Überexpression der G-CSFR Isoform IV bei der AML im Kindesalter und ihre Bedeutung für eine erhöhte Rezidivneigung nach G-CSF-Applikation

Aus der Abteilung der Pädiatrischen Hämatologie und Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover

angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed

Überexpression der G-CSFR Isoform IV bei der AML im Kindesalter und ihre Bedeutung für eine erhöhte

Rezidivneigung nach G-CSF-Applikation

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Christin Herbst aus Hameln

Hannover 2010

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 21.03.2011 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. Dirk Reinhardt und Dr. Stephanie Ehlers Kobetreuer: Dr. Nils von Neuhoff

Referent: PD Dr. Michael Koenigsmann Korreferent: Dr. Julia Skokowa, PhD Tag der mündlichen Prüfung: 21.03.2011 Prüfungsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Michael Peter Manns Prof. Dr. Arnold Ganser

Prof. Dr. Anibh Das

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1. 1 Akute myeloische Leukämie (AML) 1 1.1.1 Akute myeloische Leukämie im Kindesalter 3

1.2 Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) 3

1.2.1 Der klinische Einsatz des G-CSF 5 1.2.1.1 G-CSF in der Therapie der AML 5 1.3 Rezeptor des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors (G-CSFR) 7

1.3.1 Isoformen des G-CSFR 10 1.4 hG-CSFR und seine Signaltransduktionswege 12

1.4.1 Signalvermittler und Aktivator der Transkription (STAT) 3 und 5 13

1.4.1.1 Der JAK-STAT-Signalweg 13

1.4.2 STATs und AML 15 1.5 Fragestellungen 16 1.6 Zielsetzung 16 2. Patientenproben 17

2.1. Proben von Kindern der Studie AML-BFM von 1998 und 2004 18 3. Material 20

3.1 Reagenzien 20 3.2 Primer 21 3.3 Lösungen und Puffer 21

3.4 Wachstumsfaktoren und Zytokine 22 3.5 Monoklonale Maus-Antikörper 22

3.6 Geräte 23 3. Methoden 26

3.1 Zellbiologische Methoden 26 3.1.1 Auftauen und Vorbereitung der Knochenmarksproben 26

3.1.2 Kultivierung myeloischer Blasten und gesunder Progenitoren 26 3.1.3 Morphologische Beurteilung der kultivierten AML-Blasten 27

3.2 Proteinanalytische und Immunologische Methoden 27

3.2.1 Durchflusszytometrie: 27 3.2.2 Färbung der Blasten mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen

membranständige Epitope 28 3.2.2.1 Detektion der G-CSFR-Oberflächenexpression (CD114-Expression) 28

3.2.4 Zellsortierung der Blasten und gesunder Progenitoren aus

Knochenmarkproben 28 3.2.3 Färbung der Zellen mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen

intrazelluläre Proteine 29 3.2.3.1 Detektion von aktivierten Signaltransduktionswegen 29

3.2.3.2 Apoptose-Test mittels Annexin- und 7-AAD-Färbung 31

3.3 Molekularbiologische Methoden 31 3.3.1 Isolierung von Gesamtzell-RNA 31

3.3.2 Synthese der cDNA 32 3.3.3 Quantitative Echtzeit-PCR (RT-Q-PCR) zur Bestimmung der

G-CSFR Isoformen I und IV 33 3.3.3.1 ABI PRISM ^TM 7300 Sequence Detektions System (7300 SDS) 34

3.3.3.2 Negativ- und Positivkontrollen 36 3.3.4 Konventionelle Polymerasekettenreaktion (PCR) 37

3.3.5 Gelelektrophoretische Auftrennung und Visualisierung von PCR-Produkten 39

3.3.7 Klonierung der PCR-Produkte 39

3.3.7.1 Ligation 39 3.3.7.2 Transformation von E.coli JM109 40

3.3.7.3 Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli-Kulturen 42

3.3.8 Restriktionsanalysen 42 3.3.9 Sequenzierung der G-CSFR Isoform I- und IV-Amplifikate 43

3.4 Statistik 44 5. Ergebnisse 46

5.1 Verifikation der Primer für die G-CSFR Isoform I und IV 46 5.1.1 Konventionelle PCR zur Überprüfung der Primer-Spezifität 46

5.1.2 Sequenzanalyse der G-CSFR Isoform I und IV Amplifikate 46 5.2 Expressionsverhalten der G-CSFR Isoform I und Isoform IV in AML-Blasten

und gesunden Progenitoren 47 5.2.1 Heterogene G-CSFR Isoform I und IV-Expression der leukämischen

Blasten von Patienten mit G-CSF-Therapie 48 5.2.2 Gesteigerte Rezidivneigung und vermindertes Ereignisfreies Überleben bei

erhöhter G-CSFR Isoform IV-Expression und erhaltener G-CSF-Therapie 49 5.2.3 Positive Korrelation zwischen der G-CSFR Isoform I- und IV-Expression 53 5.2.4 Heterogene G-CSFR Isoform I- und IV-Expressionen der leukämischen

Blasten von Patienten ohne randomisierte G-CSF-Therapie 54 5.2.5 G-CSF-unabhängige Abnahme der G-CSFR Isoformen in der Zellkultur 54

5.3 Durchflusszytometrie-Analysen in myeloischen Blasten und gesunden

Progenitorzellen 56 5.3.1 G-CSFR Oberflächenexpressionsverhalten (CD 114) 56

5.3.1.1 Konstitutive G-CSFR Oberflächenexpression (CD 114) in AML-Blasten

bei Patienten mit randomisierte G-CSF-Therapie 56 5.3.1.3 Verminderte G-CSFR-Oberflächenexpression (CD 114) auf

AML-Blasten mit positiver inv(16) Aberration 56 5.3.1.4 G-CSF unabhängige G-CSFR-Oberfächenexpressionsabnahme

(CD 114) auf AML-Blasten in der Zellkultur 57 5.3.2 STAT 3-und STAT 5-Aktivierungsmuster in AML-Blasten und gesunden

Progenitorzellen 58 5.3.2.1 Rasche Aktivierung der Signalstransduktionswege STAT 3 und

STAT 5 durch G-CSF Stimulation 58

5.3.2.3 Verstärkte STAT-Aktivierung in AML-Blasten gegenüber

Gesundkontrollen 59 5.3.3 Proliferationsverhalten, Differenzierungsverhalten und Zellvitalität

myeloischer Blasten und gesunder Progenitorzellen in der Zellkultur 61 5.3.3.1 Zellvitalität myeloischer Blasten unter G-CSF-Stimulation 61 5.3.3.2 Ausreifung und Differenzierung der AML-Blasten und der gesunden

Progenitoren in der Zellkultur 63 6. Diskussion 64

6.1. Gesteigerte G-CSFR Isoform-Expression in AML-Blasten 64 6.1.1 Gesteigerte Rezidivneigung bei einer Überexpression der

G-CSFR Isoform IV bei Kindern mit akuter myeloischer Leukämie nach

G-CSF-Therapie 64 6.1.2 Verlaufsbeurteilung der G-CSFR Isoform I und IV Expression in der

Zellkultur 67 6.2 Kein einheitliches Vitalitätsverhalten myeloischer Blasten in der Zellkultur nach

G-CSF-Stimulation 68 6.3 Die G-CSFR-Oberflächenexpression und seine Beziehung zu zytogenetischen

Aberrationen in der AML 69 6.4 Hyperaktive Signaltransduktion myeloischer Blasten unter G-CSF-Stimulation

70 6.5 Kritische Betrachtungen von G-CSF in der Therapie der AML bei einer

erhöhten G-CSFR Isoform IV Expression 72 7. Zusammenfassung 74

8. Literatur 76 9. Anhang 89

9.1. Abkürzungen 89 9.2. Publikation im Rahmen dieser Arbeit 92

9.2.1. Orginalartikel 92 9.3. Danksagungen 102 9.4. Lebenslauf 103 9.5. Erklärung 104

1. Einleitung

1. 1 Akute myeloische Leukämie (AML)

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne klonale Transformation der myeloischen Vorläuferzelle im Knochenmark, die durch eine autonome Proliferation und eine Ausschwemmung unreifer Blasten ins Blut charakterisiert ist. Dies führt zu einer Verdrängung der präexistenten, nichtneoplastischen Hämatopoese, welche sich final als Anämie, Thrombozytopenie und Leukozytose im peripheren Blut des Patienten manifestiert. Eine akute myeloische Leukämie liegt gemäß WHO-Klassifikation (World Health Organisation, Weltgesundheitsorganisation) bei einem Blastenanteil von über 20 % im Knochenmark vor.¹

Die Diagnose der AML wird unter Berücksichtigung zytomorphologischer und zytochemischer Kriterien (Peroxidase (POX)- und Esterase (EST)-Reaktion) von Blut- und Knochenmarkaustrichen nach FAB-Klassifikation (French-American-British- Cooperative Group) in 8 Untergruppen eingeteilt.²

FAB-Typ Bezeichnung Zytochemie Zytogenetische

Aberrationen M0 Akute undifferenzierte Leukämie POX <3 %,

EST negativ M1 Akute unreife Myeloblastenleukämie POX > 3 %,

EST < 20 % M2 Akute Myeloblastenleukämie mit

Ausreifung

M2 baso mit Basophilie

POX > 3 %,

EST schwach positiv

t(8;21)

M3 Akute Promyelozytenleukämie (APL) POX > 3 %,

EST schwach/ mäßig positiv

t(15;17) t(11;17) selten

M4 Akute myelomonozytäre Leukämie M4 eo mit > 5 % abnormalen Eosinophilen

POX > 3 %, EST > 20 %

11q23 inv(16) t(16;16) M5 Akute Monoblastenleukämie

M5a ohne Ausreifung M5b mit Ausreifung

POX

meist negativ- leicht positiv

EST > 20 %

11q23

M6 Akute Erythroleukämie POX > 3 %,

EST kann positiv sein

M7 Akute Megakaryoblastenleukämie POX < 3 %

EST kann positiv sein Tab. 1.1. FAB-Klassifikation.

Die Diagnose der AML basiert auf der morphologischen, immunophänotypischen und zytogenetischen Diagnostik. Die Subtypisierung dient der genaueren Klassifikation und hat prognostische und therapeutische Relevanz. Chromosomale Abberationen sind wichtige Prädiktoren des Krankheitsverlaufes und werden in 50 % bis 80 % der Krankheitsfälle gefunden. Eine günstige Prognose geht mit den Translokationen t(8; 21) und inv(16) einher, wohingegen ein komplexer Karyotyp, -5, del (5q), -7 und 3q-Abnormitäten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert sind.³

Basierend auf den weitreichenden molekulargenetischen Erkenntnissen hat sich ein Zwei-Mutationen-Modell (Two-Hit-Hypothesis) entwickelt, indem genetische Abnormitäten bei der AML in zwei Klassen eingeteilt werden. Die erste Klasse umfasst Mutationen, die den Zellen einen Wachstums- und Überlebensvorteil verschaffen, die zweite Klasse beinhaltet all jene Mutationen, die zu einem Differenzierungsstopp führen. Erst ein Auftreten beider Mutationsklassen führt zur Induktion einer AML.^4-9

Neuer und prognostisch wichtiger Marker ist die aktivierende Mutation die im FLT3-Gen gefunden wurde.⁴

Die Entwicklung einer AML ist ein mehrstufiger Prozess, welcher mit verschiedenen Risikofaktoren assoziiert ist. Neben der genetischen Disposition in Form von angeborenen Funktionsstörungen (Morbus Down, Kostmann Syndrom, Klinefelter Syndrom, Fanconi Anämie, Neurofibromatose) und den bereits erwähnten erworbenen Aberrationen, spielen auch Alter, chronische Präleukämien, virale Erkrankungen, Bestrahlungen, Chemikalien (z.B. Pestizide, Benzole) und vorangegangene Chemotherapien eine wichtige Rolle.

Die AML ist eine seltene, jedoch sehr aggressiv verlaufende Erkrankung. Sie zeigt zwei Erkrankungsgipfel, einen im frühen Kindesalter und den anderen im späten Erwachsenenalter. Das mediane Erkrankungsalter aller AML-Patienten liegt mit 65 Jahren im höheren Lebensalter. Die Inzidenz der AML beträgt 3,7 auf 100.000 Erkrankte. Die Mortalität ist altersabhängig und liegt zwischen 2,7 bis etwa 18 Personen von 100.000.⁵

1.1.1 Akute myeloische Leukämie im Kindesalter

Mit etwa 35 % machen Leukämien den größten Anteil aller Neoplasien im Kindes- und Jugendalter aus. Die akute myeloische Leukämie stellt nach der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) die zweithäufigste bösartige Erkrankung des Blutes bei Kindern und Jugendlichen dar. Dies entspricht einem prozentualen Anteil von 4,8 % an der Gesamtheit aller Kinderkrebs-Erkrankungen. Im Kindesalter sind Säuglinge und Kleinkinder in den ersten beiden Lebensjahren am häufigsten betroffen. Jungen erkranken etwas häufiger als Mädchen. Mit einer kompletten Remission (weniger als 5 % Blasten im peripheren Blut bzw. Knochenmark) von 80-90 % und einem Gesamtüberleben von 50-60 % hat sich die Prognose der AML im Kindesalter in den vergangenen 30 Jahren deutlich verbessert.¹⁰

Bei etwa 30 % der Patienten kommt es nach zunächst erfolgreicher Behandlung zu einem Rezidiv. In diesem Fall ist ein kurativer Ansatz mittels Chemotherapie kaum möglich, sodass die Stammzelltherapie hier die beste Behandlungsmöglichkeit darstellt. Die Überlebensrate sinkt bei einem Rezidiv auf unter 30 %.^11-15

1.2 Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF)

Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor ist ein Zytokin der späten Granulopoese und ein Regulator der neutrophilen Granulozyten. G-CSF kann die Produktion dieser Zellen ums 10-fache steigern und fungiert als Modulator des Überlebens, der Differenzierung und beeinflusst positiv die Ausschüttung von Neutrophilen und ihren Progenitoren ins periphere Blut. In reifen neutrophilen Granulozyten steigert G-CSF die Effektorfunktion zum Beispiel in Form einer gesteigerten Phagozytosefähigkeit und begünstigt das Überleben dieser Zellen.¹⁶ Zudem wirkt G-CSF in Kombination mit anderen Zytokinen wie IL-3, IL-1α, IL-6 oder GM-CSF in vitro synergistisch.^17,18 Humanes G-CSF ist ein Glykoprotein (GP), welches aus 174 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von etwa 19-20 kDA aufweist. Im Jahr 1960 identifizierten Metcalf und Sachs die Koloniestimulierenden Faktoren mit Hilfe von Zellkulturen aus Progenitoren. Diese in vitro Experimente zeigten, dass das Überleben, die Proliferation und auch die Differenzierung dieser Zellen von der Anwesenheit, des damals noch übergeordneten Begriffes der CSA (Colony-Stimulating-Activity) abhängig waren.^19,20 Die Isolierung und Aufreinigung von G-CSF gelang erstmals im Jahr 1985 aus den Überständen einer Kultur der Blasenzelllinie 5637, verbunden mit

der Charakterisierung einiger hämatopoetischer in vitro–Eigenschaften.^21,22 Ein Jahr später folgte die Expression von rekombinantem humanem G-CSF in Bakterienzellen, nachdem die komplementäre DNA (cDNA) vom mRNA-Transkript des G-CSF-Gens kloniert worden war.^23,24

Southern-Blot-Analysen des humanen Genoms lokalisierten die G-CSF-codierende Region auf Chromosom 17 q21-22.²⁵ Dieses Gen besitzt 5 Exons und hat eine Größe von etwa 2,3 kb. Durch alternatives Splicen am zweiten Intron kann es zu zwei verschiedenen Varianten der cDNA des G-CSF kommen.²⁶

Die Regulation der G-CSF-Expression ist komplexen transkriptionalen und posttranskriptionalen Mechanismen unterworfen, sowie vom Zelltyp abhängig.^27,28 Während hämatologische Zellen wie Monozyten / Makrophagen und Lymphozyten den größten Anteil der G-CSF-produzierenden Zellen darstellen, konnte auch in Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen, Stromazellen des Knochenmarks, Astrozyten und ferner in diversen Tumorzelllinien und leukämischen Blasten die G-CSF-Produktion nachgewiesen werden.^27-32

Maßgeblich verantwortlich für den Abbau des G-CSF ist die Rezeptor-abhängige Endozytose durch die Zielzellen und der damit verbundenen Destruktion im Zellinneren.³³

Eine gesteigerte G-CSF-Synthese in vivo und in vitro wird durch Stimuli wie Interferone, IL-1, IL-3, IL-4, GM-CSF, Tumornekrosefaktoren, bakterielles Endotoxin und Lipopolysaccharide induziert. Die basale Sekretion an zirkulierendem G-CSF liegt oft unterhalb der Nachweisgrenze. Im Gegensatz dazu, kann Stress in Form einer Infektion zu einem enormen Anstieg der G-CSF-Konzentration führen. Zudem unterliegt die endogene G-CSF-Konzentration einem gegensätzlichen Verhalten zur Konzentration an peripher zirkulierenden Neutrophilen, dabei geht die Neutropenie oft mit einer hohen G-CSF-Sekretion und umgekehrt einher.^34-37

Die Erforschung und dem damit einhergehenden wachsenden Verständnis der G-CSF-Wirkung bei hämatologischen Funktionsstörungen der Leukämien, ist seit Bekanntwerden der G-CSF vermittelten Proliferation und Überlebenssteigerung von leukämischen Zellen in vitro von bedeutendem Interesse.³⁸ Demgegenüber konnten auch tumordegenerative Effekte, wie Proliferationsstopp und Zellausreifung nach einer G-CSF-Stimulation nachgewiesen werden.³⁹

1.2.1 Der klinische Einsatz des G-CSF

Die ersten evaluierten Anwendungen des G-CSF wurden bereits erfolgreich in verschiedenen Phase II-Studien an Krebspatienten getestet. Ziel dieser Studien war es eine Chemotherapie-assoziierte Leukopenie / Myelosuppression mittels G-CSF zu verkürzen. G-CSF zeigte sich als potentes Mittel mit geringen Nebenwirkungen. Es führte zum dosisabhängigen Anstieg der neutrophilen Granulozyten und damit zu einer Verbesserung der Neutropenie im Blut.

Ob dieser therapeutische Effekt zu einer Verringerung der infektionsbedingten Mortalität, zu einem reduzierten Bedarf an Antibiotika, sowie zu einer verminderten Hospitalisierung führt, ist noch nicht ausreichend geklärt.^17,40,41

Zum Anwendungsbereich der rhG-CSF-Therapien zählen primäre angeborene und idiopathische Neutropenien, infektassoziiert auftretende Neutropenien, sekundäre Insuffizienzen des hämatopoetischen Systems, sowie iatrogen induzierte Neutropenien bei Chemo-, Strahlen- und anderen myelosuppressiven Therapien. Die Gabe von humanen G-CSF bei am Myelodysplastischen Syndrom (MDS) erkrankten Patienten führte etwa zu einer Reparatur neutrophiler Anomalien, verbunden mit einem Anstieg der alkalischen Phosphatase.³⁵ Allerdings zeigte eine Studie von Negrin et al. während, oder bald nach der Zytokingabe bei einem Teil der Patienten mit Myelodysplastischen Syndrom einen Übergang in die akute myeloische Leukämie. Diese Patienten wiesen jedoch bereits vor der Therapie eine erhöhte Myeloblastenanzahl im Knochenmark auf.⁴²

Durch die gesteigerte Freisetzung hämatologischer Progenitoren spielt G-CSF auch in der Stammzellgewinnung von gesunden Spendern eine wichtige Rolle.

1.2.1.1 G-CSF in der Therapie der AML

Der Hintergrund des G-CSF Einsatzes in der Therapie der AML war vielschichtig. Zu Beginn erhoffte man sich die Ausreifung der leukämischen Stammzelle mittels G-CSF zu induzieren, dies führte jedoch zu sehr variablen Ergebnissen.⁴³ Später war das Motiv therapieresistente Blasten mittels G-CSF in chemosensible Blasten umzuwandeln.⁴⁴ Aktuell dient der Einsatz insbesondere einer Verkürzung der Neutropeniedauer während der Chemotherapie.

Die Studie Medical Research Council (MRC) des vereinigten Königreiches (UK) stellt die bislang größte randomisierte prospektive Studie zur Therapie mit G-CSF bei

adulten Patienten mit AML dar. Die Auswertung dieser Daten ergab eine verminderte Hospitalisierung der Patienten die G-CSF erhalten hatten. Es zeigte sich keine Steigerung der ereignisfreien 5-Jahres Überlebensrate (Event-free Survival, EFS) und keine Verbesserung der Infektionshäufigkeit und der Infektionsschwere in der Gesamtgruppe der Erwachsenen mit AML. Jedoch wurde eine geringere ereignisfreie 5-Jahres Überlebensrate und eine geringere komplette Remission in der der Gruppe der < 40 Jährigen detektiert. Dieser nachteilige Effekt durch G-CSF wurde als Zufallseffekt beschrieben, welcher in ergänzenden Untersuchungen überprüft werden muss.⁴⁵

Die hier vorliegende Arbeit beruht sich auf die Studie AML-BFM 98.⁴⁶ In dieser Studie in der insgesamt 526 Kinder mit akuter myeloischer Leukämie behandelt wurden, erfolgte nach 1. und 2. Induktion eine randomisierte Applikation des G-CSF, mit dem Ziel, die Neutropeniedauer und damit die Infektionshäufigkeit zu senken, um so die Therapieergebnisse zu verbessern. Verabreicht wurde 5 µg/kg/d G-CSF, dies geschah solange bis an drei aufeinander folgenden Tagen eine Neutrophilenzahl von mindestens 500/µl erreicht wurde. Die AML-BFM 98 Studie war die erste prospektive und randomisierte Phase-III-Studie, welche die Wirkkraft einer G-CSF-Applikation bei Kindern mit de novo AML untersuchte. Kinder und Jugendliche einer neu diagnostizierten AML in einem Zeitraum vom 1. Juli 1998 bis zum 30. Juni 2003, die nicht älter als 18 Jahre waren, konnten in die Studie aufgenommen werden.⁴⁶

Die Auswertung dieser Daten ergab weder eine Verbesserung der Infekt-assozierten Morbidität und Mortalität noch zeigte sich eine Steigerung der ereignisfreien 5-Jahres Überlebensrate (Event-free Survival, EFS) in der Gesamtgruppe der Kinder und Jugendlichen mit AML. Jedoch zeigte sich in der Subgruppenanalyse der Standardrisikogruppe (SR; definiert als AML FAB M1/2 mit Auerstäbchen, AML FAB M4eo bzw. den korrespondierenden Translokationen t(8; 21) und inv(16) und einem guten Therapieansprechen) die Tendenz einer gesteigerten Rezidivhäufigkeit der Patienten, die G-CSF erhalten hatten (p=0,06).^15,47,48

Kumulative Inzidenz

AML-BFM 98 Prot.pat Stand 10/04 SR ohne M3

Kein G-CSF ist=soll Rezidiv .16, SE=.07 Ereignisse/N 7/48 Kein G-CSF ist=soll Tod in KKR .04, SE=.03 Ereignisse/N 2/48 G-CSF ist=soll Rezidiv .39, SE=.10 Ereignisse/N 18/55 G-CSF ist=soll Tod in KKR .07, SE=.04 Ereignisse/N 4/55

Jahre p = .043 0,5

0,4 0,3 0,2 0,1

0,0

0 1 2 3 4 5

Kumulative Inzidenz

AML-BFM 98 Prot.pat Stand 10/04 SR ohne M3

Kein G-CSF ist=soll Rezidiv .16, SE=.07 Ereignisse/N 7/48 Kein G-CSF ist=soll Tod in KKR .04, SE=.03 Ereignisse/N 2/48 G-CSF ist=soll Rezidiv .39, SE=.10 Ereignisse/N 18/55 G-CSF ist=soll Tod in KKR .07, SE=.04 Ereignisse/N 4/55

Jahre p = .043

Kumulative Inzidenz

AML-BFM 98 Prot.pat Stand 10/04 SR ohne M3

Kein G-CSF ist=soll Rezidiv .16, SE=.07 Ereignisse/N 7/48 Kein G-CSF ist=soll Tod in KKR .04, SE=.03 Ereignisse/N 2/48 G-CSF ist=soll Rezidiv .39, SE=.10 Ereignisse/N 18/55 G-CSF ist=soll Tod in KKR .07, SE=.04 Ereignisse/N 4/55 Kein G-CSF ist=soll Rezidiv .16, SE=.07 Ereignisse/N 7/48 Kein G-CSF ist=soll Tod in KKR .04, SE=.03 Ereignisse/N 2/48 G-CSF ist=soll Rezidiv .39, SE=.10 Ereignisse/N 18/55 G-CSF ist=soll Tod in KKR .07, SE=.04 Ereignisse/N 4/55

Jahre p = .043 0,5

0,4 0,3 0,2 0,1

0,0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

0,0

0 1 2 3 4 5

Abb. 1.1. Kumulative Inzidenz von Ereignissen (Rezidiv / Tod) bei Patienten der Standard- risikogruppe der AML-BFM 98-Studie.

Randomisierte Applikation von G-CSF nach der 1. und 2. Induktion der Therapie, KKR: konstante komplette Remission.⁴⁹

In der Subgruppenanalyse der Standardrisikogruppe der AML-BFM 98-Studie vom Stand 2004 zeigte sich eine signifikant gesteigerte Häufigkeit von Rezidiven bei Kindern, die G-CSF erhalten hatten (Abb. 1.1).^46,49

1.3 Rezeptor des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors (G-CSFR)

Der Rezeptor des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors gehört zur Familie der Typ-I-Zytokinrezeptoren. Hierbei handelt es sich um einen transmembranen Glykoproteinrezeptor, der auf seiner extrazellulären Domäne eine Zytokinbindungsstelle besitzt und auf zytoplasmatischer Seite als Enzym arbeitet.

Charakteristisch ist das Fehlen einer intrinsischen Kinaseaktivität. Diese Rezeptorgruppe wird funktionell weiter unterteilt, in solche die nach Ligandenbindung ein Homodimer bilden, wie der G-CSF Rezeptor, und solche die Heterodimere oder größere Komplexe mit ihren Liganden erzeugen. Aufgabe des Rezeptors ist die zytoplasmatische Signalweitergabe des extrazellulär gebundenen G-CSF in der Zielzelle.⁵⁰

Die Expression des G-CSFR ist sowohl stadium- als auch gewebeabhängig, und findet vornehmlich auf Zellen der myeloischen Reihe, einigen hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen, aber auch auf nicht-hämatopoetischen Zellen, wie Endothelzellen, Plazentagewebe, trophoblastischem Gewebe und auf Zellreihen des kleinzelligen Lungen- und Blasenkarzinoms statt. Die Bedeutung der G-CSFR-Expression auf nichthämatopoetischen Zellen ist unklar, wenngleich eine Beteiligung am Endothelzellwachstum und am Migrationsverhalten vermutet wird.

Zudem wurde der G-CSFR in unterschiedlichem Ausmaß auch auf leukämischen Blasten von Leukämiepatienten und auf Leukämie-Zelllinien gefunden.16,17,51-53

Die Expression ist besonders von großer Bedeutung bei der Reifung des Myeloblasten zum differenzierten neutrophilen Granulozyten. Die Anzahl der exprimierten Rezeptoren auf der Oberfläche unterliegt der Zellreifung und erreicht ihr Maximum im Promyelozytenstadium. Danach fällt die Zahl der Rezeptoren nur leicht ab.^54,55 Bis zu 1000-2000 Rezeptoren / Zelle wurden auf humanen neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut detektiert.^56-58

Das Gen des hG-CSFR ist auf dem Chromosom 1 p35-p34.3 lokalisiert und nur einmal im haploiden Genom kodiert, es umfasst 16,5 kB und setzt sich aus 17 Exons und 16 Introns zusammen.⁵⁹ Zwei wichtige Regionen sind für die transkriptionelle Regulierung der G-CSFR-Expression von Bedeutung, die eine liegt bei -49 bp und beinhaltet die Sequenz GCAAT, welche eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor C/EBP α (CCAAT/Enhancer Binding Protein α) darstellt. Die andere Region liegt zwischen +36 bp und +43 bp und enthält zwei Bereiche für die Bindung des Transkriptionsfaktors PU.1 (SPI-1). Die Expression dieses Faktors ist auf hämatopoetisches Gewebe beschränkt.⁶⁰ Es wurden außerdem Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP-1, AP-2 und GF-1 entdeckt, ihre Bedeutung ist bisher noch unbekannt.⁶¹ Eine weitere Regulationsmöglichkeit stellt die posttranskriptionelle Internalisierung von Rezeptoren nach Stimulierung neutrophiler Granulozyten mit G-CSF, GM-CSF, LPS, IL-3 und chemotaktischem Peptid, sowie die Reexpression dar. Neben der Herunterregulierung (Downregulation) des Rezeptors kommt es durch die Exposition der Zelle mit TNF und TPA sogar zu einem Verlust der G-CSF-Bindungskapazität.^16,56

Der G-CSFR (Abb. 1.2) besteht aus einem 812 Aminosäuren großen Einzelstrangpolypeptid mit einem Gewicht von etwa 110-150 kD. Ursächlich für die

Größenvariationen des Rezeptors ist das Ausmaß der Glykolysierung der extrazellulären Region.16,17,62-65

Für die Klonierung des humanen G-CSFR aus Plazentazellen standen zwei cDNAs zur Verfügung. Die eine führte zur Enkodierung des G-CSFR mit einer Größe von 759 Aminosäuren, die andere zeigte eine Größe von 812 Aminosäuren. Die Ursache der verschiedenen Größen ist durch die alternative Prozessierung desselben Genproduktes bedingt. Dabei unterscheiden sich die G-CSFR lediglich in ihrer carboxyterminalen Sequenz.⁵¹

Die extrazelluläre Domäne des Rezeptors ist aus sechs Struktureinheiten aufgebaut, die jeweils eine Größe von etwa 100 Aminosäuren besitzen. Vom Amino-Terminus ausgehend beginnend mit der typischen immunglobulinartigen Domäne, gefolgt von der Zytokinrezeptor homologen Domäne (Cytokine Receptor Homology, CRH), die aus zwei Fibronektin-III-Bausteinen aufgebaut ist. Am Ende der Proteinkette befindet sich die dreimalig wiederholende Fibronektin-III-artige Domäne. Der Zytokinrezeptor homologe Bereich (CRH) ist für die Typ I-Zytokinrezeptorfamilie charakteristisch, sie enthält proximal vier konservierte Cysteinreste und distal eine konservierte WSXWS-Sequenz.⁶⁶

Dem transmembranen Abschnitt folgt der zytoplasmatische Bereich, welcher proximal aus zwei in der Zytokinrezeptorfamilie konservierten Einheiten, den so genannten Boxen 1 und 2 aufgebaut ist. Distal befindet sich eine weniger konservierte Box 3. Dieser intrazelluläre Abschnitt vermittelt über spezifische Regionen und Signaltransduktionswege, die Proliferation, die Differenzierung und die Reifung der neutrophilen Granulozyten, sowie die Modulation der immunologischen Kompetenz im reifen Granulozyt.^67,68

Abb. 1.2. Schema der extra- und intrazellulären Domänen des G-CSFR

(Ig: Immunglobulinartige Domäne, CRH: Zytokinrezeptor-homologe Domäne, Y: L-Tyrosin, FN3: Firbonektin-III-artige Domäne)

Untersuchungen zur Funktionalität des G-CSFR zeigten, dass die Transduktion spezifischer Signale durch distinkte Regionen des Rezeptors vermittelt werden.

Während proliferationsfördernde Signale im proximalen zytoplasmatischen Abschnitt des Rezeptors generiert werden, bewirkt der distale zytoplasmatische Abschnitt die Transduktion von Differenzierungssignalen.^69,70

Für die Bindung des G-CSF ist die zytokinrezeptor-homologe Domäne essentiell, allerdings weist auch der immunglobulinartige Bereich eine hohe Bindungsaffinität zu G-CSF auf.⁷¹ Zwei Dissoziationskonstanten konnten für G-CSF und seinen Rezeptor detektiert werden, wovon die erste eine mittelmäßige Affinität zu G-CSF aufweist. Die Zweite ist aufgrund der nicht Liganden abhängigen Homodimerisierung des Rezeptors und der damit einhergehenden suffizienteren Ausbildung der G-CSF-Bindungststelle mit einer hohen Affinität verbunden. Sehr hohe G-GSF-Konzentrationen können sogar zur Ausbildung von Homotetrameren führen.17,65,72,73

1.3.1 Isoformen des G-CSFR

Fünf Isoformen des G-CSFR wurden bisher identifiziert. Sie entstehen durch alternatives mRNA-Splicing und unterscheiden sich in den intrazytoplasmatischen und transmembranösen Abschnitten (Abb. 1.3.).⁵⁰

Die extrazelluläre Domäne des Rezeptors ist bei allen Isoformen identisch. Die Isoform I entspricht dem Wildtyp und hat eine zytoplasmatische Domäne mit 183 AS.

Die Klasse II der G-CSFR Isoformen stellt, aufgrund des Fehlens der transmembranen Domäne eine lösliche Rezeptorvariante dar.^59,74 Die Isoform III besitzt eine Insertion von einem 81 basenpaarlangen Inframe, welches zur Veränderung der proximal zytoplasmatischen Region um 27 Aminosäuren führt.

Diese Veränderung scheint mit einer verminderten Proliferationsvermittlung einherzugehen.⁷¹ Im Vergleich zur Isoform I, weißt die Rezeptorisoform IV eine Trunkierung des distalen zytoplasmatischen und somit des differenzierungsvermittelten Abschnittes um 87 Aminosäuren auf.⁷⁴ Nachfolgend führt diese Veränderung zu einer Störung der Ausreifungssignalweitergabe innerhalb der Zelle.⁷⁵ Die mRNA der Isoform V wird an derselben Spliceregion wie die der Isoform IV gekürzt. Jedoch statt einer Deletion von 261 bp, verliert die Isoform V 549 bp. Die Isoform V geht ebenfalls mit einem Verlust der reifungsvermittelten Domäne einher.

Abb. 1.3. G-CSF Rezeptor m-RNA-Klassen der fünf Isoformen

Gekennzeichnet sind: transmembrane Box gefüllter Kasten; Boxen 1 2 und 3 ungefüllte Kästen Klasse I ist die Full-Length-Form, Wildtyp

Klasse II weist eine Deletion der transmembranen Region auf (schmale Linie) Klasse III weist eine 27 Aminosäuren lange Insertion auf (horizontale Streifung)

Klasse IV und V weisen eine Trunkierung im distalen zytoplasmatischen Abschnitt auf (schraffierte Boxen) ⁵⁰

Zellen der myeloischen Reihe exprimieren überwiegend die Isoform I und in einem geringen Ausmaß die G-CSFR Isoform IV und V.⁷⁴ Eine Expression der anderen Splicevarianten ist auf humanen myeloischen Zellen nicht zu detektieren. Eine

signifikant gesteigerte Expression der G-CSFR Isoform IV auf blastären Zellpopulationen der AML wurde durch Untersuchungen des Expressionsverhalten bereits gezeigt.⁷⁶ Des Weiteren konnte in einem in vitro-Modell ein arretiertes Differenzierungsverhalten bei Expression der G-CSFR Isoform IV demonstriert werden,⁷⁵ so dass ein leukämogenes Potential von der G-CSFR Isoform IV ausgehen könnte.

1.4 hG-CSFR und seine Signaltransduktionswege

Wie bei allen Typ-I-Zytokinrezeptoren kommt es auch beim hG-CSFR nach Ligandenbindung zur Phosphorylierung zytoplasmatischer Tyrosinreste der C-terminalen Region. Dadurch wird eine Signalkaskade von phosphorylierten Proteinen in Gang gesetzt, aus der letztlich eine Aktivierung oder Hemmung spezifischer Gene des Zellkerns resultiert (Abb. 1.4).

Reifungs- &

Überlebenssignale

Proliferationssignale

Abb. 1.4. Signaltransduktionswege des G-CSF Rezeptors.

Die G-CSF-Bindung führt zur Rezeptor-Homodimerisierung, gefolgt von der Aktivierung verschiedener Signalproteine, zur Vermittlung von Zellproliferation, Zelldifferentzierung und / oder Zellüberleben.⁵⁰

Der G-CSFR besitzt vier verschiedene konservierte Tyrosinreste (Tyr ⁷⁰⁴,Tyr ⁷²⁹, Tyr ⁷⁴⁴, Tyr ⁷⁶⁴), die nach der Phosphorylierung als Andockstelle für Src-homologe-2-haltige Signalproteine dienen.⁷⁷

Während in ausgereiften neutrophilen Granulozyten nach G-CSF Stimulation die Tyrosinkinasen Lyn, Syk, ERK 1, ERK 2, MEK und die Transkriptionsfaktoren STAT 3 und c-rel detektiert worden sind,^78-80 wurden im Gegensatz dazu in unreifen und proliferationskompetenten Granulozyten die Tyrosinkinasen Jak 1, JAk 2 und Tyk 2 und die Transkriptionsfaktoren STAT 1, STAT 3 und STAT 5 nachgewiesen.^77,81-84

1.4.1 Signalvermittler und Aktivator der Transkription (STAT) 3 und 5

STATs sind Transkriptionsfaktoren, die die zelluläre Signalweiterleitung von Hormonen und Zytokinen gewährleisten. STAT-Proteine sind an unterschiedlichen zellphysiologischen Prozessen wie Differenzierung, Proliferation, Zellüberleben, Apoptose und Angiogenese beteiligt, und spielen somit eine wichtige Rolle für die Immunantwort, bei Entzündungsreaktionen oder auch in der fötalen Entwicklung.

85 Bei der Untersuchung von Interferon (IFN) -regulierten Gen-Transkriptionen zu Beginn der 90er Jahre, wurde die Existenz der STAT-Proteine erstmals beschrieben.^85,86 STATs sind wichtige Second Messenger der intrazellulären Signaltransduktion Tyrosinkinase-gekoppelter Rezeptoren, wie dem G-CSFR.

1.4.1.1 Der JAK-STAT-Signalweg

Durch die Bindung extrazellulärer Zytokine werden intrazelluläre Januskinasen aktiviert. Diese phosphorylieren spezifische Tyrosinreste in den STAT-Proteinen.

STAT-Monomere dimerisieren daraufhin zu einem aktivierten Rezeptorkomplex, welcher mit Hilfe der SH2-Domänen und den phosphorylierten Tyrosinresten entsteht. Das Dimer wird in den Zellkern transportiert und initiiert dort eine spezifische Gentranskription.⁸⁵

Zur Familie der STATs zählen bislang die sieben Mitglieder STAT 1, 2, 3, 4, 5a, 5b und 6. Wobei STAT 3 und STAT 5 die wichtigsten Steuerelemente, der durch Wachstumsfaktoren wie G-CSF, IL-6, GM-CSF und IL-3 regulierten Myelopoese sind.^87,88 Insbesondere die intrazelluläre Signaltransduktion von G-CSF wird durch die Proteine STAT 3 und STAT 5 vermittelt.⁸⁹ STAT 3 und STAT 5 spielen zudem

eine wichtige Rolle als Second Messenger bei der Übermittlung von Differenzierung, Proliferation und Überleben der myeloischen Progenitoren.

Wissenschaftliche Untersuchungen von STAT 3 zeigen zum einen eine gp 130-vermittelte Differenzierung der myeloischen Zellreihe durch STAT 3-Aktivierung, zum anderen wird eine Abnahme von STAT 3-Proteinen bei der Ausdifferenzierung embryonaler Stammzellen beobachtet.^90-92 Dieser Gegensatz suggeriert eine Aktivierung anderer Zielgene durch das gleiche STAT-Protein in den verschiedenen Zelltypen. Chakraborty et al. beschrieb eine G-CSF-induzierte Zelldifferenzierung über den Second Messenger STAT 3.⁸¹ Untersuchungen der distal gelegenen zytoplasmatischen Tyrosinreste Tyr ⁷⁰⁴ oder Tyr ⁷⁴⁴ des G-CSFR induzierten nach G-CSF-vermittelter Phosphorylierung eine Differenzierung von murinen leukämischen M1-Zellen.⁹³ Diese Tyrosinreste sind außerdem als Andockstellen für STAT 3α und STAT 3ß beschrieben.⁹⁴ Neben der Tyrosin-abhängigen STAT 3-Aktivierung zeigen einige Studien auch eine Tyrosin-unabhängige STAT 3-Phosphorylierung, bei hohen G-CSF-Spiegeln.^93,95 Diese alternative Aktivierung wird auch bei einer Infektionsantwort in vivo vermutet, da es im Serum zu ähnlich hohen G-CSF-Titern kommt.⁹⁶

Bisher sind 2 Formen von STAT 5 beschrieben worden, STAT 5 A und STAT 5 B.

Beide werden jeweils durch ein anderes Gen codiert.⁹⁷ Januskinasen, die an den proximal gelegenen und proliferationsvermittelnden Boxen 1 & 2 des G-CSFR sitzen, sind für die Aktivierung von STAT 5 zuständig.⁸² Auch STAT 5 gehört zu den Proteinen der Signalweitergabe der Zelldifferenzierung durch G-CSF, IL-3 und GM- CSF.^98,99 Daneben ist STAT 5 aber auch bei der Vermittlung der Zellproliferation und der Apoptose-Hemmung durch die Induktion des Bcl-Gens von Bedeutung.^99,100

STAT Isoformen entstehen durch Trunkierung, welche mittels alternativen Splicings oder proteolytischer Prozessierung des distalen zytoplasmatischen Abschnitt der Isoform STAT α entstehen (Abb. 1.6).^101,102

Abb.1.6. Struktur und Funktionsdomänen des STAT-Moleküls.

STAT α-Isoform (oben);

STAT ß-Isoform mit trunkierter C-terminaler Transaktivierungs-Domäne (unten)

NH2 : Aminogruppe; COOH: Carboxygruppe; CD: kooperative Domäne; DNA-BD: DNA-Bindungs- Domäne; TAD: Transaktivierungs-Domäne ⁸⁵

Unterschiedliche Veränderungen innerhalb der Zelle konnten durch die verschiedenen Isoformen beobachtet werden. STAT 3ß aktiviert zum Beispiel die Zellausreifung, wohingegen STAT3 α die Zellproliferation und Transformation steigert.¹⁰³ In AML-Zelllinien konnte eine vorherrschende Aktivierung der Isoform STAT 3α durch G-CSF mit einhergehender gesteigerter Proliferation beobachtet werden.¹⁰³ Während α-Isoformen als Antwort auf IL-3 vor allem in ausgereiften Zellen aktiviert werden, sind die trunkierten ß-Isoformen in unreifen murinen myeloischen Zelllinien vorherrschend.^97,101

1.4.2 STATs und AML

In 22-100 % der primären Blasten von AML-Patienten und in leukämischen Zelllinien wird eine konstitutive Aktivierung von STAT 1, STAT 3 und STAT 5 von verschiedenen Arbeitsgruppen dokumentiert.^104-108 Eine konstitutive STAT 3-Aktivität korrelliert zudem mit einem schlechteren Therapieansprechen. Eine Studie konnte ein signifikant kürzeres krankheitsfreies Überleben in AML-Patienten mit grundlegender STAT 3-Aktivität zeigen.¹⁰⁹ Im Rahmen einer weiteren Studie wurden vorherrschend trunkierte STAT-Proteine in Rezidivpatienten gefunden.¹¹⁰ Darüber hinaus findet sich in den blastären Zellen von Patienten mit AML eine veränderte Relation von aktivierten STAT 3 und STAT 5 nach G-CSF-Stimulation.¹¹¹ Nicht zuletzt ist die für die AML prognostisch ungünstige interne Tandemduplikation im FLT3-Gen mit veränderten STAT 3 und STAT 5-Aktivierungsmuster assoziiert.^9,105,112

1.5 Fragestellungen

1. Zeichnen sich AML-Blasten durch ein charakteristisches G-CSFR Isoform- mRNA-Expressionsmuster und / oder STAT 3- und STAT 5-Aktivierungsmuster aus?

1.1. Zeigen myeloische Blasten eine veränderte G-CSFR Oberflächenexpression?

1.2. Welches Expressionsmuster der G-CSFR Isoformen I und IV-mRNA findet sich in AML-Blasten?

1.3. Wie stellt sich das Aktivierungsmuster von STAT 3 und STAT 5 in den AML-Blasten dar?

1.4. Existieren Korrelationen zwischen der initialen G-CSFR Oberflächen- expression, dem G-CSFR Isoformen-mRNA Expressionsmuster, dem Aktivierungsmuster von STAT 3 und STAT 5 und anderen prognostisch wichtigen zytogenetischen und klinischen Parametern?

2. Führt die G-CSF-Stimulation der AML-Blasten in der Zellkultur zur Entkopplung der G-SCF-vermittelten Proliferations- und Differenzierungssignale?

2.1. Welche Auswirkungen hat die Stimulation mit G-CSF in der Zellkultur auf das Differenzierungs- und Proliferationsverhalten der AML-Blasten?

2.2. Bewirkt die G-CSF-Stimulation eine Veränderung der G-CSFR Oberflächen- expression?

2.3. Treten Veränderungen des Expressionsmusters der G-CSFR Isoformen I und IV-mRNA in den AML-Blasten auf?

2.4. Kommt es zu Modifikationen des Phosphorylierungsmusters der durch G-CSF-induzierten Signaltransduktionswege von STAT 3 und STAT 5 nach G-CSF-Stimulation?

1.6 Zielsetzung

Zielsetzung dieser Arbeit war es, potentielle Ursachen der erhöhten Rezidivinzidenz in der SR-Gruppe der AML-BFM 98 Studie nach G-CSF-Applikation zu identifizieren, um weitere Einblicke in die Leukämogenese der AML zu gewinnen. Die neuen Erkenntnisse sollten bezüglich des klinisch sehr relevanten leukämogenen Risikos der G-CSF-Therapie für Stammzellspender diskutiert werden.

2. Patientenproben

Die vorliegende Doktorarbeit ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im ersten Abschnitt wurden Patienten mit randomisierter G-CSF-Therapie retrospektiv (AML-BFM 98 Studie, n=54; davon 50 Standardrisiko- und 4 Hochrisikoproben) und Kontroll-Knochenmarkproben von gesunden Kindern auf das G-CSFR Isoform-Expressionsmuster analysiert. Von 50 Patientenproben der Standardrisikogruppe wurden zusätzlich 6 Proben des ersten Rezidives und in zwei Fällen zudem Proben des zweiten Rezidives untersucht. Die Standardrisikogruppe umfasst Patienten mit gutem Therapieansprechen (weniger als 5 % Blasten im Knochenmark am Tag 15) und den FAB-Klassifikationen M1/2 mit Auerstäbchen, FAB M3, FAB M4eo, oder mit den Aberrationen t(8; 21), t(15; 17) und inv(16). Da Patienten mit der FAB-Klassifikation M3 kein G-CSF erhielten, wurden diese Proben in die Analysen der vorliegenden Arbeit nicht einbezogen. Das mediane Alter dieser Gruppe betrug 12 Jahre (1 Monat – 17 Jahre). Von den übrigen 4 Patienten, die der Hochrisikogruppe zugeordnet waren, wurden sowohl Initial- als auch Rezidivproben untersucht, bei einem Patient trat ein zweites Rezidiv auf.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden prospektiv Blasten von de novo AML-Patienten ohne randomisierter G-CSF-Therapie (AML-BFM 04 Studie, n=27), und Populationen früher myeloischer Progenitorzellen von gesunden Kontrollpersonen (n=6) in vitro auf die G-CSFR Isoform-Expressionsmuster und auf die STAT-Aktivierungsmuster nach G-CSF-Applikation untersucht. Das mediane Alter dieser Gruppe betrug 12 Jahre (2 Jahre – 18 Jahre). Die gesunden Progenitoren wurden nach dem charakterisierenden CD 34 Oberflächenantigen selektiert.

Bei allen Proben handelte es sich um Ficoll-Präparate. Nur Proben mit einem Blastenanteil unter 80% wurden vor der Analyse nach den vorherrschenden Oberflächenantigenen mittels Durchflusszytometrie sortiert. Klinischen Daten, FAB Subtypen und chromosomale Aberrationen sind der Tabelle 1 zu entnehmen.

Alle Knochenmarkproben wurden nach vorheriger Patientenaufklärung und Einverständnis des Patienten bzw. durch seinen Vormund zum Zeitpunkt der initialen Diagnose, sowie falls eingetreten zum Zeitpunkt des Rezidives gewonnen. Die Diagnose der akuten myeloischen Leukämie basiert auf der Morphologie und der Immunphänotypisierung der vorherrschenden Blasten. Die Einteilung erfolgte nach

den Kriterien der FAB-Klassifizierung. Das Antikörperspektrum der Immunphänotypisierung beruht auf der AML-BFM-Studie.

2.1. Proben von Kindern der Studie AML-BFM von 1998 und 2004

analysierte Patienten der 98’er

Studie

analysierte Patienten der 04’er

Studie

n n

n 50 100% 27 100%

Geschlecht

männlich 29 58% 17 63,0%

weiblich 21 42% 10 37,0%

Alter

< 2 Jahren 1 2% 2 7,4%

2-9 Jahren 17 34% 10 37,0%

≥10 Jahren 32 64% 15 55,6%

Leukozyten, x10³/mm³

< 20 25 50% 9 33,3%

20-< 100 16 32% 6 22,2%

≥100 9 18% 12 44,4%

ZNS Leukämie

positiv 6 12% 6 22,2%

negativ 43 86% 20 74,1%

Keine Daten 1 2% 1 3,7%

FAB Subtyp

M0 0 0% 1 3,7%

M1 0 0% 3 11,1%

M1 mit

Auerstäbchen

10 20% 7 25,9%

M2 1 2% 1 3,7%

M2 mit

Auerstäbchen

27 54% 8 29,6%

M3 0 0% 4 14,8%

M4 0 0% 1 3,7%

M4eo 12 24% 1 3,7%

M5 0 0% 1 3,7%

Karyotyp und Zytogenetik

normaler Karyotyp 12 24% 6 22,2%

t(8,21) 15 30% 3 11,1%

t(15,17) 0 0% 3 11,1%

inv(16) 12 24% 2 7,4%

Andere 10 20% 8 29,6%

Keine Daten 1 2% 5 18,5%

analysierte Patienten der 98’er

Studie

analysierte Patienten der 04’er

Studie Randomisierung

für G-CSF

ja nein

G-CSF 30 60%

Kein G-CSF 20 40%

Outcome

Frühe Todesfälle * 0 0% 1 3,7%

KKR 31 62% 17 63,0%

Tod in KKR 1 2% 1 3,7%

Nonresp, /PR 2 4% 1 3,7%

Rezidive 12 24% 8 29,6%

Second malignancy 2 4%

LFU in KKR 2 4%

pEFS 50 65.6±6.8%

Tab. 1. Klinische Daten der Patienten aus der AML-BFM 98- und AML-BFM 04 Studie

Abkürzungen: KR, komplette Remission; KKR, konstante komplette Remission; LFU, Lost to Follow Up; pEFS, Wahrscheinlichkeit des ereignisfreien Überlebens; *Frühe Todesfälle sind definiert als Todeseintritt vor Tag 42

3. Material

3.1 Reagenzien

Material Bezugsquelle

Agarose SERVA; Heidelberg

Ampicillin Gibco™, Eggenstein

Aqua dest Zentralapotheke, MH-

Hannover Antibiotic-Antimycotic (ATB/ATM)

10,000 Units Penicillin, 10,000 µg Streptomycin, 25 µg Amphotericin B/ml

Gibco™, Eggenstein

Azur Eosin Methylenblauloesung nach Giemsa Sigma-Alderich, Steinheim

Bacto-Trypton Sigma, Steinheim

Big Dye Terminator Kit 3.1 Applied Biosystems,

Darmstadt

Dimethylsulfoxid Gefrierlösung (DMSO) Sigma, Steinheim

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma-Alderich, Steinheim

Eisessig MERCK; Darmstadt

Escherichia coli JM 109 Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Ethanol MERCK; Darmstadt

Ethidiumbromid (EtBr) AppliChem GmbH,

Darmstadt Eukitt (Poly(butyl methacrylate-co-methyl

methacrylate))

Sigma-Alderich, Steinheim Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco™, Eggenstein Formaldehyd (16%) Methanol free Polysciences, Inc

Hefe-Extrakt Sigma-Alderich, Steinheim

High Capacity cDNA Archieve Kit Applied Biosystems, Darmstadt

HiDi-Formamide MERCK; Darmstadt

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie–Wasser (HPLC)

Sigma-Alderich, Steinheim Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Cambrex, Charles-City,

USA

May-Grünwald Eosin-Methylenblaulösung MERCK; Darmstadt

Methanol Sigma-Alderich, Steinheim

Natriumchlorid (NaCl) MERCK; Darmstadt

Natrium-Acetat, pH 4,6 Sigma-Alderich, Steinheim NucleoSpin Extract II Macherey-Nagel, Düren Phosphate buffered saline, pH 7,4 (PBS) Zentralapotheke der MHH

RNeasy® Micro Kit Qiagen, Hilden

Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco™, Eggenstein

Stemspam™: SF Expansion Medium StemcellTechnologies Inc TaqMan® Universal PCR Master Mix Applied Biosystems,

Darmstadt

Trypan Blau Lösung MERCK; Darmstadt

Vektor pGEM-T Promega, Madison, USA

X-Vivo-10 (Serumfreies Zellkulturmedium) BioWhittacker, Heidelberg 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid

(X-Gal)

Sigma-Alderich, Steinheim

β-Mercaptoethanol Sigma-Alderich, Steinheim

DNA-Ladder (1kb) Fermentas GmbH, St. Leon-

Rot 3.2 Primer

Primer Bezugsquelle GCSF-Rezeptor Isoform I forward Operon Biotechnologies GmbH, Köln

GCSF-Rezeptor Isoform I reverse Operon Biotechnologies GmbH, Köln GCSF-Rezeptor Isoform I forward Operon Biotechnologies GmbH, Köln GCSF-Rezeptor Isoform IV reverse Operon Biotechnologies GmbH, Köln House Keeping Gen ABL forward Operon Biotechnologies GmbH, Köln House Keeping Gen ABL reverse Operon Biotechnologies GmbH, Köln 3.3 Lösungen und Puffer

50x TAE Puffer:

Tris-hydroxylmethyl-aminomethan 2 M

Eisessig 1 M

EDTA 50 mM Mit dH2O auf 500ml auffüllen

Agarose Gel 2 %

Agarose 2 g

1xTAE Puffer 100 ml

Ethidiumbromid 5 µl (10

LB-Medium:

Trypton 10 g Hefe-Extrakt 5 g NaCl 10 g

Aqua dest 1 L

LB-Agar-Platten:

Trypton 10 g Hefe-Extrakt 5 g NaCl 10 g Agar 15 g

Aqua dest 1 L

Ampicillin 100 mg/l

3.4 Wachstumsfaktoren und Zytokine

Wachstumsfaktor / Zytokin Bezugsquelle

Interleukin-3, Human Recombinat Sigma, Steinheim und von Chugai, Frankfurt Lenograstim (GCSF), Human

Recombinat

Sigma, Steinheim und von Chugai, Frankfurt Stem cell factor, Human Recombinat Sigma, Steinheim und von Chugai, Frankfurt Thrombopoietin, Human Recombinat Sigma, Steinheim und von Chugai, Frankfurt 3.5 Monoklonale Maus-Antikörper

Zielprotein Fluorochrom Bezugsquelle

Phospho-Stat3 Alexa 488 Becton Dickenson

Phospho-Stat3 Alexa 647 Becton Dickenson

Isotypkontrolle Ax 488 Alexa 488 Becton Dickenson Isotypkontrolle Ax 647 Alexa 647 Becton Dickenson

CD 114 PE Beckman Coulter

CD 2 FITC Beckman Coulter

CD 3 APC Beckman Coulter

CD 4 PC7 Beckman Coulter

CD 7 PE Beckman Coulter

CD 8 FITC Beckman Coulter

CD 10 FITC Beckman Coulter

CD 13 PE Beckman Coulter

CD 14 APC Beckman Coulter

CD 15 FITC Beckman Coulter

CD 19 PE Beckman Coulter

CD 20 APC Beckman Coulter

CD 33 FITC; APC; PC7 Beckman Coulter

CD 34 FITC; APC; PC7 Beckman Coulter

CD 36 FITC; APC; PC7 Beckman Coulter

CD 38 FITC Beckman Coulter

CD 41 FITC; APC; PC7 Beckman Coulter

CD 42b PE Beckman Coulter

CD 45 PC7 Beckman Coulter

CD 56 PE Beckman Coulter

CD 117 PE Beckman Coulter

HLA-DR FITC Beckman Coulter

zyMPO FITC Beckman Coulter

zyCD79a PE Beckman Coulter

zyCD3 PC7 Beckman Coulter

moAb 7.1 PE Beckman Coulter

Annexin V FITS Beckman Coulter

7-AAD APC Beckman Coulter

3.6 Geräte

Gerät Bezugsquelle ABI PRISM 7300 Sequence Detektor

Systems

Applied Biosystems, Darmstadt

Base Applied Biosystems, Darmstadt

Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg

CO2 Brutschrank: Heraeus Sepatech, Osterode am Harz Centrifuge 5415R Eppendorf AG, Hamburg

Cryo Tubes Vials Nunc GmbH & Co.KG, Wiesbaden Cytomics FC500 Beckmann/Coulter, Krefeld

Deckgläser 21x26mm Omnilab-Laborzentrum, Bremen Easy Flask non-traeted, T25, T…. Nunc GmbH & Co.KG, Wiesbaden Eukitt® quick-hardening mounting medium Sigma-Alderich, Steinheim

FACS Röhrchen: Sarstedt AG & Co., Nümbrech

Folie Applied Biosystems, Darmstadt

Kühlzentrifuge Sorvall Dupont, Bad Homburg

Kühlzentrifuge Jürgens Heraeus Sepatech, Osterode am Harz Mastercycler gradient Eppendorf AG, Hamburg

Mikroskop Axiovert 10 Zeiss, Oberkochen

Multifuge 3SR+ Centrifuge Heraeus Sepatech, Osterode am Harz Optical 96 well reaction plate Applied Biosystems, Darmstadt

Pipetten Eppendorf Reference Eppendorf AG, Hamburg Pipetten Eppendorf Research Eppendorf AG, Hamburg Pipettenspitzen Bioshere Filter Tips Eppendorf AG, Hamburg

Polaroid-Kamera SIGMA, München

Polyethylen Reaktionsgefäße Eppendorf AG, Hamburg Polyethylenröhrchen 15ml, 50ml Falcon Greiners, New Jersey, USA

Probe: Applied Biosystems, Darmstadt

Serolog. Pipetten:2, 5, 10 und 25ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Shandon Cytotraeger Thermo Electron, Dreieich Shandon Filter cards Thermo Electron, Dreieich

Sterilbank: Lamin Air Heraeus Sepatech, Osterode am Harz Thermomixer comfort Eppendorf AG, Hamburg

UVette RNase/DNA-/Protein frei Eppendorf AG, Hamburg Vibrofix VF1 Janke&Kunkel IKA®-Labortechnik Vortexer Reax Control Heidolph, Buckinghamshire, UK Wasserbad: GFL Gesellschaft für Labortechnik

GmbH, Burgwedel

Zählkammer:Neubauer Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe

Zentrifuge 5415R Eppendorf, Wesseling-Berzdorf

Zytospin 2 Scientific, Astmoor, UK

12-well plate, sterile, unbehandelt Nunc GmbH & Co.KG, Wiesbaden 6-well plate, sterile, unbehandelt Nunc GmbH & Co.KG, Wiesbaden 7300 Real Time PVR System Applied Biosystems, Darmstadt

3. Methoden

3.1 Zellbiologische Methoden

3.1.1 Auftauen und Vorbereitung der Knochenmarksproben

Die Proben der zu untersuchenden Zellen wurden nach der Dichtegradient- Zentrifugation in einem DMSO-haltigen IMDM-Medium in Flüssigstickstoff gelagert.

Das Auftauen erfolgte möglichst rasch unter fließendem warmem Wasser. Das Zellgemisch wurde anschließend in 25 ml 37 °C warmen RPMI-Mediums überführt.

Nach einer Inkubationsdauer von 5 min wurde die Zellsuspension für 5 min bei 1200 UpM zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in 10 ml Serum- freien X-Vivo 10 Medium resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Die Resuspension gesunder myeloischer Progenitoren erfolgte nach der Zentrifugation in StemSpan- Medium anstatt X-Vivo 10 Medium.

Zur Zellzahlbestimmung wurden gleiche Anteile der Suspensionskultur mit einer 0,4 %-iger Trypanblau-Lösung versetzt. Die Auszählung erfolgte in einer Neubauerzählkammer.

Zellzahl / ml = (gezählte Zellen / 4)x10⁴ x Verdünnungsfaktor (1:2) Trypanblau-Lösung diffundiert nur durch die in ihrer Integrität gestörte Zellmembran von nicht vitalen Zellen und färbt deren Zytoplasma blau an. Die Vitalität der Zellen wurde nach folgender Formel ermittelt.

Vitalität (in %) = Zahl der nicht gefärbten Zellen / Gesamtzellzahl 3.1.2 Kultivierung myeloischer Blasten und gesunder Progenitoren

Zur Zellkultivierung der myeloischen Blasten von Patienten der AML-BFM-Studie 04 wurde das X-Vivo 10 Medium mit Zusatz von 1 % Antibiotikum / Antimykotikum (ATB / ATM, Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B) und zur Kultivierung der frühen myeloischen Progenitoren wurde das StemSpan-Medium mit Zusatz von 1 % ATM / ATB verwendet. Die Zellen wurden auf 12er Well Mikrotiterplatten und FACS Röhrchen Zellzahl abhängig verteilt und bei 37 °C in Wasserdampf gesättigter Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert.

Die Zellpopulationen der Blasten und frühen myeloischen Progenitoren wurden mit 100 ng/ml rekombinanten humanen G-CSF, mit 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml TPO und 10 ng/ml IL-3 versetzt. Die Negativkontrollen wurden analog ohne den G-CSF-Zusatz kultiviert. Täglich erfolgte die Erneuerung von Zytokinen und Kulturmedium, sowie

zur Ermittlung des Proliferationsausmaßes die Zellzahlbestimmung. Sämtliche Schritte fanden unter sterilen Bedingungen statt.

3.1.3 Morphologische Beurteilung der kultivierten AML-Blasten

Zur Beurteilung der Morphologie und des Differenzierungsgrades der kultivierten Zellen erfolgte täglich die Anfertigung eines Zytospin. Dafür wurde 100 μl der Zellsuspension mit 400 μl X-Vivo 10 Medium gemischt und in eine Zytospinkammer, welche zuvor mit einem Objektträger, Filterpapier und einem Trichter bestückt wurde, überführt. Es erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 450 UpM. Der Objektträger konnte anschließend aus der Zytospinkammer genommen und an der Luft getrocknet werden. Die Zytospins wurden mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung gefärbt, an der Luft getrocknet, mit Eukitt eingedeckt und nach Verblindung zur mikroskopischen Ansicht herangezogen.

3.2 Proteinanalytische und Immunologische Methoden 3.2.1 Durchflusszytometrie:

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS, Fluorescence-Activated Cell Sorting) können Zellen anhand ihrer Lichstreuungseigenschaften und emittierter Fluoreszenzstrahlung auf Einzelzellebene charakterisiert werden. Zur Analyse werden die Zellen mit monoklonalen Antikörpern, die direkt oder über sekundäre Antikörper an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind, markiert. Die gefärbten Zellen passieren in einem Flüssigkeitsstrom hydrodynamisch fokussiert nacheinander einen Laserstrahl. Durch optische Einrichtungen und elektronische Detektoren wird das nach vorn (FCS= Forward Light Scatter, Vorwärtsstreulicht) und das um 90° (SSC=

Side Light Scatter, Seitwärtsstreulicht) gestreute Licht gemessen. Dabei werden die Signale des Vorwärtsstreulicht hauptsächlich durch die Zellgröße und der Impuls des Seitwärtsstreulicht vorwiegend von der Granularität der Zelle bestimmt. Neben den Streulichtsignalen werden gleichzeitig die Emissionsstrahlungen der durch den Laserstrahl angeregten Fluoreszenzfarbstoffe auf den Zellen gemessen. Mittels Teilerspiegel und farbselektiver Bandpassfilter wird das Fluoreszenzlicht verschiedener Fluorochrome separiert und mit photosensitiven Detektoren, sog.

Photomultiplern gemessen. In der Regel stehen drei Sensoren für 530 nm (Fluoreszenzkanal FL1), 585 nm (FL2) und > 650 nm (FL3) über den ersten Laser zur Verfügung. Über einen zweiten Dioden-Laser kann ein weiterer

Fluoreszenzparameter mit einer anderen Anregungswellenlänge zur Verfügung gestellt werden (FL4: 670 nm). Das optische Signal wird zunächst in elektrische Ströme und schließlich in ein digitales Signal umgewandelt.

Alle Untersuchungen wurden in einem Durchflusszytometer vom Typ Cytomics FC500 (Beckmann Coulter) durchgeführt. Zur Qualitätssicherung und Überprüfung des Zytometers wurden wöchentliche Kontrollen der Kanäle für FITC-, PE- und PC5-Fluorochrome, sowie eine tägliche Kontrolle des Kanals für APC-Fluorochrome durchgeführt.

3.2.2 Färbung der Blasten mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen membranständige Epitope

Die Subtypisierung der myeloischen Blasten der Patientenproben erfolgte routinemäßig im Rahmen der AML-BFM Studie. Dabei wurden die Blasten der Patienten mit einem der AML-BFM-Studie basierendem Antikörperspektrum gefärbt und ausgewertet.

3.2.2.1 Detektion der G-CSFR-Oberflächenexpression (CD114-Expression) Die G-CSFR-Oberflächenexpression der kultivierten Zellen wurde täglich durch einen spezifischen PE gekoppelten Antikörper ermittelt. Um eine optimal zytometrische Einstellung zu gewährleisten, wurden vor jeder CD114-Analyse ungefärbte Zellen gemessen, um die Autofluoreszenz der Probe zu detektieren und zu eliminieren.

3.2.4 Zellsortierung der Blasten und gesunder Progenitoren aus Knochenmarkproben

Die Zellsortierung erfolgte für die Proben bei einem Blastenanteil ≤ 80 %. Dabei wurden die Zellen wie in 3.2.2 mit Antikörpern gegen durch die Blasten exprimierte Oberflächenantigene gefärbt. Der Immunphänotyp der AML-Probe war durch die initiale Immunphänotypisierung, die routinemäßig im Rahmen der AML-BFM Studie durchgeführt wurde, bekannt und konnte dem Befundbogen entnommen werden. Zur Selektion früher myeloischer Progenitoren der Gesundkontrollen erfolgte die Färbung mit Anti-CD34-Antikörpern.

Anschließend wurden die Blasten und gesunden Progenitoren in der Abteilung Zellsortierung der Medizinischen Hochschule Hannover in einem FACS ARIA Zellsorter isoliert und in PBS aufgenommen.

Die Sortierung der Proben der AML-BFM 04er-Patienten ist den Schritten der Zellzählung und der Kultivierung zwischen geschaltet.

Monoklonaler Antikörper

Fluorochrom

CD 2 FITC

CD 4 APC

CD 7 FITC

CD 13 FITC

CD 15 FITC

CD 19 FITC

CD 33 FITC; APC; PC7

CD 34 FITC; APC; PC7

CD 38 FITC

CD 45 PC7

CD 56 FITC

HLA-DR FITC

Tab 3.1: Beschreibung der für die Isolierung der myeloischen Blasten verwendeten Antikörper

3.2.3 Färbung der Zellen mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen intrazelluläre Proteine

3.2.3.1 Detektion von aktivierten Signaltransduktionswegen

Die durchflusszytometrische Analyse der aktivierten Signaltransduktionswege mittels Detektion von phosphoryliertem STAT 3 und STAT 5 in Blasten und Blutstammzellen erfolgte nach der erstmals von Irish et al.¹¹³ publizierten Methode. Zur Optimierung und Anpassung der Methode wurden zahlreiche Modifikationen vorgenommen.

Bis zur endgültigen Messung am Durchflusszytometer durchläuft die Probe vier Vorbereitungsphasen.

1. Hungerphase der Zellen: Zur Vorbereitung der Zellstimulation wurden die Zellen nach dem Auftauen für zwei Stunden im X-Vivo 10 Medium kultiviert, um den Hintergrund an phosphorylierten Proteinen zu reduzieren.

2. Stimulation der Zellen mit G-CSF: Die Untersuchung der Signaltransduktionswege erfolgte in Abhängigkeit von G-CSF. Dazu wurden die Zellen auf 11 FACS-Tubes verteilt und jedes zweite Röhrchen mit 100 ng G-CSF versetzt, die unstimulierten Röhrchen dienten als Negativkontrolle. Die

Inkubation erfolgte im Brutschrank bei 37 °C für 0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min und 120 min. Alle Ansätze erfolgten in Doppelbestimmung, so fern die Probe genügend Ausgangszellen bereitstellte.

3. Fixierung und Permeabilisierung der Zellen: Im Anschluss an die jeweilige Inkubationszeit wurde eine Fixierung der Blasten mit Paraformaldehyd (PFA) vorgenommen. PFA führt zu einer Quervernetzung von Zellproteinen unter Beteiligung seiner Aldehydgruppen. Durch die Fixierung wird der Proteinstatus der Zelle erhalten und es können so die aktivierten Signaltransduktionswege der Zellen analysiert werden.

1 ml Zellsuspension wurden mit 125 µl 16 % PFA versetzt und für 15 min lichtgeschützt bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden die Zellen bei 4 °C und 1400 UpM abzentrifugiert, zur Permeabilisierung in 20 %-igem eiskaltem Methanol resuspendiert und für mindestens 10 min bei -20 °C aufbewahrt.

4. Intrazelluläre Färbung von STAT 3 und STAT 5: Zur intrazellulären Färbung wurden die Zellen durch Zentrifugation vom Methanol befreit und mit jeweils 1 ml PBS + 1% FCS gewaschen. Nach Resuspension in 200 µl PBS konnten die Zellen auf jeweils zwei FACS-Röhrchen verteilt werden, um die Färbung der Phosphokinasen STAT 3 und STAT 5 und die Parallelfärbung der Isotypkontrollen zu gewährleisten. Isotypkontrollen sind nötig, um unspezifische Bindungen durch den Antikörper zu detektieren. Nach Zugabe der Alexa 488 und Alexa 647 gekoppelten Antikörper erfolgte eine lichtgeschützte Inkubation von 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Zellen erneut mit PBS gewaschen, für 10 min bei 1400 UpM zentrifugiert und zur Messung in 500 µl PBS resuspendiert.

Monoklonaler Antikörper

(Becton Dickenson) Fluorochrom Phospho-STAT3 Alexa 488

Phospho-STAT5 Alexa 647

Isotypkontrolle Ax 488 Alexa 488 Isotypkontrolle Ax 647 Alexa 647

Tab 3.2: Beschreibung der für die Analyse des STAT3/STAT5-Aktivierungsmusters verwendeten Antikörper

Die Signaltransduktionswege wurden durchflusszytometrisch in FL1 und FL4 analysiert.

3.2.3.2 Apoptose-Test mittels Annexin- und 7-AAD-Färbung

Zur Detektion apoptotischer Zellen in einer Kultur wurde das Annexin V-FITC / 7AAD-Kit (Beckman Coulter) nach Herstellerangaben verwendet.

Der Test beruht auf einer Doppelfärbung apoptotischer bzw. toter Zellen mit FITC-konjugierten Annexin V und 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) und der anschließenden Analyse im Durchflusszytometer.

Im Frühstadium der Apoptose wird bei noch intakter Zellmembran ein Zusammenbrechen der Membransymmetrie beobachtet, indem das Phosphatidylserin (PS), welches sich bei lebenden Zellen im inneren Blatt der Plasmamembran befindet, in das äußere Blatt umgelagert wird.¹¹⁴ Annexin V-FITC bindet Ca²⁺-abhängig an das zur äußeren Zellumgebung hin exponierte PS und kann aufgrund der Konjugation mit dem Fluorochrom FITC im Durchflusszytometer nachgewiesen werden. 7-AAD ist ein langwellig emittierender Vitalfarbstoff, der tote Zellen anfärbt, jedoch die intakte Zellmembran nicht durchdringen kann. Die Doppelfärbung mit Annexin-V-FITC und 7 AAD erlaubt demnach die Identifikation drei unterschiedlicher Zellpopulationen:

1. Lebende Zellen sind Annexin V-FITC und 7-AAD negativ.

2. Zellen im frühapoptotischen Stadium sind Annexin V-FITC positiv und 7-AAD negativ.

3. Zellen im spätapoptotischen Stadium sind Annexin V-FITC negativ und 7-AAD positiv.

Dieser Test ist sehr sensitiv und erfasst auch frühapoptotische Zellen, die in anderen Tests nicht detektiert werden können. Die Messung erfolgte am Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal FL1 (detektiert Annexin V-FITS) und Fluoreszenzkanal FL-4 (detektiert 7-AAD). Bestimmt wurde der Prozentsatz früh- und spätapoptotischer Zellen der Zellpopulation.

3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 Isolierung von Gesamtzell-RNA

Die RNA-Isolierung aus den myeloischen Blasten von AML-Patienten und Progenitorzellen von Gesundzellspendern erfolgte mit dem RNeasy® Mini Kit von

Qiagen nach den Angaben des Herstellers. Ergänzend wurden die optionalen Qiashredder-Säulen und der DNAse-Verdau mit dem DNase Reaktion Mix von Qiagen ebenfalls nach Herstellerangaben verwendet. In der Regel standen 50.000 bis 200.000 Zellen für die RNA-Isolierung zur Verfügung.

Die Konzentrationsbestimmung der erhaltenen Gesamt-RNA erfolgte mit einem UV-Photospektrometer. Die Absorption der RNA wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen (Absorptionsmaximum der RNA). Die Konzentration c (µg/ml) einer RNA-Lösung lässt sich aus der gemessenen optischen Dichte (OD) unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors Fv berechnen. Die OD wurde in einer Präzisionsküvette mit der Schichtdicke d = 1 cm bestimmt. Bei einer Wellenlänge von 260 nm und einer OD von 1 beträgt die RNA-Konzentration 40 µg/ml.

c (RNA)= A260 x 40 x Fv [µg/ml]

Als Maß für die Verunreinigung mit Proteinen wurde der Quotient aus einer Messung bei 260 nm und 280 nm (Proteinabsorptionsmaximum) gebildet. Diese Ratio sollte bei ≥ 1,6 - 2,1 liegen.

3.3.2 Synthese der cDNA

Dient mRNA als Ausgangsmaterial, so muss vor der eigentlichen PCR eine Reverse Transkription (RT) durchgeführt werden. Die cDNA (complementary DNA) ist eine DNA-Kopie durch Abschrift der Nukleotid-Sequenz einer mRNA.

Komponente Volumen/Reaktion Final Konzentration Reverse-transcription master mix:

MultiScribe ^TM Reverse Transcriptase 1 µl

10x RT Buffer 2 µl 1x

10x RT Random Primer Mix 2 µl 1x

25x dNTP Mix (100mM) 0,8 µl 1x

RNase Inhibitor 1 µl

Nuclease free H2O 3,2 µl

Total Volumen 20 µl

Tab. 3.3: Reverse-Transkription Reaktionskomponenten