Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Zytostatikarückständen im Serum und im Urin von Hunden in Zusammenhang mit der Durchführung von Chemotherapien in der Veterinärmedizin. Chemotherapien werden in der Veterinärmedizin zumeist ambulant durchgeführt, so dass entsprechend behandelte Patienten nach der Chemotherapie die Klinik oder Praxis mit ihren Besitzern verlassen. Daher könnten Zytostatikarückstände im Urin in erster Linie ein potentielles Gesundheitsrisiko für Besitzer und andere Personen mit Kontakt zu derart behandelten Hunden bedeuten. Es war zu erwarten, dass Urin von chemotherapeutisch behandelten Hunden, ebenso wie es für Urin von chemotherapeutisch behandelten Menschen gezeigt werden konnte (FRANSMAN et al. 2004), Rückstände der eingesetzten Substanzen enthalten würde. Dennoch sind bis heute keine systematischen klinischen Studien veröffentlicht worden, in denen Rückstände von Chemotherapeutika in Se- und Exkreten von veterinärmedizinischen Patienten untersucht wurden.
Das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum chemotherapeutisch behandelter Hunde wurde in dieser Studie vor allem im Hinblick auf ein potentielles Kontaminationsrisiko für Tierärzte und Laborpersonal untersucht, welches durch den Umgang mit Blutproben dieser Hunde bestehen könnte.
In der Humanmedizin beschreiben diverse Studien, über welche Wege Klinikpersonal in Kontakt mit zytotoxischen Substanzen kommen kann. Sowohl über die Haut während der Vorbereitung und Durchführung von Chemotherapien (KROMHOUT et al. 2000, FRANSMAN et al. 2004, 2005), als auch via Inhalation (DE WERK et al.
1983, MC DEVITT et al. 1993, KROMHOUT et al. 2000, KIFFMEYER et al. 2002) können entsprechende Substanzen von betroffenen Personen inkorporiert werden.
Außerdem bestätigen FRANSMAN et al. (2004, 2005) in zwei Studien das Vorliegen eines Expositionsrisikos beim Umgang mit Urin von chemotherapeutisch behandelten Patienten. Ebenso kann Personal beim Waschen entsprechender Patienten und bei der Bettenreinigung auf onkologischen Stationen Zytostatikarückständen ausgesetzt sein (FRANSMAN et al. 2004, 2005).
In der Humanmedizin wird häufig Cyclophosphamid als exemplarische Substanz gewählt, um die Exposition gegenüber antineoplastischen Substanzen zu messen (SESSINK et al. 1992; McDEVITT et al. 1993; ENSSLIN et al. 1994; SESSINK et al.
1994; BURGAZ et al. 1999; KROMHOUT et al. 2000; KIFFMEYER et al. 2002;
FRANSMAN et al. 2004, 2005, 2007). Cyclophosphamid wird häufig eingesetzt, und es stehen sensitive Analysemethoden zur Konzentrationsbestimmung von entsprechenden Rückständen zur Verfügung (FRANSMANN et al. 2007). Im Gegensatz zu diesen Studien erlaubt die in der aktuellen Studie angewandte LC/MS/MS-Methode die simultane Messung der vier Zytostatika Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin im µg/L-Bereich (HAMSCHER et al.
2010). Diese Substanzen sind Bestandteil vieler Kombinationschemotherapie-protokolle in der Veterinärmedizin (ZEMANN et al. 1998; THAMM et al. 1999; CHUN et al. 2000; BOYCE u. KITCHELL 2000; MOORE et al. 2001; GARRETT et al. 2002;
DAVIES et al. 2004; SIMON et. al. 2006, THAMM et al. 2006; CAMPS-PALAU et al.
2007; RASSNICK et al. 2008; SIMON et al. 2008), so dass der Analyse ihrer Residuen wegen der häufigen Anwendung besondere Bedeutung zukommt. Durch die zeitgleiche Analyse von Rückständen der vier genannten Zytostatika können zu jedem Messzeitpunkt innerhalb einer Kombinationschemotherapie Rückstände aller vier Substanzen nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zur Rückstandsanalyse von Zytostatika im Serum zeigen, dass Zytostatikarückstände im Serum chemotherapeutisch behandelter Hunde direkt im Anschluss an die Behandlung nachgewiesen werden können. Diese messbaren Konzentrationen in Serumproben wenige Minuten nach der Chemotherapie variierten, wie erwartet, je nach applizierter Substanz.
Blutproben, die zu diesem Zeitpunkt gewonnen werden, stellen daher ein Kontaminationsrisiko dar. Variationen in den Messwerten lassen sich zum Teil durch geringe Schwankungen in den Zeitintervallen vom Ende der Applikation der Zytostatika bis zur anschließenden Entnahme der Blutprobe erklären. Diese Schwankungen sind abhängig von der individuellen Verteilung und vom jeweiligen Metabolismus im Patienten und von der Arbeitsweise des behandelnden Tierarztes.
Auch wenn es sich hierbei nur um Schwankungen von wenigen Minuten handelt,
könnten gewisse Variabilitäten in den Serumkonzentrationen zu diesem Zeitpunkt von diesem Faktor beeinflusst worden sein. Dennoch stimmen die Ergebnisse dieser Studie mit früheren pharmakokinetischen Studien überein. Eine jüngere Studie über die Pharmakokinetik von Doxorubicin berichtet zum Beispiel über vergleichbare Serumkonzentrationen kurz nach der Doxorubicininfusion (SELTING et al. 2006).
Da eine Blutentnahme direkt nach der Chemotherapie und an den folgenden ein bis drei Tagen jedoch nur in Ausnahmefällen notwendig sein dürfte, ist der Kontakt von Tierärzten und Laborpersonal mit Blutproben zu diesen Zeitpunkten seltener.
Laborkontrollen finden in vielen Chemotherapieprotokollen üblicherweise sieben Tage nach der Behandlung statt (MacEWEN et al. 1981; MYERS et al. 1997;
ZEMANN et al. 1998; SIMON et al. 2006). Daher wurde in dieser Studie der Interessenschwerpunkt auf diesen Zeitpunkt gelegt, und in der überwiegenden Mehrzahl der Proben lagen die Rückstandskonzentrationen zu diesem Zeitpunkt unterhalb der Nachweisgrenzen. In einer einzelnen Probe konnten niedrige Vinblastinkonzentrationen nachgewiesen werden. Gründe für diese Ausnahme bleiben unklar. Eine Kontamination während der Probengewinnung oder individuelle Unterschiede im Metabolismus sind mögliche Erklärungen hierfür. Hieraus ergibt sich, dass der Umgang mit Blutproben zu diesem Zeitpunkt als sicher angesehen werden kann.
Es muss jedoch erwähnt werden, dass in zwei von zwölf Serumproben, die ein bis zwei Tage nach der oralen Gabe von Cyclophosphamid entnommen worden waren, Cyclophosphamidrückstände nachgewiesen wurden. Obwohl die gemessenen Serumkonzentrationen zu diesem Zeitpunkt, verglichen mit Konzentrationen direkt nach der Behandlung, sehr gering waren und nur in einzelnen Proben nachgewiesen wurden, muss die Möglichkeit des Vorkommens von Rückständen im Serum kurze Zeit nach oraler Chemotherapie beachtet werden. Dieser Aspekt ist vor allem in Hinblick auf Chemotherapieprotokolle, die die kontinuierliche orale Zytostatikaverabreichung vorsehen, wie beispielsweise zur Behandlung der chronischen lymphatischen Leukämie (LEIFER u. MATUS 1986) oder des multiplen Myeloms (McEWEN u. HURVITZ 1977), interessant und sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.
Die Ergebnisse der Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Urin bestätigen, dass im Urin von Hunden Rückstände aller vier untersuchten Zytostatika (Vincristin, Vinblastin, Doxorubicin und Cyclophosphamid) nachweisbar sind. Die gemessenen Konzentrationen variierten in Abhängigkeit vom Untersuchungszeitpunkt nach der Chemotherapie. Die höchsten Konzentrationen wurden ein bis zwei Stunden nach der Behandlung gemessen. Cyclophosphamid zeigte die kürzeste Dauer nachweisbarer Rückstände im Urin. Residuen dieser Substanz waren nur wenige Minuten nach der intravenösen Verabreichung messbar. An den Tagen eins bis drei nach der Behandlung lagen die medianen Cyclophosphamidkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze. In einzelnen Urinproben konnten lediglich sehr niedrige Konzentrationen gemessen werden. Vermutlich sind diese Ergebnisse mit der Pharmakokinetik von Cyclophosphamid zu erklären. Diese Substanz wird in der Leber sehr schnell zu aktiven Metaboliten metabolisiert (GLUE u. CLEMENT 1999).
Da die Urinproben in der vorliegenden Arbeit nicht auf das Vorkommen dieser Metaboliten untersucht wurden, müsste dieser Aspekt in weiterführenden Studien geklärt werden.
Zusätzlich wurden in der aktuellen Studie Urinrückstände nach oraler Verabreichung von Cyclophosphamid untersucht. Die Anzahl entsprechender Proben war zwar gering, die Ergebnisse zeigen aber, dass die medianen Cyclophosphamidkonzentrationen im Urin ein bis zwei Tage nach der Gabe unterhalb der Nachweisgrenze lagen. In einer Probe konnten niedrige Konzentrationen nachgewiesen werden. Die genauere Datenrecherche ergab, dass der Besitzer das Cyclophosphamid in diesem Fall am Abend eingegeben hatte und die Urinprobe am folgenden Morgen gewonnen worden war, so dass zwischen Verabreichung des Zytostatikums und Probengewinnung ein Zeitintervall von 12 statt 24 Stunden wie in den übrigen Fällen, lag. Diese Ergebnisse zeigen, dass detaillierte Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Urin von Hunden mit kontinuierlicher täglicher oraler Zytostatikagabe durchgeführt werden sollten.
Im Gegensatz zu Cyclophosphamid waren Vincristin- und Vinblastinrückstände im Urin über einen Zeitraum von drei Tagen nach der Behandlung nachweisbar.
Zusätzlich lag die mediane Vinblastinurinkonzentration sieben Tage nach der
Injektion im messbaren Bereich. Da die Anzahl von Urinproben nach der Behandlung mit Vinblastin, mangels zur Verfügung stehender Patienten, in dieser Studie gering war, müssten zusätzliche Untersuchungen weiterer Proben, auch zu späteren Zeitpunkten, die dargestellten Ergebnisse verifizieren und vervollständigen.
Die längste Ausscheidungsdauer von Rückständen im Urin zeigte sich nach der Behandlung mit Doxorubicin. Doxorubicinrückstände konnten bis zu 21 Tage nach der Doxorubicininfusion im Urin nachgewiesen werden. Die gemessenen Konzentrationen waren mit unter 10% der initialen Doxorubicinurinkonzentration eine Woche nach der Chemotherapie und 1-2% nach zwei Wochen jedoch relativ niedrig.
Die lange Ausscheidungsdauer von Doxorubicin im Urin kann vermutlich durch seine pharmakokinetischen Eigenschaften erklärt werden. Es wird an Plasmaproteine und an Gewebe gebunden (ROBERT u. GIANNI 1993). Diese Bindung führt zu einer raschen Elimination aus dem Serum, gefolgt von einer zweiten Phase des Metabolismus in der Leber und anschließend einer letzten metabolischen Phase, in der die Gewebebindung gelöst wird (ROBERT u. GIANNI 1993).
Die Höhe der in der aktuellen Arbeit gemessenen Doxorubicinrückstände und die Ausscheidungsdauer unterscheiden sich von Ergebnissen einer vorangegangenen Studie (HAHN et al. 1994). In dieser früheren Studie konnten Doxorubicinrückstände im Urin von Hunden mit Lymphomen nur für einen Zeitraum von fünf Tagen nach der Chemotherapie nachgewiesen werden. Weiterhin waren die gemessenen Doxorubicinkonzentrationen an den Tagen eins bis vier nach der Chemotherapie in dieser Studie vier- bis neunfach geringer, als die in der aktuellen Studie nachgewiesenen Konzentrationen. Die Gründe für diese Unterschiede sind nicht ganz klar, könnten jedoch in Zusammenhang mit der hohen Selektivität der in der aktuellen Arbeit eingesetzten LC-ESI-MS-MS-Methode stehen. Anders als in der Studie von HAHN et al. (1994), in der fünf Hunde in metabolischen Käfigen gehalten wurden, um den gesamten Urin in diesem Zeitraum sammeln zu können und auf Doxorubicinrückstände und dessen Metabolite zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit keine metabolischen Käfige eingesetzt. Deshalb erlauben die Ergebnisse dieser Arbeit keine differenzierten Aussagen über die Pharmakokinetik und den Metabolismus der untersuchten Zytostatika. Dadurch kann weder die
prozentuale Gesamtzytostatikamenge, die mit dem Urin ausgeschieden wird angegeben werden, noch können Verteilungskurven erstellt werden. Jedoch sollten in dieser Arbeit Residuen unter realen Bedingungen der Chemotherapieapplikation und nachfolgender Entlassung der Patienten untersucht werden, welche keine Haltung der Patienten in metabolischen Käfigen notwendig macht.
In diesem Kontext stellt sich zusätzlich die Frage, inwiefern die Ausscheidungsdauer mit dem Körperfettanteil der Hunde korreliert. Dieser interessante Aspekt sollte in zukünftigen Studien untersucht werden, besonders, wenn es sich um Substanzen handelt, die wie beispielsweise Doxorubicin eine hohe Gewebebindung aufweisen.
Die Konzentrationen von Rückständen im Urin scheinen hingegen nicht wesentlich von der Länge der Lagerung der Proben im Kühlschrank beeinflusst zu werden. Im Stabilitätsversuch wurden Proben initial analysiert, anschließend bei -80°C drei Jahre aufbewahrt und nach diesem Zeitraum erneut untersucht. Die Cyclophosphamid- und Doxorubicinkonzentrationen stimmten gut überein. Die Vincristin- genau wie die Vinblastinkonzentrationen waren über diesen Zeitraum nur sehr geringfügig niedriger geworden.
Wie bereits eingangs erwähnt, sind Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapeutika und dabei anfallenden Abfallprodukten für die Veterinärmedizin zusammengestellt worden (ECVIM-CA 2007). In diesen Richtlinien werden auch Zeiträume definiert, in denen nach der Chemotherapie eine Kontamination durch Zytostatikarückstände im Urin entsprechend behandelter Patienten zu erwarten ist.
Die Festlegung dieser Zeiträume basiert jedoch auf Erfahrungen in der Humanmedizin. Für die Zytostatika Cyclophosphamid, die Vincaalkaloide und für Doxorubicin werden beispielsweise vier, drei bzw. sieben Tage angegeben, an denen in Folge einer Behandlung mit diesen Substanzen mit entsprechenden Rückständen im Urin gerechnet werden muss (ECVIM-CA 2007). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen aber, dass die Dauer der zu erwartenden Ausscheidungen von Rückständen mit dem Urin für Vinblastin und Doxorubicin angepasst werden müsste. Rückstände dieser Substanzen waren im Urin über längere Zeiträume als angegeben messbar. Im Gegensatz dazu zeigte
Cyclophosphamid eine kürzere Ausscheidungsdauer von Rückständen der Reinsubstanz. Allerdings sollte im Hinblick auf das Vorkommen potentieller zytotoxischer Metaboliten von Cyclophosphamid im Urin, das in dieser Arbeit nicht untersucht wurde, der Urin mit entsprechender Vorsicht auch über einen Tag nach der Chemotherapie hinaus behandelt werden.
Bis heute beschreiben zwei frühere Veröffentlichungen das Expositionsrisiko gegenüber Zytostatika in der Veterinärmedizin (ERJAVEC et al. 2001, MEIJSTER et al. 2006). In einer Studie untersuchten die Autoren die Exposition von Personen bei der Zubereitung und Verabreichung von Zytostatika in veterinärmedizinischen Kliniken. Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Werte nachweisbarer Zytostatikarückstände auf der Oberfläche von Handschuhen 15-mal höher lagen als gemessene Werte während der Verabreichung von Zytostatika in Humankrankenhäusern (MEIJSTRER et al. 2006). Rückstände in Se- und Exkreten klinischer Patienten wurden in dieser Studie jedoch nicht untersucht. Ein weiterer Fallbericht beschreibt den Haarverlust bei zwei Haustieren, die durch mit Paclitaxel kontaminierten Speichel ihrer Besitzerin, die wegen eines Ovarialzellkarzinoms chemotherapeutisch behandelt wurde, Paclitaxel aufgenommen hatten (ERJAVEC et al. 2001). Der Speichel der Besitzerin war auf einen Hund und eine Katze übertragen worden, weil sie von der Besitzerin vorgekautes Essen gefüttert bekamen. Dieser Fall zeigt, dass Speichel eine zusätzliche potentielle Kontaminationsquelle darstellen könnte. Der Aspekt sollte daher ebenfalls in weiterführenden Studien untersucht werden.
In einer jüngeren Studie berichten FRANSMAN et al. (2007) von der sinkenden Expositionsrate von Krankenschwestern onkologischer Stationen gegenüber Zytostatika zwischen 1997 und 2000 in den Niederlanden. Unter anderem hat die Erstellung detaillierter Richtlinien zu dieser Senkung beigetragen. Das Ergebnis dieser Studie betont die Bedeutung der Charakterisierung von Berufsrisiken und Umweltgefahren in Verbindung mit der Durchführung von Chemotherapien in der
veterinärmedizinischen Onkologie und die Verbesserung der Risikosituation durch Anpassung von Sicherheitsstandards.
Die Nachweisgrenzen der in den vorliegenden beiden Studien angewandten Methode für die vier untersuchten Substanzen stellen einen limitierenden Faktor der Studien dar. Die hier untersuchten Zytostatika werden teilweise von der International Association of Research on Cancer (IARC) als karzinogen und mutagen und alle als teratogen klassifiziert (IARC 1975, 1976, 1981, 1987). Demnach müsste jede nachweisbare Menge dieser Substanzen als potentiell gesundheitsgefährlich angesehen werden. Unter Beachtung, dass Patienten in der Veterinärmedizin in der Regel geringere Mengen der Chemotherapeutika erhalten als Patienten in der Humanmedizin (RUSLANDER 2005), weil niedrigere Dosierungen eingesetzt werden und die Körpergewichte der Tiere geringer sind, können niedrigere Rückstandskonzentrationen erwartet werden als in der Humanmedizin. Es bleibt unklar, ob in der vorliegenden Arbeit die Proben mit Messergebnissen unterhalb der festgesetzten Nachweisgrenzen wirklich frei von Rückständen der entsprechenden Zytostatika sind. Verbesserte Messmethoden mit geringeren Nachweis- und Bestimmungsgrenzen würden diesen Faktor präzisieren. Auf der anderen Seite ist unklar, inwiefern die gemessenen Rückstandskonzentrationen überhaupt hoch genug sind, um ein Gesundheitsrisiko für den Menschen darzustellen. Dieser Aspekt kann in der vorliegenden Arbeit nicht letztendlich geklärt werden. Daher müssen weiterführende Studien Mutagenitätsprüfungen mit Zytostatikadosierungen in Höhe der nachgewiesenen Konzentrationen beinhalten. Erst dadurch wird es möglich sein, potentielle Gefahren ausgehend von Zytostatikarückständen im Serum und im Urin näher zu definieren. So lange entsprechende Daten noch nicht zur Verfügung stehen, sollte Urin und Serum von Hunden, die mit den zytotoxischen Substanzen Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin behandelt werden, innerhalb der Zeiträume, in denen in dieser aktuellen Studie Zytostatikarückstände nachgewiesen werden konnten, mit entsprechender Vorsicht und entsprechend den Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin behandelt werden.
Diese Arbeit stellt einen ersten wichtigen Schritt zur Charakterisierung von Zytostatikarückständen in Se- und Exkreten von Hunden während und nach der Chemotherapie dar. Die Ergebnisse tragen dazu bei, bestehende Richtlinien für die Veterinärmedizin anzupassen und damit das Expositionsrisiko für den Menschen zu reduzieren, um so zu einem sichereren Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin zu führen.