Das Lidocainderivat QX-314 permeiert die humane Isoform von TRPV1 und vermittelt eine Inhibition spannungsabhängiger Natriumkanäle

Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover

Das Lidocainderivat QX-314 permeiert die humane Isoform von TRPV1 und vermittelt eine Inhibition spannungsabhängiger

Natriumkanäle

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der

Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Christoph Hadamitzky aus Georgsmarienhütte

Hannover 2019

Für meine Familie

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 02.06.2020 Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Andreas Leffler 1. Referent/in: Prof. Dr. rer. nat. Erich Schneider 2. Referent/in: Prof. Dr. med. Bahram Mohammadi

Tag der mündlichen Prüfung: 02.06.2020 Prüfungsausschuss

Vorsitz: Prof. Dr. med. Hermann Müller-Vahl 1. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Marc Ziegenbein 2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Frank Schuppert

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Historische Hintergründe 1

1.2. Schmerzen und Nozizeption 3

1.2.1. Anatomische Grundlagen der Schmerzentstehung 4 1.2.2. Mikroanatomie der nozizeptiven peripheren Endstrecken 5 1.3.Elektrophysiologische Grundlagen der Schmerzsignale auf molekularer Ebene 8

1.3.1. TRP-Kanäle 10

1.3.2. Die Sub-Familie der TRPV-Kanäle 11

1.3.3. TRPV1 11

1.3.4. Der Natriumkanal NaV1.7 12

1.4. Lokalanästhetika 13

1.5. Molekulares Zusammenspiel von Lokalanästhetika am Natrium-Kanal 15 2. Hintergründe und Hypothesen der vorliegenden Arbeit 18

3. Wissenschaftliche Fragestellung 19

4. Material und Methoden 20

4.1. Zellkultur HEK 293t-Zellen 20

4.2. Transfektion 20

4.3. Elektrophysiologie 21

4.3.1. Allgemeine Grundlagen 21

4.3.2. Versuchsaufbau 22

4.3.3. Versuchsdurchführung 23

4.4. Chemikalien 25

4.5. Datenanalyse 25

5. Ergebnisse 27

6. Diskussion 35

6.1. Wirkung unterschiedlicher extrazellulärer Substanzen auf die tonische (schnelle) Inaktivierung der Membranpotentiale hNaV 1.7/hTRPV1-

exprimierender Zellen 36

6.2. Wirkung unterschiedlicher Substanzen auf die frequenzabhängige (langsame) Blockade der Membranpotentiale hNaV1.7/hTRPV1-

exprimierender Zellen 39

7. Zusammenfassung 42

8. Literaturverzeichnis 43

9. Alphabetisches Abkürzungsverzeichnis 52

10. Lebenslauf 53

11. Anhang 54

1. Einleitung

Lokalanästhetika inhibieren nichtselektiv spannungsabhängige Natriumkanäle aller Nervenfasern und sind deshalb ungeeignet für eine selektive nozizeptive Blockade.

Um das Ziel der selektiven nozizeptiven Blockade zu erreichen, beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit dem Einschleusen des membran-impermeablen Natriumkanalblockers QX-314 durch den polymodalen Capsaicinrezeptor Transient Vanilloid Rezeptor Potential 1 (TRPV1). Die Permeation dieses Rezeptors durch das Lidocainderivat QX-314 und eine damit verbundene Blockade spannungsabhängiger Natriumkanäle konnte bereits in murinen Forschungsmodellen gezeigt werden¹. Da der Beweis einer analogen Permeation der humanen Isoform dieses Kanals (hTRPV1) bisher noch ausstand, wurde diese Hypothese mit der vorliegenden Arbeit geprüft.

1.1. Historische Hintergründe

Die Untersuchung von Schmerz und die klinische Anwendbarkeit selektiver Schmerzhemmung können in den unterschiedlichsten Formen bis hin zum Ursprung der menschlichen Zivilisation verfolgt werden. Erste dokumentierte Empfehlungen zur Interpretation des Schmerzes, sowie dessen Behandlung, stammen aus Mesopotamien. Damals wurden Schmerzen nicht nur mit externen Noxen und Verletzungen in Beziehung gesetzt, sondern auch mit bösen Geistern. Manche Gottheiten waren zudem gezielt für bestimmten Schmerzen verantwortlich, bzw.

zuständig². Somit war das primitive menschliche Schmerzerlebnis sowohl gesellschaftlich als auch in religiöser Weise integriert. Diese integrative Beziehung kann sogar bis heute bei Urvölkern bestätigt werden, bei welchen schmerzhafte Rituale in Form von Skarifizierungen, Tätowierungen, Perforierungen von Körperteilen und Verbrennungsrituale als symbolischer Übergang vom kindlichen ins erwachsene Leben vorgenommen werden. Die Reifung und Volljährigkeit wird somit in engen Zusammenhang mit dem Erleben von starken Schmerzen gebracht und schmerzhafte Erfahrungen als Synonym für Mut, Reife und Disziplin angesehen³.

Auch in der griechischen Kultur der Antike wurden Schmerzen als Zeichen von Erfahrung angenommen und sowohl in der theatralischen Tragödie, als auch in der Kunst und Philosophie gelobt und gesellschaftlich gepriesen⁴.

Diese ursprüngliche Einstellung zum Schmerzerlebnis steht in tiefem Gegensatz zu den Werten in entwickelten Ländern. In unseren postmodernen Gesellschaften mögen Gebräuche, wie z.B. Tätowierungen oder Piercings zwar mit dem Übergang vom Kindes- ins Erwachsenenalter verbunden sein, stehen aber keineswegs in Zusammenhang mit gemeinsamen Ritualen. Die „Tapferkeit“ des Ertragens von Schmerzen wird nicht mehr nur als lobenswert gesehen. Eher werden Schmerzen in unserer Gesellschaft verborgen. Schmerzen als Zeichen einer möglichen Erkrankung haben das kollektive Bewusstsein weitaus mehr belastet als deren semiologische Bedeutung. Ein schmerzhafter Zustand geht nicht mit dem angestrebten Gesundheitsideal der postmodernen Gesellschaft einher und wird daher als Versagen erlebt. Daher ist die Schmerztoleranz in Gesellschaften von entwickelten Ländern im Vergleich extrem niedrig⁵. Natürlich ist dieser Zustand durchaus als wünschenswert zu sehen. Niemand möchte zu den obskuren Zeiten des Mittelalters zurückkehren, in welchen die Durchführung operativer Methoden ohne jegliche oder nur mit rudimentärer Anästhesie als normal erachtet wurde⁶. Allerdings befinden sich die Ärzte der West-Europäischen Kultur unter einem extremen Leistungsdruck bezüglich der Kontrolle von Schmerzen. Zudem mangelt es der postmodernen Bevölkerung an Schmerzerfahrung. Dies wurde sowohl durch lange Friedenszeiten, den schnellen Zugang zu akuter medizinischer Versorgung und medizinische Begleitung von Geburten, aber auch durch Hemmung der gesellschaftlichen Benachrichtigung schmerzhafter Erlebnisse motiviert. Das Erlebnis von Schmerzen ist keine heldenhafte Erfahrung mehr, im Gegenteil. Schmerzen und Erkrankungen sind nicht Teil des aktuellen individuellen Erfolgsmodels. Somit sind die möglichen psychosozialen Modulatoren des individuellen Schmerzes deutlich schwächer als beispielsweise in früheren Zeiten. Das Verständnis über solche Phänomene ist essenziell für eine erfolgs- und ergebnisorientierte Schmerzmedizin.

Nach wie vor sind sowohl für die postoperative Rehabilitation als auch bei chronischen Schmerzsyndromen neurologischer Genese, die Bewegungen der betroffenen schmerzhaften Körperareale eine der wichtigsten Komponente für die

zeitnahe Behandlung. Die Motorik führt zu trophischem Erhalt, funktioneller Integration und schließlich zu langanhaltender Schmerzlinderung. Allerdings ist die Bereitschaft der Patienten, in unseren postmodernen Kulturen, Schmerzen zuzulassen oder zu überwinden, um die Bewegung aufrechtzuhalten, in der Regel sehr gering. Deshalb besteht speziell im 21. Jahrhundert ein ungedeckter Bedarf an Medikamenten, welche z.B. die Nozizeption als Schmerzreiz ausschalten, gleichzeitig jedoch die Beweglichkeit ungestört ermöglichen würden.

1.2. Schmerzen und Nozizeption

Schmerzen entstehen als komplexes Phänomen unserer Wahrnehmung tatsächlicher oder möglicher Gewebeschäden, bestehend aus einer an das Wachbewusstsein gebundenen sensorischen, kognitiven, affektiven, motorischen und vegetativen Komponente⁷. Unter Nozizeption wird die sensorische Aufnahme unangenehm beschriebener schmerzhafter Reize, die Übersetzung in neuronale Erregung und Weiterleitung, sowie die zentrale Verarbeitung der nozizeptiven Information verstanden. Dieser Ausdruck wurde um 1908 vom englischen Neurobiologen Sir Charles Scott Sherrington (Nobelpreis Medizin 1932) aus den lateinischen Wurzeln nocere = Schaden und sensus = Empfinden, erfasst⁸. Daher muss die Nozizeption vom allgemeinen Konzept des Schmerzes unterschieden werden.

Phylogenetisch ergaben sich die Wege der Nozizeption etwa zwischen der Evolution der strahlenförmigen (radialen) wirbellosen (Seesterne und Quallen) zu bilateralen oder symmetrisch wirbellosen (Tintenfische, Krebse, Schnecken, Libellen) Tieren⁹. Schwämme haben kein Nervensystem, und daher keine Nozizeption. Die oben genannten radialen Wirbellosen hingegen besitzen bereits Nervennetze, die das Verhalten, etwa durch die Vermeidung von Noxen, beeinflussen (z.B. Flucht der Qualle bei Fischbissen). Aber erst bei bilateralen Wirbellosen kann eine höhere Konzentration von Neuronen dorsal der Mundzone festgestellt werden (rudimentäres zentrales Nervensystem). Diese Neuronen bilden eine Nervenbahn ventral des Körpers¹⁰, welche im Laufe der Evolution zu den Wirbeltieren eine Umdrehung von 180° erfuhr und eine Verlagerung in die dorsale Wirbelsäule bewirkte¹¹. Ab diesem phylogenetischen Schritt war die Nozizeption möglich. Nichts desto trotz kann bei

primitiven Wirbeltieren nicht vom Bestehen aller Schmerzkomponenten ausgegangen werden, da die Gehirne von Fischen und Amphibien beispielsweise keinen zerebralen Cortex besitzen¹². Selbst bei den höher entwickelten Reptilien sind sowohl das Dienzephalon als auch das limbische System als neurobiologische Basis für die Verarbeitung von Emotionen nur sehr rudimentär angelegt¹³. Der Zusammenhang von Schmerz und Nozizeption, wie wir ihn vom Menschen kennen, ist daher vermutlich hauptsächlich auf Säugetiere übertragbar^11,14.

1.2.1. Anatomische Grundlagen der Schmerzentstehung

In allen Säugetieren und beim menschlichen Fötus ab der 24. Schwangerschaftswoche¹⁵ sind die Wege der Nozizeption angelegt, und charakteristischerweise etwas komplexer als die neurologischen Wege der normalen Sensibilität. Nozizeptoren sind sogenannte polymodale primäre afferente Nervenzellen. Die Nozizeption erfolgt über zwei unterschiedliche Nervenfaserarten¹⁶. Diese unterscheiden sich in Durchmesser, Grad der Myelinisierung und die dadurch unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten in m/s. Dickere myelinisierte Typ-A-Fasern des Untertyps- transportieren sowohl Schmerzreize als auch die Information mancher Berührungsrezeptoren, sowie Temperaturextreme am schnellsten. Zudem werden nozizeptive Reize ebenfalls über nicht myelinisierte dünne C-Fasern, allerdings langsamer, weitergeleitet¹⁷. Letztere sind schwieriger zu stimulieren, verursachen aber eine länger anhaltende Antwort (Abbildung 1). Die C-Fasern stellen 60-90% der afferenten Nervenfasern der Haut und quasi die Gesamtheit der viszeralen afferenten Nervenfasern dar¹⁸.

Abbildung 1: Schema der unterschiedlichen Nervenleitgeschwindigkeiten und ihrer Intensitäten.

Anatomisch gesehen befinden sich die Zellkerne der pseudounipolaren peripheren (afferenten) Neuronen der A- und C-Fasern in den Spinalganglien, inklusive des Ganglion trigeminale, auch Hinterwurzelganglien genannt (DRG - dorsal root cell ganglion). Diese Perikarya sind somit außerhalb der Wirbelsäule lokalisiert und besitzen als zentrale Fortsätze Dendriten zum Hinterhorn des Rückenmarks und zum vegetativen Nervensystem. Auf diesen Ebenen findet die Umschaltung auf die zweiten Neurone statt. Im Hinterhorn teilen sie sich T-förmig und steigen ca. zwei Wirbelsäulensegmente auf und ab. Die Synapsen bestehen aus Strangzellen, aber auch aus Interneuronen. Ab der Umschaltung zum zweiten Neuron wird das nozizeptive Signal vervielfacht und an das zentrale Nervensystem weitergegeben.

Auch das kontralaterale Rhomb- und Dienzephalon erhält Signale zur Aktivierung schneller extrakortikaler motorischer Reflexe über die Strangzellen, der Thalamus über die Vorderstränge und die motorischen Bahnen.

Diese Verschaltung erlaubt eine komplexe Antwort aus protektiven Reflexen, sensibler Erörterung der Nozizeption und vielfacher emotionaler Reaktion, sowohl vegetativ als auch durch das limbische System. Es ist diese komplexe Antwort, durch welche der Begriff Schmerz charakterisiert werden kann¹⁹. Die anatomische Komplexität der Schmerzbahnen lässt die Wichtigkeit der Schmerzhemmung auf Ebene des ersten Neurons erahnen. Ab der ersten Synapse ist die Verteilung der Schmerzsignale bereits erfolgt und dessen umfassende Kontrolle dadurch deutlich erschwert.

1.2.2. Mikroanatomie der nozizeptiven peripheren Endstrecken

Die Aktivierung der nozizeptiven Erstneuronen ist zum Teil abhängig vom Faser Typ.

Aufgrund der sehr geringen Konzentration von A-Fasern auf Ebene der viszeralen Organe, treffen die Aussagen über die nozizeptive Aktivierung dieser Fasern in Haut und Gelenken auf das viszerale System nur bedingt zu. Selbst massive Gewebeläsionen können komplett schmerzlos erfolgen (z.B. asymptomatischer Myokardinfarkt, neoplastische Prozesse), oder aber durch simple Dehnung von Gewebe (C-Fasern) stärkste Schmerzen verursachen (z.B. Peritoneal-Schmerz bei Obstipation oder Nephrolithiasis). Zudem ist die nozizeptive Aktivierung adaptiv.

Anhand chronischer Stimuli können die Schmerzneuronen bei deutlich geringeren

Stimuli bereits aktiviert werden (Sensibilisierung), beziehungsweise Spontanaktivität aufweisen. Somit sind beispielsweise die A- und C-Fasern der Gelenke in gesundem Zustand nur bei extremen Druckzuständen oder übermäßiger Dehnung schmerzhaft. Erfolgt demgegenüber eine chronische Aktivierung durch eventuelle Entzündungsprozesse²⁰, kann bereits bei Berührung oder Bewegung im Regelumfang ein protektiver Schmerzstimulus entstehen^21,22.

A-Faser können in zwei weitere Subtypen aufgeteilt werden. Nozizeptoren A-Typ I sind in der Lage sowohl auf leichte chemische Reize als auch auf mechanische Noxen (Dehnung, Quetschung, Prellung) Aktionspotentiale zu generieren. Hieraus ergibt sich die Empfindung von sogenannten stechenden Schmerzen. Allerdings sind diese Erstneuronen ohne vorherige Sensibilisierung erst spät in der Lage, extreme Temperaturen als schmerzhaft zu identifizieren (50°C)²³. Im Gegensatz dazu sind Nozizeptoren A-Typ II sehr temperaturempfindlich, reagieren dafür aber nur auf sehr intensive mechanische Noxen.

Auch C-Fasern sind multimodal und können durch intensiven oder längeren mechanischen Noxenkontakt, Extremtemperaturen (> 42° C oder <15°C) oder chemische Stimuli (z.B. Protonen, Bradykinin, Serotonin, Histamin, Prostaglandine, ATP, Acetylcholin, Leukotriene) ein Aktionspotential generieren²⁴. Diese Noxen bewirken einen anhaltenden, brennenden und dumpfen Schmerz²⁵. Verschiedene Subtypen taktiler C-Fasern sind eher empfindlich für hohe Temperaturen, besitzen aber eine schwächere mechanische Empfindlichkeit. Interessanterweise sind diese Fasern viel empfindlicher für Histamin und spielen eine wichtige Rolle in der Entstehung von Entzündungen²⁶.

Manche C-Fasern hingegen haben eher regulierende Funktionen. Die niederschwellig afferenten taktilen C-Fasern reagieren ausschließlich auf leichte Berührungen der behaarten Hautareale und scheinen somit für die intensive, nicht schmerzhafte taktile Wahrnehmung zuständig zu sein²⁶.

Die Heterogenität der nozizeptiven Endstrecken betrifft also nicht nur deren afferente, sondern auch die efferente Funktion. Mikroanatomisch sind Nozizeptoren pseudounipolare Neuronen. Dies bedeutet, dass sie mit einem gemeinsamen Axon

nah am Zellkern ausgestattet sind, welches sich in periphere und zentrale Dendriten verteilt (Abbildung 2).

Abbildung 2: Schema eines pseudounipolaren Nozizeptor und dessen Verbindungen zum Rückenmark und in die Peripherie als freie Nervenendigungen (von Scholz und Woolf²⁷).

Diese Zellen geben daher nicht nur eine Richtung im Transport der Information vor, sondern leiten die Signale sowohl nach zentral, Richtung Wirbelsäule, vegetatives System und Gehirn, als auch nach peripher, in das Gewebe, über. Die peripheren Endstrecken mancher in der Nähe liegender Nozizeptoren (z.B. peptiderge C-Fasern) sind dadurch in der Lage auch Neuropeptide, wie Substanz P und Calcitonin-Gene-Related-Peptide zu produzieren, welche der Aufrechterhaltung der Schmerzstimulation oder Entzündung dienen. Andere Subtypen weisen eine Sekretion anderer Neuropeptide mit dem Ziel der trophischen Erhaltung/Vermehrung der nervalen Endstrecken und deren Stimulation (z.B. c-Ret-Neurotrophin-Rezeptor und Nerven-Wachstumsfaktor Neurturin, Artemin) auf²⁸. Diese parakrine Aktivität dient der Plastizität der Schmerzwahrnehmung und führt mittelfristig zu oben genannter Sensibilisierung der Endstrecken, mit Generierung von Aktionspotentialen bei geringen Stimuli oder aber spontan²⁹.

Trotz der Multimodalität der Aktivierung aller Nozizeptoren, resultieren deren elektrische Potentiale aus physiologischer Sicht aus der Funktionalität sehr spezifischer Ionenkanäle. Die Kanäle sind in Subtypen unterteilt, welche in Abhängigkeit der Stimulationsart aktiviert werden. Zudem sind diese Ionenkanäle fasertyp-übergreifend sowohl bei myelinisierten als auch bei nicht myelinisierten Nervenfasern exprimiert. Somit werden beispielsweise Ionenkanäle wie ASICs (Acid Sensing Ion Channel) hauptsächlich durch Säuren, TRPA1 durch chemische Noxen, TRPM8 durch Kälte und TRPV1 bei Hitze³⁰ und Capsaicin aktiviert³¹. In den multimodalen Nozizeptoren werden also mehreren Arten von Kanälen exprimiert, welche als essentielle Transduktoren eine wichtige Rolle spielen und dafür verantwortlich sind, dass Noxen aus der Umgebung (thermischer-, mechanischer- oder chemischer Natur) eine Information generieren und diese als elektrisch verstärkte Potentiale weiterleiten³².

1.3. Elektrophysiologische Grundlagen der Schmerzsignale auf molekularer Ebene

Das Verständnis der Entstehung elektrischer Potentiale auf Nervenebene bedarf einer kurzen Klärung mancher Vorurteile. Da der Strom im Haus- und Industriebereich aus Elektronenwanderung besteht, wird dieser Begriff häufig in Analogie mit den Prozessen z.B. in Akkus, also mit einem Fluss von Elektronen von der Kathode zur Anode aufgrund unterschiedlicher Potentiale, assoziiert.

Aber nicht alle Stromformen bestehen aus der Wanderung von Elektronen. In humanen Zellen werden elektrische Stromsignale auf Membranebene anhand chemischer Potentialunterschiede erzeugt. Die Stromspannung erfolgt hier nicht durch Wanderung von Elektronen in Längsrichtung, sondern durch Austausch von geladenen Ionen über die Membran (Dipol). Die Wanderung der Potentiale erfolgt durch Ionenaustausch entlang der Nervenzelle, bzw. saltatorisch auf Höhe der Ranvier’sche Schnürringe in myelinisierten Fasern. In Ruhephasen erfolgt die Wiederherstellung des Ruhemembranpotentials.

Das Membran-Ruhepotential weist folgende Merkmale auf:

- Im Zellinneren unmittelbar in der Nähe der Zellmembran ist die Umgebung negativ geladen.

- Die unmittelbare extrazelluläre Umgebung ist positiv geladen.

- Die Potenzialdifferenz von Nozizeptoren über der Membran in Ruhe liegt bei rund -60 mV.

Aufgrund des chemischen und elektrischen Gradienten tendieren die Ionen zum Gleichgewicht an beiden Membranseiten. Die Spannung wird aufrechterhalten durch selektive Permeabilität. In Ruhe sind die Natriumkanäle verschlossen und die Zelle ist fast undurchlässig für Natrium Ionen (11Na⁺). Zudem sorgt die Natrium-Kalium- ATPase für den konstanten aktiven Austausch von je drei Natrium Ionen aus der Zelle heraus, gegen zwei Kalium Ionen (19K⁺) in die Zelle hinein. Dies bewirkt einen

„Verlust“ von Positivität im Zellinneren und Erhalt des o.g. negativen Ruhemembranpotenzials von ca. -60 mV.

Das Ruhe- oder Haltepotential resultiert daher aus der stets aktiven Aufrechterhaltung einer Grundspannung im Bereich der Membran. In diesem Kontext bedarf es nur der Öffnung der spezifischen Ionenkanäle der Zellmembran, um den spontanen Ionenausgleich an beide Membranseiten zu erwirken, um so einen Nervenimpuls generieren zu können. Hier sind unterschiedliche Kanäle zuständig.

Viele Ionenkanäle für die Nozizeption (e.g. TRP-Kanäle) lassen positiv geladene Ionen schnell ins Zellinnere gelangen. Die hierdurch entstehende Membrandepolarisation reicht nicht aus, um die Erregungsschwelle des Neurons, einhergehend mit der Ausbildung eines Aktionspotentials, zu erreichen. Hierzu ist die kombinierte Aktion mit spannungsabhängigen-Natriumkanälen (NaV-Familie: Voltage activated sodium (Na) channels) erforderlich. Die kaskadenartige Aktivierung wurde elektrophysiologisch nachgewiesen, beispielweise für Kälte/Menthol-Stimuli zwischen TRPM8 und NaV1.8 Kanälen und für Hitze/Capsaicin zwischen TRPV1 und NaV 1.7³². Diese Mechanismen führen bei bestimmten Noxen zur Eröffnung von Ionenkanälen der TRP-Familie und damit zur spannungsabhängigen Aktivierung der assoziierten Natriumkanäle. Die Folge ist ein massiver Eintritt von Natrium Ionen in die Zelle und letztendlich die Entwicklung des Aufstrichs eines Aktionspotentials³⁰. Die darauffolgende Öffnung von Kaliumkanälen und das Schließen der Natriumkanäle verursacht ein Ausströmen der Kationen aus der Zelle und erzeugt ein

negatives Niveau des Membraninneren (Repolarisation oder Hyperpolarisation).

Somit stimmt zwar die Negativität der Membran im Zytosol, aber nicht die Zusammensetzung der Ionen auf jeder Membranseite. Die Schnelligkeit der Aktivität der Natrium-Kalium-Pumpe bestimmt die Dauer der refraktären Phase, in welcher keine weitere Aktivierung des Nozizeptors möglich ist.

In experimenteller Umgebung besteht die Notwendigkeit, Interaktionen der Zelle mit bestimmten Noxen, Pharmaka oder Stimuli bestimmten Membranzuständen über die Zeit zuzuordnen. Zu diesem Zweck wird die Überleitung von über die Membran angelegten Strompulsen untersucht. Diese Pulse induzieren ebenfalls eine refraktäre Phase an den spannungsabhängigen Natriumkanälen. Es werden für die Untersuchung der Wirkungen an der Zelle im Ruhezustand der Ionenkanäle Pulse in sehr geringer Frequenz appliziert (typischerweise Frequenzen unter 0.1 Hz). Diese erlauben eine ausreichend lange Zeit für die Abwicklung der Repolarisation des zu untersuchenden Kanals. Wird eine Blockade des Pulses nach Substanzapplikation unter diesen Konditionen beobachtet, beschreibt man diese als tonischen Block.

Eine wiederholte Applikation der Strompulse mit einer hohen Frequenz versetzt die spannungsabhängigen Natriumkanäle in ein Repolarisationsstadium und die damit assoziierte Blockade. Eine Strompulsüberleitung, gemessen unter diesen Konditionen, kann die Wirkung einer Substanz in der Repolarisationsphase analysieren und wird deshalb als frequenzabhängige Blockade beschrieben. Andere gängige Beschreibungen in der englischen Nomenklatur sind phasic block oder use-dependent block.

1.3.1. TRP-Kanäle

Die Familie der TRP-Kanäle (transient receptor potential) ähnelt phylogenetisch sehr stark dem 1969 erstmals im Rahmen einer visuellen Wahrnehmungstörung aufgrund von Mutation bei Drosophila melanogaster beschriebenen TRP-Gen und der 1989 identifizierten TRP-Kanäle³³, sowie denen von Säugetieren. Die Eigenschaft der schnellen (transienten) Inaktivierung trug zur Namensgebung bei³⁴.

Die Klassifikation der Sub-Familien erfolgt anhand analoger genetischer Sequenzen.

Somit sind TRPC (Canonical); TRPM (Melastatin); TRPML (Mucolipin);

TRPP (Polycystin); TRPA (Ankyrin) und TRPV (Vanilloid) als Sub-Familien definiert worden³⁵.

Weil es sich um eine genetisch strukturelle Zusammensetzung handelt und einzelne TRP-Kanäle nicht Liganden gesteuert, sondern lediglich durch Gensequenzhomologien identifiziert werden, sind innerhalb der Sub-Familien die Funktionen und Aktivierungsnoxen der Kanäle sehr unterschiedlich und teilweise noch unbekannt. Die Klassifikation fordert deshalb ein hohes Maß an Kenntnis für eine adäquate physiologische Interpretation wissenschaftlicher Studien, da sie keine logische Anordnung der Funktionalität darstellt³⁵.

1.3.2. Die Sub-Familie der TRPV-Kanäle

Kanäle der Sub-Familie der TRPV (Vanilloid) weisen eine hohe Permeabilität für Calcium auf, wobei nach Aktivierung und Öffnung ein Calciumeinstrom nach intrazellulär erfolgt. Die Subtypen TRPV1-4 kommen wahrscheinlich sowohl als Monomer als auch als Heteromere (kombinierte) Kanäle vor, und werden mit unterschiedlichen Temperaturschwellen durch Wärme, bzw. Hitze, aktiviert.

1.3.3. TRPV1

TRPV1 ist primär bekannt als der Capsaicin-Rezeptor, aber auch für dessen Hitze- Empfindlichkeit und Schlüsselrolle als Thermorezeptor^36,37.

So haben transgene Mäuse ohne TRPV1 zum einen die Eigenschaft verloren, Capsaicin zu identifizieren, zum anderen weisen sie eine herabgesetzte Empfindlichkeit und fehlendes defensives Verhalten bei schmerzhafter Hitze

>42- 52°C, sowie bei Entzündung auf^38,39. Die Expression von TRPV1 in nozizeptiven Nervenfasern, sowie die Sensibilisierung bereits vorhandener TRPV1 Rezeptoren, werden durch Entzündungsmediatoren wie Bradykinin, Prostaglandin und NGF (Nerve Growth Factor) stark hochreguliert, bzw. sensibilisiert⁴⁰. Diese gezielte Überexpression und Sensibilisierung von TRPV1 erklärt wahrscheinlich die brennenden Schmerzen und empirisch festgestellte Überempfindlichkeit gegen Hitze während inflammatorischer Prozesse²⁰. Zudem unterstreicht dieses Phänomen die

wichtige Rolle dieses Rezeptors in der Kaskade zur Aufrechterhaltung chronischer entzündlicher Prozesse, wie rheumatoide Arthritis, inflammatorische Darmerkrankungen oder Malignome⁴¹.

1.3.4. Der Natriumkanal NaV1.7

Spannungsgesteuerte Natriumkanäle werden in allen elektrisch erregbaren Geweben, wie Gehirn, Nerven, Gefäße⁴², Herz- und Skelettmuskulatur exprimiert und sind dort für die Ausbildung und Weiterleitung elektrischer Signale verantwortlich. Der in dieser Arbeit transfizierte und untersuchte Natriumkanal - Untereinheit Nav1.7 wird vom Gen SCN9A kodiert, und fast ausschließlich in sensorischen und sympathischen Afferenzen exprimiert. Hereditäre „gain of function“ Mutationen in Nav1.7 führen zu einer Überfunktion des Kanals, einhergehend mit gravierenden Schmerzsymptomen wie Erythromelalgie, die mit stark brennenden Schmerzen bei leichten Hautberührungen einhergeht⁴³. Umgekehrt tragen manche Familien „loss of function“ Gendefekte im SCN9A, einhergehend mit einem kompletten Funktionsverlust des Kanals. Interessanterweise spüren diese Gendefektträger gar keine Schmerzen, d.h. es besteht eine kongenitale Schmerzunempfindlichkeit⁴⁴ (congenital insensitivity to pain - CIP). Außer einer kombinierten Anosmie sind wahrscheinlich alle anderen sensorischen Funktionen normal. Das Leben verdienen sich einige dieser Erkrankten im Straßentheater (sog.

Fakire), wo sie sich beispielsweise vor Publikum schmerzhaften Prozeduren unterziehen. Bedauerlicherweise haben die Betroffenen eine geringere Lebenserwartung, da es häufig durch nicht bemerkte und nicht heilende Wunden, sowie Frakturen zu septischen Krankheitsbildern kommt⁴⁵.

Es ist noch immer unklar, durch welche Mechanismen der NaV1.7 Kanal die Schmerzwahrnehmung beeinflusst. Die meist akzeptierte Theorie beschreibt im Falle einer „loss of function“-Mutation eine fehlende Amplifikation des Schmerzsignals.

Ohne NaV1.7 sind die Aktionspotentiale abgeschwächt und können nicht als Schmerz weitergeleitet und interpretiert werden⁴⁶. Zudem finden die Mechanismen der Sensibilisierung chronischer Schmerzen nicht statt⁴⁷. Gegebenenfalls ist diese Disposition assoziiert mit der endogenen Produktion von Opioiden seitens der neuronalen Endstrecken. In NaV1.7-Knockout-Mäusen führte die fehlende NaV1.7 Funktion zur fehlenden Hemmung der Produktion endogener Opioid-Peptide und zu

einer Erhöhung der peripheren Bioverfügbarkeit endogener Opioide als Konsequenz⁴⁸.

1.4. Lokalanästhetika

Unter Lokalanästhetika werden Substanzen verstanden, welche nach lokaler Applikation nicht selektiv, aber reversibel die Entstehung und Fortleitung des Aktionspotentials über Nervenfasern blockieren und dadurch unter anderem die Schmerzempfindung ohne Ausschaltung des Bewusstseins verhindern⁴⁹. Hierbei stehen auf der beschriebenen Ebene der Endstrecke der Nozizeption mehrere denkbare Mechanismen zur Verfügung, unter anderem die Hemmung der Kanäle der TRP-Familie (Hemmung der Detektion von Schmerznoxen), sowie die Hemmung der in nozizeptiven Nervenfasern exprimierten spannungsabhängigen Natriumkanäle (Hemmung der Detektion und Amplifikation des Schmerzsignals). Beiden Wegen gemein ist die Blockade des ursprünglichen Schmerzimpulses, da die Kombination anatomischer Verteilungswege und die parakrine Aktivität der Nozizeptoren bereits ab dem ersten Aktionspotential und der zweiten neuronalen Umschaltung eine komplexe generalisierte Schmerzantwort hervorruft.

Historisch gesehen ist die Anwendung von Lokalanästhetika mit kurzer Wirkdauer in primitiven Kulturen stark verankert. Dies betrifft Substanzen, welche die Kanäle der TRP-Familie entweder hemmen oder aktivieren. Meerrettich, Wasabi, Knoblauch, Zimt, Curcuma, Senf aber auch Tetrahydrocannabinol, führen zu einer Aktivierung und späterer Inaktivierung von TRPA1-Kanälen⁵⁰. Ebenfalls empirisch angewendet werden Minze (Menthol) und Eukalyptus, welche eine Aktivierung/Inaktivierung der TRPM8-Kanäle bewirken (kälteempfindliche TRP-Subfamilie). Zu den Substanzen, welche die TRPV1 Kanäle aktivieren und vorübergehend blockieren, bzw. den Calciumeinstrom reduzieren, gehören Vanillin, Eugenol (Nelken), Campher, Gingerol (Ingwer), sowie Piperin in schwarzem Pfeffer, und Capsaicin in Chili⁵¹.“

Anhand der physiologischen Wirkung TRPV1-hemmender Substanzen in Verhaltensstudien können ebenfalls Schlussfolgerungen über die Funktion an TRPV1-Kanälen im zentralen Nervensystem nachvollzogen werden, vor allem im Zusammenspiel mit nikotinerger Aktivierung. Neuronen von Säugetieren weisen nach

Nikotin-Gabe eine geringere Amplifikation der Capsaicin-induzierten Aktionspotentiale durch NaV1.7 auf⁵². Ethanol potenziert die TRPV1-Aktivität. Murine TRPV1-Null-Mutanten konsumieren im Vergleich zu Wild-Typ-Mäusen vermehrt Ethanol statt Wasser im sogenannten zwei-Flaschen Test ⁵³. Aufgrund der Assoziation zwischen der Aktivierung von TRPV1-Kanälen und der kaskadenartigen Aktivierung des sympathischen Systems, wird eine Hemmung der Produktion von viszeralem Fett vermutet. Diese Hypothese konnte bisher nur in Mäusen bestätigt werden⁵⁴.

Der andere bekannte, und klinisch etablierte Wirkungsweg der Schmerzhemmung durch Lokalanästhetika betrifft spannungsaktivierte Natriumkanäle. Lokalanästhetika sind viel potenter als die o.g. traditionellen Mittel, und sie gehören zwei molekularen Klassen an: den Aminoestern oder Lokalanästhetika des „Ester-Typ“ (wie Procain, Benzocain) und den Aminoamiden oder dem „Amid-Typ“ (e.g. alle Lidocainderivate, unter anderem auch das QX-314, welches in dieser Studie angewendet wurde).

Die Hemmung von Natriumkanälen kann sowohl durch extrazelluläre als auch durch intrazelluläre Mechanismen erfolgen. Die Bindungsstelle für Lokalanästhetika am Natriumkanal befindet sich im intrazellulären Anteil aller NaV-Moleküle, und alle klinisch angewendeten Substanzen für die Lokalanästhesie sind ohne Ausnahme lipophil. Somit überqueren sie nach Injektion ins Gewebe unspezifisch die Zellmembran aller Nerven und binden dann im Intervall an der intrazellulären Bindungsstelle der NaV-Kanäle. Nicht nur die Penetration der Nervenzellen ist unspezifisch. Auch die Hemmung der Natriumkanäle betrifft alle Subtypen. Insofern sind Lokalanästhetika nicht selektiv für Nozizeptoren, sondern können ebenfalls andere Nerven hemmen und organspezifischen Nebenwirkungen wie Krampfanfälle, respiratorische Insuffizienz oder Herzrhythmusstörungen hervorrufen.

1.5. Molekulares Zusammenspiel von Lokalanästhetika am Natrium-Kanal

Spannungsabhängige Natriumkanäle besitzen eine tetramere Struktur, bestehend aus vier nicht identischen Domänen (DI-DIV)⁵⁵, der sogenannten -Untereinheit, welche 260 kDa groß ist. Hierbei handelt es sich um Glykoproteine mit einem größeren intramembranären Segment und kleineren transmembranären Segmenten, sowie extrazellulären Anteilen. In Abhängigkeit vom Subtyp (NaV1.1 – 1.9) weisen die extrazellulären Anteile verschiedene Bindungsstellen auf, z.B. für Toxine. Die extramembranären Segmente bilden eine dreidimensionale Klappe (Krone), die den Kanal während des Ruhepotentials geschlossen hält. Weitere transmembranäre Segmente bilden die Pore des Kanals, die in der mittleren Ebene nur 0,3 x 0,5 nm weit ist. Somit kann ausschließlich ein einzelnes Natriumion assoziiert mit einem Wassermolekül hindurchgelangen. Größeren Kaliumionen hingegen bleibt der Durchgang verwehrt. Die intramembranären Segmente des Natriumkanals sind letztlich für die hormonelle und metabolische Bindung von Regulatoren von Bedeutung⁵⁶. Eine Blockade des Natriumflusses in der refraktären Phase erfolgt durch Konformationsänderung der intramembranären Segmente der Domäne DIII und DIV und das Einrollen ins Innere der Pore. Diese intrazelluläre Blockade führt selbst dann zur Inaktivierung des Kanals, auch wenn die extrazelluläre Klappe noch offen ist^57,58. Bei Lokalanästhetika vom Amidtyp, wie z.B. Lidocain, erfolgt die Blockade des S6-Segmentes durch Bindung des Amidringes am intramembranären Phenylalanin des Natrium-Kanals (in der Literatur auch LA-Rezeptor genannt) und führt somit zur darauffolgenden Inaktivierung⁵⁹. Hierbei sollen sowohl die dreidimensionale Konformitätsänderung der -Untereinheit, speziell der Domäne DIII und DIV mit Verschluss der Pore, als auch die direkte Blockade der Pore durch die an Phenylalanin und Tyrosin verankerten Moleküle des Lokalanästhetikums⁵⁹ eine Rolle spielen (Abbildung 3).

Abbildung 3: Dreidimensionales Modell eines spannungsabhängigen Natriumkanals⁵⁹. Dieser Kanal besitzt eine - sowie mehrere ß-Untereinheiten, wobei die -Untereinheit von zentraler Bedeutung ist.

Die -Untereinheit besteht aus vier Domänen, jede davon aus sechs transmembranen Segmenten (genannt S1-6). Hier, einschließlich des Bindungsrezeptors für Lokalanästhetika im intramembranären DIV S6 Anteil der Moleküle dargestellt ⁵⁹.

Die Dauer der Inaktivierung des Natriumkanals durch Lokalanästhetika ist vom dreidimensionalen Zustand des Kanals abhängig. Für einen Natriumkanal in Ruhe bewirkt das Ruhepotential der Membran eine spannungsabhängige geschlossene Konfiguration der Pore durch die extramembranäre Klappe. Eine Hemmung durch Lokalanästhetika ist dann nur in sehr hohen Konzentrationen möglich, da die Affinität der molekularen Bindung zum intramembranären Lokalanästhetika-Rezeptor des Kanals in dieser Konfiguration sehr schwach ausgeprägt ist. Eine starke Affinität der Bindung ist nur möglich, wenn der Kanal offen, oder intramembranär inaktiviert ist.

Dann ist die dreidimensionale Struktur des Kanals so konfiguriert, dass das Lokalanästhetikum sehr gut in den Rezeptor passt und bereits bei geringen Konzentrationen eine hohe Affinitätsblockade entsteht. Auf diesen Konformitätszustand wird der Begriff „frequenzabhängige Blockade“ oder

spannungsabhängige Blockade angewandt, da diese starke Bindung nur im Rahmen der Depolarisation und refraktären Phase stattfindet. Dieses Phänomen hat logischerweise Konsequenzen auf die elektrophysiologische Interpretation von Versuchsergebnissen. Um die Eigenschaften der Lokalanästhetika ohne Einfluss von spannungsabhängigen dreidimensionalen Veränderungen der Kanäle zu eruieren, werden deshalb sehr negative Membranpotentiale nahe -120 mV erzeugt, um den verschlossen Zustand der Kanäle als Ausgangszustand sicherzustellen. Die darauffolgenden Depolarisationen erlauben das Testen von spannungsabhängigen Blockaden in experimenteller Umgebung⁶⁰.

2. Hintergründe und Hypothesen der vorliegenden Arbeit

Die medizinische Anwendung von Lokalanästhetika im Rahmen der Rehabilitation, der Geburtshilfe und im Besonderen die Behandlung chronischer und spezieller Schmerzen würde von einer erhöhten Spezifizität bezüglich der Natriumkanalblockade profitieren. Durch die unspezifische Wirkung auf spannungsabhängige Natriumkanäle aller Subtypen haben Lokalanästhetika potenziell lebensgefährliche Nebenwirkungen bei Dosierungsfehlern und stellen einen erheblichen Nachteil durch z.B. konkomitante Hemmung der Motorik dar.

Die Versuche mit dem quartären Lidocainderivat QX-314 in Verbindung mit TRPV1 und NaV 1.7 hat die Untersuchung der Grundlagen zur Spezifizität nozizeptiver Blockaden auf der Suche nach klinisch anwendbaren Substanzen zum Ziel. Sie ist im murinen Model gelungen, weil die Bindung dieses Lokalanästhetikums nicht nur spezifisch auf den intramembranären Anteil der schmerzspezifischen Natriumkanäle abgestimmt ist, sondern weil diese polarisierten Moleküle schließlich durch TRPV1 Kanäle der murinen Nozizeptoren ins Zellinnere gelangen konnten. Eine Penetration der Zellmembran, wie es anderen lipophilen Lokalanästhetika gelingt, ist daher für QX-314 nicht möglich. Somit ist durch TRPV1 der Eintritt dieses Lokalanästhetikums in das Zytoplasma peripher auf die Endstrecken der Nozizeptoren beschränkt. Die Hemmung der spannungsaktivierten Natriumkanäle konnte daher spezifisch in murinen TRPV1-exprimierenden Spinalganglienzellen erfolgen¹. Eine experimentelle Wirkung auf menschliche TRPV1 Kanäle war bis dato unerforscht.

3. Wissenschaftliche Fragestellung

Anhand dieser Arbeit sollte die Wirksamkeit des nicht membranpermeablen, aber selektiv Natriumkanäle blockierenden quartären Lidocainderivates QX-314 in einem humanen Zellmodell erforscht und bewiesen werden.

Um die Permeation durch hTRPV1 und den Effekt von extrazellulär appliziertem Lidocainderivat QX-314 auf menschliche nozizeptive Natriumkanäle zu untersuchen, wurden HEK-293t Zellen mit humanen NaV1.7 und TRPV1-Kanälen transfiziert. Diese Zellen sollten dann anhand ihrer verschiedenen Transfektionen und Medikamentenapplikationen mit entsprechenden Kontrollgruppen und bestimmten Stromprotokollen verglichen werden.

4. Material und Methoden

4.1. Zellkultur HEK 293t-Zellen

Die menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK 293t) sind eine immortale Zelllinie, welche weder TRPV1 noch NaV1.7 selbst exprimieren. Auch vor dem Hintergrund der Expression neuronaler Strukturen in HEK293-Zellen, wie Neurofilamenten, ähnlich derer von Neuronen in der frühen Differenzierung, sollte erwähnt werden, dass sich HEK293-Zellen in der Erforschung von Natrium- und TRPV1-Kanälen als Zellmodel jedoch etabliert haben⁶¹. Mit humanem Natrium-Kanal (hNaV1.7, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Angelika Lampert, Aachen, Deutschland)) transfizierte HEK 293t-Zellen wurden bei 37°C, 5% Kohlendioxid und 95% Raumluft im Nährmedium DMEM (Dulbecco´s modified Eagle medium, Gibco-Invitrogen, Schwerte, Deutschland,), sowie 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen), 25mM HEPES (Hydroxyeththyl- piperazinyl-ethansulfonsäure, Gibco-Invitrogen), 10% HBS (Heat-inactivated fetal Bovine Serum, Gibco-Invitrogen) und 3 mM Taurin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) inkubiert und je nach Bodenbewuchs der jeweiligen Kulturflasche wieder vereinzelt. Die fertig transfizierten Zellen wurden unter den gleichen oben beschriebenen Bedingungen inkubiert.

4.2. Transfektion

Um Fremd-DNA in die zu untersuchende Zelle zu schleusen, und die entsprechenden Proteine zu kodieren und zu exprimieren, wurde das Verfahren der Transfektion benutzt. In diesem Verfahren wird die zu transfizierende Fremd-DNA in ein Vektorsystem eingebaut. Für die Transfektion in der vorliegenden Arbeit wurden die Calcium-Phosphat-Präzipitationsmethode, sowie die Transfektion mit Nanofektin verwendet (siehe Protokolle im Anhang).

Bei der benutzten Calcium-Phosphat-Präzipitationsmethode bindet die zu transfizierende DNA an die aus dem Calciumchlorid- und Natriumphosphatgemisch ausfallenden Kristalle und kann durch Endozytose nach intrazellulär aufgenommen

werden. Die zu exprimierenden Proteine werden nach der darauffolgenden DNA- Transkription und Translation in die Zielzellmatrix, im vorliegenden Fall in die Zellmembran, integriert. Nach etwa 15-20 Stunden dauernder Inkubationszeit wurden die Zellen separiert und in 35 mm Petrischalen (Greiner Bio-One, Bad Nenndorf, Deutschland) ausgesät, so dass sie innerhalb von 1-3 Tagen für die Experimente genutzt werden konnten. Die von uns genutzten stabilen NaV1.7-HEK-293t Zellen wurden gleichzeitig mit GFP-DNA (Green fluorescent protein, Cloontech, Mountain View, USA), sowie mit humaner hTRPV1-DNA (Geschenk von Dr. Peter Zygmunt, Lund, Schweden) co-transfiziert.

Unter dem inversen Mikroskop konnten so durch die Co-Transfektion mit GFP die erfolgreich transfizierten, humanen und rodenten TRPV1-exprimierenden Zellen anhand der gleichzeitigen Expression von fluoreszentem Protein in Zellwand und Organellen identifiziert werden. Für eine stabile Expression von hTRPV1 wurden 5 µg/ml Blasticidin (PAA, Wien, Österreich), sowie 16–24 Stunden vor den Experimenten Tetrazyklin 0,1 µg/ml (Sigma-Aldrich) für die Induktion in das Medium gegeben. Alle Experimente fanden mit Zustimmung der Gewerbeaufsicht des Landes Niedersachsen statt.

4.3. Elektrophysiologie

4.3.1. Allgemeine Grundlagen

Zur Charakterisierung der neurophysiologischen Merkmale und Besonderheiten von Ionenkanälen ist das Patch-Clamp Verfahren heute die weltweit verbreitete elektrophysiologische Messmethode der Wahl. Neher und Sakmann beschrieben 1976 erstmalig das Prinzip der sogenannten „Membranfleckklemmung“, bei welcher Spannungs-, Strom-, sowie Potential-Änderungen einzelner Ionenkanäle gemessen werden können⁶². Das Prinzip dieser Methode besteht darin, eine Glaspipette mit einer definierten Öffnungsfläche mittels Mikromanipulator an die Zellmembran der zu messenden Zelle heranzubringen, diese durch einen Unterdruck anzusaugen und einen hoch abgedichteten Kontakt zwischen dem isolierten Membranfleck („patch“) und Pipette mit einem Widerstand im Gigaohmbereich zu erzeugen (sog. „Gigaseal“).

Für die Entwicklung dieser Methode erhielten die beiden Deutschen 1991 den Nobelpreis.

Es existieren verschiedene Konfigurationen des Patch-Clamp Verfahrens, wobei in den vorliegenden Experimenten ausschließlich die „whole-cell“-Konfiguration verwendet wurde. Hierbei handelt es sich, wie beschrieben, um eine kurzzeitige Erhöhung des Pipettenunterdrucks, um die Perforation der Zellmembran zu erreichen. Geschieht dies vorsichtig, wird die Umgebung um die Pipettenspitze nicht geschädigt und man erhält eine direkte elektrische Verbindung über die intakte Zellmembran ins Zellinnere. Ist nun eine Spannung voreingestellt, so wird das Prinzip der Strommessung über die Zellmembran als Spannungsklemmenverfahren („Voltage clamp“) bezeichnet. Das Zytosol der zu untersuchenden Zelle wird währenddessen gegen die speziell hergestellte Lösung in der Pipette ausgetauscht.

Nun ist es möglich, die gesamte Zellmembran auf ein vorher definiertes Potential („Sollspannung“) zu bringen und elektrische Vorgänge und deren Veränderungen unter Applikation von Testsubstanzen auch an der intakten Membran zu messen.

4.3.2. Versuchsaufbau

Die Experimente wurden unter einem inversen Mikroskop auf einem schwingungsgedämpften Metalltisch durchgeführt. Alle Geräte waren über einen Verstärker geerdet und zudem von einem geerdeten Farraday´schen Käfig umgeben, um eine optimale Abschirmung gegen Signalrauschen durch elektromagnetische Wellen zu gewährleisten⁶³. Zur Verstärkung der gemessenen Ströme wurde ein HEKA Electronics USB10-Verstärker (HEKA-Instruments Inc., New York, USA) verwendet. Die einzelnen Ströme wurden zur Unterdrückung von hochfrequentem Rauschen bei 5kHz gefiltert und digitalisiert. Die Versuche wurden im Bereich einer 25kHz-Abtastfrequenz (digitalisierte Sampling Rate) durchgeführt und die Datenerfassung erfolgte mit einem konventionellen PC und der Patchmaster- Software v20x60 (HEKA-Instruments Inc.). Pro Petrischale wurde nur eine Zelle für die Experimente verwendet. Einzelne Versuchsreihen wurden an mindestens 2-3 unabhängigen Experimentiertagen durchgeführt. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt und aufgezeichnet. Als Referenzelektrode diente ein chlorierter Silberdraht (Ag/AgCl-Elektrode), welcher in die Messkammer eingelegt und mit dem Verstärker verbunden war. Die zu applizierenden Lösungen befanden sich in einem nachfüllbaren Perfusionssystem aus Spritzenhaltern. Dieses System

war in geeigneter Höhe seitlich über der Messkammer befestigt, um einen konstanten gravitationsbedingten Fließdruck zu gewährleisten und Messflüssigkeiten sehr nah an die Zelle applizieren zu können. Das Perfusionssystem bestand aus 7 in Spritzenhaltern eingelegten 10ml Spritzenbehältern ohne Stempel mit Drei-Wege-Hähnen. Diese Spritzenbehälter wurden über ein Schlauchsystem zusammengeführt, und vereinigten sich am Ende zu einer Kapillare.

Die Kapillare wurde mit Hilfe eines Mikromanipulators (Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland) bis auf etwa 100µm an die zu untersuchende Zelle herangeführt und die jeweilige Lösung gravitationsgetrieben appliziert. Das Schlauchsystem wurde zwischen den Versuchen mit Extrazellularlösung durchgespült und gereinigt. Das mikrometergenaue Heranfahren des Pipettenhalters samt Patchelektrode an die Zelle wurde mit Hilfe eines elektrischen Mikromanipulators (Narishige, Tokyo, Japan) gewährleistet. Am Pipettenhalter war ein flexibler Schlauch mit einer handelsüblichen 2ml Spritze befestigt, der es ermöglichte, einen kurzzeitigen Unterdruck zu erzeugen.

Die Pipetten wurden aus Borosilikatglas ohne Filament (GB150EFT-8P, Science Products, Hofheim, Deutschland) mit Hilfe eines Pipettenpullers selbst hergestellt (Zeitz, Martinsried, Deutschland, Widerstand von 2,7-3,2 Mega-Ohm). Eventuelle Unreinheiten an den Pipettenspitzen wurden beseitigt. Die Zeiteinstellung des zweizeitigen Ausziehens wurde manuell eingestellt.

4.3.3. Versuchsdurchführung

Für die durchgeführten elektrophysiologischen Untersuchungen wurden die Zellen nach erfolgreicher Transfektion mit 1,5ml Trypsin vom Boden der T-25-Flasks abgelöst, auf 35mm dishes ausgesät und erneut inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte vor Versuchsbeginn die Kontrolle der Zellen an dem inversen Mikroskop unter UV-Licht. Die Zellen wurden vor Beginn des Versuchs mit einer Extrazellularlösung gewaschen, welche aus 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES (Gibco-Invitrogen) und 10 mM Glukose bestand. Der pH-Wert dieser Extrazellularlösung wurde bei Bedarf mit Tetramethylammoniumhydroxid (TMA-OH) auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Als zusätzliche Extrazellularlösung wurde zudem calciumfreie Lösung verwandt welche 140 mM NaCL, 5 mM KCL, 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES (Gibco-Invitrogen) und 10 mM Glukose

enthielt. Auch diese Lösung wurde mit TMA-OH bei Bedarf auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.

Jeweils eine erfolgreich transfizierte Zelle wurde anhand der in der Zellwand und in den Organellen angereicherten fluoreszierenden Proteine ausgewählt und für die Experimente genutzt. Vor Ausrichten des Perfusionssystems an die Zelle wurde die Refenzelektrode aus chloriertem Silberdraht im Lösungsbad platziert. Die Borosilikatglaspipette wurde nun mit Intrazellularlösung gefüllt, welche sich wie folgt zusammensetzte: 140 mM CsF, 10 mM NaCl, 1 mM EGTA, und 10 mM HEPES (Gibco-Invitrogen). Bei Bedarf wurde die Intrazellularlösung mit Cäsiumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.

Nach Heranfahren der Meßpipette mit Hilfe des Mikromanipulators bis auf die Zellmembran wurde durch leichten Unterdruck die Zellwand angesaugt und perforiert. Mit langsamem manuellem Sog wurde ein Gigaseal und im Anschluss durch Perforation der Zellmembran der „Whole-Cell-Modus“ geschaffen. Lag der über die Pipette gemessene Widerstand der Zelle unter 1 Gigaohm, oder ergab sich während der Messung ein Leckstrom von mehr als 1,0 nA, so wurde die Messung abgebrochen und die Zelle verworfen.

Nach der Applikation der Testlösungen (Lidocain, Capsaicin und QX-314) wurde das Perfusionssystem jeweils mit der Extrazellularlösung ausgewaschen. Die Filterfrequenz für die Experimente mit Natriumkanälen betrug 5 kHz, die Aufnahmefrequenz 25 kHz. Der Serienwiderstand wurde zu 60-80% kompensiert und die Kondensatorkapazitätsartefakte durch die Patchmaster Software unterdrückt.

Was die Bestimmung der tonischen Blockade betraf, wurden die Daten der bestimmten Widerstände von vier hyperpolarisierenden Pulsen genutzt. Die Leckströme wurden linear subtrahiert. Die Pulse wurden nach Applikation eines depolarisierenden Testpotentials gemessen. Für die Experimente mit den TRPV1-Kanälen betrug die Filterfrequenz 2 kHz, die Aufnahmefrequenz 10 kHz. Alle Experimente und Aufzeichnungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Reihenfolge der unterschiedlichen Experimente wird in der Abbildung 4 zusammengefasst.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge der Experimente.

4.4. Chemikalien

Als Chemikalien wurden Lidocain und QX-314 (beide von Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) direkt in die Extrazellularlösung, bzw. für die Kontrollmessungen in die Intrazellularlösung gelöst, um eine Stocklösung von 100 mM zu erhalten. Mit Hilfe von Tetramethylammoniumhydroxid wurde der pH-Wert aller Lösungen, wenn nicht anders erwähnt, auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Der TRPV1-Agonist Capsaicin (Biotrend, Köln, Deutschland) wurde in Ethanol gelöst, um Lösungen von 0,01 - 1 mM herzustellen. Alle Stock-Lösungen wurden bei -20°C aufbewahrt und für die Experimente in entsprechenden Testkonzentrationen, extrazellulärer Pufferlösung oder Zellkulturmedium verdünnt.

4.5. Datenanalyse

Alle Datenaufzeichnungen der Einwärtsströme wurden nach Aufzeichnung als berechnete Mittelwerte mit Standardfehler abgebildet. Wenn repetitive Messungen erfolgten, wurden die Stromantworten jeweils zur initialen Stromantwort der Zelle

normalisiert. Die statistische Signifikanz wurde auf einen Irrtumswahrscheinlichkeitswert oder p-Wert von <0,05 angelegt. Die statistische Analyse wurde mit dem Programm GraphPrism (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA) durchgeführt. Ausgewertet und aufbereitet wurden die Daten mit Hilfe der Software Pulsefit (HEKA-Instruments), sowie Origin 6.0 (Microcal Software, Northhampton, MA, USA). Vergleiche zwischen zwei Gruppen mit verschiedenen Probengrößen (Strömen) wurden nichtparametrisch, zweiseitig anhand des Kruskal- Wallis-Test durchgeführt. Dieser Test wurde als äquivalent zum t-Test für nicht parametrische unabhängige Stichproben angewendet, da unsere Ergebnisse nicht aus isolierten Einzelmesswerten bestanden, sondern auch aus Membranpotential- Verteilungskurven. Mehrfachvergleiche für Gruppen mit gleichen, balancierten Proben wurden mit einem Dunns-post-hoc-Test nach dem oben genannten Kruskal- Wallis-Test ausgeführt. Die als Kurven dargestellten Graphiken wurden aus den Doppel-Puls-Protokollen generiert. Die erhobenen Daten wurden durch die Boltzmann-Gleichung (y = 1/ {1 + exp (EPP-0,5) /kh}) angepasst, wobei EPP ein bearbeitetes Pulspotential darstellt, 0,5 die elektrische Spannung bei der y = 0,5 und kh den Faktor des Anstiegs. Durch die Hill-Gleichung (y 0 ymax x {(IV50n/IC50n x Cn)}), wurden die Daten des Verhältnisses aus Konzentration und Inhibition durch Lidocain angepasst und als Konzentrations-Inhibitions-Kurven aufgetragen. Bei der Hill-Gleichung steht ymax für die maximale Amplitude, IC50 für die halbmaximale Blockierungskonzentration, wenn y/ymax = 0,5 und n für den Hill-Koeffizienten. Um den IC50 -Wert (halbmaximale Blockierungskonzentration) für den tonischen Block durch Lidocain zu ermitteln, wurden die Maximalstromamplituden der verschiedenen Stoffkonzentrationen an den Wert angepasst, welcher in der jeweiligen Kontrolllösung herrschte. Die Hill-Gleichung wurde daher für die statistische Darstellung der Substratbindung in das Medium benutzt.

Für die Schätzung des Umfangs der Stichproben wurden frühere Studien der Arbeitsgruppe herangezogen, d. h., es wurde anhand der Daten aus vorangegangenen Experimenten eine Leistungsanalyse und Probenmengenprojektion durchgeführt.

5. Ergebnisse

Der erste Versuchsaufbau hatte als Ziel, die idealen tonischen Blockaden zu bestimmen, um zu einem späteren Zeitpunkt die Wirkung von QX-314 untersuchen zu können. Zur Kontrolle wurde ein Haltepotential von -70 mV etabliert. Die ausgewählten Zellen unter diesem Haltepotential wurden jeweils 40 depolarisierenden Pulsen von -10 mV bei einer Frequenz von 0,1 Hz ausgesetzt (Abbildung 4, erste Spalte). Hierbei zeigte sich in der Kontrolllösung ein starker Abfall der Spitzenstromamplitude und somit eine zunehmende Inaktivierung der NaV1.7 Kanäle (45  28%, n = 23; siehe Abbildung 5B). Als das gleiche Protokoll bei einem Haltepotential von -120 mV angewandt wurde, ergab sich kein Amplitudenabfall, sondern eine leichte Zunahme des Spitzenstroms über die Zeit (6  10%; n = 25), was auf eine Zunahme der Offenheitswahrscheinlichkeit der spannungsabhängigen Natriumkanäle im Falle der Depolarisierung hindeutet.

Abbildung 5: Experimentelle Bestimmung der Haltepotentiale der hNaV1.7 transfizierten HEK-293t Zellen. (A) Beispiele der Pulsmessungen bei einem Ausgangspotential (Haltepotential) von -120 mV (obere Reihe) bzw. -70 mV (untere Reihe). (B) Normalisierte Darstellung von 40 durchgeführten Messungen der Hauptspannungsamplitude bei einem Haltepotential von -120 mV (schwarz) bzw.

-70 mV (blau). Punkte stellen den Durchschnitt, Klammerbalken den Standardfehler für jede Messung dar.

Um das ideale Haltepotential für die im Anschluss stattfindenden Experimente zu bestätigen, wurden die Zellen mittels einer spannungsabhängigen schnellen Inaktivierung getestet. Diese Inaktivierung entspricht nicht wie im Vorexperiment dem Mechanismus, der normalerweise nach Depolarisierung für die refraktäre Phase eines Kanals verantwortlich ist, sondern stellt die Inaktivierung im offenen Zustand des Kanals dar. Die für die schnelle Inaktivierung benötigten Versuche umfassten 100 ms lange Vorpulse, welche sich von -150 mV bis -10 mV erstreckten und in Schritten von 10 mV an die Zellen gelegt wurden. Anschließend wurde die Stromamplitude mit einem Testpuls bei -10 mV ermittelt (siehe Abbildung 5A oben rechts) und an die entsprechende Spannung des Ruhe-Membranpotentials angeglichen. Obgleich eine wesentliche Anzahl der Natriumkanäle bei -70 mV noch inaktiviert war, waren bei -120 mV 100% der Kanäle verfügbar (Mittelpunkt der Innaktivierung (50%) im offenen Zustand bei -79 mV  6 mV, n= 8; Abbildung 6).

Daher wurden die weiteren Versuche mit Protokollen von Natriumströmen in Zellen mit einem Haltepotential von -120 mV aufgezeichnet.

Abbildung 6: Bestimmung der schnellen Inaktivierung der hNaV1.7-Kanäle mit Vorpulsen von -150 mV bis -10 mV während 100 ms, gefolgt von einem -10 mV Puls. Normalisierte Darstellung der gemessenen Hauptspannungsamplituden. Die durchgezogene Linie ergibt sich aus der Boltzmann- Gleichung der Werte (Wahrscheinlichkeits-Annäherung) und erlaubt die Bestimmung der Werte bei Haltepotentialen von -120 mV und -70 mV (gestrichelte Linien). Punkte stellen Mittelwerte, Klammerbalken den Standardfehler für jede Messung dar.

Da in früheren Publikationen bereits bei geringen extrazellulären Konzentrationen von 5 mM QX-314 ein bedeutender Abfall der Natriumionenströme an embryonalen Spinalganglienzellen bei Ratten gemessen werden konnte^1,64, wurde eine QX-314-Lösung mit einer Konzentration von 5 mM QX-314 für die vorliegenden Experimente verwendet. Wie in der Abbildung 4 beschrieben, waren die co-transfizierten hNaV1.7/hTRPV1-Zellen folgenden Reagenzien extrazellulär für 60 Sekunden bei einem Haltepotential von -120 mV ausgesetzt:

 1 µM Capsaicin

 Capsaicin in Kombination mit 5 mM QX-314

 Capsaicin in Kombination mit 30 mM QX-314

Nach dieser definierten Zeit erfolgte eine erneute Messung mit einem Puls von -10 mV (Abbildung 7A). Nach Applikation jeder Kombination der Testsubstanzen konnte ein Rückgang der Spitzenstromamplitude beobachtet werden (Abbildung 7B).

Diese Ergebnisse wurden nun mit dem gemessenen Abfall der Spitzenstromamplituden bei alleiniger Auswirkung von 1 µM Capsaicin (20%  14% Rückgang, n = 10), sowie der Kombination aus Capsaicin und QX-314 auf die Zellen verglichen. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Kombination aus Capsaicin und 5 mM QX-314 (35%  24% Rückgang, n = 16), bzw.

Capsaicin und 30 mM QX-314 (23%  18% Rückgang, n = 26) zu keinem signifikant stärkeren Rückgang der Gesamtströme führte als Capsaicin alleine (p > 0,05, Kruskal-Wallis und post hoc Dunn Test) (Abbildung 7C). Auch die alleinige Applikation von 30 mM QX-314 führte zu keiner signifikanten Inhibition⁶⁵.

Abbildung 7: Wirkung unterschiedlicher extrazellulärer Substanzen auf die tonische Blockade von Natriumströmen in hNaV1.7/hTRPV1-exprimierenden Zellen durch QX-314. (A) Schematische Darstellung der Versuchsreihe in chronologischer Folge. (B) Beispiel einer Patch-Clamp Messung vor (Natriumstrom links), während (Capsaicin-induzierter Strom Mitte) und nach (Natriumstrom rechts) Behandlung der Zelle mit 1 M Capsaicin und 5 mM QX-314 während 60 Sekunden. (C) Normalisierte Darstellung der gemessenen Stromamplituden der Natriumströme unter der Wirkung unterschiedlicher Substanzen. Balken stellen Mittelwerte, Klammerbalken den Standardfehler für jede Messreihe dar.

n.s. nicht statistisch signifikante Unterschiede.

Aufgrund der nun vorliegenden Daten wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine kombinierte extrazelluläre Exposition mit QX-314 und Capsaicin über 60 Sekunden keine robuste Blockade an Natriumkanälen auslösen konnte. Zum besseren Verständnis der Wirkungsweise wurde daher ein tonischer Block mittels Lidocain an ruhenden NaV1.7-Kanälen untersucht, da sich die Potenz der Inhibition des Natriumkanals im Zytosol zwischen den Lokalanästhetika Lidocain und QX-314 nicht wesentlich unterscheidet. Das Haltepotential der hNaV1.7-transfizierten Zellen, die extrazellulär jeweils verschiedenen Konzentrationen (10 bis 30 000 µM) von Lidocain ausgesetzt wurden, betrug -120 mV (Abbildung 8). Der für diesen tonischen Block errechnete IC50-Wert (mittlere effektive Konzentration) betrug 1710 µM  242 µM (n = 6 bis 11 Zellen je unterschiedlicher Konzentration) (siehe Hill-Gleichung in Material und Methoden).

Abbildung 8: Wirkung der extrazellulären Applikation von Lidocain auf hNav1.7. (A) Komparative Superposition der Stromkurven unter steigenden Konzentrationen von Lidocain induziert durch einen Puls von -10 mV bei einem Haltepotential von -120 mV. (B) Normalisierte Darstellung der gemessenen Stromamplituden unter der Wirkung steigender Konzentrationen von Lidocain. Punkte stellen Mittelwerte, Klammerbalken den Standardfehler für jede Messreihe dar. Die durchgezogene Linie ergibt sich aus der Hill-Gleichung der nichtparametrischen Werte.

Anhand dieser Ergebnisse, welche die Notwendigkeit von hohen intrazellulären Konzentrationen von QX-314 im Zytosol, analog zu Lidocain, erahnen ließen, strebten wir eine Verlängerung der Einwirkzeit von QX-314 an, um eine starke Blockade der ruhenden Natriumkanäle zu induzieren. In vorherigen Arbeiten konnte diesbezüglich der Zusammenhang einer längeren Einwirkzeit und stärkerer Blockade aufgezeigt werden¹.

Die Verlängerung der Einwirkzeit auf >3 Minuten bei der kombinierten Gabe von QX-314 und Capsaicin wurde allerdings durch die zunehmende Instabilität der Zellen beim Aufzeichnen der Ströme limitiert. Durch die beobachtete Membraninstabilität war die Natriumkanalblockade durch QX-314 von einer unspezifischen Stromabnahme nicht mehr zu unterscheiden. Zudem war in den früheren Aufzeichnungen der durch Capsaicin verursachten Einwärtströme durch die hTRPV1-Pore gezeigt worden, dass diese innerhalb der 60 Sekunden des Experiments fast komplett abnahmen (Abbildung 7B).

Wenn die Hypothese angenommen werden soll, dass QX-314 durch die Kanalporen von hTRPV1 permeieren muss, um Natriumkanäle zu inhibieren, so ist es schwer nachvollziehbar, dass allein durch die verlängerte Einwirkzeit bei jedoch

gleichzeitiger Inaktivierung von hTRPV1 nach etwa 60 Sekunden, überhaupt ein verstärkter Blockade-Effekt auftreten könnte.

Als alternatives Vorgehen wurde daraufhin versucht, die Natriumkanalblockade im Rahmen der Verlängerung der refraktären Phase der Zellen zu analysieren. Hierzu wurde die QX-314-vermittelte frequenzabhängige Blockade der Natriumströme ohne Co-Applikation von Capsaicin unter 100 depolarisierenden Pulsen von -10 mV und einer Frequenz von 10 Hz an mit hNaV1.7-transfizierten Zellen gemessen. Das Haltepotential betrug weiterhin -120 mV. Zuerst erfolgte die extrazelluläre Gabe einer geringen Konzentration von QX-314 ohne Zugabe von Capsaicin. Die Ergebnisse des vorgegebenen Pulsprogramms wurden dann mit den Ergebnissen in Kontrolllösung verglichen (p > 0,05, Kruskal-Wallis mit post hoc Dunn-Test). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Wirkung von sehr niedrigen (100 µM QX-314, 6  4% Rückgang, n = 5) und sehr hohen Konzentrationen (5 mM QX-314, 4  3% Rückgang, n = 7) von QX-314 im Vergleich zu den Membranpotentialen der hNaV1.7-transfizierten Zellen in Kontrolllösung (5  5% Rückgang, n = 5) (Abbildung 9A-C). Wurde allerdings QX-314 direkt intrazellulär in einer sehr niedrigen Konzentration über die Pipettenlösung gegeben, konnte bei 10 Hz eine frequenzabhängige Blockade am Natriumkanal erzeugt werden (100 µM QX-314, 54  14% Rückgang, n = 10; p = < 0,001, Kruskal-Wallis mit Dunn post hoc -Test, Abbildung 9C). Die alleinige extrazelluläre Gabe von 100 µM QX-314 erzeugte keine wesentliche frequenzabhängige Blockade der Natriumkanäle (7  5% Rückgang, n = 6, Abbildung 9A).

Abbildung 9: Bestimmung der frequenzabhängigen Blockade der hNaV1.7-transfizierten HEK-293t- Zellen. (A,B) Beispiele der progredienten Blockade bei extrazellulärer (A) bzw. intrazellulärer (B) Gabe von 100 µM QX-314. (C) Normalisierte Darstellung von 100 durchgeführten Strompulsen mit 10 Hz bei einem Haltepotential von -120 mV, ohne signifikante Unterschiede für die extrazellulären Applikationen ohne Capsaicin und Kontrolllösung und starke frequenzabhängige Blockade nach intrazellulärer Applikation von QX-314. Punkte stellen Mittelwerte, Klammerbalken den Standardfehler für jede Messung dar.

Nav1.7

Allerdings ließ sich eine signifikante frequenzabhängige Blockade bei extrazellulärer Co-Applikation von 1 µM Capsaicin und 5 mM QX-314 (34%  18% Rückgang, n = 13; p<0,01, Kruskal-Wallis mit Dunns-post hoc Test, Abbildung 10B) an mit hNaV1.7/hTRPV1-co-transfizierten HEK-293t-Zellen erzeugen. Diese Messergebnisse bewiesen erstmalig, dass QX-314 wirklich durch aktivierte humane TRPV1-Kanäle permeieren kann, um hNaV1.7 zu inhibieren. Somit konnte nach den durchgeführten Experimenten hTRPV1 tatsächlich als Voraussetzung für die Membranpermeation von QX-314 bestimmt werden, um Natriumkanäle durch dieses Lokalanästhetikum intrazellulär zu blockieren (Abbildung 10).

Abbildung 10: QX-314 permeiert die humane Isoform des Transient Receptor Potential Vanilloid 1 unter extrazellulärer Hinzugabe von 1 µM Capsaicin und verursacht eine frequenzabhängige Blockade von Natriumströmen in hNaV1.7/hTRPV1-co-transfizierten HEK-293t-Zellen. (A) Schematische Darstellung der Versuchsreihe in chronologischer Folge. (B) Normalisierte Darstellung der Messungen unter Applikation von 1 µM Capsaicin (weiß), die Kombination von 1 µM Capsaicin mit 5 mM QX-314 (blau) und 5 mM QX-314 (rot). Punkte oder Balken stellen Mittelwerte, Klammerbalken den Standardfehler für jede Messung dar.

Nav1.7 + hTRPV1