Charakterisierung der Helicobacter pylori- assoziierten Magenadenokarzinogenese am Tiermodell des Mongolischen Gerbils: Rolle der
cag-Pathogenitätsinsel bei der Induktion präkanzeröser Prozesse
DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth
vorgelegt von Tobias Wiedemann
2009
Rieder (LMU-München) am Lehrstuhl für Bakteriologie des Max von Pettenkofer- Instituts, Ludwig-Maximilians-Universität, München angefertigt.
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth genehmigten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.
rer. nat.).
Die Untersuchungen wurden durch Mittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (RI 972/3-1) / (SFB576) und des BMBF (ERA-NET PathoGenoMics, HELDIVNET, FKZ 0313930D) gefördert.
Promotionsgesuch eingereicht am: 23.11.2009 1. Gutachter: Prof. Dr. D. Kleiner
2. Gutachter: PD Dr. G. Rieder 3. Gutachter: Prof. Dr. O. Meyer Prüfer: Prof. Dr. K. Dettner Prüfer: PD Dr. St. Heidmann
Tag des wissenschaftlichen Kolloquiums: 16.04.2010
Diese Arbeit wurde in der Abteilung Bakteriologie am Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Ludwig-Maximilians-Universität, München angefertigt.
An erster Stelle möchte ich mich besonders bei PD Dr. Gabriele Rieder für ihre Hilfsbereitschaft und ihren Ideenreichtum in theoretischen und praktischen Aspekten der Arbeit sowie ihren Enthusiasmus, der mir immer eine Motivation war, bedanken.
Besonderer Dank gilt auch Prof. Dr. Diethelm Kleiner für die unkomplizierte Vertretung dieser Arbeit an der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth.
Eva Löll und den derzeitigen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe danke ich für die gute Zusammenarbeit und das angenehme Arbeitsklima.
Sehr dankbar bin ich des Weiteren meinen Eltern für ihre stetige Motivation und ihre finanzielle Unterstützung während der letzten Jahre.
1. Zusammenfassung 1
Summary 3
2. Einleitung 5
2.1 Entdeckung und Charakterisierung von
Helicobacter pylori 5
2.2 Epidemiologie der H. pylori-Infektion 6
2.3 Pathogenitätsfaktoren 7
2.3.1 Urease 7
2.3.2 Flagellen 8
2.3.3 Adhäsine 8
2.3.4 VacA 9
2.3.5 Die cag-Pathogenitätsinsel (cag-PAI) 10
2.3.6 CagA 12
2.3.6.1 CagA-Translokation 12
2.3.6.2 CagA als Effektorprotein 13
2.3.6.3 T4SS-abhängige, CagA-unabhängige Effekte 14
2.4 Pathogenese der H. pylori-Infektion 14
2.5 Diagnose und Therapie 16
2.5.1 Diagnose 16
2.5.2 Therapie 17
2.6 Problemstellung 18
3. Synopsis 20
3.1 Mongolische Gerbils als Tiermodell für die H. pylori-induzierte
Karzinogenese im Magen 20
3.1.1 cag-PAI-abhängige Kolonisierungsdichte 20
3.1.2 cag-PAI-abhängige pathohistologische Veränderungen 21 3.1.3 cag-PAI-abhängige immunologische Veränderungen 22 3.1.4 cag-PAI-abhängige physiologische Veränderungen 23
3.2.2 Essentielle Strukturen, Mechanismen und Signalwege in der
Wirtszelle 24
3.3 H. pylori CagL-induzierte IL-8-Expression 26
4. Literaturverzeichnis 28
5. Darstellung des Eigenanteils 39
6. Anhang 42
Teilarbeit A Teilarbeit B Teilarbeit C
7. Zusammenstellung aller eigenen Publikationen
8. Erklärung
1. Zusammenfassung
Helicobacter pylori ist ein spiralförmiges, gramnegatives, mikroaerophiles und motiles Bakterium. Der humanpathogene Keim adhäriert an die Magenepithelzellen, wodurch eine Signaltransduktionskaskade gestartet wird, die in der Induktion von Zytokinen, der Infiltration von immunreaktiven Zellen und letztendlich in einer chronischen Gastritis resultiert. Eine über Jahre anhaltende chronische Entzündung stellt per se ein erhöhtes karzinogenes Risiko dar. H. pylori als Karzinogen der Klasse I wird somit eine bedeutende Rolle bei der Umwandlung der Magenmukosa, entlang der präkanzerösen Stufen Atrophie, Metaplasie, Dysplasie bis hin zum Magenadenokarzinom zugeschrieben. Aufgrund der Fähigkeit virulenter H. pylori- Stämme (Typ I) das Effektorprotein CagA in die Wirtszelle zu translozieren, wird vermutlich eine Signaltransduktionskaskade gestartet, die auf die Physiologie und Architektur der Magenmukosa direkt regulatorisch wirkt. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den Regulationsmechanismus der H. pylori-induzierten Karzinogenese im Magen am Modell des Mongolischen Gerbils zu analysieren. Mit Hilfe einer Zeitverlaufsstudie konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine frühzeitig hochgradige Entzündung der Antrum- und Korpusmukosa zu späten physiologischen Veränderungen führt (Hypochlorhydrie und Hypergastrinämie). Diese H. pylori Typ I-Stamm-induzierte Entzündung und die damit verbundenen physiologischen Veränderungen sind kausal für die Entwicklung präkanzeröser Transformationen der Magenmukosa verantwortlich.
Anhand der Ergebnisse diverser Studien wurde vermutet, dass dem gastrointestinalen Hormon Gastrin eine bedeutende Schlüsselrolle bei der Entstehung maligner Veränderungen der gastrointestinalen Mukosa zukommt.
Aufgrund der im Tiermodell gemessenen Hypergastrinämie und der damit verbundenen Entwicklung präkanzeröser Veränderungen wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Regulation des humanen Gastrinpromotors durch H. pylori Typ I- Stämme untersucht. Hierfür wurden in diesem Teilprojekt die stabil mit einem humanen Gastrinpromotor-Luziferase-Reporterkonstrukt transfizierten Magen- karzinomzellen AGS verwendet. Es konnte erstmalig 5-Integrin als wichtiger Wirtsrezeptor für die H. pylori-induzierte Gastrinpromotoraktivierung identifiziert werden. Weitere Untersuchungen bestätigten einen neuartigen 5-Integrin-ILK- Signalkomplex, der für die H. pylori-induzierte Gastrinexpression verantwortlich ist.
Zusätzlich konnte eine Beteiligung des EGF-Rezeptors sowie des Liganden TGF-
bei der Aktivierung der Gastrinexpression nachgewiesen werden.
Das von H. pylori induzierte, aus der Epithelzelle der Magenmukosa sekretierte Chemokin IL-8 bewirkt im Tiermodell eine frühe Infiltration von immunreaktiven Zellen, sowie die daraus resultierende hochgradige Entzündung. Aus diesem Grund wurde die Regulation der H. pylori-induzierten IL-8-Sekretion mit Hilfe von AGS- Zellen in vitro untersucht. Das Ergebnis zeigt, dass eine spezifische C-terminale
„coiled-coil“-Region des H. pylori CagL-Proteins eine essentielle Rolle bei der Adhärenz des Bakteriums an die Epithelzelle besitzt. Bedeutend war, dass isogene H. pylori-Mutanten, bei denen die „coiled-coil“-Region des CagL-Proteins deletiert wurde, keine IL-8-Ausschüttung mehr zeigten.
1. Summary
Helicobacter pylori is a spiral-shaped, gram-negative, microaerophilic and motile bacterium. The human pathogen adheres to the epithelial cells of the stomach and induces a signal cascade that leads to the induction of cytokines, the infiltration of immune cells and eventually chronic gastritis. A persisting chronic inflammation intrinsically increases the risk for developing cancer. Hence, H. pylori a class I- carcinogen plays a crucial role in the malignant transformation of the gastric mucosa including all described precancerous steps leading to cancer (atrophy, metaplasia, and dysplasia). The physiology and architecture of the gastric mucosa are probably regulated via signal cascades that are induced by the translocated H. pylori type I effector protein CagA. One aim of this study was to analyze the regulatory mechanisms that are involved in H. pylori-induced carcinogenesis of the stomach. To examine these regulatory mechanisms, we used the Mongolian gerbil animal model.
By applying a time course experiment, we could show for the first time that an early severe inflammation in antral and corpus mucosa later leads to physiological changes (hypochlorhydria, hypergastrinemia). This H. pylori type I-strain induced inflammation and the associated physiological changes are responsible for precancerous transformations of the gastric mucosa.
Several studies indicated that the gastrointestinal hormone gastrin plays an essential role in regulating the normal and malignant development of the gastrointestinal mucosa. Based on the observed hypergastrinemia and induced precancerous conditions in Mongolian gerbils, we analyzed the mechanisms involved in H. pylori type I-strain-induced gastrin expression. In order to explore the regulation of the human gastrin expression by H. pylori, we used an in vitro study applying gastric epithelial cell line (AGS) stably transfected with a human gastrin promoter luciferase reporter construct. We have identified 5-integrin as a host-recognition receptor essential for H. pylori-induced gastrin promoter activation. Further investigations revealed a novel 5-integrin-ILK signaling complex that is responsible for H. pylori- induced gastrin expression. Additionally, we determined the EGF receptor and one of its ligands, TGF-were involved in H. pylori-induced gastrin expression.
An early infiltration of immune cells and the resulting severe inflammation of the gastric mucosa observed in the animal model infected with H. pylori were mainly caused by IL-8, a chemokine secreted by epithelial cells. For this reason, we wanted to examine the H. pylori-induced IL-8 secretion by applying an in vitro approach. The
results of this study demonstrate that a specific C-terminal coiled-coil region of CagL plays a crucial role in H. pylori-adherence to the epithelial cells. However, the most important finding is that isogenic H. pylori mutant-strains missing the specific coiled- coil region are completely unable to induce IL-8 expression.
2. Einleitung
2.1 Entdeckung und Charakterisierung von Helicobacter pylori
Im Jahre 1982 entdeckten B. Marshall und R. Warren bei der Untersuchung von Magenbiopsien aus Gastritispatienten spiralförmige, gramnegative Bakterien (Warren and Marshall, 1983). Bis zu diesem Zeitpunkt nahm man an, dass aufgrund der hohen Säurekonzentration im Magen eine bakterielle Kolonisation der Magenschleimhaut nicht möglich ist. Nach der Kultivierung dieses Bakteriums wurde es in die Gattung Campylobacter eingegliedert und bekam nach seinem Fundort den Namen Campylobacter pyloridis. Mit fortschreitender Erforschung und somit immer neueren Erkenntnissen über diesen Keim wurde er schließlich wegen seiner besonderen Charakteristika umbenannt und einer vollkommen neuen Gattung zugeordnet. Im Jahr 1989 wurde der erste Vertreter dieser neuen Gattung Helicobacter pylori genannt (Goodwin et al., 1989).
H. pylori (Abb.1) ist ein spiralförmiges, gramnegatives Bakterium, das eine Länge von circa zwei bis vier Mikrometer aufweist (Vandamme et al., 1991). Es besitzt zwei bis sieben unipolar angeordnete Flagellen, die ihm die notwendige Motilität für eine erfolgreiche Besiedelung der Magenschleimhaut ermöglichen. H. pylori wird im Labor unter mikroaerophilen Bedingungen (5% O2; 10% CO2; 85% N2) bei 370 C auf Blut oder Serum enthaltenden Vollmedienplatten kultiviert (Goodwin and Armstrong, 1990; Goodwin and Worsley, 1993). Durch eine verlängerte Kultivierung wird die kokkoide Form von H. pylori induziert, die metabolisch noch aktiv, jedoch nicht mehr in vitro kultivierbar ist (Bode et al., 1993; Nilius et al., 1993; Kusters et al., 1997). Die Rolle dieser kokkoiden Form bei der Infektionsübertragung ist jedoch bis heute nicht geklärt (She et al., 2003; Wang et al., 1997).
Abb.1: H. pylori auf der Magenschleimhaut des Menschen
Rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahme 9000x [© eye of science]
2.2 Epidemiologie der H. pylori-Infektion
Mit einer Prävalenz von circa 50% ist die Infektion mit H. pylori die zweithäufigste Infektionskrankheit weltweit. Die Infektion mit H. pylori kommt in allen Bevölkerungen und Gesellschaftschichten vor, variiert jedoch nach geografischer Region, Alter und sozioökonomischem Status (Malaty et al., 1992; Malaty and Graham, 1994; Malaty et al., 2001). Risikofaktoren für eine Ansteckung sind beispielsweise ein niedriger sozioökonomischer Status, schlechte hygienische Verhältnisse sowie das Wohnen auf zu engem Raum (Webb et al., 1994). Diese Kriterien erklären, warum die Infektionsrate in Entwicklungsländern ~ 90%, in Industrieländern aber nur durchschnittlich 20% - 30% beträgt (Dunn et al., 1997). Die Übertragung von H. pylori von Individuum zu Individuum ist bis heute nicht vollständig geklärt. Es wird hauptsächlich von einer oral-oralen oder fäkal-oralen Übertragung vorrangig von der Mutter auf das Kind ausgegangen (Drumm et al., 1990). Diese Annahme ergibt sich durch die Beobachtung, dass in der Regel bei nahen Angehörigen dieselben H.
pylori-Stämme gefunden wurden und die Infektion meist schon im Kindesalter erworben wurde (Bamford et al., 1993; Konno et al., 2005; Granstrom et al., 1997;
Mitchell et al., 1992). Bei der Frage nach dem Hauptreservoir des Keims gehen Forscher davon aus, dass es der menschliche Magen ist, obwohl H. pylori auch im Zahnstein und Stuhl nachgewiesen werden konnte (Desai et al., 1991; Namavar et al., 1995).
2.3 Pathogenitätsfaktoren
2.3.1 Urease
Um den menschlichen Magen kolonisieren zu können, müssen die Bakterien für einige Zeit im sauren Milieu des Magenlumens überleben, bevor sie ihre Nische im epithelnahen, fast neutralen Magenschleim erreichen. Hierfür besitzt H. pylori das Enzym Urease, das aus den Untereinheiten UreA und UreB aufgebaut ist und den im Magen vorkommenden Harnstoff in Kohlendioxid und Ammoniak aufspaltet (Marshall et al., 1990; Stingl et al., 2002). Bei diesem Prozess wird der Harnstoff durch einen pH-abhängigen Harnstoffkanal, der durch das Membranprotein UreI gebildet wird, aufgenommen und im Zytosol durch die Urease gespalten (Weeks et al., 2000).
Dieser Mechanismus dient der Aufrechterhaltung des neutralen pH-Wertes im bakteriellen Zytosol. Der entstandene Ammoniak puffert die einströmenden Protonen der Magensäure ab und gewährleistet somit einen neutralen pH-Wert. Damit wird ein Milieu geschaffen, welches das Membranpotential und die Energiegewinnung aufrechterhält und somit das Überleben des Bakteriums ermöglicht (Rektorschek et al., 1998). Die Regulation des Harnstoffkanals ist gekoppelt an den pH-Wert des Zytosols. Steigt der pH-Wert über ~ 7, wird der Kanal geschlossen und eine Alkalisierung des Zytosols vermieden (Clyne et al., 1995). Um die Pufferung des Periplasmas zu gewährleisten, besitzt H. pylori das Enzym -Karboanhydrase.
Dieses Enzym wandelt das durch die Ureaseaktivität entstehende CO2 zu HCO3-
um (Marcus et al., 2005). Die Urease ist hauptsächlich ein zytoplasmatisches Enzym, das aber auch an der Oberfläche des Bakteriums vorkommt (Phadnis et al., 1996;
Marcus and Scott, 2001). Es wird angenommen, dass die an der Oberfläche lokalisierte Urease eine Ammoniakwolke erzeugt und somit das Bakterium vor der Säure des Magens schützt. In Maus- und Gerbil-Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass eine funktionsfähige Urease für die Kolonisierung des Magens essentiell ist. Konstruiert man H. pylori UreI-Mutanten, in denen der Harnstoffkanal defekt ist, kommt es nur in säuregeblockten Tieren zur Kolonisierung. In unbehandelten Tieren, die einen normalen Magen pH-Wert von ~ 1 haben, kann keine H. pylori-Kolonisierung festgestellt werden (Sachs et al., 2003). Aufgrund dieser Resultate konnte die Urease als wichtiger Kolonisierungsfaktor für die H.
pylori-Besiedelung des Magens charakterisiert werden (Kavermann et al., 2003).
Eine Beteiligung des Enzyms bei Epithelzellschäden durch die Anreicherung des
Zellgiftes Ammoniak (Megraud et al., 1992; Sommi et al., 1996; Suzuki et al., 1992) oder bei der Induktion von Apoptose wird bis heute kontrovers diskutiert (Igarashi et al., 2001).
2.3.2 Flagellen
Um eine lebenslange Persistenz des Keims in einem extremen Habitat wie dem menschlichen Magen zu ermöglichen, ist H. pylori auf seine Begeißelung und die damit verbundene Motilität angewiesen. Durch sie erreicht das Bakterium entlang des pH-Gradienten die schützende Bikarbonat-gepufferte Schleimschicht, welche die Magenepithelzellen vor der aggressiven Säure des Magens schützt (Yoshiyama et al., 1999; Schreiber et al., 2004). Um Verluste durch Peristaltik zu verhindern ist es für den Keim essentiell, mit Hilfe seiner hohen Motilität die Magenepithelzellen zu erreichen und an ihnen zu adhärieren. Für die Beweglichkeit des Bakteriums sind zwei bis sieben unipolar angeordnete Flagellen zuständig, die aus den Flagellinproteinen FlaA und FlaB aufgebaut sind (Leying et al., 1992; Suerbaum et al., 1993). Eine lipidhaltige Flagellenhülle schützt die Geißeln vor dem Abbau durch die Magensäure (Geis et al., 1993). Der Schutz dieser Hülle ist jedoch zeitlich begrenzt und setzt daher eine relativ schnelle Kolonisierung des Bakteriums voraus (Schreiber et al., 2005). Im Tiermodell mit gnotobiotisch gehaltenen Ferkeln konnte gezeigt werden, dass neben der Urease (siehe 2.3.1) auch die Flagellen einen essentiellen Kolonisierungsfaktor darstellen (Eaton et al., 1992).
2.3.3 Adhäsine
Untersuchungen zur Verteilung von H. pylori auf der Magenmukosa zeigten eine vermehrte Lokalisierung des Keims 0 - 25 Mikrometer über dem Epithel.
Überraschend jedoch war die Beobachtung, dass nur ungefähr 30% der Bakterien im Bereich 0 - 5 Mikrometer oberhalb der Mukosa zu finden waren, und nur circa 20%
an den Epithelzellen gebunden vorlagen (Hessey et al., 1990; Schreiber et al., 1999).
Dabei ist die Bindung von H. pylori an das Epithel essentiell, da sie den Verlust des Keims durch Magenperistaltik verhindert. Die Bindung an die Epithelzelle erfolgt meist über eine Gruppe von äußeren Membranproteinen, den Adhäsinen. Die bislang wichtigsten Vertreter dieser Adhäsionsmoleküle sind die Adhäsine BabA, SabA, AlpA und AlpB. BabA (blood group antigen-binding adhesin) bindet fukosylierte Lewisb- Blutgruppenantigene auf der Oberfläche der Epithelzellen (Boren et al., 1993; Ilver et al., 1998; Aspholm-Hurtig et al., 2004). Aufgrund epidemiologischer Studien konnte
gezeigt werden, dass BabA-positive H. pylori-Stämme im Gegensatz zu BabA- negativen Stämmen mit verstärkter mukosaler Entzündung, atrophischer Gastritis und Magenadenokarzinom assoziiert sind (Prinz et al., 2001). SabA (sialic acid- binding adhesin) bindet an sialylierte Glykoproteine, die vorrangig in der entzündeten Magenmukosa und eher selten in der gesunden Magenmukosa vorkommen (Aspholm et al., 2006). AlpA und AlpB sind zwei homologe, 518 Aminosäuren lange
„outer membrane“-Proteine (OMP). Diese wurden ebenfalls der Gruppe der Adhäsine zugeordnet, obwohl ihr Rezeptor an den Epithelzellen noch nicht identifiziert werden konnte (Odenbreit et al., 1999).
2.3.4 VacA
Das 88 kDa große Protein VacA (vacuolating cytotoxin A) ist ein von H. pylori sekretiertes Zytotoxin, das die Ausbildung großer, zytoplasmatischer Vakuolen in Epithelzellen induziert (Abb.2) (Cover et al., 1992). Alle aus menschlichen Biopsien reisolierten H. pylori-Stämme produzieren VacA, obwohl deutliche Variationen in der Sequenz erkennbar sind. Aufgrund dieser Sequenzpolymorphismen ergeben sich verschiedene VacA-Allele, die sich in ihrer Vakuolisierungsaktivität unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit H. pylori-Stämmen, die ein vakuolisierungsaktives VacA-Allel (s1m1 oder s1m2) tragen, mit schwereren Krankheitsverläufen einhergeht (Atherton et al., 1995; van Doorn et al., 1998). VacA wird nach der Sekretion in die kovalent verbundenen Domänen p33 (33 kDa) und p55 (55 kDa) aufgespalten (Telford et al., 1994). Diese beiden Untereinheiten weisen unterschiedliche Funktionen auf. Die p55-Untereinheit vermittelt die Bindung des Toxins an die Wirtszelle (Reyrat et al., 1999). Das kleinere p33-Fragment entfaltet mit Hilfe des N-terminalen Teils von p55 die vakuolisierende Aktivität im Zytoplasma der Wirtszelle (de et al., 1998). VacA bildet als reifes Toxin hexamere Ringe aus, von denen sich jeweils zwei aneinanderlagern und hochmolekulare Dodekamere ausbilden (~1 MDa). Diese Dodekamere zerfallen unter sauren (pH-Wert <4) oder alkalischen (pH-Wert >9) Bedingungen wieder in Monomere und erlangen so eine vielfach erhöhte Toxizität (Cover et al., 1997). Diese Monomere inserieren in die Zytoplasmamembran der Wirtszelle und formen dort Membranporen, die für die Aufnahme des Toxins essentiell sind (Szabo et al., 1999; McClain et al., 2003;
Vinion-Dubiel et al., 1999). Weitere Eigenschaften des VacA-Toxins sind die Induktion der Apoptose (Galmiche et al., 2000; Kuck et al., 2001) sowie die Inhibition
(I) des intrazellulären Vesikeltransports (Montecucco et al., 1996; Satin et al., 1997), (II) der Antigenpräsentation in B-Zellen (Molinari et al., 1998) und (III) der T-Zell- Aktivierung (Boncristiano et al., 2003; Gebert et al., 2003; Sundrud et al., 2004;
Sewald et al., 2008).
Abb.2: Vakuolisierung von HeLa-Zellen durch VacA Zugabe. Färbung mit Neutralrot.
(T.L. Cover and S.R. Blanke et al. 2005)
2.3.5 Die cag-Pathogenitätsinsel (cag-PAI)
H. pylori wird in sogenannte Typ I- oder Typ II-Stämme unterteilt. Der Unterschied zwischen ihnen liegt darin, dass Typ I-Stämme im Gegensatz zu Typ II-Stämmen eine komplett funktionelle cag-PAI sowie ein aktives VacA besitzen (Xiang et al., 1995). Die cag-PAI ist eine 40 kb große Genregion mit circa 29 Genen (Abb. 3). Die Gene der cag-PAI codieren für ein Typ IV-Sekretionssystem (T4SS) sowie dessen Substrat CagA (Abb.4) (Censini et al., 1996).
Abb.3: Schematische Darstellung der cag-PAI von H. pylori P12 (Fischer et al.)
Die offenen Leseraster (orfs) sind als Pfeile dargestellt und wurden entsprechend ihrer Sequenzanordnung in H. pylori P12 mit durchlaufenden Nummern hp520-548 bezeichnet. Die Buchstaben kennzeichnen die bisher bekannten cag-Gene (z.B. X = cagX). Orfs mit Homologien zu den vir-Genen von Agrobacterium tumefaciens wurden oberhalb gekennzeichnet.
CagA wird durch das T4SS in die Wirtszelle injiziert und entfaltet dort vielfältige Funktionen (siehe 2.3.6.2) (Backert et al., 2000; Naumann, 2005; Fischer et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit H. pylori Typ I-Stämmen mit der Entwicklung schwererer Krankheitsverläufe wie chronischer und atrophischer Gastritis, Ulkuserkrankungen sowie Magenadenokarzinom assoziiert ist (Peek, Jr. et al., 1995; Yamaoka et al., 1997; Covacci et al., 1993; Graham and Yamaoka, 1998;
Walker and Crabtree, 1998; Webb et al., 1999; Blaser et al., 1995; Parsonnet et al., 1997).
Abb.4: Hypothetisches Modell des Typ-IV-Sekretionsapparates (Fischer et al.)
Das T4SS ist ein Multiproteinkomplex, der die innere und äußere Membran von H. pylori durchspannt.
An diesem Modell wird nach aktuellem Wissensstand vereinfacht die Lokalisierung der Einzelkomponenten und die Translokation von CagA in die Wirtszelle dargestellt.
2.3.6 CagA
2.3.6.1 CagA-Translokation
Lagert sich ein H. pylori Typ I-Stamm an eine Epithelzelle des Wirts, so kommt es durch das T4SS zur Injektion von CagA (130-170 kDa). Dieser Prozess wird durch
51-Integrine der Wirtszelle und dem CagL-Protein am Pilus des T4SS von H. pylori vermittelt (Kwok et al., 2007). CagL ist auf der cag-PAI codiert (siehe Abb.3). Es enthält ein sogenanntes RGD (Arg-Gly-Asp)-Motiv, das die Bindung an 51-Integrin
Abb.5: Modell zur Veranschaulichung der H. pylori CagA-Translokation (Kwok et al. 2007) (1+2) Ohne Kontakt zur Wirtszelle wird CagL zur Bakterienoberfläche oder spezifisch an die Oberfläche des Pilus transportiert. (3) Während der Infektion bekommt H. pylori Kontakt mit der Wirtszelle und CagL bindet an den Transmembranrezeptor 51-Integrin des Wirts. (4) Durch bisher unbekannte Mechanismen verlängert sich der Pilus aufgrund der Interaktion zwischen CagL und 51- Integrin. (5) Während der Bindung des RGD-Motivs von CagL an den Rezeptor 51-Integrin wird dieser aktiviert. (6) Das aktivierte 51-Integrin löst nun die „downstream“-Signalkaskaden aus, die zu einer Phosphorylierung von FAK und Src führen. Diese Aktivierung induziert unmittelbar danach sogenannte „actin-cytoskeletal rearrangements“, „plasma-membrane dynamics“, die Zusammen- ballung von Integrinen sowie die Aktivierung anderer Rezeptoren. (7) Diese Veränderungen sind bedeutend für die CagA-Injektion in die Wirtszelle. (8) Die aktivierte Src-Kinase phosphoryliert das translozierte CagA an seinen Tyrosinresten. (9) Das phosphorylierte CagA stimuliert nun weitere Signalwege (siehe 2.3.6.2).
der Wirtszelle ermöglicht. Die CagL-51-Integrin-Interaktion stimuliert parallel zur CagA Translokation auch FAK (focal adhesion kinase) und Src (Mitra and Schlaepfer, 2006). Die Tyrosinkinase Src phosphoryliert das translozierte CagA- Protein an seinen spezifischen EPIYA (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala)- Phosphorylierungsmotiven (siehe Abb.5) (Backert et al., 2001; Stein et al., 2002).
Phosphoryliertes sowie auch unphosphoryliertes CagA induziert diverse Wirtssignalkaskaden, die meist mit malignen Transformationen der Wirtszellen einhergehen (siehe 2.3.6.2).
2.3.6.2 CagA als Effektorprotein
Im Laufe der Zeit konnten diverse Effekte von Tyrosin-phosphoryliertem CagA (CagAP-Tyr) auf die Wirtszelle gezeigt werden. Durch die Phosphorylierung von CagA kommt es zu Dephosphorylierungen von Wirtszellproteinen wie Kortaktin, Ezrin und Vinkulin (Selbach et al., 2003; Selbach et al., 2004; Moese et al., 2007). Die Dephosphorylierung dieser Aktin-bindenden Proteine führt zu charakteristischen Zellausläufern, ein Phänotyp, der als „hummingbird“-Phänotyp bezeichnet wurde.
Außerdem kommt es zum Auseinanderweichen der Epithelzellen, dem sogenannten
„cell scattering“ (Segal et al., 1999; Backert et al., 2001; Tsutsumi et al., 2003; Churin et al., 2003; Higashi et al., 2004; Suzuki et al., 2005). Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass CagAP-Tyr in viele Signalkaskaden eingreift, die mit der Induktion von sogenannten „cytoskeletal rearrangements“ verbunden sind.
Neben den eben beschriebenen phosphorylierungsabhängigen Funktionen gibt es auch einige zelluläre Funktionen von CagA, die keine Phosphorylierung des Proteins voraussetzen. So konnten Interaktionen des unphosphorylierten CagA-Proteins mit E-Cadherin (Zelladhäsionsprotein), c-Met (Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor), PLC- (Phospholipase), Par1 (Adaptermolekül) und Grb2 (Adaptermolekül) nachgewiesen werden (Mimuro et al., 2002; Churin et al., 2003; Murata-Kamiya et al., 2007; Saadat et al., 2007; Zeaiter et al., 2008). Diese phosphorylierungsunabhängigen Interaktionen von CagA bewirken eine Störung der
„tight junctions“, der „adherens junctions“ und der Zellpolarität sowie eine Induktion der Entzündung und Zellteilung. Aufgrund epidemiologischer Studien wurde der Zusammenhang zwischen der CagA-Expression und dem Entstehen eines Magenadenokarzinoms dargestellt. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass CagA
mit der Bildung gastrointestinaler Tumore in Mäusen assoziiert ist und somit onkogenes Potential besitzt (Ohnishi et al., 2008).
2.3.6.3 T4SS-abhängige, CagA-unabhängige Effekte
Obwohl CagA bis heute das einzige bekannte vom T4SS translozierte Effektorprotein ist, konnten diverse Antworten des Wirts unabhängig von CagA beobachtet werden.
Dazu zählen proinflammatorische Reaktionen des Wirts, bei denen die Signalmoleküle NF-B, AP-1 sowie die Protoonkogene c-Fos und c-Jun eine Rolle spielen (Sharma et al., 1995; Censini et al., 1996; Sharma et al., 1998; Meyer-ter- Vehn et al., 2000). Eine Aktivierung von Rac1 und Cdc42 (Rho-GTPasen) sowie eine Stimulation der Erk („extracellular-signal regulated kinase“) und des EGF (epidermal growth factor)-Rezeptors wurde außerdem beobachtet (Churin et al., 2001; Keates et al., 2005). Diese Resultate sprechen dafür, dass das T4SS möglicherweise noch andere Faktoren neben CagA in die Wirtszelle translozieren kann beziehungsweise Komponenten des Apparats selbst für das Auslösen von Signaltransduktionskaskaden verantwortlich sind. Ein Schritt in diese Richtung wurde von Viala et al. (2004) beschrieben, indem Peptidoglykan mit Hilfe des T4SS in die Wirtszelle transloziert werden konnte. Dadurch wurde die proinflammatorische Signalkaskade über den intrazellulären Rezeptor Nod1 und NF-B und somit die Ausschüttung von IL-8 induziert (Viala et al., 2004).
2.4 Pathogenese der H. pylori-Infektion
Nach der Kolonisierung der Magenschleimhaut mit H. pylori kommt es zu einer akuten Gastritis, welche durch die Infiltration von Immunzellen in die Magenmukosa gekennzeichnet ist (Genta, 1997; Rossi et al., 2000). Die daraus entstehende chronische Gastritis verläuft jedoch in circa 90% aller Fälle asymptomatisch und kann nur histologisch nachgewiesen werden. Nur in 10% - 20% der Fälle entwickeln sich über einen längeren Zeitraum schwerere gastrointestinale Erkrankungen wie z.B.
chronisch atrophische Gastritis, Magen- oder Duodenalulkus, Magenadenokarzinom oder MALT (mucosa associated lymphoid tissue)-Lymphome (siehe Abb.6) (Atherton, 2006). Das Magenadenokarzinom wird histologisch in zwei Typen eingeteilt: Der intestinale und der diffuse Typ. Die Prävalenz einer H. pylori-Infektion bei Patienten mit einem Karzinom vom intestinalen Typ liegt mit 89% signifikant höher als beim diffusen Typ (32%) (Parsonnet et al., 1991). Ob sich eine Antrum-prädominante
Gastritis oder eine chronische Korpus-dominante atrophische Gastritis mit einem erhöhten Risiko für die Entstehung eines Magenadenokarzinoms entwickelt, wird zusätzlich von Umwelt- und Wirtsfaktoren beeinflusst. Bei Individuen mit intakter Säuresekretion kolonisiert H. pylori vorwiegend die antrale Mukosa, die wenig säureproduzierende Parietalzellen besitzt. Aus dieser Kolonisierung entsteht eine sogenannte Antrum-prädominante Gastritis, mit einer Prädisposition für die Entwicklung von Magen- und Duodenalulkus (Kusters et al., 2006). Dieser Gastritistyp kommt bei circa 15% aller infizierten Individuen vor und ist vermehrt in westlichen Ländern verbreitet.
Ist die Säuresekretion jedoch gestört, kommt es zu einer zunehmenden Besiedelung von H. pylori im Korpus. Diese Kolonisierung der Korpusmukosa führt zu einer Korpus-prädominanten Pangastritis (Kuipers et al., 1995). Die daraus resultierende aktive Entzündung im Korpusgewebe führt zu einer verstärkten Hypochlorhydrie, da das proinflammatorische Zytokin IL-1 einen stark suppressiven Effekt auf die säureproduzierenden Parietalzellen ausübt (El-Omar et al., 1997; Ruiz et al., 1996).
Somit ist die Korpus-dominante atrophische Gastritis ein Hauptrisikofaktor für die Entwicklung eines Magenadenokarzinoms. Die Prävalenz mit der eine H. pylori- infizierte Person aus einer atrophischen Gastritis ein Magenadenokarzinom entwickelt, liegt bei circa einem Prozent.
Abb.6: Pathogenese der H. pylori-Infektion (nach Telford et al. 1997) Erläuterungen zum Schema siehe Text 2.4.
Die Variabilität in den Krankheitsbildern lässt sich damit erklären, dass es unterschiedlich pathogene H. pylori-Stämme gibt (siehe 2.3.5) sowie die Immunantwort des Wirts von Individuum zu Individuum unterschiedlich ausfällt (Shimoyama et al., 1998). Bedeutende Faktoren, die auf die Karzinogenese der Magenmukosa beschleunigend wirken, sind exogene Einflüsse wie beispielsweise salzreiche Lebensmittel (Nitritpökelsalz), die Einnahme entzündungshemmender Schmerzmittel (hauptsächlich Acetylsalicylsäurederivate), Alkohol, Koffein und Nikotin sowie endogene Faktoren wie psychogener Stress, verminderte gastrale Durchblutung und Vitamin C-Mangel (Harrisons Innere Medizin 1995). Des Weiteren spielen bei der malignen Entwicklung der Magenmukosa genetische Wirtsdeterminanten wie z.B. Polymorphismen im IL-1- oder TNF--Gen eine entscheidende Rolle (Garza-Gonzalez et al., 2005; El-Omar et al., 2000).
Epidemiologische Studien zeigen die Assoziation zwischen der Kolonisierung mit H.
pylori und der Entstehung von Magen- und Duodenalulkus (Ernst and Gold, 2000;
Suerbaum and Michetti, 2002) sowie der Entwicklung eines Magenadenokarzinoms auf. Deshalb wurde H. pylori 1994 von der WHO (World Health Organisation) als Typ I-Karzinogen eingestuft (Logan, 1994).
2.5 Diagnose und Therapie
2.5.1 Diagnose
Bei der H. pylori-Diagnose verwendet man sogenannte invasive und nicht-invasive Methoden.
Invasive Methoden:
Bei einer Magenspiegelung werden Biopsien entnommen, die anschließend durch verschiedene mikrobiologische, biochemische und histologische Nachweismethoden analysiert werden. Der H. pylori-Nachweis kann durch Kultivierung des Bakteriums auf komplexen Medien, Urease-Schnelltest, histologische Färbungen oder PCR erfolgen (Makristathis et al., 2004; Malfertheiner, 1994). Bei einem Urease- Schnelltest wird ein Indikatormedium verwendet, das eine Alkalisierung aufgrund der Ureaseaktivität durch einen Farbumschlag anzeigt. Ein großer Vorteil in der Kultivierung der Bakterien liegt darin, dass man sie anschließend einer Antibiotikaresistenzprüfung unterziehen kann, deren Ergebnis eine optimale Eradikation erleichtert.
Nicht-invasive Methoden:
Die am häufigsten verwendete nicht-invasive Nachweismethode ist der sogenannte
13C-Harnstoff-Atemtest. Bei diesem Test wird dem Probanden gelöster 13C-Harnstoff verabreicht und das durch die Urease entstandene 13CO2 mittels massen- spektroskopischer Analyse in der Atemluft nachgewiesen (Pathak et al., 2004).
Weitere nicht-invasive Methoden zum Nachweis von H. pylori sind serologische Untersuchungen aus Blut, Speichel und Urin sowie der Stuhl-Antigen-Test, der spezifische H. pylori-Antigene mittels ELISA detektiert (Asfeldt et al., 2004; Kato et al., 2004).
2.5.2 Therapie
Aus ökonomischen Gründen werden Patienten mit einer asymptomatischen Gastritis nicht therapiert. Nach den Richtlinien des Maastricht Konsensus der EHSG sollen Personen mit H. pylori-assoziierter symptomatischer Gastritis, Ulkuserkrankungen, MALT-Lymphomen sowie nach der Operation eines Magenadenokarzinoms eradiziert werden (Malfertheiner, 2003; Malfertheiner et al., 2002). Derzeit ist die Tripel-Therapie als Standardtherapie vorgeschlagen. Bei dieser Therapie wird eine Kombination aus zwei Antibiotika (Clarithromycin mit Amoxycillin oder Metronidazol) und einem Protonenpumpeninhibitor (PPI) verabreicht (Lind et al., 1999). Da die Zahl der antibiotikaresistenten H. pylori-Stämme immer weiter ansteigt, wird alternativ eine Quadrupeltherapie angeboten, welche sich aus einem PPI, Metronidazol, Tetrazyklin und Wismuthsalz zusammensetzt.
2.6 Problemstellung
Teilarbeit A:
Eine über Jahre hinweg andauernde chronische Entzündung stellt ein erhöhtes Risiko für die Krebsentstehung dar. H. pylori als Typ I-Karzinogen könnte somit eine bedeutende Rolle bei der Umwandlung der Magenmukosa, entlang der präkanzerösen Stufen (Atrophie, Metaplasie und Dysplasie) bis hin zum Magenadenokarzinom, zugeschrieben werden. Mit Hilfe des etablierten Tiermodells, der Mongolischen Gerbils (Wüstenrennmäuse, Meriones unguiculatus), sollen schrittweise die pathologischen Veränderungen der Magenmukosa unter einer chronischen H. pylori-Infektion beleuchtet werden. Es sollen hauptsächlich die Faktoren der Prädisposition für die Entwicklung des Magenadenokarzinoms vom intestinalen Typ untersucht werden. Dabei soll die Frage geklärt werden, was tritt zuerst auf, die Hypochlorhydrie oder die Hypergastrinämie, und was ist die Ursache und was die Folge der damit assoziierten Hyperproliferation, Atrophie und Metaplasie der Korpusmukosa. Ein spezieller Teilaspekt dieses Abschnitts der Arbeit liegt in der Quantifizierung („real-time“ RT-PCR) diverser Mediatoren und Entzündungsfaktoren auf mRNA-Ebene. Da das Genom des Mongolischen Gerbils nicht sequenziert ist, müssen die zu untersuchenden Gene mit Hilfe der sogenannten „cross-species“- Amplifikation isoliert und anschließend sequenziert werden.
Teilarbeit B:
Das Peptidhormon Gastrin, das hauptsächlich die Säureregulation im Magen steuert, beeinflusst zusätzlich diverse wichtige zelluläre Prozesse, die vermutlich eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese im Magen besitzen. Zu den zellulären, durch Gastrin regulierten Prozessen zählen beispielsweise die Regulation der Proliferation, Apoptose, Zellinvasion, Zellmigration und Angiogenese. Die Daten von Rieder et al.
2005 zeigen, dass es bei einer Infektion mit H. pylori nach 32 Wochen zu einer Hypergastrinämie im Gerbilmodell kommt. Deshalb sollen mit Hilfe von in vitro Experimenten die durch H. pylori ausgelösten Signaltransduktionskaskaden untersucht werden, welche für die Induktion des Gastrinpromotors verantwortlich sind. Hierfür soll eine humane Magenadenokarzinomzelllinie (AGS), die stabil mit einem Gastrin-Luziferase-Reporterkonstrukt (AMO) transfiziert ist, verwendet werden. Das Hauptaugenmerk bei diesem Teilabschnitt liegt auf der Identifizierung
des bislang unbekannten H. pylori-Rezeptors der Wirtszelle, der für die Gastrinpromotorinduktion notwendig ist.
Teilarbeit C:
Im dritten Teilprojekt dieser Arbeit sollen die am Tiermodell beobachteten H. pylori- induzierten Regulationsmechanismen, im Besonderen die durch Wildtyp-Stämme hervorgerufene erhöhte KC-(IL-8-Homolog)-Expression, in vitro an einer humanen Magenadenokarzinomzelllinie (AGS) untersucht werden. Bei diesen Experimenten soll der Fokus auf der Identifizierung des bakteriellen Liganden liegen, der die Ausschüttung von IL-8 induziert.
3. Synopsis
3.1 Mongolische Gerbils als Tiermodell für die H. pylori-induzierte Karzinogenese im Magen
Originalarbeit:
Wiedemann T., et al. (2009) Helicobacter pylori cag-pathogenicity island-dependent early immunological response triggers later precancerous gastric changes in Mongolian gerbils. PLoS One 4: e4754.
In den letzten Jahren fanden zahlreiche Tiermodelle Einsatz, um die Pathogenese des Magenadenokarzinoms im Zusammenhang mit der chronischen H. pylori- assoziierten Gastritis zu beleuchten. Die am häufigsten dazu verwendeten Nagetiere, die Mäuse, bieten den Vorteil der genetischen Manipulierbarkeit, doch verläuft die H.
pylori-Infektion nicht dem humanen Entzündungsprozess entsprechend, da die cag- PAI in Mäusen nicht stabil ist und somit H. pylori-Typ I-Stämme für Infektions- versuche nicht verwendet werden können (Philpott et al., 2002). Aus diesem Grund wurde das bereits etablierte Tiermodell des Mongolischen Gerbils eingesetzt (Rieder et al., 2005). In dieser Teilarbeit soll die H. pylori-Infektion über einen Zeitverlauf von 2, 4, 8, 16 und 64 Wochen analysiert werden, um die Reihenfolge der nach 32 Wochen beschriebenen veränderten Parameter in einen größeren Kontext setzen zu können. Es sollen schrittweise die pathophysiologischen Veränderungen der Magenmukosa unter einer chronischen H. pylori-Infektion beleuchtet werden. Für diese Untersuchung wurden neben einer nicht infizierten Gerbil-Kontrollgruppe eine weitere Gruppe mit dem Gerbil-adaptierten Typ I-Wildtypstamm B128 (Wt) und eine dritte Gruppe mit einer entsprechenden isogenen cagY-Mutante oral infiziert. Die
cagY-Mutante besitzt ein defektes T4SS, wodurch die Translokation des Effektorproteins CagA in die Wirtszelle nicht mehr möglich ist. Dadurch wurde der Effekt der cag-PAI auf die zeitliche Veränderung der Magenmukosa betrachtet.
3.1.1 cag-PAI-abhängige Kolonisierungsdichte
Durch Kultivierung von Gewebehomogenisaten wurden die H. pylori B128 und H.
pylori B128cagY Kolonisierungsdichten (Cfu) für die jeweiligen Zeitpunkte bestimmt.
Nach zwei Wochen Infektion konnte sowohl für die Wt-infizierte als auch für die
cagY-infizierte Gruppe eine vergleichbare Kolonisierungsdichte zwischen den
jeweiligen Antrum- (105 Cfu/g Magen) und Korpusproben (103 Cfu/g Magen) ermittelt werden. Bei der Analyse der späteren Zeitpunkte konnten zwei cag-PAI-abhängige Vorgänge beobachtet werden. Zum einen sank die Kolonisierungsdichte in der antralen Mukosa der B128-infizierten Gerbils nach 32 Wochen signifikant, wohingegen die Kolonisierungsdichte dieser Tiere in der Korpusmukosa kontinuierlich von vier bis 32 Wochen anstieg (Fig. 1). In B128cagY-infizierten Tieren konnten keine Schwankungen in der Kolonisierungsdichte festgestellt werden.
3.1.2. cag-PAI-abhängige pathohistologische Veränderungen
Durch histologische Untersuchungen von Gewebeschnitten aus Tieren, die mit dem Wt-Stamm oder der Mutante infiziert waren, konnten weitere cag-PAI-abhängige Prozesse nachgewiesen werden. Nur Tiere, die mit dem Wt-Stamm infiziert worden waren, wiesen eine frühe, hochgradig aktive und chronische Gastritis in der antralen Mukosa acht Wochen nach Infektion auf. In der Korpusmukosa zeigten diese Tiere eine über das gesamte Zeitverlaufsexperiment ansteigende aktive und chronische Gastritis, was in Tieren, die mit der Mutante infiziert worden waren, nicht der Fall war (Fig. 2A-C). Ein weiterer für die Pathogenese wichtiger Punkt lag in der cag-PAI- abhängigen kompletten Parietalzellatrophie der Korpusmukosa acht Wochen nach Infektion (Fig. 4B,C+Tab.1). Betrachtet man die Gesamtarchitektur der Magenmukosa von Wt-infizierten im Vergleich zu B128cagY-infizierten Tieren, so fällt das Hauptaugenmerk auf die in der Korpusmukosa von Wt-infizierten Tieren stattfindende starke Dedifferenzierung des Gewebes in Richtung des intestinalen Typs. Diese Veränderungen konnten im Gewebe von B128cagY-infizierten Tieren nicht beobachtet werden (Fig. 3A+Tab. 1). Somit konnte die sogenannte „Correa- Kaskade“ (chronische Gastritis chronisch-atrophische Gastritis intestinale Metaplasie Dysplasie), welche für die Entstehung eines Karzinoms des intestinalen-Typs beschrieben wurde, nur bei Wt-infizierten Tieren beobachtet werden. Bei diesen Tieren konnten ab einer Infektionsdauer von 16 Wochen fokale Dysplasien nachgewiesen werden. Bei der Analyse der Schleimproduktion durch eine spezielle PAS-Alcian-Blau-Färbung konnten cag-PAI-abhängige Veränderungen der Verteilung von saurem und neutralem Magenschleim beobachtet werden (Fig.
3B). Diese sogenannte Schleimdrüsenmetaplasie konnte nur bei Wt-infizierten Tieren ab acht Wochen nachgewiesen werden.
3.1.3 cag-PAI-abhängige immunologische Veränderungen
In diesem Abschnitt sollte die histologisch beobachtete, starke Infiltration von Entzündungszellen in die Lamina propria der Wt-infizierten Tiere untersucht werden.
Hierfür wurde das Expressionsmuster der wichtigsten anti- und proinflammatorischen Zytokine mittels „real-time“ RT-PCR untersucht (IL-1, IFN-, TNF-, IL-6, KC, IL-10).
Für die Detektion der Zytokine mussten spezifische Sonden und Primer entworfen werden. Da im Gegensatz zur Maus (Mus musculus) und zur Ratte (Rattus norvegicus) die Nukleotidsequenz vom Gerbil nicht über Genbanken zur Verfügung stand, mussten die zu analysierenden Gene zuerst mit Hilfe einer „cross-species“- Amplifikation isoliert und dann sequenziert werden. Die so erworbenen Oligonukleotid- und Sondensequenzen der anti- und proinflammatorischen Zytokine wurden in der RT-PCR eingesetzt. Zur Normalisierung der gemessenen Mediatoren wurde das 18S rRNA Gen verwendet.
Die Analyse ergab einen sprunghaften Anstieg der proinflammatorischen Zytokine in Wt-infizierten Tieren in der Antrum- und Korpusmukosa im Infektionszeitraum zwischen vier und acht Wochen. Im Gegensatz dazu konnte bei den B128cagY- infizierten Tieren nur ein geringer, auf die antrale Mukosa begrenzter kontinuierlicher Anstieg der proinflammatorischen Zytokine nachgewiesen werden (Fig. 5A-E). Da sowohl TNF- als auch IL-1 starke Inhibitoren der Säuresekretion in der Korpusmukosa sind (Beales and Calam, 1998), stellen sie weitere cag-PAI- abhängige Faktoren dar, die am malignen Verlauf der H. pylori Typ I-Infektion eine essentielle Rolle spielen. Bei der Bestimmung der Expression des anti- inflammatorischen Zytokins IL-10 konnte ein gradueller Anstieg in der Antrum- wie auch in der Korpusmukosa von Wt- und B128cagY-infizierten Tieren über den gesamten Zeitverlauf gemessen werden. Interessanterweise zeigten jedoch nur Tiere, welche mit der Mutante infiziert worden waren, einen signifikanten Anstieg der IL-10 Expression in der Antrum- und Korpusmukosa nach acht Wochen Infektion. Im Gegensatz dazu zeigten Wt-infizierte Tiere nur in der Korpusmukosa einen signifikanten IL-10-Anstieg nach diesem Zeitraum (Fig. 5F). Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass IL-10 ein entscheidender Regulator bei der H. pylori-vermittelten chronischen Entzündung der Magenmukosa darstellt.
3.1.4 cag-PAI-abhängige physiologische Veränderungen
Im Weiteren sollte der Effekt der H. pylori-Infektion auf die physiologischen Parameter pH-Wert und Gastrinausschüttung analysiert werden. Die Messungen ergaben einen signifikant erhöhten pH-Wert (Hypochlorhydrie) nach 16 Wochen und eine ebenso signifikant erhöhte Gastrinkonzentration (Hypergastrinämie) nach 32 Wochen in Wt-infizierten Tieren (Fig. 6A,B). B128cagY-infizierte Tiere zeigten ähnliche pH- und Gastrinwerte wie die nicht-infizierte Kontrollgruppe. Aufgrund dieser Resultate konnte gezeigt werden, dass in H. pylori Typ I-infizierten Gerbils eine frühe Entzündung der Korpusmukosa, einhergehend mit einer fortschreitenden Parietalzellatrophie, der Grund für spätere physiologische Veränderungen ist. Diese scheinen für die präkanzerösen Transformationen der Magenmukosa verantwortlich zu sein.
3.2 H. pylori-induzierte Gastrinexpression
Originalarbeit:
Wiedemann T., et al. (2009) „A novel integrin-5-ILK signaling complex is jointly responsible for Helicobacter pylori-induced precancerous conditions”
(Cellular Microbiology, submitted)
In den letzten zwei Jahrzehnten ließen mehrere Studien vermuten, dass dem gastrointestinalen Hormon Gastrin eine bedeutende Schlüsselrolle in der Regulierung der normalen, aber auch malignen Entwicklung der gastrointestinalen Mukosa zukommt (Dockray et al., 2001; Pritchard and Przemeck, 2004; Rozengurt and Walsh, 2001; Cui et al., 2006; Przemeck et al., 2008). Wie im Tiermodellexperiment (siehe 3.1) gezeigt werden konnte, verursacht die H. pylori- Infektion nur unter Verwendung des Wt-Stammes (B128) eine Hypochlorhydrie und eine Hypergastrinämie, die auf eine direkte oder indirekte Regulierung der Gastrinexpression durch ein intaktes T4SS schließen lässt. Um dieses näher zu untersuchen, verwendeten wir in dieser Teilarbeit eine humane Magenkarzinom- Zelllinie (AGS), welche stabil mit einem Gastrin-Luziferase-Reporterkonstrukt (AMO) transfiziert war. Als Kontrolle diente eine entsprechende Gastrinpromotormutante (AM4). Mit Hilfe dieser Zellen sollte der Effekt der cag-PAI von H. pylori Typ I- Stämmen auf den Gastrinpromotor analysiert werden. Vorversuche mit diesem in vitro Modell ergaben eine signifikante Erhöhung der Luziferaseaktivität durch die
Stimulierung mit H. pylori Typ I-Stämmen. Andere Pathogene des Gastrointestinaltraktes wie beispielsweise Escherichia coli und Campylobacter jejuni sowie H. pylori Typ II-Stämme waren nicht in der Lage den Gastrinpromotor zu induzieren (Rieder et al., 2005).
3.2.1 Bakterielle Voraussetzungen für die Gastrinexpression
In diesem Teilabschnitt sollten die Voraussetzungen eines H. pylori-Stammes für die Induzierung des Gastrinpromotors identifiziert werden. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der genetischen Ausstattung des Bakteriums sowie seiner Oberflächenproteine, die potentielle Bindungsstellen für die Wirtszelle darstellen könnten. Die erhaltenen Daten bestätigten unsere bisherigen Beobachtungen, dass im Gegensatz zu H. pylori Typ II-Stämmen nur H. pylori Typ I-Stämme mit einem funktionellen T4SS in der Lage sind die Gastrinexpression zu stimulieren (Rieder et al., 2005). Des Weiteren wurde bestätigt, dass es sich bei der Induktion des Gastrinpromotors um ein H. pylori-spezifisches Phänomen handelt, da andere Pathogene des Gastrointestinaltraktes wie Escherichia coli und Campylobacter jejuni keine Stimulierung des Gastrinpromotors hervorrufen konnten (Fig. 1).
Bei der Untersuchung der Hauptvirulenzfaktoren VacA und CagA zeigte das Onkogen CagA nach seiner Überexpression keinen Effekt auf den Gastrinpromotor (Fig. 2A,B). Auch die Stimulierung der Zellen mit säureaktiviertem VacA ergab keine Induktion des Promotors (Fig. 2C). Eine wichtige Rolle bei der Besiedelung der Magenschleimhaut spielten die Adhäsine, eine Gruppe von äußeren Membranproteinen, die durch ihre Bindung an die Wirtszelle eine dauerhafte Infektion mit H. pylori ermöglichen (Linden et al., 2002; Mahdavi et al., 2002;
Odenbreit et al., 1999). Die Resultate der Untersuchung zeigten, dass die getesteten Adhäsine keinen Effekt auf die Gastrinpromotorinduktion haben (Fig. 3B), jedoch der direkte Kontakt eines intakten H. pylori-Stammes mit der Wirtszelle essentiell für die Promotorinduktion ist (Fig. 3A,C).
3.2.2 Essentielle Strukturen, Mechanismen und Signalwege in der Wirtszelle In der 2007 erschienenen Studie von Kwock et al. konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass H. pylori 51-Integrine als Wirtsrezeptor verwendet, um CagA mit Hilfe des T4SS in die Epithelzelle zu translozieren (Kwok et al., 2007). Aufgrund der neuen Erkenntnis, dass die Proteinfamilie der Integrine als potentielle Wirtsrezeptoren bei der H. pylori-Erkennung in Betracht kommt, wurden diverse Integrine in Hinblick auf
die Gastrinexpression getestet. Hierfür wurde unter Verwendung von spezifischen anti--Integrin-Blockierungsantikörpern eine Beteiligung des vorher beschriebenen
51-Integrins bei der H. pylori-induzierten Gastrinpromotorstimulierung ausgeschlossen (Fig. 4A,B). Im Gegensatz dazu konnte eine signifikante Reduktion der H. pylori-induzierten Promotoraktivität nach Präinkubation mit einem anti-5- Integrin-Blockierungsantikörper gezeigt werden (Fig. 4B). Mit dieser Studie gelang es uns erstmalig einen weiteren von H. pylori genutzten Integrinrezeptor auf der Wirtszelle zu beschreiben.
Nach Entdeckung des 5-Integrins als wichtigen Rezeptor für die H. pylori- Pathogenese stellte sich die Frage, über welche inneren Zellstrukturen die Signale weitergeleitet werden. Die bis dato im Zusammenhang mit -Integrin beschriebenen sogenannten „fokal adhesion“-Strukturen (FA), ILK (integrin-linked-kinase) und FAK (focal-adhesion-kinase) (Harburger and Calderwood, 2009) wurden mittels siRNA ausgeschaltet und die Gastrinpromotoraktivität bestimmt. Die Messungen ergaben, dass H. pylori einen neuartigen 5-Integrin-ILK-Signalkomplex an der Zelloberfläche des Wirts benutzt, um die Signaltransduktions-kaskade für die Aktivierung der Gastrinexpression auszulösen (Fig. 6). Im weiteren Verlauf der Studie konnte durch die Verwendung von spezifischen Inhibitoren gegen die Src-, Abl-, PKC-, Raf-, Erk-, p38-, JAK- und EGF-R-Kinasen deren Involvierung bei der H. pylori-induzierten Gastrinexpression bewiesen werden (Fig. 5B+7A).
Aus den gewonnenen Daten dieser Teilarbeit konnte zusammenfassend ein hypothetischer Signaltransduktionsweg für die Aktivierung des Gastrinpromotors herausgearbeitet werden (Fig. 8). Hierbei bindet H. pylori über den 5-Integrin- Rezeptor an die Wirtszelle und aktiviert ILK. Mit Hilfe der Kinasen PKC, Src und Abl kommt es zu einer aktivierenden Kopplung von ILK mit ADAM 10/17 (a disintegrin and metalloprotease). Aktivierte ADAM 10/17 schnüren den in der Membran sitzenden inaktiven EGF-R-Liganden, TGF (transforming growth factor)-, ab. Freies aktives TGF- bindet anschließend an seinen Rezeptor EGF-R und induziert die Gastrinexpression über den Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweg.
Unter Verwendung von EGF und anti- EGF-Antikörpern konnte gezeigt werden, dass EGF einen synergistischen Effekt auf die H. pylori-induzierte Gastrinexpression hat, anscheinend aber nicht den oben beschriebenen Weg einschlägt (Fig. 5A,B).
3.3 H. pylori CagL-induzierte IL-8-Expression
Originalpaper:
Wiedemann T., et al. (2009) „A C-terminal coiled-coil region of CagL is responsible for Helicobacter pylori-induced IL-8-expression“
(Molecular Microbiology, submitted)
Das Pathogen Helicobacter pylori adhäriert an die Magenepithelzellen, wodurch Signaltransduktionskaskaden gestartet werden, die in der Induktion von Zytokinen, der Infiltration von immunreaktiven Zellen in die Lamina propria und letztendlich in einer chronischen Gastritis resultieren. Hierfür ist das T4SS von entscheidender Bedeutung. Wie auch im Tiermodell beobachtet (siehe 3.1.3), löst die Adhärenz des Bakteriums eine starke proinflammatorische Immunantwort in der Mukosa aus. Diese führt durch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-B und über die Phosphorylierung der MKK4/JNK-Kinasen zur Sezernierung des Chemokins IL-8 (Foryst-Ludwig and Naumann, 2000; Keates et al., 1997; Chu et al., 2003). Die Sekretion von IL-8 durch die H. pylori-stimulierten Epithelzellen führt überwiegend zu einem erweiterten Einstrom von Neutrophilen und Lymphozyten in das betroffene Gewebe und spielt somit eine wichtige Rolle bei der H. pylori-vermittelten Immunopathogenese. Für die in vitro Untersuchung der H. pylori-induzierten IL-8- Expression wurde eine humane Magenkarzinom-Zelllinie (AGS) verwendet. Die Bestimmung der IL-8-Konzentration im Zellüberstand wurde mittels IL-8-ELISA durchgeführt. Um die H. pylori-induzierte IL-8-Promotoraktivität analysieren zu können, wurden die Zellen transient mit einem humanen IL-8-Promotor-Luziferase- Reporterkonstrukt transfiziert und anschließend stimuliert.
Die Analyse der H. pylori-induzierten Signaltransduktionskaskaden der Gastrin- und IL-8-Expression sollte die Rolle dieser Faktoren bei der Entstehung präkanzeröser Transformationen der Magenmukosa beleuchten. Da in einer früheren Studie das Stimulierungsverhalten des Gastrinpromoters mit H. pylori Typ I-Stämmen sowie den isogenen cag-Mutanten exakt dem Stimulierungsmuster der IL-8-Sekretion der AGS- Zellen entsprach (Rieder et al., 2005), sollte in diesem Teilprojekt die Signaltransduktionskaskade der H. pylori-Infektion auf die IL-8-Expression näher analysiert werden.
Mit Hilfe von speziellen Filtereinsätzen konnte bestätigt werden, dass der direkte Kontakt von H. pylori Typ I-Stämmen an die Magenepithelzellen notwendig ist, um
die IL-8-Expression zu stimulieren (Fig. 1A-D) (Rieder et al., 1997). Im weiteren Verlauf der Studie konnte durch Verwendung von diversen H. pylori- Adhäsinmutanten die Beteiligung der Hauptadhäsine BabA, SabA und AlpAB an der H. pylori-induzierten IL-8-Sekretion ausgeschlossen werden (Fig. 1E).
Interessanterweise konnte bei der systematischen Untersuchung aller cag-Mutanten eine vollständige Blockierung der IL-8-Expression durch eine CagL-Mutante beobachtet werden (Fig. 1A,B).
Das Protein CagL ist an der Spitze des T4SS lokalisiert und wurde erstmals durch Kwok et al. als essentiell für die CagA-Translokation beschrieben (Kwok et al., 2007).
Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde die 3D-Struktur von CagL mit Hilfe von speziellen Proteinstruktur-Vorhersage-Programmen analysiert. Dabei wurde eine C- terminale „coiled-coil“ Region identifiziert, die eine potentielle Interaktion zwischen Bakterium und Wirtszelle darstellen könnte (Strauss and Keller, 2008; Gazi et al., 2009). Messungen der IL-8-Expression nach Stimulierung mit speziell konstruierten
cagL-Mutanten (B128cagL(1-206) bzw. B128cagL(1-224)) ergaben, dass die C- terminale „coiled-coil“-Region essentiell für die H. pylori Typ I-induzierte IL-8- Expression ist (Fig. 2E,F). Durch Immunfloureszenzaufnahmen konnte im weiteren Verlauf der Arbeit gezeigt werden, dass die C-terminale „coiled-coil“-Region des CagL-Proteins eine wichtige Rolle bei der Adhärenz des Bakteriums an seine Wirtszellen spielt (Fig. 3). Bei der Inkubation von AGS-Zellen mit B128cagL(1-206) bzw. B128cagL(1-224) zeigte sich im Vergleich zum Wt-Stamm eine Reduktion der Adhärenz von circa 50%. Somit konnte ein neuer Wirtszellligand von H. pylori identifiziert werden, der sowohl bei der Induktion des proinflammatorischen Chemokins IL-8 als auch bei der Adhärenz des Keims an seine Wirtszelle eine bedeutende Rolle spielt.
Bei der Untersuchung der IL-8-Signalkaskaden innerhalb der Wirtszelle konnte wie schon bei der Gastrinpromotorinduktion (siehe 3.2.2) eine Beteiligung des EGF-R- Liganden TGF- sowie dessen Rezeptor EGF-R nachgewiesen werden. Sowohl durch die Präinkubation der Zellen mit einem spezifischen anti-TGF--Antikörper als auch durch den Einsatz des EGF-R-Inhibitor Gefitinib konnte die H. pylori-induzierte IL-8-Sekretion signifikant blockiert werden (Fig. 4B).
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