4. Material und Methoden
6.2. Wirkung unterschiedlicher Substanzen auf die frequenzabhängige (langsame) Blockade der Membranpotentiale
hNaV1.7/hTRPV1-exprimierender Zellen
Die finale Experimentreihe der vorliegenden Arbeit bewies erstmalig die Fähigkeit der humanen Isoform des TRPV1-Kanals, ähnlich zu denen von Nagern, das Lidocainderivat QX-314 von extrazellulär ins Zytosol zu schleusen, wo es den spannungsabhängigen Natriumkanal hNaV1.7 erfolgreich inhibieren konnte. Diese Wirkung erfolgte hauptsächlich über die frequenzabhängige Blockade der Kanäle, welche experimentell über ein hochfrequentes Pulsprogram induziert wurde.
Somit war nicht nur die Erkenntnis der molekularen Transportfunktion des humanen TRPV1-Kanals unter Ausschluss der Unterschiede zwischen Spezies relevant. Auch die im Verlauf veröffentlichte65 methodische Vorgehensweise stellt einen Beitrag zur Verbreitung erfolgreicher wissenschaftlicher Praxis dar. Es wurde bereits für andere Substanzen (Toxine oder Lokalanästhetika), die ebenfalls an den intramembranären Rezeptor des NaV 1.7 Kanal binden, gezeigt, dass die spannungsabhängige dreidimensionale Veränderung der Natriumkanaldomäne extreme Variationen der Rezeptoraffinität bewirken82. Eine tonische oder schnelle Membrandepolarisation verursacht in einer Zelle, welche sich zuvor in Ruhe oder im Zustand des sog.
Haltepotentials befand, eine schnelle extramembranäre Konfigurationveränderung mit Eröffnung der Pore und schnellem Eintritt der Natriumionen ins Zytosol83. Nach kurzer refraktärer Phase stellt sich ein Ruhepotential ein, und der Natriumkanal ist wieder funktionsfähig. Die dreidimensionale Konfiguration der Kanäle in Ruhe, bzw.
während der schnellen Depolarisierung, geht mit einer sehr geringen Affinität des intramembranären Rezeptors einher84.
Anders ist es während der refraktären Phase des Kanals. Um möglichst viele Kanäle in diesen Zustand zu versetzen, werden mehrere kurze aufeinanderfolgende Pulse benutzt. Im refraktären Zustand ist die Affinität des intramembranären Rezeptors auf die o.g. Substanzen verdrei- bis verfünffacht82. Die kalkulierte IC50 in dieser Konfiguration ist sehr gering. Das bedeutet, dass geringe Konzentrationen im Zytosol ausreichend sind, um 50% der vorhandenen Kanäle zu blockieren85. Als über eine Pipette eine intrazelluläre Gabe von 100 M QX-314 erfolgte, konnte eine
starke frequenzabhängige Blockade nachgewiesen werden. Im Vergleich waren Effekte nach extrazellulärer Applikation von 5 mM QX-314 in hNaV1.7/hTRPV1-exprimierenden Zellen etwas abgeschwächt, aber noch signifikant.
Vermutlich wurden mit dem benutzten Versuchsprotokoll mittels extrazellulärer Gabe des Lokalanästhetikums geringe intrazelluläre Konzentrationen von weniger als 100
M QX-314 verursacht. Die alleinige Applikation von 5 mM QX-314 induzierte eine ähnliche starke Inhibition wie die Kombination aus 5 mM QX-314 und Capsaicin.
Dieses Ergebnis könnte bedeuten, dass QX-314 auch ohne eine starke Öffnung der Kanalpore durch den Kanal permeieren kann. In der aktuellen Literatur wird in keiner Studie eine Agonist-unabhängige Permeation und subsequente Hemmung des TRPV1-Kanals durch QX-314 beschrieben. Nichts desto trotz, beobachteten Puopolo et al.75 eine Permeation des QX-314 durch TRPV1 ohne weitere Veränderungen der Kanal-Konfiguration. Obwohl eine Aktivierung des Kanals beobachtet werden konnte, ließen sich lediglich sehr geringe Einwärtsströme messen, welche sich nur langsam entwickelten. In früheren Studien wurde eine Inaktivierung des TRPV1 durch extrazelluläre Applikation von isoliertem QX-314 beschrieben86,87, allerdings betrugen die Messzeiten nur 20 Sekunden, so dass möglicherweise die Phase der diskreten Aktivierung des Kanals übersehen wurde88. In Tierexperimenten wurde die alleinige Applikation von QX-314 in Nagern als Ursache für lokale Irritationen und Anästhesie beschrieben73,89,90, ein Effekt der durchaus unsere Beobachtungen unterstützt. Andere aktuellere Studien zeigen, dass QX-314 auf Ratten-TRPV1 sowohl hemmende als auch aktivierende Wirkung aufweist91,92. Die Beobachtung der Wirkung von QX-314 auf Schaf-TRPV1, evolutionär Capsaicin-unempfindlich geworden, zeigte eine Interaktion von QX-314 auf intrazellulärem Niveau mit der Vanilloid-bindenden-Domäne und subsequenter Eröffnung sowie Aktivierung des Kanals87. Diese Fähigkeit ist möglicherweise speziesübergreifend, daher unsere Beobachtungen bei der humanen Isoform.
Obwohl die klinische Nutzung von QX-314 als Lokalanästhetikum durch dessen nachgewiesene zytotoxische Effekte65,93 noch fraglich ist, beherbergt es sowohl durch die selektive Permeation der TRPV1 Kanäle als auch durch die effiziente Natriumkanalblockade ein enormes Potential94. Lokalanästhetika mit ähnlicher, oder leicht veränderter molekularer Struktur, könnten ggf. eine neue Generation von Medikamenten darstellen, die in der Lage wären, eine selektive sensorische
Blockade (Schmerzhemmung) ohne begleitende motorische Paresen, bzw. andere systemische Nebenwirkungen, zu ermöglichen. Problematisch ist zurzeit die TRPV1-Aktivierung, da durch die Einströme von Calcium-Ionen über diesen Kanal, eine Calcium-vermittelte, Apoptose-ähnliche, Zelldestruktion induziert wird, welche als Grundlage der Zelltoxizität vermutet wird95,96. Zudem könnte in der molekularen Zusammensetzung von QX-314 als bromiertes Lidocainderivat der Schaden in der Zellhomöostase begründet liegen.
7. Zusammenfassung
Um den Effekt von extrazellulär appliziertem Lidocainderivat QX-314 auf menschliche nozizeptive Natriumkanäle zu untersuchen, wurden zum ersten Mal HEK-293t Zellen mit humanen NaV1.7 und TRPV1-Kanälen transfiziert. Diese Zellen konnten dann anhand ihrer verschiedenen Transfektionen und Medikamentenapplikationen mit entsprechenden Kontrollgruppen und bestimmten Stromprotokollen verglichen werden.
Die experimentelle Arbeit wurde in fünf chronologischen Versuchsreihen an mit humanen spannungsgesteuerten Natriumkanälen (NaV 1.7), bzw. mit humanen-TRPV1-Kanälen transfizierten menschlichen, embryonalen Nierenzellen (HEK 293t) durchgeführt. In der ersten Versuchsreihe konnte mit der Patch-Clamp-Methode das optimale Haltepotential für die Messungen der tonischen Blockade der NaV 1.7 Kanäle auf -120 mV festgelegt werden. Unter tonischen Block-Bedingungen konnte allerdings trotz Aktivierung des hTRPV1-Kanals durch Capsaicin keine Kanalblockade durch QX-314 gemessen werden. Erst nach Änderung des depolarisierenden Pulsprogramms für die Untersuchung einer frequenzabhängigen-Blockade des Natriumkanals NaV 1.7 bei 10 Hz war es möglich, eine Permeation von QX-314 durch TRPV1 nachzuweisen. Anhand eines Vergleiches mit durchgeführten Kontrollexperimenten wurde die spannungsabhängige dreidimensionale Veränderung der intrazellulären Affinität des Natriumkanal-Rezeptors für Lokalanästhetika als einer der möglichen Mechanismen erachtet, welche die Unterschiede zwischen der tonischen- und der frequenzabhängigen Blockade begründen.
Das Ziel war es, zukünftige Arbeiten zu unterstützen, welche die Wirksamkeit selektiver Lokalanästhetika erforschen. Zudem sollte die Bewertung dieser Substanzen für die klinische Anwendbarkeit vereinfacht werden.
Die vorliegende Arbeit hat erstmalig einen Beitrag in der Grundlagenforschung für die Charakterisierung der Interaktion des Lokalanästhetikums QX-314 mit der humanen Isoform des TRPV1-Kanals geleistet. Es bleibt zu hoffen, dass weitere zukünftige Studien in der Lage sein werden, neue Lokalanästhetika zu testen und zu entwickeln97 und somit den klinischen Alltag in der Anästhesie und vor allem die individualisierte Schmerzbehandlung der Patienten zu revolutionieren.
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