pharmakokinetik von Doxorubicin berichtet zum Beispiel über vergleichbare Serumkonzentrationen kurz nach der Doxorubicininfusion (SELTING et al. 2006).

Da eine Blutentnahme direkt nach der Chemotherapie und an den folgenden ein bis drei Tagen jedoch nur in Ausnahmefällen notwendig sein dürfte, ist der Kontakt von Tierärzten und Laborpersonal mit Blutproben zu diesen Zeitpunkten seltener.

Laborkontrollen finden in vielen Chemotherapieprotokollen üblicherweise sieben Tage nach der Behandlung statt (MacEWEN et al. 1981; MYERS et al. 1997;

ZEMANN et al. 1998; SIMON et al. 2006). Daher wurde in dieser Studie der Interessenschwerpunkt auf diesen Zeitpunkt gelegt, und in der überwiegenden Mehrzahl der Proben lagen die Rückstandskonzentrationen zu diesem Zeitpunkt unterhalb der Nachweisgrenzen. In einer einzelnen Probe konnten niedrige Vinblastinkonzentrationen nachgewiesen werden. Gründe für diese Ausnahme bleiben unklar. Eine Kontamination während der Probengewinnung oder individuelle Unterschiede im Metabolismus sind mögliche Erklärungen hierfür. Hieraus ergibt sich, dass der Umgang mit Blutproben zu diesem Zeitpunkt als sicher angesehen werden kann.

Es muss jedoch erwähnt werden, dass in zwei von zwölf Serumproben, die ein bis zwei Tage nach der oralen Gabe von Cyclophosphamid entnommen worden waren, Cyclophosphamidrückstände nachgewiesen wurden. Obwohl die gemessenen Serumkonzentrationen zu diesem Zeitpunkt, verglichen mit Konzentrationen direkt nach der Behandlung, sehr gering waren und nur in einzelnen Proben nachgewiesen wurden, muss die Möglichkeit des Vorkommens von Rückständen im Serum kurze Zeit nach oraler Chemotherapie beachtet werden. Dieser Aspekt ist vor allem in Hinblick auf Chemotherapieprotokolle, die die kontinuierliche orale Zytostatikaverabreichung vorsehen, wie beispielsweise zur Behandlung der chronischen lymphatischen Leukämie (LEIFER u. MATUS 1986) oder des multiplen Myeloms (McEWEN u. HURVITZ 1977), interessant und sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.

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Die Ergebnisse der Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Urin bestätigen, dass im Urin von Hunden Rückstände aller vier untersuchten Zytostatika (Vincristin, Vinblastin, Doxorubicin und Cyclophosphamid) nachweisbar sind. Die gemessenen Konzentrationen variierten in Abhängigkeit vom Untersuchungszeitpunkt nach der Chemotherapie. Die höchsten Konzentrationen wurden ein bis zwei Stunden nach der Behandlung gemessen. Cyclophosphamid zeigte die kürzeste Dauer nachweisbarer Rückstände im Urin. Residuen dieser Substanz waren nur wenige Minuten nach der intravenösen Verabreichung messbar. An den Tagen eins bis drei nach der Behandlung lagen die medianen Cyclophosphamidkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze. In einzelnen Urinproben konnten lediglich sehr niedrige Konzentrationen gemessen werden. Vermutlich sind diese Ergebnisse mit der Pharmakokinetik von Cyclophosphamid zu erklären. Diese Substanz wird in der Leber sehr schnell zu aktiven Metaboliten metabolisiert (GLUE u. CLEMENT 1999).

Da die Urinproben in der vorliegenden Arbeit nicht auf das Vorkommen dieser Metaboliten untersucht wurden, müsste dieser Aspekt in weiterführenden Studien geklärt werden.

Zusätzlich wurden in der aktuellen Studie Urinrückstände nach oraler Verabreichung von Cyclophosphamid untersucht. Die Anzahl entsprechender Proben war zwar gering, die Ergebnisse zeigen aber, dass die medianen Cyclophosphamidkonzentrationen im Urin ein bis zwei Tage nach der Gabe unterhalb der Nachweisgrenze lagen. In einer Probe konnten niedrige Konzentrationen nachgewiesen werden. Die genauere Datenrecherche ergab, dass der Besitzer das Cyclophosphamid in diesem Fall am Abend eingegeben hatte und die Urinprobe am folgenden Morgen gewonnen worden war, so dass zwischen Verabreichung des Zytostatikums und Probengewinnung ein Zeitintervall von 12 statt 24 Stunden wie in den übrigen Fällen, lag. Diese Ergebnisse zeigen, dass detaillierte Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Urin von Hunden mit kontinuierlicher täglicher oraler Zytostatikagabe durchgeführt werden sollten.

Im Gegensatz zu Cyclophosphamid waren Vincristin- und Vinblastinrückstände im Urin über einen Zeitraum von drei Tagen nach der Behandlung nachweisbar.

Zusätzlich lag die mediane Vinblastinurinkonzentration sieben Tage nach der

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Injektion im messbaren Bereich. Da die Anzahl von Urinproben nach der Behandlung mit Vinblastin, mangels zur Verfügung stehender Patienten, in dieser Studie gering war, müssten zusätzliche Untersuchungen weiterer Proben, auch zu späteren Zeitpunkten, die dargestellten Ergebnisse verifizieren und vervollständigen.

Die längste Ausscheidungsdauer von Rückständen im Urin zeigte sich nach der Behandlung mit Doxorubicin. Doxorubicinrückstände konnten bis zu 21 Tage nach der Doxorubicininfusion im Urin nachgewiesen werden. Die gemessenen Konzentrationen waren mit unter 10% der initialen Doxorubicinurinkonzentration eine Woche nach der Chemotherapie und 1-2% nach zwei Wochen jedoch relativ niedrig.

Die lange Ausscheidungsdauer von Doxorubicin im Urin kann vermutlich durch seine pharmakokinetischen Eigenschaften erklärt werden. Es wird an Plasmaproteine und an Gewebe gebunden (ROBERT u. GIANNI 1993). Diese Bindung führt zu einer raschen Elimination aus dem Serum, gefolgt von einer zweiten Phase des Metabolismus in der Leber und anschließend einer letzten metabolischen Phase, in der die Gewebebindung gelöst wird (ROBERT u. GIANNI 1993).

Die Höhe der in der aktuellen Arbeit gemessenen Doxorubicinrückstände und die Ausscheidungsdauer unterscheiden sich von Ergebnissen einer vorangegangenen Studie (HAHN et al. 1994). In dieser früheren Studie konnten Doxorubicinrückstände im Urin von Hunden mit Lymphomen nur für einen Zeitraum von fünf Tagen nach der Chemotherapie nachgewiesen werden. Weiterhin waren die gemessenen Doxorubicinkonzentrationen an den Tagen eins bis vier nach der Chemotherapie in dieser Studie vier- bis neunfach geringer, als die in der aktuellen Studie nachgewiesenen Konzentrationen. Die Gründe für diese Unterschiede sind nicht ganz klar, könnten jedoch in Zusammenhang mit der hohen Selektivität der in der aktuellen Arbeit eingesetzten LC-ESI-MS-MS-Methode stehen. Anders als in der Studie von HAHN et al. (1994), in der fünf Hunde in metabolischen Käfigen gehalten wurden, um den gesamten Urin in diesem Zeitraum sammeln zu können und auf Doxorubicinrückstände und dessen Metabolite zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit keine metabolischen Käfige eingesetzt. Deshalb erlauben die Ergebnisse dieser Arbeit keine differenzierten Aussagen über die Pharmakokinetik und den Metabolismus der untersuchten Zytostatika. Dadurch kann weder die

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prozentuale Gesamtzytostatikamenge, die mit dem Urin ausgeschieden wird angegeben werden, noch können Verteilungskurven erstellt werden. Jedoch sollten in dieser Arbeit Residuen unter realen Bedingungen der Chemotherapieapplikation und nachfolgender Entlassung der Patienten untersucht werden, welche keine Haltung der Patienten in metabolischen Käfigen notwendig macht.

In diesem Kontext stellt sich zusätzlich die Frage, inwiefern die Ausscheidungsdauer mit dem Körperfettanteil der Hunde korreliert. Dieser interessante Aspekt sollte in zukünftigen Studien untersucht werden, besonders, wenn es sich um Substanzen handelt, die wie beispielsweise Doxorubicin eine hohe Gewebebindung aufweisen.

Die Konzentrationen von Rückständen im Urin scheinen hingegen nicht wesentlich von der Länge der Lagerung der Proben im Kühlschrank beeinflusst zu werden. Im Stabilitätsversuch wurden Proben initial analysiert, anschließend bei -80°C drei Jahre aufbewahrt und nach diesem Zeitraum erneut untersucht. Die Cyclophosphamid- und Doxorubicinkonzentrationen stimmten gut überein. Die Vincristin- genau wie die Vinblastinkonzentrationen waren über diesen Zeitraum nur sehr geringfügig niedriger geworden.

Wie bereits eingangs erwähnt, sind Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapeutika und dabei anfallenden Abfallprodukten für die Veterinärmedizin zusammengestellt worden (ECVIM-CA 2007). In diesen Richtlinien werden auch Zeiträume definiert, in denen nach der Chemotherapie eine Kontamination durch Zytostatikarückstände im Urin entsprechend behandelter Patienten zu erwarten ist.

Die Festlegung dieser Zeiträume basiert jedoch auf Erfahrungen in der Humanmedizin. Für die Zytostatika Cyclophosphamid, die Vincaalkaloide und für Doxorubicin werden beispielsweise vier, drei bzw. sieben Tage angegeben, an denen in Folge einer Behandlung mit diesen Substanzen mit entsprechenden Rückständen im Urin gerechnet werden muss (ECVIM-CA 2007). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen aber, dass die Dauer der zu erwartenden Ausscheidungen von Rückständen mit dem Urin für Vinblastin und Doxorubicin angepasst werden müsste. Rückstände dieser Substanzen waren im Urin über längere Zeiträume als angegeben messbar. Im Gegensatz dazu zeigte

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Cyclophosphamid eine kürzere Ausscheidungsdauer von Rückständen der Reinsubstanz. Allerdings sollte im Hinblick auf das Vorkommen potentieller zytotoxischer Metaboliten von Cyclophosphamid im Urin, das in dieser Arbeit nicht untersucht wurde, der Urin mit entsprechender Vorsicht auch über einen Tag nach der Chemotherapie hinaus behandelt werden.

Bis heute beschreiben zwei frühere Veröffentlichungen das Expositionsrisiko gegenüber Zytostatika in der Veterinärmedizin (ERJAVEC et al. 2001, MEIJSTER et al. 2006). In einer Studie untersuchten die Autoren die Exposition von Personen bei der Zubereitung und Verabreichung von Zytostatika in veterinärmedizinischen Kliniken. Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Werte nachweisbarer Zytostatikarückstände auf der Oberfläche von Handschuhen 15-mal höher lagen als gemessene Werte während der Verabreichung von Zytostatika in Humankrankenhäusern (MEIJSTRER et al. 2006). Rückstände in Se- und Exkreten klinischer Patienten wurden in dieser Studie jedoch nicht untersucht. Ein weiterer Fallbericht beschreibt den Haarverlust bei zwei Haustieren, die durch mit Paclitaxel kontaminierten Speichel ihrer Besitzerin, die wegen eines Ovarialzellkarzinoms chemotherapeutisch behandelt wurde, Paclitaxel aufgenommen hatten (ERJAVEC et al. 2001). Der Speichel der Besitzerin war auf einen Hund und eine Katze übertragen worden, weil sie von der Besitzerin vorgekautes Essen gefüttert bekamen. Dieser Fall zeigt, dass Speichel eine zusätzliche potentielle Kontaminationsquelle darstellen könnte. Der Aspekt sollte daher ebenfalls in weiterführenden Studien untersucht werden.

In einer jüngeren Studie berichten FRANSMAN et al. (2007) von der sinkenden Expositionsrate von Krankenschwestern onkologischer Stationen gegenüber Zytostatika zwischen 1997 und 2000 in den Niederlanden. Unter anderem hat die Erstellung detaillierter Richtlinien zu dieser Senkung beigetragen. Das Ergebnis dieser Studie betont die Bedeutung der Charakterisierung von Berufsrisiken und Umweltgefahren in Verbindung mit der Durchführung von Chemotherapien in der

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veterinärmedizinischen Onkologie und die Verbesserung der Risikosituation durch Anpassung von Sicherheitsstandards.

Die Nachweisgrenzen der in den vorliegenden beiden Studien angewandten Methode für die vier untersuchten Substanzen stellen einen limitierenden Faktor der Studien dar. Die hier untersuchten Zytostatika werden teilweise von der International Association of Research on Cancer (IARC) als karzinogen und mutagen und alle als teratogen klassifiziert (IARC 1975, 1976, 1981, 1987). Demnach müsste jede nachweisbare Menge dieser Substanzen als potentiell gesundheitsgefährlich angesehen werden. Unter Beachtung, dass Patienten in der Veterinärmedizin in der Regel geringere Mengen der Chemotherapeutika erhalten als Patienten in der Humanmedizin (RUSLANDER 2005), weil niedrigere Dosierungen eingesetzt werden und die Körpergewichte der Tiere geringer sind, können niedrigere Rückstandskonzentrationen erwartet werden als in der Humanmedizin. Es bleibt unklar, ob in der vorliegenden Arbeit die Proben mit Messergebnissen unterhalb der festgesetzten Nachweisgrenzen wirklich frei von Rückständen der entsprechenden Zytostatika sind. Verbesserte Messmethoden mit geringeren Nachweis- und Bestimmungsgrenzen würden diesen Faktor präzisieren. Auf der anderen Seite ist unklar, inwiefern die gemessenen Rückstandskonzentrationen überhaupt hoch genug sind, um ein Gesundheitsrisiko für den Menschen darzustellen. Dieser Aspekt kann in der vorliegenden Arbeit nicht letztendlich geklärt werden. Daher müssen weiterführende Studien Mutagenitätsprüfungen mit Zytostatikadosierungen in Höhe der nachgewiesenen Konzentrationen beinhalten. Erst dadurch wird es möglich sein, potentielle Gefahren ausgehend von Zytostatikarückständen im Serum und im Urin näher zu definieren. So lange entsprechende Daten noch nicht zur Verfügung stehen, sollte Urin und Serum von Hunden, die mit den zytotoxischen Substanzen Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin behandelt werden, innerhalb der Zeiträume, in denen in dieser aktuellen Studie Zytostatikarückstände nachgewiesen werden konnten, mit entsprechender Vorsicht und entsprechend den Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin behandelt werden.

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Diese Arbeit stellt einen ersten wichtigen Schritt zur Charakterisierung von Zytostatikarückständen in Se- und Exkreten von Hunden während und nach der Chemotherapie dar. Die Ergebnisse tragen dazu bei, bestehende Richtlinien für die Veterinärmedizin anzupassen und damit das Expositionsrisiko für den Menschen zu reduzieren, um so zu einem sichereren Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin zu führen.

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IV. Publikationen

Der selbstständige Anteil an diesen Publikationen umfasst die Probenakquise, die Auswertung der Ergebnisse und Literaturrecherche und die Verfassung beider Publikationen als Hauptautorin.

1. KNOBLOCH, A., S. A. I. MOHRING, N. EBERLE, I. NOLTE, G. HAMSCHER, D. SIMON (2010):

Drug residues in serum of dogs receiving anticancer chemotherapy.

J.Vet.Intern.Med. 24, 379-383

2. KNOBLOCH, A., S. A. I. MOHRING, N. EBERLE, I. NOLTE, G. HAMSCHER, D. SIMON (2010):

Cytotoxic drug residues in urine of dogs receiving anticancer chemotherapy.

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V. Zusammenfassung (englisch)

Anna Katharina Felicitas Knobloch (2010):

Evaluation of drug residues in serum and urine of dogs receiving anti-cancer chemotherapy

The presence of drug residues in serum and urine of chemotherapeutically treated dogs may represent an occupational hazard. However, studies on cytotoxic drug residues in serum and urine of clinical patients are lacking in veterinary oncology.

Therefore, the objective of the two studies was the quantitative analysis of cytotoxic drug residues in serum of dogs seven days after treatment and in urine at different timepoints following treatment, in order to evaluate possible occupational hazards associated with chemotherapy in veterinary medicine.

Client-owned canine cancer patients treated for lymphoma or mast cell tumors with the chemotherapeutic agents vincristine, vinblastine, cyclophosphamide, or doxorubicin were eligible for these studies.

Measurement of vincristine, vinblastine, cyclophosphamide and doxorubicin residues in serum and urine was performed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS).

In the first study evaluating drug residues in serum the mean serum concentrations of 33 samples collected directly after treatment were: vincristine: 37.0 µg/L, vinblastine:

13.0 µg/L, cyclophosphamide: 2484.0 µg/L, doxorubicin: 404.0 µg/L. In 81 serum samples collected seven days following treatment, the majority of samples conained no measurable residues. The analysis only revealed low vinblastine residues (7.0 µg/L) in one sample collected seven days following treatment and low concentrations of cyclophosphamide (7.4 µg/L and 8.6 µg/L) in two samples collected one to two days following oral administration.

The second study evaluating drug residues in urine showed a median cyclophosphamide residue concentration of 398.2 µg/L directly following treatment (d0) and below the level of detection on days 1-3 (d1, d2, d3). Median vincristine residue concentration was 53.8 µg/L directly after treatment and 20.2, 11.4, and 6.6µg/L on days 1, 2, and 3. Median vinblastine residues amounted to 144.9 (d0),

(24)

70.8 (d1), 35.6 (d2), and 18.7 µg/L (d3) with low concentrations detectable for seven days after treatment. Median urine doxorubicin concentrations were 354.0 (d0), 165.6 (d1), 156.9 (d2), and 158.2 µg/L (d3). Low concentrations of doxorubicin residues were measurable up to 21 days after administration.

The conclusion of the two studies is that in this population of dogs, measurement of serum from canine chemotherapy patients seven days following treatment with vincristine, vinblastine, cyclophosphamide and doxorubicin revealed no detectable chemotherapy residues in the majority of cases. Therefore, handling of blood samples at this time point may be considered safe. In urine samples variable concentrations of cytostatics were measured, depending on sampling time point and substance. Findings may serve to improve present chemoprotection guidelines and help minimize exposure risks.

(25)

VI. Zusammenfassung (deutsch)

Anna Katharina Felicitas Knobloch (2010):

Untersuchungen zu Zytostatikarückständen in Serum und Urin bei Hunden mit Tumorerkrankungen während und nach Chemotherapie

Obwohl Zytostatika in Abhängigkeit von der Substanz als kanzerogen, mutagen und teratogen einzustufen sind und somit eine potentielle Gesundheitsgefährdung für Kontaktpersonen darstellen, gab es bis heute keine systematischen Studien, die Rückstände dieser Substanzen nach chemotherapeutischer Behandlung von Hunden in der Veterinärmedizin untersucht haben. Die vermehrte Anwendung von Chemotherapeutika in der Veterinärmedizin wirft jedoch die Frage nach möglichen Gesundheitsrisiken für Kontaktpersonen, so wie Umweltrisiken durch Rückstände in Se- und Exkreten und entsprechenden Ausscheidungen chemotherapeutisch behandelter Tiere auf.

Daher war das Ziel der zwei Studien die quantitative Analyse von Zytostatikarückständen im Serum von Hunden sieben Tage nach der Chemotherapie und im Urin zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Chemotherapie, um mögliche Gesundheitsrisiken im Zusammenhang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin zu definieren.

Eingegangen in die Studien waren Hunde, die wegen eines Lymphoms oder eines Mastzelltumors mit den Chemotherapeutika Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid oder Doxorubicin behandelt worden waren.

Die Konzentrationen von Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin im Serum und im Urin wurden mittels einer quantitativen LC/MS/MS-Methode bestimmt.

In der ersten Studie, in der Zytostatikarückstände im Serum untersucht wurden, betrugen die medianen Serumkonzentrationen in 33 Serumproben, die wenige Minuten nach der Behandlung gewonnen worden waren: Vincristin: 37,0 µg/L, Vinblastin: 13,0 µg/L, Cyclophosphamid: 2484,0 µg/L, Doxorubicin: 404,0 µg/L.

In 81 Serumproben, die entweder sieben Tage nach der Applikation von Vincristin, Doxorubicin oder Cyclophosphamid (Lymphompatienten), oder sieben Tage nach der intravenösen Applikation von Vinblastin und ein bis zwei Tage nach der oralen Gabe

(26)

von Cyclophosphamid (Mastzelltumorpatienten) gewonnen worden waren, konnten in der Mehrzahl der Proben keine Rückstände nachgewiesen werden. Lediglich in einer Probe wurden Vinblastinrückstände in einer Konzentration von 7,0 µg/L und in zwei Proben Cyclophosphamidrückstände in den Konzentrationen 7,4 µg/L und 8,6 µg/L gemessen.

Die zweite Studie, in der Zytostatikarückstände im Urin untersucht wurden, ergab eine mediane Konzentration von Cyclophosphamidrückständen im Urin von 398,2 µg/L am Tag der Behandlung (d0). An den Tagen 1-3 (d1, d2, d3) nach der Behandlung lagen die Cyclophosphamidrückstände unterhalb der Nachweisgrenze.

Die mediane Vincristinrückstandskonzentration lag bei 53,8 µg/L am Tag der Behandlung und bei 20,2 µg/L, 11,4 µg/L, und 6,6 µg/L an den Tagen 1, 2, und 3. Die medianen Vinblastinrückstände wurden in den Konzentrationen 144,9 µg/L (d0), 70,8 µg/L (d1), 35,6 µg/L (d2), und 18,7 µg/L (d3) gemessen. Niedrige Vinblastinkonzetrationen waren im Urin bis sieben Tage nach der Behandlung messbar. Mediane Doxorubicinkonzentrationen lagen bei 354,0 µg/L (d0), 165,6 µg/L (d1), 156,9 µg/L (d2), und 158,2 µg/L (d3). Niedrige Konzentrationen von Doxorubicinrückständen waren im Urin bis zu 21 Tage nach der Doxorubicininfusion messbar.

Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit scheint es, dass in Blutproben chemotherapeutisch behandelter Hunde sieben Tage nach der Chemotherapie mit Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin keine Zytostatikarückständen zu erwarten sind und der Umgang mit den Blutproben zu diesem Zeitpunkt als sicher angesehen werden kann. Im Urin dagegen sind in Abhängigkeit vom Zeitpunkt nach der Behandlung und der applizierten Substanz unterschiedlich hohe Konzentrationen von Zytostatikarückständen zu erwarten. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin und zur Vermeidung von Gesundheitsgefahren im Zusammenhang mit dem Einsatz von Zytostatika bei Tieren zu entwickeln.

(27)

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(38)

VIII. Abkürzungsverzeichnis

µg Mikrogramm

L Liter

mg Milligramm

m² Quadratmeter

d day

IU international units

SC subcutanenous

IV intravenous

PO per os

°C degree celsius min minutes

mL millilitre

M mol

mM millimol

pH pondus hydrogenii

g gravitational acceleration et al. et alii

(39)

IX. Verlagsbestätigungen

1.

30-Nov-2009 Dear Dr. Simon:

It is a pleasure to accept your manuscript entitled "Drug residues in serum of dogs receiving anti- cancer chemotherapy" in its current form for publication in the Journal of Veterinary Internal Medicine.

Thank you for choosing the Journal of Veterinary Internal Medicine for publication of your work.

Sincerely,

Prof. Kenneth Hinchcliff

Editor in Chief, Journal of Veterinary Internal Medicine hkw@unimelb.edu.au

2.

10-Nov-2009 Dear Dr. Simon:

It is a pleasure to accept your manuscript entitled "Cytotoxic drug residues in urine of dogs receiving anti-cancer chemotherapy" in its current form for publication in the Journal of Veterinary Internal Medicine.

Thank you for choosing the Journal of Veterinary Internal Medicine for publication of your work.

Sincerely,

Dr. Stephen DiBartola

Editor in Chief, Journal of Veterinary Internal Medicine Stephen.DiBartola@cvm.osu.edu

(40)

X. Weitere Publikationen im Rahmen dieser Arbeit

Publikationen:

1. G Hamscher, SAI Mohring, A Knobloch, N Eberle, H Nau, I Nolte, D Simon (2010) Determination of drug residues in urine of dogs receiving anti-cancer

chemotherapy: is there an environmental or occupational risk?

J.Anal.Toxicol. accepted for publication November 15^th, 2009

Vorträge:

1. A Knobloch, SAI Mohring, N Eberle, I Nolte, G Hamscher, D Simon (2008):

Analysis of drug residues in serum of dogs receiving anti-cancer chemotherapy

18^th ECVIM-CA Congress in Ghent (4-6^th September 2008)

2. A Knobloch, SAI Mohring, N Eberle, I Nolte, G Hamscher, D Simon (2009):

Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Serum von Hunden nach Chemotherapie

InnLab-Tagung in Berlin (31. Januar-1. Februar 2009)

3. A. Knobloch, SAI Mohring, N Eberle, I Nolte, G Hamscher, D Simon (2010):

Belastung von Patient und Umwelt durch Chemotherapeutika Leipziger Tierärztekongress (21. Januar-23. Januar 2010)

(41)

X. Danksagung

Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. Ingo Nolte dafür danken, dass ich meine Dissertation in der Klinik für Kleintiere anfertigen durfte. Ich bedanke mich für die freundliche, wissenschaftliche Betreuung.

Ein ganz herzliches Dankeschön gilt Frau Dr. Daniela Simon für die Überlassung des interessanten Themas. Ich bedanke mich für die unerschöpfliche Geduld bei dem Erstellen der unzähligen Graphiken und den immer wieder notwendigen Korrekturen.

Ich danke dir für jegliche Unterstützung bei dieser Arbeit und darüberhinaus für die unschätzbar wertvolle Starthilfe in mein Berufsleben.

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. Nina Eberle, die mir in den zweieinhalb Jahren meiner Promotion immer zur Seite gestanden hat. Bei Problemstellungen jeglicher Art war sie mir zu jeder Zeit eine große Hilfe und ihrem unermüdlichen Engagement verdanke ich eine exzellente klinische Ausbildung. Ich habe wissenschaftlich und menschlich viel von ihr gelernt. Vielen Dank für die sehr schöne und fröhliche Zeit unserer Zusammenarbeit, in der wir viel Spaß hatten und in der du mir eine gute Freundin geworden bist.

Weiterhin möchte ich mich bei Frau Alexa Jötzke und Frau Caroline Berg für die gute Zusammenarbeit und die Mithilfe bei der Probensammlung bedanken. Alexa hat mir darüberhinaus stets ihre Unterstützung bei Computerfragen gewährt. Vielen Dank dafür. Auch über alltägliche Kuriositäten habe ich viel von dir gelernt.

Hervorheben möchte ich auch die freundliche Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr.

Gerd Hamscher und Frau Siegrun Mohring, für die ich mich ebenfalls bedanke.

Ich danke von ganzem Herzen meinen Eltern für die Hilfe bei der Verwirklichung meines Kindheitstraumes. Erst durch ihre uneingeschränkte moralische und finanzielle Unterstützung waren mein Studium und die Anfertigung dieser Arbeit möglich. Danke, dass ihr immer für mich da seid. Weiterhin möchte ich mich bei meinen Geschwistern Julien und Rebecca dafür bedanken, dass sie mir immer wichtige und anteilnehmende Gesprächspartner und über das geschwisterliche

(42)

Verhältnis hinaus gute Freunde sind. Meinem Bruder Tobias danke ich für den Ansporn, der mir die Fertigstellung seiner eigenen Dissertation war.

Abschließend möchte ich mich bei meinem Freund Nicolas für das kritische Korrekturlesen und die vielen anregenden Diskussionen bedanken. Ich danke dir von ganzem Herzen für deine wertvolle und stets liebevolle Unterstützung, dein Verständnis und deine unendliche Geduld. Schön, dass es dich gibt!