Untersuchungen zur Konzentration des Nerve Growth Factors und des C-reaktiven Proteins in Serum und Urin
bei Harnabsatzstörungen des Hundes
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Ulrike G. Kordaß
Bremen
Hannover 2014
1. Gutachter: Prof. Dr. A. Tipold 2. Gutachter: Prof. Dr. A. Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 30.10.2014
Meiner Familie
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form eines Posters auf folgender Fachtagung präsentiert:
Kordass,U; Carlson, R.; Rohn, K.; Stein, V.M.; Tipold, A.:
Urinary and Serum C-reactive Protein and Nerve Growth Factor Concentration in dogs with Micturition Disorders
27th Annual Symposium of ESVN and ECVN, “Feline Neurology”, Madrid, Spain, 18.09.-20.09.2014
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 7
2. Literaturübersicht ... 9
2.1 Biomarker ... 9
2.2 Harnabsatzstörungen ... 9
2.3 Harnabsatzstörungen neurologischen Ursprungs ... 10
2.4 Nerve Growth Factor ... 12
2.5 C- reaktives Protein ... 14
2.6 Harnwegsinfektionen ... 15
3. Material und Methoden ... 17
3.1 Patientenmaterial ... 17
3.2 Material ... 18
3.3 Methode ... 21
4. Manuskript ... 25
5. Übergreifende Diskussion ... 44
6. Zusammenfassung ... 50
7. Summary ... 52
8. Abkürzungsverzeichnis ... 54
9. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... 56
10. Literaturverzeichnis ... 57
11. Anhang ... 66
12. Danksagung... 76
1. Einleitung
Der Kontrollverlust über den Harnabsatz ist eine häufige Komplikation bei Hunden mit neurologischen Erkrankungen (Granger et al., 2013). Der Harnabsatz ist ein komplexer Vorgang. Die Koordination des Harnabsatzes erfolgt über ein Zusammenspiel von Gehirn, Rückenmark, peripheren Nerven und dem autonomen Nervensystem mit der Harnröhre und der Harnblase (de Groat, 2006, Fowler et al., 2008). Ein kontrollierter Urinabsatz kann daher durch viele verschiedene Faktoren leicht beeinflusst werden. Neben den neurologischen Erkrankungen können auch nicht neurologische Erkrankungen, wie Zystitiden zu Harnabsatzbeschwerden führen. Daher sind viele verschiedene Differentialdiagnosen in Betracht zu ziehen, die Ursache der Harnabsatzstörung sein können (Noel et al., 2010). Bei Verletzungen des Rückenmarks kranial der sakralen Segmente wird die Übertragung zwischen Gehirn und Rückenmark unterbrochen, ein kontrollierter Urinabsatz kann gestört sein (de Groat, 2006). Bandscheibenvorfälle führen zu Rückenmarksverletzungen und können so zu Harnabsatzstörungen führen (Bubenik and Hosgood, 2008, Granger et al., 2013).
Abhängig von Menge, Geschwindigkeit und Dauer des vorgefallenen Bandscheibenmaterials stellt sich die klinische Symptomatik dar (Anderson and Hall, 1993, Kearney et al., 1988), diese reichen von Schmerzhaftigkeit bis zu schweren neurologischen Defiziten (Jeffery et al., 2013). Meist sind Harnabsatzstörungen mit schweren Gangstörungen assoziiert. In der Humanmedizin wurden Neurotrophine im Zusammenhang mit Harnabsatzstörungen beschrieben (Cruz, 2014, Fry et al., 2014). Der Nerve Growth Factor (NGF) ist das am häufigsten beschriebene Neurotrophin. Er wird von Nervenzellen und Zellen des M. detrusor der Harnblase und des Urotheliums gebildet (Bhide et al., 2013). Durch verschiedene Studien konnte bestätigt werden, dass NGF bei der Pathophysiologie von Entzündungen und schmerzhaften Prozessen, besonders des unteren Harntraktes, eine Rolle spielt (Levi- Montalcini et al., 1996, Liu and Kuo, 2012, Seth et al., 2013, Vizzard, 2000). Ein weiteres Protein, welches häufig im Zusammenhang mit Entzündungen genannt wird, ist das C- reaktive Protein (Black et al., 2004). Das CRP ist ein Akute-Phase-Protein, das in der Leber gebildet wird (Maddens et al., 2010). Erhöhte CRP-Werte wurden bei Entzündungen und Gewebsschädigungen festgestellt (Ceron et al., 2005). Studien in der Humanmedizin haben
gezeigt, dass CRP im Serum bei Erkrankungen der unteren Harnwege erhöht ist (Chuang et al., 2010).
Eine korrekte Diagnose ist essentiell für eine erfolgreiche Behandlung von Harnabsatzbeschwerden. Diese ist häufig nicht einfach zu stellen, da viele verschiedene Differentialdiagnosen in Betracht gezogen werden müssen (Noel et al., 2010). Ein Biomarker soll ein Indikator für eine bestimmte Erkrankung sein. Er dient dazu das Vorhandensein, den Schweregrad und den Verlauf einer Erkrankung darzustellen (Bhide et al., 2013). Mit dieser Studie soll die Hypothese bestätigt werden, dass eine Erhöhung von NGF und CRP im Urin zwischen Harnabsatzstörungen unterscheiden lässt, die aufgrund einer neurologischen Erkrankung oder wegen einer bakteriellen Zystitis auftreten. Im Anschluss soll überprüft werden, ob NGF und CRP im Serum oder Urin als Biomarker dienen können.
2. Literaturübersicht
2.1 Biomarker
Biomarker dienen dazu, das Vorhandensein, den Schweregrad und den Verlauf einer Erkrankung darzustellen. Zudem kann der Therapieerfolg kontrolliert werden (Fry et al., 2014). Biomarker können bestimmte Zellen, Enzyme, Hormone, Gene oder Produkte von Genen sein. Die Bestimmung kann aus verschiedenen Körperteilen, Geweben, Urin oder Blut erfolgen (Bhide et al., 2013). Zu den Biomarkern, die im Harn des Menschen bei Harnabsatzbeschwerden bestimmt werden können, gehören bisher unter anderem der Nerve Growth Factor (NGF), sowie das C-reaktive Protein (CRP) (Bhide et al., 2013). Der Nachweis eines Biomarkers sollte zuverlässig und praktikabel sein. Zudem sollte er spezifisch für die untersuchte Erkrankung sein (Fry et al., 2014).
2.2 Harnabsatzstörungen
Die Koordination des Harnabsatzes erfolgt über ein komplexes Zusammenspiel von Gehirn, Rückenmark, peripheren Nerven und dem autonomen Nervensystem mit der Harnröhre und der Harnblase. Die gezielte Kontrolle über dieses System kann während der Entwicklung des Nervensystems erlernt werden (de Groat, 2006, Fowler et al., 2008). Jedoch kann diese Kontrolle durch Erkrankungen und Verletzungen verloren gehen (Fowler et al., 2008).
Harnabsatzstörungen können neurologischen oder anderen Ursprunges sein. Neurologische Ursachen können eingeteilt werden in Erkrankungen des oberen und des unteren motorischen Neurons, Detrusor-Urethra-Dyssynergie, Dysautonomie und primäre Blasenatonie.
Harnabsatzstörungen nicht neurologischen Ursprungs können Insuffizienzen des Urethrasphinkters, Hyperreflexie des M. detrusor, sowie Obstruktionen der harnableitenden Wege durch funktionale oder anatomische Ursachen sein (Noel et al., 2010). Man kann zwischen einer Sammel- und einer Eliminationsphase unterschieden (de Groat, 2006, Nickel and Venker-van Haagen, 1999). Störungen in der Sammelphase führen zu Urininkontinenz, Störungen der Eliminationsphase führen zu Urinretention, gefolgt von einer Überlaufblase (Noel et al., 2010). Die Registrierung des Füllungszustandes der Blase erfolgt über den N.
pelvinus und N. hypogastricus. Der Blasenhals und die Urethra werden sensorisch vom N.
pudendus und N. hypogastricus versorgt (de Groat, 2006, Fowler et al., 2008). Während sich die Harnblase füllt, wird über sympathische und somatische Reflexe der innere und äußere Sphinkter kontrahiert, der Detrusor, sowie das parasympathische Ganglion inhibiert, sodass unbeabsichtigter Harnabsatz verhindert wird (de Groat, 2006, Fowler et al., 2008, Nickel and Venker-van Haagen, 1999). Die Informationen des Füllungszustandes der Harnblase werden bis zum kaudalen Lenden-Sakralrückenmark geleitet. Sobald ein bestimmter Füllungszustand erreicht wird, erfolgt eine Aktivierung des Miktionszentrums in der Pons. Dieses ist in der Lage die koordinierte Blasenentleerung einzuleiten (Blok et al., 1995, de Groat, 2006). Die Urethrasphinkter relaxieren und der M. detrusor der Harnblase kontrahiert sich, so dass Urin durch die Urethra austreten kann, welches zusätzlich ein reflexartige Blasenentleerung hervorruft (de Groat, 2006, de Groat and Yoshimura, 2006, Fowler et al., 2008, Nickel and Venker-van Haagen, 1999). Dieser Kreislauf wird durch viele verschiedene Neurotransmitter reguliert und beeinflusst (de Groat, 2006). Bei Verletzungen des Rückenmarks, die kranial der sakralen Segmenten gelegen sind, wird die Übertragung zwischen Gehirn und Rückenmark unterbrochen und es kann kein kontrollierter Urinabsatz mehr erfolgen (de Groat, 2006).
Veränderungen in der Synthese, Freisetzung oder Aktivierung von Neurotransmittern können den Harnabsatz verhindern (de Groat and Yoshimura, 2006).
2.3 Harnabsatzstörungen neurologischen Ursprungs
Da der Harnabsatz von vielen verschiedenen Faktoren beeinflusst wird, ist er anfällig für Störungen (Yoshimura et al., 2014). Bei Verletzungen des Rückenmarks rostral des Lumbosakralwirbelbereichs kann ein gezielter, bewusster Urinabsatz verhindert werden. Es entsteht eine Urinretention, da keine Koordination zwischen dem M. detrusor der Harnblase und den Urethrasphinktern stattfindet (Detrusor-Sphinkter-Dyssynergie) (de Groat and Yoshimura, 2006, de Groat and Yoshimura, 2012). Der Urethrasphinkter ist stark kontrahiert.
Die Harnblase erscheint groß und fest. Bei Läsionen zwischen T3-L3 kommt es zu einer Verletzung der sensorischen und motorischen Nervenbahnen (Coates, 2013). Verletzungen kaudal von L7 führen zu einer atonischen Blase (Ma et al., 2011). Eine atonische Blase bezeichnet eine große Blase ohne Tonus, aus der Urin ausläuft (Ross, 1951).
Bandscheibenvorfälle können zu Harnabsatzstörungen führen (Bubenik and Hosgood, 2008).
Bandscheibenvorfälle sind eine häufig diagnostizierte neurologische Erkrankung. Sie gehören zu den degenerativen Erkrankungen. Der thorakale Bereich ist am häufigsten betroffen (Fluehmann et al., 2006). Manche Vorfälle verlaufen klinisch inapparent. Sind Symptome zu beobachten, können diese minimal bis sehr schwerwiegend sein. Sie reichen von Schmerzhaftigkeit bis hin zu schweren neurologischen Defiziten (Jeffery et al., 2013). Eine Einteilung nach dem Schweregrad der Erkrankung kann nach Sharp und Wheeler 2005 durchgeführt werden (Sharp & Wheeler, 2005). Grad I zeichnet sich durch Schmerzhaftigkeit ohne neurologische Defizite aus, Grad II zeigen Hunde mit Ataxie inklusive Propriozeptionsdefiziten und geringgradigen Paresen. Hochgradige Paresen von nicht gehfähigen Hunden werden mit Grad III beschrieben. Eine Plegie mit Tiefenschmerz zeigen Hunde mit Grad IV. Hunde mit Grad V weisen eine Plegie und keinen Tiefenschmerz auf (Sharp and Wheeler, 2005). Zusätzlich zur Plegie treten häufig Probleme beim Harnabsatz auf (Arnold et al., 2007). Bandscheibenvorfälle entstehen durch strukturelle pathologische Veränderungen, die wahrscheinlich multigenetischen Ursprungs sind (Adams and Dolan, 2012, Stigen and Christensen, 1993). Dabei unterscheidet man zwischen Hansen Typ I, bei dem es zur Extrusion des Nucleus pulposus in den Wirbelkanal bei hauptsächlich chondrodystrophen Rassen kommt. Beim Hansen Typ II entsteht eine Protrusion des Anulus fibrosus, dies tritt in erster Linie bei großen Hunderassen, wie z. B. Golden Retriever oder Schäferhund auf. Davon abzugrenzen ist der traumatische Bandscheibenvorfall. Hier kommt es aufgrund von körperlicher Bewegung zu einer perakuten Extrusion von Bandscheibenmaterial (Hansen, 1952). Durch die direkten mechanischen Einwirkungen des vorgefallenen Bandscheibenmaterials auf das Rückenmark entsteht eine primäre Schädigung.
Zudem kommt es sekundär zu Gewebsverletzungen durch vaskuläre, biochemische und entzündliche Vorgänge, die bis zu einer Woche nach dem Vorfall auftreten können (Anderson and Hall, 1993, Dumont et al., 2001, Olby, 1999). Diese Faktoren können zum Zelltod der Neuronen durch Nekrose und Apoptose führen (Anderson & Hall, 1993; Dumont et al., 2001). Innerhalb weniger Stunden nach der Verletzung startet der Einfluss der Entzündungszellen auf die Schädigung des Rückenmarks, nach vier Tagen erreicht er seinen Höhepunkt (Olby, 1999). Der Schweregrad der neurologischen Symptomatik hängt von Menge, Geschwindigkeit und Dauer des vorgefallenen Bandscheibenmaterials ab (Kearney et
al., 1988). Bildgebende Diagnostik ist die beste Methode, um Informationen zu liefern.
Röntgenbilder können erste Hinweise auf Bandscheibenvorfälle liefern. Um sich ein genaues Bild zu machen, benötigt man jedoch weiterführende bildgebende Diagnostik wie die Computer- oder Magnetresonanztomographie (Jeffery et al., 2013). Die chirurgische Dekompression ist eine effektive Methode zur Behebung der neurologischen Defizite (Sanders et al., 2002, Scott, 1997). Ab welchem Grad der Kompression eine chirurgische Behandlung notwendig ist, wird kontrovers diskutiert, da das Rückenmark teilweise in der Lage ist trotz Kompression zufriedenstellend zu funktionieren (Jeffery et al., 2013). Das Ausmaß der neurologischen Ausfälle beeinflusst die Prognose. Prognostische Aussagen bei plegischen Tieren zu treffen, ist nicht ganz einfach. Es besteht eine Erfolgschance bei plegischen Patienten mit einer Läsion im thorakalen Bereich ohne Tiefenschmerz von 43-75%
(Duval et al., 1996, Olby et al., 2003, Ruddle et al., 2006, Yovich et al., 1994). Mehrere Biomarker wurden bereits beim Hund untersucht, ob diese mit dem Schweregrad der neurologischen Symptomatik sowie der Heilung der Patienten korrelieren (Jeffery et al., 2013). Im Liquor konnten das Tau-Protein sowie die Matrix-Metalloproteinase 9 vermehrt in Hunden mit Bandscheibenvorfällen gefunden werden (Levine et al., 2006, Roerig et al., 2013). Auch die Kreatininkinaseaktivität und eine Pleozytose mit einer erhöhten Anzahl von Makrophagen im Liquor cerebrospinalis kann bei Patienten mit schlechter Prognose vermehrt nachgewiesen werden (Srugo et al., 2011, Witsberger et al., 2012). Im Serum konnte eine erhöhte Matrix-Metalloproteinase 9 Aktivität festgestellt werden (Levine et al., 2006). Bei paretischen Hunden wurden im Serum geringere Werte phosphorylierte Neurofilament Untereinheit (pNF-H) als bei plegischen Hunden gefunden. Hunde mit besonders hohen pNF- H-Werten konnten die Fähigkeit zu laufen nicht wieder erlangen (Nishida et al., 2014a).
Studien bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen zu Biomarkern im Urin, die einen Rückschluss auf die klinischen Symptome und die Prognose von Harnabsatzstörungen schließen lassen, wurde nach Wissen der Autorin noch nicht durchgeführt.
2.4 Nerve Growth Factor
1949 wurde der Nerve Growth Factor (NGF) das erste Mal beschrieben (Aloe, 2004). NGF gehört zu der Gruppe der Neurotrophine (Cruz, 2014, Seth et al., 2013). Neurotrophine
beeinflussen Prozesse von Zellen des Nervensystems und anderen Zellen. Dies geschieht bei physiologischen und pathologischen Prozessen (Althaus et al., 2008, Seth et al., 2013). Sie unterstützen die Verbindung von Nervenzellen und helfen bei der Regulierung von Synapsen (Pezet and McMahon, 2006, Seth et al., 2013), haben einen Einfluss auf das Überleben und die Funktion von Gliazellen und beeinflussen die Freisetzung von Neurotransmittern.
Neurotrophine werden aus ca. 250 Aminosäuren als Präproteine produziert, die finale Form des Proteins hat ein Molekulargewicht von ca. 13kDa (Cruz, 2014). Während der Entwicklung des Nervensystems unterstützen die Neurotrophine die Ausbildung von Rezeptoren (Pezet and McMahon, 2006). NGF bindet mit einer hohen Affinität an den Tropomyosin- related kinase Rezeptor A (TrkA) und mit einer niedrigen Affinität an den p75NTR –Rezeptor (Aloe, 2004, Pezet and McMahon, 2006). Die Aktivierung dieser Rezeptoren hat eine große Auswirkung auf das Schmerzempfindungssystem (Levi-Montalcini et al., 1996, Pezet and McMahon, 2006). Menschen und Tiere, denen kleine Mengen NGF intramuskulär oder subkutan appliziert wurden, reagierten mit unterschiedlich langer Hyperalgesie abhängig von der Dosis und Art der Applikation (Levi-Montalcini et al., 1996, Pezet and McMahon, 2006). Dies erfolgt direkt über die Expression von TrkA-Rezeptoren und indirekt über Mastzellen, sympathische postganglionäre Neuronen und durch Akkumulation von Neutrophilen (Pezet and McMahon, 2006). Eine Verabreichung von Anti- NGF führt zur Schmerzlinderung (Levi-Montalcini et al., 1996, Pezet and McMahon, 2006).
In mehreren Studien wurde bewiesen, dass NGF im entzündlichen Gewebe vermehrt ausgeschieden wird (Pezet and McMahon, 2006). NGF hat einen Einfluss auf die neurologische Funktion des Harnabsatzes (Fry et al., 2014). Im unteren Harntrakt spielt NGF eine wichtige Rolle bei Patienten mit interstitieller und bakterieller Zystitis sowie bei Harnsteinen und Karzinomen des Urotheliums (Bhide et al., 2013, Cruz, 2014). Studien haben gezeigt, dass Detrusorzellen der Ratte und des Menschen fähig sind, NGF frei zu setzen, dies geschieht unter physiologischen Bedingungen nur in sehr geringen Mengen (Bhide et al., 2013). Bei dauerhafter Dehnung der Blase steigt auch der Gehalt an ausgeschüttetem NGF an (Liu and Kuo, 2009). Bei akuter und chronischer cyclophosphamid- induzierter Zystitis wurde eine Verringerung des NGF in der Harnblasenwand festgestellt.
Dieses Ergebnis zeigte sich auch bei Rückenmarksverletzungen bis zu vier Wochen nach dem Primärinsult. Ab der fünften Woche konnte ein Anstieg des NGFs in den Urothelialzellen
festgestellt werden (Vizzard, 2000). Urotheliale Zellen reagieren auf NGF Ausschüttung mit einer gesteigerten Produktion von TrkA und p-75 Rezeptoren (Bhide et al., 2013, Cruz, 2014).
NGF kann zudem in sensorisch-afferenten Nervenfasern der Harnblase und im Major Pelvic Ganglion gefunden werden. Studien haben gezeigt, dass eine Applikation von NGF in der Blase zu Hyperaktivität der Blase sowie zu einer Sensibilisierung von sensorischen Nervenfasern führen kann. Zudem kann eine chronische Applikation im Bereich vom sechsten Lumbalwirbel bis zum ersten Sakralwirbel auch zu Blasenhyperaktivität führen (Cruz, 2014). NGF ist auch an der Pathophysiologie von Entzündungen und schmerzhaften Prozessen beteiligt (Levi-Montalcini et al., 1996). Für NGF im Urin wurde noch kein standardisierter Normalbereich festgelegt (Seth et al., 2013).
2.5 C- reaktives Protein
Das C-reaktive Protein (CRP) des Hundes ist ein Akute-Phase-Protein mit einem Molekulargewicht von 105 kDa (Maddens et al., 2010). CRP wurde als erstes Akute-Phase- Protein beschrieben. Erhöhte CRP-Werte konnten bei verschiedenen Infektionen, nach Operationen, bei gastrointestinalen Erkrankungen, bei autoimmunen Erkrankungen sowie bei Neoplasien gefunden werden (Ceron et al., 2005). CRP wird nach Stimulation durch Zytokine von Hepatozyten gebildet (Jialal et al., 2004). Die Akute-Phase-Antwort ist eine unspezifische und komplexe Reaktion, die direkt nach der Gewebsverletzung folgt (Seo et al., 2012).
Extrahepatische Synthese von CRP wurde unter anderem auch in Neuronen beschrieben (Yasojima et al., 2000). Fieber, Leukozytose, erhöhte Kortisolwerte im Blut und verringerte Thyroxinkonzentrationen, metabolische Veränderungen sowie niedrige Eisen- und Zinkwerte sind typische Anzeichen der Akute-Phase-Antwort (Ceron et al., 2005). Zu der Antwort gehören auch Veränderungen von bestimmten Proteinen, die Akute-Phase-Proteinen. Einzelne Konzentrationen steigen, andere sinken. Zu den Proteinen mit ansteigender Konzentration in der akuten Phase einer Entzündung gehört das CRP (Cray, 2012). CRP-Konzentrationen korrespondieren mit Vorhandensein, Ausprägung und Schweregrad der Gewebeverletzung (Cray, 2012). CRP bindet an Bakterien, um das Komplementsystem zu unterstützen und damit die Phagozytose zu fördern. Zudem induziert es die Ausschüttung von Zytokinen und hemmt die Chemotaxis sowie die Funktion von Neutrophilen (Ceron et al., 2005).
Untersuchungen des CRPs im Serum beim Menschen und beim Hund zeigten, dass bei verschiedenen Erkrankungen des unteren Harntraktes, besonders bei Infektionen das CRP ansteigt (Fry et al., 2014, Seo et al., 2012). In Zellen des M. detrusor, sowie in Zellen des Urotheliums und im Urin konnten bei den verschiedenen Erkrankungen des unteren Harntraktes nur geringe CRP-Werte festgestellt werden. Die Werte im Urin sind viel geringer als die Serumwerte (Chuang et al., 2010). Anderseits gibt es Untersuchungen beim Menschen, die auf eine Produktion von CRP von glatten Muskelzellen schließen lassen (Blake and Ridker, 2002). Das CRP wurde in der Humanmedizin bereits im Zusammenhang mit Harnwegsentzündungen als Biomarker im Urin untersucht (Bhide et al., 2013). Beim Hund wurde das CRP schon in Zusammenhang mit experimentell induzierten Zystitiden untersucht, dabei konnte eine Erhöhung des CRPs im Serum festgestellt werden (Seo et al., 2012).
2.6 Harnwegsinfektionen
Harnwegsinfektionen werden als vorrübergehendes oder dauerhaftes Versagen der Abwehrmechanismen gegenüber Infektionserregern beschrieben. Die Infektionserreger können sich so im Harntrakt ansiedeln und vermehren (Smee et al., 2013a). Die meisten Harnwegsinfektionen werden von Bakterien verursacht, seltener entstehen sie durch Pilze, Viren, Mykoplasmen und Parasiten. Hündinnen sind häufiger betroffen als Rüden (Wooley and Blue, 1976). Entzündungen des Harntraktes können auch z.B. durch Neoplasien oder Traumata entstehen. Es gibt symptomatische und asymptomatische Harnwegsinfektionen (Thompson et al., 2011). Meistens zeigen die Hunde Dysurie, Pollakiurie, Strangurie, Periurie und Hämaturie (Smee et al., 2013a). Ein Verlust der Stubenreinheit ist ebenfalls zu beobachten. Am häufigsten wird Escherichia coli aus caninem Urin isoliert, gefolgt von Proteus, Staphylokokken und Streptokokken. 75% aller Harnwegsinfektionen werden von nur einem Keim verursacht (Wooley and Blue, 1976). Ausgehend vom Gastrointestinaltrakt oder der Haut steigen die Keime in die Harnblase auf, eine Infektion über die Blutbahn ist äußerst selten (Smee et al., 2013a). Der normale Urinabsatz trägt einen großen Beitrag zu den Abwehrmechanismen des Hundes bei. Studien an der Ratte zeigen, dass beim physiologischen Harnabsatz bis zu 99% aller Bakterien aus den Harnwegen hinausgespült werden (Harrison et al., 1988). Sind die Patienten nicht in der Lage ihre Blase komplett oder
nur teilweise zu entleeren, gibt es den Bakterien mehr Zeit und Raum sich zu vermehren (Bubenik and Hosgood, 2008, Harrison et al., 1988). Zudem kann ein sehr verdünnter Urin, mit niedrigen Harnstoffwerten, den Bakterien ein optimaleres Milieu für die Vermehrung schaffen (Smee et al., 2013a). Die Urethra kann einen sehr hohen Druck erzeugen, um zu verhindern, dass eine Vielzahl an Bakterien aufsteigen kann. Den Rüden kommt eine längere Harnröhre sowie das bakterizide Sekret der Prostata als Abwehrmechanismen gegen Harnwegsinfektionen zu Hilfe (Fair and Wehner, 1976). Das gesunde Uroepithelium verhindert die Adhäsion von Bakterien, indem die äußerste Schicht des Uroepitheliums Glukosaminoglykane und Proteoglykane produziert (Apodaca, 2004, Cornish et al., 1988).
Glukosaminoglykane binden Wasser, diese Verbindung verhindert die Anheftung von Bakterien und unterstützt die Impermeabilität der Harnblase (Apodaca, 2004). Die antibakteriellen Eigenschaften des Urins zeichnen sich durch einen niedrigen pH-Wert, die hohe Konzentration an Harnstoff und schwachen organischen Säuren sowie das hohe spezifische Gewicht aus (Weese et al., 2011). Harnwegsinfektionen manifestieren sich meistens in der Harnblase. Man kann zwischen einfachen und komplizierten Harnwegsinfektionen unterscheiden. Bei einfachen Harnwegsinfektionen liegen keine strukturellen, neurologischen oder funktionellen Störungen vor (Weese et al., 2011). Häufige Harnwegsinfektionen bei Rüden, unkastrierten Hündinnen und eine Mitbeteiligung von Prostata oder Nieren werden als kompliziert bezeichnet (Smee et al., 2013). Die Untersuchungsmethode der Wahl, um eine Harnwegsinfektion zu diagnostizieren, ist die Harnuntersuchung nach Zystozentese. Neben einer Urinanalyse wird eine mikrobiologische Untersuchung inklusive Resistenztest durchgeführt (Smee et al., 2013b, Weese et al., 2011)
3. Material und Methoden
3.1 Patientenmaterial
Es wurden Urin- und Serumproben von insgesamt 76 Patienten der Klinik für Kleintiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, gesammelt. Die Studie wurde nach den ethischen Richtlinien der Universität durchgeführt und vom LAVES Niedersachsen unter der Tierversuchsnummer: 33.4-42502-04-13A374 genehmigt. Die Patientengruppe setzte sich aus folgenden Rassen zusammen: Mischlinge (17), Dackel (10), Beagle (8), Berner Sennenhund (6), Labrador (5), Französische Bulldogge (4), Golden Retriever (3), Jack Russel Terrier (2), Schäferhund (3), Riesenschnauzer (2), kl. Münsterländer (1), Boxer (1), Bolonka Zwetna (1), Zwergschnauzer (1), Weimeraner (1), Bernhardiner (1), Old English Bulldog (1), Großer Schweizer Sennenhund (1), Pekinese (1),), Chihuahua (1), Shitzu (1), Brandbracke (1), Deutsch Drahthaar (1). Darunter befanden sich 29 männliche, 21 männlich-kastrierte, 7 weibliche und 19 weiblich-kastrierte Hunde. Das durchschnittliche Alter betrug 5,6 Jahre (Spanne: 0,5 – 13 Jahre) und das mittlere Gewicht lag bei 19,8 kg (Spanne 2,5 – 66 kg). In die Studien konnten Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen, sowie 20 gesunde Hunde als Kontrollgruppe eingeschlossen werden.
Gruppen Anzahl
1 Hunde mit neurologischen Erkrankungen, die nicht das Rückenmark betreffen
14 2 Hunde mit Rückenmarkserkrankungen ohne
Harnabsatzprobleme
15 3 Hunde mit Rückenmarkserkrankungen mit
Harnabsatzproblemen
27
4 gesunde Hunde 20
Tabelle 1 Gruppenübersicht
Die Diagnosen wurden mittels klinischer und neurologischer Untersuchung, Blutuntersuchung sowie zusätzlich bei 52 Hunden mit Hilfe von Magnetresonanztomographie und bei 48 Tieren nach Untersuchung des Liquor cerebrospinalis gestellt. Die Urinproben wurden per Zystozentese unter Ultraschallkontrolle gewonnen oder Spontanharn wurde aufgefangen. Anschließend wurde eine routinemäßige Urinanalyse mittels Urinstick (siehe
Materialienliste) und Sedimentuntersuchung durchgeführt. Per Stick wurde der Urin auf pH- Wert, Protein, Glukose, Hämoglobin, Bilirubin, Urobilinogen, Aceton und Leukozyten untersucht. Das Sediment wurde auf Erythrozyten, Leukozyten, Übergangsepithelien und Bakterien überprüft. Zudem wurde mittels Refraktometer (siehe Geräteliste) das spezifische Gewicht bestimmt. Aus Gruppe drei konnte bei zehn Hunden erneut eine Harnprobe genommen werden, als diese fähig waren, selbstständig Urin abzusetzen. Bei allen Proben wurde der Urin-Creatininwert mit Hilfe eines Cobas C311 Analyzer (Roche Diagnotics GmbH, Mannheim, Deutschland) bestimmt. Das Testprinzip beruht auf einer Umwandlung des Creatinins mittels Creatinase, Creatininase und Sacrosinoxidase zu Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid. Das freigesetzte Wasserstoffperoxid bildet daraufhin mit 4- Aminophenazon und 2,4,6-Trijod-3-Hydroxybenzoesäure einen Chinoniminfarbstoff. Dieser Farbstoff ist direkt proportional zum Creatiningehalt im Urin. Die Blutproben wurden parallel zu den Urinproben gesammelt. Es erfolgte eine Zentrifugation der Proben bei 1000rpm für 10 Minuten, der Überstand wurde abpipettiert und bei -20°C bis zur Weiterverarbeitung gefroren gelagert.
3.2 Material
Reagenzien und Chemikalien
• NGF EMAX ®ImmunoAssay System- ELISA Test Kit, Promega, ( Artikel Nr.G 67603) Mannheim, Deutschland
• Dog High- Sensitive CRP ELISA Kit, Kamiya, (Artikel Nr. KT-093) Medical Company, Seattle, WA, USA
• Trizma Base (Ref. Nr: T1503-500G) Sigma-Aldrich, USA
• Natriumhydroxid (NaOH) 1 N, (Art.-Nr. 1.09137.1000, Ch.-B. HC616601), Merk KGaA, Darmstadt, Deutschland
• Natriumcarbonat (Na2CO3), (Art.-Nr. 1.06392.0500, Ch.-B. A185092 937), Merk KGaA, Darmstadt, Deutschland
• Natriumclorid (NaCl) Emsure (Best.Nr. 1064040500), Merckmilipore, Darmstadt, Deutschland
• 0.025 Natriumbicarbonat (NaHCO3) (Ref. Nr. S5761-500G), Sigma-Aldrich, USA
• Salzsäure (HCl) 1 N, (Art.-Nr. 1.09057.1000, Ch.-B. HC622391), Merk KGaA, Darmstadt, Deutschland
• 150mM NaCl 0.02% Tween, (Ref. Nr. P2287-500ML), Sigma- Aldrich, USA
• TAPS-Puffer (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansuflonsäure), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland
• TAPS-Puffer (50mmol/l, pH 8.0, Creatininase, Mikroorganismen), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland
• Urinstreifen, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland
Geräte
• Reagenzglasschüttler Reax control, Heidolph, Schwabach, Deutschland
• Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure, TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert, Deutschland
• Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen, Deutschland
• Gefrierschrank Premium NoFrost, Fa. Liebherr, Ochsenhausen, Deutschland
• Laborwaage LabStyle204, Fa. Mettler Toledo, Giessen, Deutschland
• Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001,Fa. Heidolph, Schwabach, Deutschland
• Magnetrührstäbchen, verschiedene Größen, 90 715, -730, -751, Fa. H+P Labortechnik, Oberschleißheim, Deutschland
• pH Meter, pH300, Hanna Instruments Deutschland GmbH, Kehl am Rhein, Deutschland
• Plattformschüttler Promax 1020, Heidolph, Schwabach, Deutschland
• Tischzentrifuge Rotina 35R, Hettich, Tuttlingen, Deutschland
• Wasserbad mit Einhängethermostat, Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Deutschland
• Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten, BioTek Instruments, Bad, Friedrichshal, Deutschland
• Cobas C311 Analyzer, Roche Diagnotics GmbH, Mannheim, Deutschland
• Manuelles Handrefraktometer, A.KRÜSS Optronic GmbH, Hamburg, Deutschland
• Digital timer (EU609-0135) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland
Laborbedarf
• Serumröhrchen, (Best.Nr. 57.469), Sarstedt Nümbrecht, Deutschland
• Nunc-Immuno™ MicroWell™ 96 well solid plates (Ref.Nr. M9410-1CS) Sigma- Aldrich, USA
• Plattensealer, Uniseal Microplate devices (Ref.Nr.7707-0001) Whatman Inc. USA
• Pipettenspitzen:
10 μl (Kristall; Best.-Nr. 702504), Brand, Wertheim 200 μl(gelb) (Best.-Nr. 613-0240), VWR, Darmstadt 1000 μl (blau) (Best.-Nr. 2100610), Ratiolab, Dreieich
• Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000μl), Brand, Wertheim, Deutschland
• Pipettierhelfer accu-jet® pro, Brand, Wertheim, Deutschland
• Pipettierhelfer, Handystep, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
• Serologische Auslaufpipette:
5ml Ref. Nr. 86.1253.001) Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland 10ml (Ref.Nr. 86.1254.001) Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland 25ml (Ref.Nr. 86.1685.001) Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
• Polystyrolröhrchen 3,5 ml und 5 ml (Art.-Nr. 55.1579 bzw. 55.484.001), Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
• Belüftungsstopfen, (Ref. Nr. 65772) Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
• Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100), Brand, Wertheim, Deutschland
• Polypropylenröhrchen 4 ml (Best.- Nr. 55.532), Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
• Präzisionsdispenserspitzen 1ml, 5 ml, (Best.-Nr. 702406, 702376),
• Fa. Brand, Werthein
• Spritzflasche 250ml, (Art. Nr. 711-6126) Henry Schein, Hamburg, Deutschland
• Zellstoff, (Art. Nr. 126021), Praxisdienst, Longuich, Deutschland
• Parafilm® M, 4 IN. X 250 FT. Roll, (Art.-Nr. 291-1213), VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland
• Bechergläser, VWR International GmbH, Darmstadt; Deutschland
• 5 und 10ml Spritzen, Terumo Deutschland GmbH, Eschborn, Deutschland
• Einmalkanülen Gr. 1 gelb (Best. Nr. 370-690), Terumo, Henry Schein vet GmbH, Hamburg, Deutschland
• Einmalkanülen Gr. 12, schwarz (Best. Nr. 370-692), Terumo, Henry Schein vet GmbH, Hamburg, Deutschland
• Pasteur Pipetten, 150 mm, (Art.-Nr. 747715), Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
Computersoftware
• Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software, Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
• Statistik Software- R®(R Foundation for Statistical Computing), S.A.S. 9.3 Enterprise, Cary, North Carolina, USA
3.3 Methode
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Die Biomarker wurden mittels ELISA bestimmt. Dafür wurden spezielle ELISA Kits verwendet. Der ELISA basiert auf einer Antigen-Antikörperreaktion. Die entstehenden Komplexe werden mit Enzymen, die einen Farbumschlag hervorrufen, sichtbar gemacht.
Dieser kann photometrisch erfasst und gemessen werden. Anhand der Farbreaktion wird die Menge des entsprechenden Biomarkers berechnet (Heinrich et al., 2014).
Die genaue Durchführung erfolgte nach Anleitung des Herstellers. Anschließend wurden die gemessenen Werte im Urin durch den Urin-Creatinin-Wert geteilt, um unterschiedliche Verdünnungen des Harns auszuschließen (Cruz, 2014).
NGF-ELISA
Zur Bestimmung des Nerve Growth Factors wurde ein NGF Emax Immuno Assay System von Promega verwendet. Die Proben wurden nach Angaben des Herstellers gemessen. Eine Anwendung dieses Kits im Urin ist bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen in der Literatur beschrieben (Seth et al., 2013). Beim Hund wurde der Test validiert und es konnte mit Hilfe dieses Assays NGF in der Synovia festgestellt werden (Isola et al., 2011). Die 96- Well ELISA-Platte wird mit einem polyklonalen Antikörper beschichtet, welcher NGF erfasst. Darauffolgend bindet sich ein zweiter monoklonaler Antikörper und ein Anti-Rat IgG als dritter Reaktionspartner an das NGF. Anti-Rat IgG ist mit einer Meerrettichperoxidase
versehen, welche nachfolgend mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) inkubiert wird. Ist Peroxidase und damit NGF vorhanden, ruft dies einen blauen Farbumschlag hervor. Dieser wird anschließend mit 1N Salzsäure gestoppt. Die Intensität der Farbe ist proportional zum NGF in den Wells. Alle Proben sowie der Standard wurden in Duplikaten aufgetragen. Die Standardkurve erfasste einen Messbereich von 3,9 – 250 pg/ml. Für die statistische Auswertung dienten die Mittelwerte der Proben der Duplikate. Proben kleiner als 3,9 pg/ml wurden als nicht messbar qualifiziert. Proben >250 wurden als 250 pg/ml angesehen.
Protokoll siehe Anhang Seite 66-68.
.
Abbildung 1: Layout NGF ELISA
CRP-ELISA
Die Bestimmung des C-reaktiven Proteins in Urin und Serum erfolgte mit einem dog high- Sensitive CRP ELISA Kit, Kamiya Medical Company, Seattle, WA, USA. Die Durchführung erfolgte nach Anweisungen des Herstellers. Der ELISA wurde laut Hersteller speziell für den Hund entwickelt. Er soll eine Messung in biologischen Proben ermöglichen. Die bereits mit Anti-CRP Antikörper beschichtete ELISA-Platte bindet das CRP aus den Proben. Der zweite Antikörper wird nachfolgend aufgetragen. An diesen ist eine Meerretichperoxidase gebunden,
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Probe 30 Probe 31
Probe 32 H
D Blank
Probe 33
C
A 62.5
Probe 3
E
G
R 3.9 D
N 31.25 D
15.6 Probe 29
F
A 7,8
Probe 27 Probe 28 Probe 5
Probe 17 Probe 25
Probe 23
Probe 24
Probe 26
A
S 250
Probe 1 Probe 9
B
T 125
Pobe 18
Probe 19 Probe 20 Probe 21 Probe 22
Probe 40 Probe 34 Probe 2
Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6
Probe 8
Probe 10
Probe 11 Probe 12 Probe 13 Probe 14 Probe 15
Probe 16 Probe 7
Probe 35 Probe 36 Probe 37 Probe 38 Probe 39
welche zusammen mit 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) einen Farbumschlag hervorruft.
Um die Farbreaktion zu stoppen wird eine Stopp-Lösung verwendet. Ein Auftragen in Duplikaten aller Proben und des Standards erfolgte, um einen Mittelwert für die statistische Auswertung zu erhalten. Der Referenzbereich des Standards befand sich zwischen 3,125 – 200 ng/ml. Werte kleiner 3,125 ng/ml wurden als nicht messbar evaluiert. Genaue Durchführung des Tests siehe Anhang S. 69-70. Die Zusammensetzung der Stopp-Lösung ist vom Hersteller nicht angegeben.
.
Abbildung 2: Layout CRP ELISA
Statistische Auswertung
Die Überprüfung auf Normalverteilung erfolgte mittels parametrischer Tests und der visuellen Beurteilung der Boxplots. Da nicht alle Daten normal verteilt waren, wurden zusätzlich der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test durchgeführt, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen Werten, die bei den einzelnen Diagnosen erhoben werden konnten, zu ermitteln.
Um zwischen gesunden Hunden und Hunden mit abweichendem Harnstatus zu unterscheiden, wurde ein gepaarter T-Test durchgeführt. Zudem wurden mit Hilfe des F-Tests die Werte von Hunden verglichen, die zunächst nicht fähig waren, selbstständig Urin abzusetzen, diese
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Probe 35 Probe 36 Probe 37 Probe 38 Probe 39 Probe 40 Probe 34 Probe 2
Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6
Probe 8
Probe 10
Probe 11 Probe 12 Probe 13 Probe 14 Probe 15 Probe 16 Probe 7
Pobe 18
Probe 19 Probe 20 Probe 21 Probe 22 Probe 23 Probe 24
Probe 26
A
S 200
Probe 1 Probe 9
B
T 100
Probe 17 Probe 25
Probe 27 Probe 28 Probe 5
D
12,5 Probe 29
F
A 6,25 C
A 50
Probe 3
E
G
R 3,125 D
N 25
Probe 30 Probe 31 Probe 32 H
D Blank
Probe 33
Fähigkeit aber wieder erlangten. Um zu bestimmen, in wie vielen Proben CRP und NGF nachgewiesen werden konnte, wurde der Fisher-Yates-Test angewendet. Alle Daten wurden mittels Packet SAS® Version 9.2. analysiert und ausgewertet. Für alle statistisch ausgewerteten Daten nahmen wir eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 als signifikante Grenze an.
4. Manuskript
Measurements of C-reactive Protein (CRP) and Nerve-Growth-Factor (NGF) Concentrations in Serum and Urine Samples of Dogs with Micturition Dysfunction U. Kordass; R. Carlson; V.M. Stein; A. Tipold; Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
Background: C-reactive protein (CRP) and nerve growth factor (NGF) may be potential biomarkers for lower urinary tract disorders.
Hypothesis: CRP and NGF can help to distinguish between micturition dysfunctions of different origin in dogs with spinal cord diseases.
Animals: 76 animals were included in the study and assigned to four different groups: spinal cord disorder with physiological micturition (n=15), spinal cord disorder with micturition dysfunction (n=27), other neurological diseases (n=14) and healthy dogs (n=20).13 patients had leukocytes and/or bacteria in the urine.10 patients of the group with micturition
dysfunction regained the ability to urinate properly.
Methods: NGF- and CRP- concentrations were measured in serum and urine using specific ELISA-Kits. Results in urine were standardized by urine-creatinine levels.
Results: CRP in serum was detectable in 32/76 and in urine samples in 40/76 patients. NGF could be measured in all serum and in 70/76 urine samples. Urinary CRP concentrations were significantly higher in dogs with micturition dysfunction (p=0.0009) and in dogs with other neurological diseases (p=0.0020) compared to the control group. However, comparing dogs with spinal cord disorders with and without associated micturition dysfunction no significant difference could be detected for NGF and CRP values in urine or serum samples.
Additionally, levels did not decrease significantly, when measured a second time in dogs regaining the ability to urinate properly (urinary NGF p=0.7962; urinary CRP p=0.078). Urine samples with bacteria and/or leukocytes had no significant increase in urinary NGF
(p=0.1112) or CRP (p=0.0534) concentrations.
Conclusions and Clinical Importance: From these data we conclude that neither CRP nor NGF in urine or serum can be considered as reliable biomarkers for micturition disorders in dogs with spinal cord disorders, but their production might be part of the pathogenesis of such disorders. Significantly higher levels of CRP could be found in the urine of dogs with micturition dysfunctions compared to control dogs. This phenomenon can be explained by unspecific extrahepatic CRP production by smooth muscle cells in the dilated bladder.
Additionally higher levels of CRP-levels in urine from dogs with cystitis were found compared to dogs without signs of cystitis.
Key words: Nerve Growth Factor; C-reactive Protein; Micturition Disorders; spinal cord disease, cystitis
Introduction
Complications with the voluntary control of micturition are commonly observed in disorders of the nervous system (Granger et al., 2013) and can worsen the prognosis in intervertebral disc diseases (Ross, 1951), a common neurological disorder in dogs (Fluehmann et al., 2006).
Intervertebral disc disease rostral to the lumbosacral level can affect the voluntary voiding process (de Groat and Yoshimura, 2012) and might result in a detrusor-urethral dyssynergia with an areflectic bladder and urine retention (Yoshimura et al., 2014). Micturition disorders may be caused by the neurological disorder itself or an associated cystitis (Arnold et al., 2007) precipitated by bacterial infections (Smee et al., 2013a). Escherichia coli is the most common isolate from canine urine (Norris et al., 2000, Wooley and Blue, 1976). The pathogens reach the bladder from either gastrointestinal sources or the skin via the urethra (Smee et al., 2013a). The clinical signs are pollakisurie, stranguria, dysuria, hematuria, inappropriate urination or periuria (Smee et al., 2013b) and are difficult to distinguish from a neurogenic induced micturition disorder.
Therefore, a biomarker helping to distinguish between neurogenic and non-neurogenic micturition disorders might be useful for assessing the prognosis and initiating appropriate treatment.
A biomarker should be an indicator for a specific disease and is supposed to identify the presence, severity, progression and the response to a specific treatment (Fry et al., 2014, Schoeman et al., 2013). Specific cells, enzymes, hormones, genes or gene products can be used as biomarkers (Bhide et al., 2013). The measuring can be performed in different parts of the body including blood, urine and tissues (Bhide et al., 2013, Fry et al., 2014). Two of the urinary biomarkers in human medicine identified so far are the nerve growth factor (NGF) and the C-reactive protein (CRP) (Bhide et al., 2013).
NGF being a well-known neurotrophin, plays an important role in conditions of inflammatory and neuropathic pain (Levi-Montalcini et al., 1996, Pezet and McMahon, 2006). It is responsible for the growth, survival and development of neural cells, as well as the regulation of neural plasticity in the micturition pathway (Ochodnicky et al., 2011). NGF is produced by urethral cells and cells of the detrusor muscle (Steers et al., 1991). Different studies show that NGF is involved in the development of neurogenic bladder overactivity at the spinal level following the disruption of supraspinal micturition control after spinal cord injury (Ochodnicky et al., 2011). Raised NGF levels in serum could be found in bladder dysfunctions (Liu and Kuo, 2012). There are several studies in humans on NGF as a urinary biomarker (Cruz, 2014) showing increased NGF levels in patients with urinary tract disorders (Liu and Kuo, 2012, Rachaneni et al., 2013, Seth et al., 2013).
CRP is an acute-phase protein, mainly produced in the liver and elevated after infection, inflammation or trauma. The CRP concentration rises depending on the tissue damage (Ceron et al., 2005). In human studies CRP in serum is increased in patients with lower urinary tract disorders and it correlates with the severity of clinical signs (Chuang et al., 2010, Hsiao et al., 2012). In dogs, CRP in serum can be used as an indicator of inflammatory response to experimentally induced cystitis (Seo et al., 2012).
Therefore, we hypothesize that CRP and NGF are measurable in serum and urine samples and can be used as prognostic biomarkers in either serum or urine to distinguish between micturition disorders caused by neurologic dysfunctions or bacterial cystitis in dogs with spinal cord disease.
Material and methods
Study design and animals
Urine and serum samples of 76 patients of the Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine, Hannover were collected. The study was performed according to the ethical rules of the University, animal experiment number: 33.4- 42502-04-13A374. The following breeds were included: mixed breed (n=17), Dachshund (n=10), Beagle (n=8), Bernese Mountain Dog (n=6), Labrador (n=5), French bulldog (n=4),
Golden Retriever (n=3), Jack Russell Terrier (n=2), Shepherd (n=3), Giant Schnauzer (n=2), Small Münsterländer (n=1), Boxer (n=1), Bolonka Zwetna (n=1), Miniature Schnauzer (n=1), Weimaraner (n=1), Saint Bernard dog (n=1), Old English Sheepdog (n=1), Swiss Mountain Dog (n=1), Pekingese dog (n=1), Chihuahua (n=1), Shi Tzu (n=1), Bracke (n=1), German wirehaired pointer (n=1). The mean age of the dogs was 5,6 years (+/- 2,8) and the average weight was 19,8 kg (+/-13). 29 dogs were male, 21 castrated-male, 7 female and 19 spayed female.
Paired urine and serum samples were collected from patients with different neurological disorders. The clinical diagnosis was performed using a combination of clinical examination, neurological examination, blood and urine analysis, in most cases magnetic resonance
imaging (n = 52), surgery and evaluation of cerebrospinal fluid samples. The patients were categorized in 4 different groups (table 1): healthy dogs (n = 20); different neurological disorders (table 2) (n = 14); spinal cord disorders with normal micturition (n = 15); spinal cord disorders with micturition problems (n = 27); out of the 27 dogs with micturition
problems, 10 urine samples were taken in a follow up study, when the dogs regained again the ability to void.
Sample collection
Urine samples were collected after spontaneous voiding, using catheters or cystocentesis and immediately analyzed. All urine samples were analysed with a calorimetric urine analysis reagent test stripe (Urine stripes, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). In the urine sediment analysis special emphasis was laid upon leukocytes and bacteria, the specific gravity was measured with a refractometer (Manual Handrefractometer, A.KRÜSS Optronic GmbH, Hamburg, Germany). The urine creatinine level was measured to normalize CRP and NGF levels using Cobas C311 Analyzer (Roche Diagnotics GmbH, Mannheim, Germany).
Urine and serum samples were centrifuged at 1000rpm for 10 minutes and frozen at -20°C until analysed.
Analysis of NGF
Urinary and serum NGF concentrations were determined using an immunosorbent assay system (NGF EMAX ®ImmunoAssay System- ELISA Test Kit, Madison, WI, USA). This assay was evaluated for the use of canine samples (Isola et al., 2011, Seth et al., 2013). The assay had a minimum sensitivity of 7,8 pg/ml, a detection limit of 250 pg/ml and was performed according to the manufacturer’s instructions. Serum samples were diluted 1:50, urine samples were not diluted. Results higher than the detection limit (250 pg/ml) were counted as 250 pg/ml, values lower than the detection range as zero. All samples were run in duplicates and the mean of these two values was used for further evaluation.
Analysis of CRP
CRP levels in urinary and serum samples were measured using a commercially available dog specific available immunosorbent assay system (dog high- Sensitive CRP ELISA Kit, Kamiya Medical Company, Seattle, WA, USA), which is usable for several biological fluids such as urine. The detection range was between 3,125 ng/ml and 200 ng/ml. The assays were
conducted according to the manufactures instructions. The serum samples were diluted 1:1000, urine samples were diluted 1:2. Results below the detection range were counted as zero. None of the samples were above the detection limit. All samples were run in duplicates and the mean of these two values was used for further evaluation.
Statistical analysis
Testing for normal distribution was performed using a t-test as well as by visual assessment of boxplots. Furthermore, the Wilcoxon-Mann-Whitney-Test was used to evaluate potential significant differences between the four different groups. To distinguish between healthy dogs and dogs with cystitis a t-test was performed. In order to differentiate between dogs with abnormal micturition and dogs with regained ability of normal micturition a f-test was performed. To analyze the number of samples with detectable CRP and NGF values a Fisher- Yale was used. All data analyses were conducted with the statistic program package SAS®, version 9.2 (SAS Institute, Cary, NC). For all statistical tests an error probability of p < 0.05 as significant level was chosen.
Results
76 dogs with different neurological disorders met the inclusion criteria. The patients were categorized in 4 different groups:
Different neurological disorders (n=14), spinal cord disorders with normal micturition (n=15) and spinal cord disorders with micturition problems (n=27) (Table 1). The mean age of the dogs was 5,6 years (range 0,5-13 years) and the average weight 19,8 kg (2,5 – 66 kg). 29 male, 21 castrated-male, 7 female and 19 spayed female dogs were included in the study.
Groups N
1 Different neurological disorders 14
2 Spinal cord disorders without micturition problems 15 3 Spinal cord disorders with micturition problems 27
4 Healthy dogs 20
Table 1. Categorization of the dogs into four different groups.
Diseases included in the study are summarized in table 2.
Disease N
Idiopathic epilepsy 5
Cryptogenic epilepsy 1
Meningoencephalitis 3
Steroid-responsive meningitis-arteritis 1
Vestibular disease 2
Neoplasia intracranial 1
Polyneuropathy 1
Intervertebral disc herniation 39
Myelitis 1
Vertebral dislocation 2
Total 56
Table 2. Different diseases included in the study.
Urinary CRP could not be detected in each patient. The highest levels were found in single dogs with spinal cord disorders and micturition problems. 80% of the dogs in the control group, 64 % with the different neurological disorders, 41% with the spinal cord disorders with micturition problems and 29% with the spinal cord disorders without micturition problems had detectable CRP values. In detail, urinary CRP was measurable in 16/20 dogs of the control group with a mean concentration of 1,08 ng/ml (range: 0-1,76 ng/ml). After normalizing CRP to creatinine the mean ratio was 0,01 CRP/Crea (range: 0-0,02 CRP/Crea) (Table 3). In 9/14 of the patients urinary CRP was measurable within the group of different neurological disorders with a mean concentration of 2,21 ng/ml (range: 0-11,39 ng/ml) and after normalizing to creatinine the mean ratio accounted for 0,04 CRP/Crea (range: 0-0,26 CRP/Crea) (Table 3). In the group “spinal cord disorders without micturition problems” CRP was measurable in 4/15 dogs with a mean concentration of 1,45 ng/ml (range: 0- 14,91 ng/ml) and after normalizing to creatinine the mean ratio was 0,02 CRP/Crea (0- 0,17 CRP/Crea) (Table 3). CRP was measurable in 11/27 patients of the group with the spinal cord disorders with micturition problems with a mean concentration of 9,22 ng/ml (0- 131 ng/ml) and after normalizing to creatinine a mean ration of 0,12 CRP/Crea (0- 1,14 CRP/Crea) was detected (Table 3).
Serum CRP could be detected in 4/20 patients in the control group with a mean of 946 ng/ml (range: 0- 6820 ng/ml) (table 3). The mean level in 7/14 patients with neurological disorders is 22452 ng/ml (range: 0- 208658 ng/ml) (Table 3). The wide range of the values was caused by including dogs with inflammatory CNS diseases. One dog suffering from steroid- responsive meningitis-arteritis displayed the highest value (208658 ng/ml). This sample was additionally used as a positive control (Bathen-Noethen et al., 2008) to evaluate the ELISA test, since CRP was not measurable in all serum samples. In 9/15 dogs with spinal cord disorders without micturition problems CRP was measurable with a mean concentration of 14764 ng/ml (range: 0-92035ng/ml) and in 12/27 dogs with micturition problems a mean concentration of 9235 ng/ml (range 0- 81719ng/ml) could be detected (Table 3).
In all of the 20 patients in the control group urinary NGF was measurable and ranged between 7,17-250 pg/ml (mean 76,60 pg/ml). After normalizing to creatinine a mean ratio of 0,50 NGF/Crea (range 0,06 - 3,00 NGF/Crea) could be found (Table 3). In 13/14 patients with
different neurological disorders NGF was measurable with a mean concentration of 31,98 pg/ml (range 0-150 pg/ml) and after normalizing to creatinine the mean ratio was 0,61 NGF/Crea (range 0-2,41 NGF/Crea) (Table 3). Urinary NGF mean value was 63,24 pg/ml (range 0-198 pg/ml) in 13/15 patients with spinal cord disorders without micturition problems (Table 3), the mean NGF/Creatinine ratio was 1,00 NGF/Crea (range 0- 3,43 NGF/Crea) (Table 3). In 24/27 dogs with micturition problems the mean concentration of NGF was 58,11 pg/ml (range 0- 250 pg/ml). The range of the ratio after normalizing to creatinine was 0-4,40 NGF/Crea with a mean of 0,73 NGF/Crea (Table 3).
Serum NGF was detectable in all of the analyzed serum samples. The mean concentration of the control group was 179 pg/ml (range: 104-250 pg/ml), of different neurological disorders 164 pg/ml (range: 40-250 pg/ml), of the spinal cord disorders without micturition problems 166 pg/ml (range: 24,77-250 pg/ml) and the spinal cord disorders with micturition problems showed a mean concentration of 167 pg/ml (range: 46-250 pg/ml) (Table 3).
CRP urine ng/ml
CRP/Crea urine
CRP serum ng/ml
NGF urine
NGF/Crea urine
NGF serum pg/ml Control
Group
1,08 (0-1,76)
0,01 (0-0,02)
946 (0- 6820)
76,60 (7,17- 250)
0,50 (0,06-3,01)
179 (104-250)
Neurological Disorders
2,21 (0-11,39)
0,04 (0-0,26)
22452 (0- 208658)
31,98 (0-150)
0,61 (0-2,41)
164 (40-250)
SC 01,45
(0- 14,91)
0,02 (0- 0,1721)
14764 (0-92035)
63,24 (0-198)
1,00 (0- 3,43)
166
(24,77-250) SC MP 9,22
(0- 131)
0,12 (0- 1,1462)
9235 (0- 81719)
58,11 (0- 250)
0,73 (0-4,40)
167 (46-250) Table 3. C-reactive protein (CRP) and nerve-growth-factor (NGF) levels in urine and serum samples (mean, range in brackets), CRP/Creatinine and NGF/Creatinine ratios in the different groups: control group (n=20), neurological disorders (n=14), spinal cord disorders without micturition problems (SC) (n=15) and spinal cord disorders with micturition problems (SC MP) (n=27).
CRP/Crea Urine
CRP/Crea Urine all
CRP Serum
NGF/Crea Urine
NGF Serum Control Group vs
Neurological Disorders
0.0020* 0.2510 0.0670 0.6119 0.6450
Control Group vs Spinal cord disorders without micturition dysfunction
0.5391 0.0118* 0.0181* 0.4334 0.9591
Control Group vs
Spinal cord disorders with micturition dysfunction
0.0009* 0.4010 0.1113 0.8546 0.6484
Neurological Disorders vs Spinal cord disorders without micturition dysfunction
0.6997 0.0445* 0.4503 0.4712 0.7315
Neurological Disorders vs Spinal cord disorders with micturition dysfunction
0.4033 0.3369 0.8576 0.7207 0.9778
Spinal cord disorders without micturition dysfunction vs
Spinal cord disorders with micturition dysfunction
0.3961 0.2837 0.3401 0.4620 0.8298
Cystitis vs No cystits
0.0534 0.1112
Dogs unable to urinate vs Dogs with normal voiding
0.0778 0.7962
Table 4: p-values of the different concentrations of C-reactive protein (CRP) and nerve growth factor (NGF) in serum and after normalizing to creatinine (CRP/ Crea; NGF/Crea) in urine samples for the different groups. Measurements including all CRP/Crea values are shown in the column “CRP/Crea urine all”, calculations of samples only with detectable values are shown in the column “CRP/Crea Urine”. P-values comparing dogs with spinal cord disorders and associated micturition dysfunction with (cystitis) and without cystitis (no cystitis) and dogs regaining the ability to urinate in urine samples (dogs with normal voiding) are shown in the last rows. Significances are highlighted with an asterisk (*).
Statistical calculations were performed twice: using all data including the patients without measurable CRP values (counted as zero) and a calculation including only patients with measurable values. Data of calculated p-values are summarized in (Table 4). In the first group including all dogs, significant differences measuring the CRP/Crea-ratio could be found between the spinal cord disorders without micturition problems and the control group (p=0.0118) as well as with different neurological disorders (p=0.0445). No significant
correlation in the measurement of urinary CRP/Crea could be found between the control group and the neurological disorders (p=0.2510) and with the spinal cord injuries with micturition disorders (p= 0.4010). In dogs with spinal cord disorders with normal micturition compared to dogs with micturition disorders no significance could be detected (p=0.2837).
CRP/Crea of the group with spinal cord disorders with micturition disorders were not significantly different from different neurological disorders (p=0.3369).
The CRP levels in serum were significantly different in the control group and the spinal cord disorders without micturition problems (p=0.0181) (Table 4). The control group showed no statistical significance in serum samples to the neurological disorders (p=0.0670) or the spinal cord disorders with micturition problems (p=0.1113) (Table 4). CRP levels were not significantly different in neurological disorders compared to spinal cord disorders without (p=0.4503) and with micturition disorders (p=0.8576) (Table 4). When comparing spinal cord disorders without and with micturition disorders no significance could be found (p=0.3401) (Table 4).
Additionally, we determined the significances between the concentrations of CRP/Crea in the different groups in the urine only within measurable samples (Figure 1 and Table 4).
Significant differences could be detected between the healthy control group and the neurological disorders (p=0.0020) as well as the spinal cord disorders with micturition problems (p=0.0009). The control group and the spinal cord disorders without micturition disorders were not significantly different (p=0.5391). Also no significance could be detected between the neurological disorders and the spinal cord disorders without micturition problems (p=0.6434) and with micturition problems (p=0.4033). No significance could be found between spinal cord disorders with and without micturition problems (p=0.3961). However, the highest values of CRP/Crea-ratios occurred in dogs with micturition problems.
C- reactive protein/ creatinine ratios urine
Figure 1. C-reactive Protein/Creatinine (CRP/Crea) concentrations: significant differences (*) between the control group (healthy dogs) and different neurological disorders (ND) (p=0.0020) as well as spinal cord disorders with micturition dysfunction (SC MD) (p=0.0009).
No significant differences could be detected in the urine of NGF/Crea ratios and the NGF levels in serum in the four different groups (Figure 2 and Table 4).
Urine Serum
Figure 2. Ratios of nerve growth factor/creatinine in urine (NGF/Crea) and nerve growth factor (NGF Serum) levels in serum in the different groups: control group (healthy dogs) (n=20), neurological disorders (ND) (n=14), spinal cord disorders without micturition
dysfunctions (SC) (n=15) and spinal cord disorders with micturition dysfunction (SC MD) (n=27). No significant differences could be detected.
Neither urinary NGF/Crea (p=0.7962) nor CRP/Crea (p=0.0778) showed significantly decreased levels after dogs with micturition disorders regained the ability to urinate (Table 4).
The urine examination revealed in 10 samples of the 27 dogs with micturition dysfunction leucocytes (8/10) or bacteria and leukocytes (2/10). CRP/Crea and NGF/Crea values of dogs with cystitis were higher than in dogs without bacteria and/or leukocytes in the urine.
However, this increase was not statistically significant (NGF/Crea p=0.1112 and CRP/Crea p= 0.0534) (Figure3 and Table 4).
Spinal Cord disorders with micturion dysfunction
Figure 3: Values of ratios C-reactive Protein/creatinine (CRP/Crea) and nerve-growth factor/
creatinine (NGF/Crea) of dogs with spinal cord disorders with micturition dysfunction. No significant difference in CRP/Crea (p=0.0534) or NGF/Crea (p=0.1112) could be detected within dogs with micturition dysfunctions with or without cystitis. However, higher concentrations could be found in dogs with cystitis in the NGF and CRP measurements.
Discussion
In the current study the hypothesis had to be proven, that CRP or NGF are measurable in urine and serum samples of dogs and that these two proteins may be involved in the pathogenesis of micturition disorders. The aim of the study was to establish CRP and NGF as biomarkers. A prognostic biomarker could help to distinguish between neurogenic and non- neurogenic micturition disorders and be helpful for assessing prognosis and initiating the appropriate treatment. In this study we concentrated on micturition disorders caused by diseases of the spinal cord and associated bacterial cystitis. Indeed, CRP and NGF are measurable with specific, commercially available ELISA kits in both urine and serum of dogs as described before (Isola et al., 2011, Seth et al., 2013). Urine samples were compared to creatinine values of the urine to overcome the different dilutions between the samples (Seth et al., 2013).
However, the second part of the hypothesis could not be proven. No correlation of NGF in serum or urine could be found between the different groups of neurological disorders and the control group.
NGF levels can rise in many different conditions such as neurologic conditions, endocrinologic disorders and diseases of the immune system (Aloe et al., 1997). It is produced by many different cells, including urothelial cells, smooth muscle cells and mast cells (Liu and Kuo, 2012). Urinary NGF in particular was examined with lower urinary tract disorders (Rachaneni et al., 2013). Liu and Kuo (2012) demonstrated that serum and urine NGF levels were increased in humans suffering from interstitial cystitis and bladder pain syndrome, but no correlation could be found between serum and urinary NGF and the clinical signs. The authors suggest that other systemic disorders are also involved and influence the NGF-levels, especially the levels in serum (Liu and Kuo, 2012). In the current study, we tried to virtually rule out other systemic diseases by routine blood examination and different imaging techniques such as ultrasound and radiographs of abdomen and thorax to exclude such an influence.
Urinary NGF levels were also found to be increased in cerebrovascular events and correlate with the severity of neurological impairment but not with urinary tract dysfunctions (Liu et
