Rückstände in Eiern nach Anwendung von Enrofloxacin bei Legehennen in Boden- und Käfighaltung

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Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Rückstände in Eiern nach Anwendung von Enrofloxacin bei Legehennen in Boden- und Käfighaltung

INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

( Dr. med. vet. )

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Wolfram Jürgens

aus Hannover

Hannover 2006

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Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. M. Kühne

1. Gutachter: PD Dr. M. Kühne 2. Gutachter: Prof. Dr. U. Neumann

Tag der mündlichen Prüfung: 30.5.2006

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Für Paula

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Inhaltsverzeichnis:

1. Einleitung 1

2. Wissenschaftliches Schrifttum 3

2.1 Therapeutischer Einsatz von Fluorchinolonen 3

2.1.1 Chemie und Pharmakodynamik von Fluorchinolonen 3 2.1.2 Wirkungsspektrum und Resistenzsituation von Enrofloxacin 4 2.1.3 Pharmakokinetik und Ausscheidung von Enrofloxacin 5 2.1.4 Einsatz von Fluorchinolonen in der Veterinärmedizin 5

2.1.4.1 Einsatz bei Geflügel 6

2.2 Begriffsbestimmung von NOEL, ADI und MRL 7

2.3 Gesetzliche Grundlagen für die Anwendung von Fluorchinolonen bei

lebensmittelliefernden Tieren 9

2.3.1 Nationales Recht 9

2.3.1.1 Arzneimittelgesetz 9

2.3.1.2 Tierärztliche Hausapothekenverordnung 10 2.3.1.3 Lebens- und Futtermittelgesetzbuch 11

2.3.1.4 Nationaler Rückstandskontrollplan 12

2.3.2 Supranationales Recht 13

2.3.2.1 Welthandelsorganisation 13

2.3.2.2 Europäisches Gemeinschaftsrecht 15

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2.4 Fluorchinolonrückstände in Hühnereiern 19

2.4.1 Eibildung 19

2.4.2 Zeitliche Einordnung der Entstehung von Fluorchinolon-

rückständen in Hühnereiern 20

2.4.3 Verteilung von Fluorchinolonrückständen zwischen

Eidotter und Eiklar 21

2.5 Rückstandsproblematik von Fluorchinolonen in Lebensmitteln 22 2.5.1 Unerwünschte Wirkungen von Fluorchinolonen 22 2.5.2 Antimikrobielle Wirkung auf die menschliche Darmflora 23 2.5.3 Resistenzentwicklung geflügelrelevanter pathogener

Mikroorganismen gegenüber Fluorchinolonen

in Human- und Veterinärmedizin 24

2.5.4 Risikobewertung von Enrofloxacinrückständen 26

2.6 Vorliegende Studien und Verfahren 29

2.6.1 Analyseverfahren zum Nachweis von Enro- und

Ciprofloxacinrückständen in Hühnereiern 29 2.6.1.1 High Performance Liquid Chromatography 30

2.6.1.2 Agardiffusionstest 31

2.6.1.3 Alternative Rückstandsnachweisverfahren zu

Fluorchinolonen 32

2.6.2 Vorliegende Rückstandsstudien zu Enro- und Ciprofloxacin 34

2.7 Zusammenfassende Betrachtung des wissenschaftlichen Schrifttums 36

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3. Eigene Untersuchungen 37

3.1 Tiermaterial und Versuchsanordnung 37

3.1.1 Versuchsansatz 1 37

3.2 Eingesetzte Arzneimittel und Versuchsdurchführung 38

3.2.4 Eingesetzte Proben 40

3.3 Laboruntersuchungen 41

3.3.1 Material 41

3.3.1.1 Reinsubstanzen 41

3.3.1.2 Nährmedien 42

3.3.1.3 Testkeime 43

3.3.1.4 Festphasensäule 43

3.3.1.5 Chemikalien 44

3.3.2 Geräte 44

3.4 Methoden 46

3.4.1 Festphasenextraktion 46 3.4.1.1 Probenvorbereitung 47

3.4.1.2 Festphasenextraktion mittels SA-Säule 47

3.4.1.3 Einengung der Eluate 47

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3.4.2 High Performance Liquid Chromatography 48

3.4.2.1 Eichung der HPLC-Anlage 48

3.4.2.2 Wiederfindungsversuche 48

3.4.2.3 Durchführung der HPLC 48

3.4.2.4 Mathematische Weiterverarbeitung der Messwerte 49

3.4.3 Testkeimgewinnung 50 3.4.3.1 Herstellung der Sporensuspension 50

3.4.3.2 Anzucht von Escherichia coli 51

3.4.4 Agardiffusionstest 52

3.4.4.1 Herstellung der Testplatten 52

3.4.4.2 Erstellung von Verdünnungsreihen 53

3.4.4.3 Probenvorbereitung 54

3.4.4.4 Auswertung der Hemmhöfe 54

3.4.5 Statistische Auswertung 54

4. Ergebnisse 55

4.1 Versuchsansatz 1 55

4.1.1 Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und

Ciprofloxacinrückstände 55

4.1.2 Prozentualer Anteil von Ciprofloxacin an der mittels HPLC

festgestellten Summe von Enrofloxacin und Ciprofloxacin 57 4.1.3 Eichkurve zur Auswertung der Ergebnisse des

Agardiffusionstests 59

4.1.4 Vergleich der Ergebnisse von HPLC und Agardiffusionstest 60 4.1.5 Korrelation der mittels HPLC und Agardiffusionstest ermittelten

Rückstände 63

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4.2 Versuchsansatz 2 65 4.2.1 Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und

Rückstände 73

4.2.6 Mittels HPLC festgestellte individuelle Ausscheidung von

Enro- und Ciprofloxacin 74

4.3 Versuchsansatz 3 85

4.3.1 Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und

Rückstände 93

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5. Diskussion 95

5.1 Verteilung von Enro- und Ciprofloxacinrückständen zwischen den

Eifraktionen 95

5.2 Zeitliche Einordnung des Auftretens, der maximalen Konzentration

und der Elimination von Enrofloxacin und Ciprofloxacin 96

5.3 Empfindlichkeit und Nachweisbarkeitsgrenzen der angewendeten

Analyseverfahren 102

5.4 Zusammenfassende Betrachtung der Ergebnisdiskussion 104

6. Zusammenfassung 105

7. Summary 109

8. Anhang 111

9. Literaturverzeichnis 115

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1. Einleitung

Enrofloxacin ist ein synthetisches Fluorchinolon, das in der Veterinärmedizin weltweit therapeutisch zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen des Atmungs- und Ver- dauungstraktes eingesetzt wird. In den meisten europäischen Ländern besteht eine arz- nei- und lebensmittelrechtliche Zulassung für Rinder, Schweine, Kleintiere, Mastgeflügel und Nutzfische. Bei der Anwendung sind Wartezeiten zu beachten, die so bemessen sein müssen, dass Rückstände, die europaweit geltende Höchstmengen überschreiten, in den vom behandelten Tier stammenden Lebensmittel vermieden werden. Diese War- tezeiten betragen beispielsweise für das in Deutschland zugelassene Präparat Baytril®

7-9 Tage. Die Zulassung erstreckt sich in den europäischen Staaten nicht auf Geflügel, das zur Produktion von Eiern gehalten wird. In der tierärztlichen Praxis kommt es aber dennoch nicht selten auch in Legehennenbetrieben zur Anwendung. Dies ist, bei ent- sprechendem Therapienotstand, laut Tierärztlicher Hausapothekenverordnung (TÄHAV) durch Umwidmung möglich, da Enrofloxacin grundsätzlich zur Anwendung bei Lebens- mitteltieren geeignet ist. Die World Health Organisation (WHO) stellte in ihrem Bericht zum „Gebrauch von Chinolonen bei Lebensmitteltieren und möglichen Einflüssen auf die menschliche Gesundheit“ (WHO, 1998) fest, dass solche Umwidmungen in der Verant- wortung des Tierarztes in verschiedenen Ländern üblich sind.

In Deutschland gilt bei Umwidmung eine pauschale Wartezeit von mindestens 10 Tagen für Eier von behandelten Tieren, die vom Tierarzt auf ihre Zuverlässigkeit hinsichtlich der Vermeidung von Rückständen überprüft werden muß. Während für Muskulatur und andere essbare Gewebe Höchstmengen festgelegt wurden, gilt für die Eier von behandelten Legehennen die Forderung nach analytischer Rückstandsfreiheit. Da keine Un- tersuchungen zum Rückstandsverhalten von Enrofloxacin und seinem Hauptmetaboliten Ciprofloxacin in Eiern vorliegen, stehen dem Anwender von Enrofloxacin-haltigen Präpa- raten somit keine verlässlichen Daten zur Verfügung, wie lange eine ausreichend sichere Wartezeit zu bemessen ist.

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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines sensitiven und routi- nemäßig durchführbaren Nachweisverfahrens für Enrofloxacin und Ciprofloxacin. Hierzu sollen Ausscheidungskurven für Hühnereier nach Anwendung von Enrofloxacin bei Le- gehennen in Boden- und Käfighaltung ermittelt werden.

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2. Wissenschaftliches Schrifttum

2.1 Therapeutischer Einsatz von Fluorchinolonen

Fluorchinolone gehören zu den Gyrasehemmstoffen, deren Name sich von der Hemm- wirkung auf die bakterielle DNA-Gyrase ableitet. Zu unterscheiden sind Vertreter der ersten Generation, wie beispielsweise die Nalidixinsäure, von neueren Wirkstoffen, die sich infolge einer leicht abgeänderten Molekülstruktur durch ein breiteres Wirkungs- spektrum, geringere Resistenzentwicklung und verbesserte pharmakokinetische Eigen- schaften auszeichnen (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL 1995). Dazu zählen Orbifloxacin, Norfloxacin, Sarafloxacin, Difloxacin, Danofloxacin, Marbofloxacin, Enroflo- xacin und Ciprofloxacin. In der Veterinärmedizin sind Enro-, Dano-, Di- und Sarafloxacin sowie Flumequin und Oxolinsäure zur Anwendung bei Geflügel zugelassen, allerdings gibt es keine Zulassung für Legehennen.

2.1.1 Chemie und Pharmakodynamik von Fluorchinolonen

Gemeinsames Strukturmerkmal aller Verbindungen dieser Wirkstoffgruppe ist ein 4 - Chinolonring, der je nach Präparat durch ein strukturähnliches Naphtyridin-, Cinnolon- oder Pyridopyrimidingrundgerüst ersetzt werden kann. Im Vergleich zu den Gyrase- hemmern der ersten Generation wird bei den Fluorchinolonen in Position 6 der 4 - Chi- noloncarbonsäure Wasserstoff durch Fluor substituiert.

Strukturformel von Enrofloxacin und Ciprofloxacin (Abb.1)

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Der antibakterielle Wirkmechanismus beruht auf einer Hemmung des Enzyms Gyrase, dessen eigentliche Aufgabe es ist, während der Replikation die bakteriellen DNA- Stränge aufzuspalten und nach erfolgter negativer Überspiralisierung wieder zu ver- knüpfen. Aus dieser Störung der DNA-Replikation erklärt sich ein bakteriostatischer Ef- fekt. Aufgrund der Tatsache, dass es unter Anwesenheit von Sauerstoff aber zu einer bakteriziden Wirkung kommt, werden weitere, noch nicht näher erforschte Mechanismen vermutet. Die der Gyrase entsprechende Topoisomerase in Säugetierzellen ist gegen- über Fluorchinolonen tausendfach weniger empfindlich (FREY u. LÖSCHER 1995).

Wird Enrofloxacin in Kombination mit Chloramphenicol, Tetracyclinen oder Makrolidanti- biotika eingesetzt, kommt es zu antagonistischen Effekten, wohingegen in Kombination mit Aminoglykosiden, Cephalosporinen und Breitspektrum-Penicillinen eine synergisti- sche Beeinflussung im Vordergrund steht. Eine verminderte enterale Resorption von Enrofloxacin wird bei gleichzeitiger Gabe von Arzneimitteln, die mehrwertige Kationen beinhalten, beobachtet. Hier sind vor allem Magnesium, Aluminium und Calcium zu er- wähnen (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL 1995). Fluorchinolone hemmen außerdem das Cytochrom P-450-IA2-Isoenzym, wodurch es zu einem klinisch relevan- ten, verzögerten Abbau von Methylxanthinen kommen kann (FREY u. LÖSCHER 1995).

2.1.2 Wirkungsspektrum und Resistenzsituation von Enrofloxacin

Als empfindlich gegenüber Fluorchinolonen der neuen Generation gelten Keime mit einer minimalen Hemmstoffkonzentration (MHK) unter 2 µg/ml. Somit umfasst das Wir- kungsspektrum von Enrofloxacin viele gramnegative Keime wie beispielsweise Entero- bacteriaceae, Campylobacter ssp., Haemophilus ssp., Pseudomonaden und Vibrionen, außerdem Brucellen, Chlamydien, Mykoplasmen und Mykobakterien. Sehr gute Wirk- samkeit im grampositiven Bereich besteht lediglich gegenüber Staphylokokken, die Be- handlung von Streptokokken und Anaerobiern mit Enrofloxacin ist demgegenüber häufig wenig erfolgreich. Hefen und Pilze besitzen eine natürliche Resistenz (FREY u. LÖ- SCHER 1995).

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2.1.3 Pharmakokinetik und Ausscheidung von Enrofloxacin

Fluorchinolone werden sowohl nach oraler als auch nach parenteraler Verabreichung schnell bis zu 90 % resorbiert, wobei die Plasmaproteinbindung mit 10 – 20 % als gering einzustufen ist. Ein hohes scheinbares Verteilungsvolumen von 2 – 4 l/kg deutet darauf hin, dass die Fluorchinolone in der Lage sind, in den Intrazellularraum überzugehen und sich dort anzureichern. Besonders die Konzentrationen im Lungengewebe, in der Bron- chialschleimhaut, im Knochen und in der Haut können das drei- bis vierfache des Blutplasmaspiegels erreichen (FREY u. LÖSCHER 1995). SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL (1995) geben die therapeutisch einzuhaltende Konzentration von Enroflo- xacin im Blut mit 1 µg/ml an. Die Elimination von etwa 80 % der verabreichten Wirk- stoffmenge der meisten Fluorchinolone erfolgt renal durch glomeruläre Filtration und tubuläre Sekretion innerhalb von 48 Stunden. Der Rest wird biliär sezerniert und mit den Faeces ausgeschieden (FREY u. LÖSCHER 1995). Teilweise werden auch wirksame Metaboliten gebildet, wie im Fall von Enrofloxacin, bei dem durch Dealkylierung Ciprofloxacin entsteht, das ebenfalls antimikrobiell wirksam ist (EMEA 2002). SCHA- DEWINKEL-SCHERKL und SCHERKL (1995) betonen, dass auch im Genitaltrakt, der Leber, der Galle und der Niere besonders hohe Konzentrationen von Enrofloxacin erreicht werden.

2.1.4 Einsatz von Fluorchinolonen in der Veterinärmedizin

Betrachtet man den anteiligen Verbrauch von Antibiotika allgemein in der Tiermedizin, fällt auf, dass vorwiegend ältere und günstigere antibakterielle Stoffe, wie Sulfonamide und Tetracycline, zum Einsatz kommen. Dies findet sich darin begründet, dass nicht mehr die Behandlung eines Einzeltieres, das an einer infektiösen Erkrankung leidet, im Vordergrund steht, sondern vielmehr die prophylaktische und metaphylaktische, mög- lichst wenig kostenintensive Bestandsbehandlung (PLONAIT 1988; HIERETH 1996;

MATHES 1996). Neuere Antibiotika wie die Fluorchinolone machen trotz sehr guter

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Wirksamkeit und günstiger Resistenzlage aufgrund ihres Preises nur einen relativ geringen Anteil am Gesamtverbrauch aus (Abb. 2). FREY und LÖSCHER (1995) empfehlen den Einsatz von Fluorchinolonen außerdem in erster Linie als Reserveantibiotikum bei schwerwiegenden Infektionen, deren Therapie erfahrungsgemäß Probleme bereitet. En- rofloxacin, Marbofloxacin, Difloxacin und Danofloxacin sind in der EU ausschließlich für die Anwendung am Tier zugelassen (UNGEMACH, 1999b).

Tetracycline 5% 4% 2% 1%

Makrolide

9% β-Lactame

Sonstige Aminoglykoside

Sulfonamide/Trimethoprim Fluochinolone

12%

67%

Verbrauch antimikrobieller Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe bei Tieren in der EU und der Schweiz 1997: 3.494 t (modifiziert nach FEDESA 2001) (Abb.2)

2.1.4.1 Einsatz bei Geflügel

SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL (1995) geben die im Therapiefall zu verab- reichenden Wirkstoffmengen wie folgt an:

- Tauben: 5 mg/kg KGW, 1-2 mal täglich i.m., s.c., per os oder 100 – 200 mg/l Trinkwasser, über 5 Tage

- Hühner: 10 mg/kg KGW oral über 3 – 5 Tage oder 50 – 100 mg/l Trinkwasser ü- ber 3 – 5 Tage

- Wartezeit bei parenteraler Gabe: 7 Tage für essbares Gewebe, 9 Tage für Eier

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Außer Enrofloxacin (Baytril® 10% - Orale Lösung) ist in Deutschland mit Difloxacin (Di- cural® orale Lösung) noch ein weiteres Fluorchinolon für Hühner und Puten auf dem Markt, wobei sich die Zulassung nicht auf Legehennen erstreckt (ANONYM 2005). Aus diesem Grund ist auch kein MRL (Maximum Residue Limit) für Eier angegeben. Die EU- Verordnung 2377/90 definiert in Annex I für Geflügel anderer Nutzungsrichtung folgende MRL-Werte:

- für Muskulatur, Haut und Fett: 100 µg/kg - für Leber: 200 µg/kg

- für Niere: 300 µg/kg.

Diese Angaben beziehen sich jeweils auf die Summe aus Enrofloxacin und Ciprofloxa- cin. Für andere zur Lebensmittelgewinnung genutzte Tierarten sind die MRL-Werte ver- gleichbar. Bei den neuesten Fluorchinolonen, die in der Veterinärmedizin zum Einsatz kommen, unterscheiden sich die MRL-Werte je nach toxischem Potential sehr deutlich.

Für Danofloxacin liegt der MRL-Wert für Haut und Fett beispielsweise bei 100 µg/kg, für Leber und Niere bei 400 µg/kg. Für Sarafloxacin gelten insgesamt sehr niedrige MRL- Werte zwischen 10 und 100 µg/kg, wohingegen diejenigen von Difloxacin im oberen Be- reich zwischen 300 µg/kg für Muskulatur und 1900 µg/kg für Leber angesiedelt sind.

2.2 Begriffsbestimmung NOEL, ADI und MRL

Um die gesetzlichen Grundlagen zur Zulassung, zur Anwendung und zum Verbot von Arzneimitteln bei lebensmittelliefernden Tieren zu verdeutlichen, soll im Folgenden das Verfahren zur Festsetzung von NOEL, ADI und MRL dargestellt werden.

Vor der Zulassung eines Arzneimittels wird anhand von Dosis-Wirkungsbeziehungen im Rahmen von Tierversuchen der sogenannte non observed effect level (NOEL) für den in Frage stehenden Wirkstoff ermittelt und als diejenige Dosis definiert, die keine adversen

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Effekte mehr mit sich bringt. Dieser Wert wird durch einen Sicherheitsfaktor 100 divi- diert, davon ausgehend, dass der Mensch 10 mal empfindlicher ist als das Tier und dass zusätzlich noch interindividuelle Schwankungen auftreten können, denen mit einem weiteren Faktor Rechnung getragen wird (IPSC 1987; WOODWARD 1998). Der daraus resultierende Wert wird als ADI (acceptable daily intake) bezeichnet. Definitions- gemäß ist der ADI diejenige Menge einer Substanz, die lebenslang täglich aufgenommen werden kann, ohne dass mit einer Gesundheitsgefährdung gerechnet werden muss (EU 2001).

Im weiteren Verlauf des Verfahrens wird davon ausgegangen, dass der Durchschnitts- mensch zur Deckung seines täglichen Nährstoffbedarfs 300 g Fleisch, 100 g Leber, 50 g Niere, 50 g Fett, 1500 g Milch, 100 g Ei und 20 g Honig verzehrt. Die Summe aller in diesen Geweben vorhandenen Arzneimittelrückstände muss auf jeden Fall kleiner sein als der ADI-Wert. Um dies zu sichern, werden Maximum Residue Limits (MRL) vorge- schrieben, die für einen Wirkstoff und ein bestimmtes Gewebe gelten und in den Anla- gen I und III der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 aufgelistet sind. Um diese Höchstmen- gen nicht zu überschreiten, ist es nötig, Wartezeiten einzuhalten, die vom pharmazeuti- schen Unternehmen im Rahmen des Zulassungsverfahrens aufgrund von Rückstands- analysen belegt werden müssen. Als Wartezeit wird die Zeit definiert, innerhalb derer bei bestimmungsgemäßer Anwendung von Arzneimitteln bei Tieren mit Rückständen gesundheitlich nicht unbedenklicher Stoffe in den Lebensmitteln, insbesondere in sol- chen Mengen, die festgesetzte Höchstmengen überschreiten, gerechnet werden muss, einschließlich einer angemessenen Sicherheitsspanne (CHOLAS 1976; JACKSON 1980).

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2.3 Gesetzliche Grundlagen für die Anwendung von Fluorchinolonen bei lebensmittelliefernden Tieren

Werden pharmakologisch wirksame Stoffe zur Therapie oder Prophylaxe am lebensmittelliefernden Tier eingesetzt, kann es in den Lebensmitteln tierischen Ursprungs wie Milch, essbaren Geweben oder auch Eiern zu unerwünschten Rückständen des Arz- neimittels oder seiner Metaboliten kommen. Werden mit Rückständen behaftete Le- bensmittel vom Menschen aufgenommen, kann sich dies unter Umständen nachteilig auf dessen Gesundheit auswirken. Diese Tatsache begründet, dass sowohl nach nationalem als auch nach internationalem Recht Anwendungsbeschränkungen und - bedingungen für Wirkstoffe gelten, wenn sie bei lebensmittelliefernden Tieren eingesetzt werden.

2.3.1 Nationales Recht

2.3.1.1 Arzneimittelgesetz

Das Arzneimittelgesetz (AMG 2005) strebt an, die Problematik der unerwünschten, nicht unbedenklichen Rückstände von pharmakologisch wirksamen Substanzen in Lebens- mitteln tierischen Ursprungs schon auf der Ebene der Arzneimittelzulassung anzugehen.

In Paragraph 22 sind die prinzipiell für die Zulassung von Arzneimitteln nötigen Angaben festgelegt. Dazu gehören beispielsweise neben einer qualitativen chemischen und gale- nischen Prüfung eine genaue Definition der Anwendungsbereiche, Dosierung und Ne- benwirkungen. Paragraph 23 regelt darüber hinaus das Vorgehen bei der Zulassung von Arzneimitteln, die zur Anwendung bei lebensmittelliefernden Tieren bestimmt sind.

Er enthält unter anderem Vorschriften über die Angabe der Wartezeit sowie über die Erhebung von Ergebnissen aus Rückstandsprüfungen der pharmakologisch wirksamen Stoffe und ihrer Umwandlungsprodukte. Weiterhin muß nach Paragraph 24 ein Sach- verständigengutachten vorgelegt werden, aus dem hervorgeht, ob und wie lange nach

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Anwendung des Arzneimittels mit Rückständen in den Lebensmitteln tierischen Ur- sprungs zu rechnen ist und wie diese Rückstände zu bewerten sind. Zusätzlich ist eine gutachterliche Aussage nötig, die belegt, dass vorhandene Rückstände nach Ablauf der angegebenen Wartezeit die nach der EWG-Verordnung Nr. 2377/90 festgesetzten Höchstmengen nicht überschreiten.

Paragraph 56 a beinhaltet die Vorschriften zur sogenannten Umwidmung. Danach ist es einem Tierarzt erlaubt, ein Arzneimittel, das für die gleiche Tierart, aber ein anderes Anwendungsgebiet zugelassen ist, oder auch ein Arzneimittel, das für eine andere lebensmittelliefernde Tierart zugelassen ist, umzuwidmen, sofern kein adäquates anderes Therapeutikum zur Verfügung steht und dadurch der Heilungserfolg und damit die Ge- sundheit des Tieres ernstlich in Frage gestellt würde. In begründeten Fällen kann selbst ein Human- oder Heimtierpräparat umgewidmet werden, sofern der Wirkstoff in den An- hängen I bis III der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 aufgeführt ist. Erfolgt eine Umwid- mung bei der Behandlung von lebensmittelliefernden Tieren, müssen pauschale Warte- zeiten eingehalten werden, die in der Tierärztlichen Hausapothekenverordnung festgelegt sind.

Wie bereits erwähnt, ist der Wirkstoff Enrofloxacin in Europa nicht für die Behandlung von Legehennen zugelassen. Wird Enrofloxacin im Krankheitsfalle trotzdem zum Ein- satz gebracht, handelt es sich um eine Umwidmung. Da noch keine wissenschaftlichen Untersuchungen zum Rückstandsverhalten von Enrofloxacin und Ciprofloxacin vorliegen, ist somit bisher die Einhaltung der Wartezeiten nach TÄHAV geboten.

2.3.1.2 Tierärztliche Hausapothekenverordnung

Eine zentrale Rolle bei der Vermeidung von Rückständen in Lebensmitteln tierischen Urprungs spielt die Tierärztliche Hausapothekenverordnung (TÄHAV), auf die das AMG bezüglich der Wartezeitenregelung verweist. Sie legt in Paragraph 12 a fest, dass bei notwendiger Umwidmung im Falle des sogenannten Therapienotstandes zur Behand- lung von lebensmittelliefernden Tieren Wartezeiten eingehalten werden müssen, um zu

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garantieren, dass die in der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 festgesetzten Höchstmen- gen nicht überschritten werden. Ist auf einem Fertigarzneimittel keine Wartezeit für die betreffende Tierart angegeben, so gelten die folgenden Zeiträume:

- Eier: 10 Tage - Milch: 7 Tage

- eßbares Gewebe von Geflügel und Säugetieren: 28 Tage

Der Tierarzt hat dafür zu sorgen, dass die Gesundheit von Mensch und Tier durch die Umwidmung nicht gefährdet wird und er trägt die Verantwortung für möglicherweise ent- stehende Schäden. Der pharmazeutische Unternehmer kann in diesem Fall nicht zur Verantwortung gezogen werden, da die Anwendung des Präparates außerhalb der Zu- lassung erfolgt und unter diesen modifizierten Bedingungen die Wirksamkeit nicht belegt ist. Die Feststellung des Therapienotstandes erfolgt nur nach objektiven Untersuchun- gen im Einzelfall und kann nur medizinisch begründet werden (TÄHAV 2001).

2.3.1.3 Lebens- und Futtermittelgesetzbuch

Ziel des Lebens- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB) ist es, durch seine Vorschriften dem Verbraucher ein hygienisch und gesundheitlich unbedenkliches Nahrungsmittel zu sichern.

Insbesondere Paragraph 10 LFGB beschäftigt sich mit Rückständen von Stoffen mit pharmakologischer Wirkung in Lebensmitteln tierischer Herkunft sowie in lebensmittelliefernden Tieren. Darin ist verankert, dass Lebensmittel tierischen Ursprungs nicht in den Verkehr gebracht werden dürfen, wenn sie Rückstände von Arzneimitteln oder deren Abbauprodukten enthalten, die bei dieser Tierart prinzipiell nicht oder auch aufgrund keiner sonstigen arzneimittelrechtlichen Vorschrift angewendet werden dürfen oder die festgesetzte Höchstmengen überschreiten. Dabei wird sowohl auf das AMG als auch

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auf die Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 verwiesen, deren Anhänge I (festgelegte Höchstmengen), III (vorläufige Höchstmengen) und IV (Anwendungsverbot für lebensmittelliefernde Tiere) zur Anwendung kommen.

Ferner dürfen auch keine Tiere, die der Lebensmittelgewinnung dienen, in den Verkehr gebracht werden, wenn sie mit pharmakologisch wirksamen Stoffen behandelt wurden, die nach den oben genannten Rechtsvorschriften bei dieser Tierart nicht angewendet werden dürfen, nicht registriert sind oder denen sowohl die Zulassung als Arzneimittel als auch die Zulassung als Futterzusatzstoff fehlt.

In Paragraph 64 LFGB verweist der Gesetzgeber auf die Amtliche Sammlung von Un- tersuchungsverfahren, die Empfehlungen bezüglich der Analyse von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen enthält. Sie wird unter Mitarbeit von Vertretern der Wissenschaft, der Forschung und der Wirtschaft ständig auf dem neuesten Stand gehalten.

2.3.1.4 Nationaler Rückstandskontrollplan

1989 wurde der Nationale Rückstandskontrollplan mit dem Ziel ins Leben gerufen, Le- bensmittel tierischen Ursprungs auf den verschiedenen Produktionsstufen auf Rück- stände von gesundheitlich unerwünschten Stoffen zu überwachen. Er wird von allen Ländern der Europäischen Union (EU) nach einheitlichen Maßstäben durchgeführt und jährlich neu erstellt.

Gesetzliche Grundlage ist seit 1998 zum einen die Richtlinie 96/23/EG, zum anderen die Entscheidung 97/747/EG über Umfang und Häufigkeit der Umsetzung dieser Richtlinie.

Zusätzlich ist der Rückstandskontrollplan in Lebensmittelrecht, Fleischhygienerecht und Geflügelfleischhygienerecht auf nationaler Ebene verankert.

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Kontrollen finden in Tierbeständen, Schlachtbetrieben und Betrieben statt, die das noch unveränderte Roherzeugnis erhalten, um die Rückverfolgbarkeit in den Ursprungsbe- trieb zu gewährleisten. Wurden anfänglich vorwiegend Schlachtkörper untersucht, gehö- ren seit 1999 auch Eier zum Überwachungsspektrum des Rückstandskontrollplans.

Nach den europaweiten Richtlinien muss eine Probe pro 1000 t Eiproduktion gezogen werden mit dem Ziel, die illegale Anwendung von verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen aufzudecken, wobei die Liste der Pflichtstoffe, auf die jede Probe mindestens zu untersuchen ist, jährlich aktualisiert wird (BVL 2005).

Im Jahr 2001 wurden rund 43.800 Proben auf 473 Stoffe untersucht, somit wurden im Rahmen des Rückstandskontrollplanes etwa 335.000 Einzeluntersuchungen durchge- führt. Dabei entfielen auf Eier 762 Proben mit insgesamt 6.348 Untersuchungen, wovon keine ein positives Rückstandsergebnis erbrachte. Auch die Untersuchungen auf antibakterielle Stoffe verliefen negativ, der Untersuchungsschwerpunkt lag dabei mit über 50 % im Bereich der Chinolone (BVL 2003).

2.3.2 Supranationales Recht

Die Anwendung von Arzneimitteln bei lebensmittelliefernden Tieren unterliegt nicht nur nationalem Recht. Die zunehmende Globalisierung des Handels verstärkt die Forderung nach Harmonisierung relevanter Rechtsbereiche, um Chancengleichheit unter den Staa- ten zu wahren.

2.3.2.1 Welthandelsorganisation

Am 1. Januar 1995 wurde die Welthandelsorganisation gegründet, deren Ziel es ist, freien Warenverkehr zwischen den 148 Vertragsstaaten ohne Diskriminierung einzelner Länder zu gewährleisten. Lediglich zum Schutz des Verbrauchers, beispielsweise ge- genüber Gesundheitsgefährdung oder Täuschung, sind handelsbeschränkende Maß-

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nahmen zulässig. Für alle Mitgliedsstaaten verbindlich sind die Standards der Codex Alimentarius Kommission (CAK), die der Food and Agriculture Organization der Verein- ten Nationen (FAO) und der World Health Organisation (WHO) untersteht (WTO 2005).

Sowohl nationales als auch europäisches Recht sind dem untergeordnet.

Die Codex Alimentarius Kommission kommt alle ein bis zwei Jahre zusammen, wobei außer den Delegierten der verschiedenen Mitgliedsstaaten auch Vertreter aus Industrie, Verbraucherschutzverbänden und Wissenschaft teilnehmen und als Berater fungieren.

Die Kommission beschäftigt sich zum einen mit Fragen der Lebensmittelqualität; dazu zählen beispielsweise Problemgebiete wie die Rückstände von Tierarzneimitteln und Pestiziden, andere Kontaminanten, mögliche Proben- und Analysemethoden oder die Lebensmittelhygiene. Zum anderen werden Optimierungswege zur Lebensmittelver- marktung erläutert, wozu Export- und Importbescheinigungen, Handelskontrollen oder Lebensmitteletikettierung gehören. Ziel ist es, Empfehlungen auszusprechen, um ver- bindliche internationale Standards zu entwickeln. Zu diesem Zweck werden verschie- denste Ausschüsse gebildet, die sich dann ausschließlich mit dem entsprechenden Themenkomplex beschäftigen. Der Ausschuss zu Tierarzneimittelrückständen in Le- bensmitteln wird beispielsweise federführend von den USA geleitet, derjenige zur Ana- lysen- und Probenmethodik von Ungarn (CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION 2005).

Internationale Harmonisierung ist nur möglich, wenn alle Mitgliedsstaaten einheitliche Standards annehmen. Die Aufgabe der Kommission ist dabei, die Standards so festzu- legen, dass alle Mitgliedsstaaten in der Lage sind, sie umzusetzen (CODEX ALIMEN- TARIUS COMMISSION 2005).

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2.3.2.2 Europäisches Gemeinschaftsrecht

MEYER (1998) erläutert die Auswirkungen des europäischen Gemeinschaftsrechtes auf die Rechtslage im Lebensmittelbereich wie folgt:

Das nationale Recht einschließlich der jeweiligen Verfassung ist dem Gemeinschafts- recht jederzeit untergeordnet. Folglich werden Bestimmungen der einzelnen Mitglieds- staaten ungültig, sofern sie mit dem Gemeinschaftsrecht kollidieren. Dieses Phänomen wird als sogenannte Sperrwirkung bezeichnet.

Verordnungen der Europäischen Gemeinschaft sind für alle Staaten unmittelbar wirksam und verbindlich. Richtlinien erlangen ihre Gültigkeit erst nach dem Verstreichen einer genau definierten Frist, innerhalb der die Richtlinie in nationales Recht umgesetzt werden muss. Diese Umsetzung wiederum erfolgt nach dem nationalen Recht des jeweiligen Staates.

Gerade zu Kontaminanten in Lebensmitteln tierischen Ursprungs existieren auf europäi- scher Ebene eine Vielzahl von Verordnungen und Richtlinien, die mittlerweile in gelten- des deutsches Recht umgesetzt wurden und entsprechend geändert oder laufend er- gänzt werden. Nachfolgend sollen nur die für die vorliegende Arbeit wichtigsten Verord- nungen aufgeführt werden.

Verordnung (EWG) Nr. 315/93

Diese Verordnung regelt das Verfahren zur Kontrolle von Kontaminanten in Lebensmit- teln, wobei Artikel 1 Kontaminanten als Stoffe definiert, die dem Lebensmittel nicht ab- sichtlich hinzugefügt werden, aber als Rückstände vorhanden sind. Ausdrücklich wird darauf hingewiesen, dass hierunter auch die Behandlungsmethoden aus der Veterinär- medizin fallen. In Artikel 2 wird bestimmt, dass für bestimmte Kontaminanten Höchstwer-

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te festgelegt werden, die durch Hinweise auf analytische Nachweisbarkeitsgrenzen oder zu verwendende Probennahme- und Analysemethoden ergänzt werden können. Artikel 4 gestattet den Mitgliedsstaaten, diese Verordnung auszusetzen, sollte der begründete Verdacht bestehen, dass von einem Lebensmittel eine gesundheitliche Gefährdung ausgeht, obwohl es mit den Vorschriften der Verordnung hinsichtlich nicht zu über- schreitender Höchstmengen konform geht. Die Europäische Kommission setzt sich da- raufhin mit dem Ständigen Lebensmittelausschuss in Verbindung, um die angegebenen Gründe zu prüfen und möglicherweise die Vorschriften entsprechend abzuändern.

Verordnung (EWG) Nr. 2377/90

Inhalt dieser Verordnung ist die Festlegung von Rückstandshöchstmengen in Nah- rungsmitteln tierischen Ursprungs, die auf die Anwendung von Tierarzneimitteln zurück- gehen, mit dem Ziel, einerseits die medikamentelle Therapie des Tieres und damit dessen Gesundheit zu erhalten, andererseits innerhalb der europäischen Gemeinschaft dem Verbraucher ausschließlich unbedenkliche Lebensmittel zu sichern. Gleichzeitig ermöglicht die länderübergreifende Festsetzung von Höchstmengen die diskriminie- rungsfreie Lebensmittelvermarktung innerhalb der Europäischen Union.

Die Höchstmengen werden durch den Ausschuß für Tierarzneimittel nach erfolgter Un- bedenklichkeitsprüfung in einem Schnellverfahren festgelegt. Zu jedem Zeitpunkt findet eine enge Zusammenarbeit mit den nationalen Ausschüssen zur analytischen und toxi- kologisch-pharmakologischen Prüfung statt, die in der Bundesrepublik Deutschland auf der Basis des Arzneimittelgesetzes eingesetzt werden.

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Außer allgemeinen Bestimmungen über Höchstmengen pharmakologisch wirksamer Stoffe gehören zu der Verordnung noch fünf Anhänge:

Anhang I beinhaltet ein Verzeichnis der pharmakologisch wirksamen Stoffe, für die Rückstandshöchstmengen festgelegt sind. Darin wird der pharmakologisch wirksame Stoff, die zu bestimmende Markersubstanz, die Tierart, das Zielgewebe und der Maxi- mum Residue Limit (MRL) genau definiert. Der MRL-Wert ist in Anlehnung an das Arz- neimittelgesetz die maximal zugelassene Höchstmenge eines Stoffes, die nach wissenschaftlichen Erkenntnissen bei durchschnittlichen Essgewohnheiten keine Gefährdung der menschlichen Gesundheit darstellt.

In Anhang II werden solche Stoffe geführt, für die keine Rückstandshöchstmengen gelten. Nach dem heutigen Stand der Wissenschaft sind diese Stoffe und ihre Metaboliten bei bestimmungsgemäßem Gebrauch zu keiner Zeit gesundheitsgefährdend.

Anhang III listet die Stoffe auf, für die vorläufige Höchstmengen festgelegt wurden und ist analog dem Anhang I aufgebaut. Der vorläufige MRL-Wert gilt für 5 Jahre nach Auf- nahme in Anhang III. Innerhalb dieser Zeit müssen toxikologische Prüfungen durchge- führt werden, um eine Zuordnung in eine andere Anhangsliste zu ermöglichen.

Kann für einen pharmakologisch wirksamen Stoff eine sichere Höchstmenge nicht definiert werden, wird er in Anhang IV aufgeführt und ist grundsätzlich für die Anwendung am lebensmittelliefernden Tier verboten.

Anhang V ist von verwaltungstechnischer Natur und legt fest, welche Angaben für einen Antrag zur Festsetzung von Rückstandshöchstmengen nötig sind.

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Unter Berücksichtigung der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 sind folgende

(Fluor)chinolone zum Einsatz beim Geflügel direkt oder durch Umwidmung unter Einhal- tung der entsprechenden weiteren Rechtsnormen zugelassen (Tabelle 1):

Pharmakologisch wirksamer Stoff

Marker-

rückstand Gewebe MRL Sonstige Vorschriften Danofloxacin Danofloxacin Muskel

Fett + Haut Leber Niere

200 µg/kg 100 µg/kg 400 µg/kg 400 µg/kg

Nicht bei Tieren anwen- den, deren Eier für den menschlichen Verzehr bestimmt sind

Difloxacin Difloxacin Muskel

300 µg/kg 400 µg/kg 1.900 µg/kg 600 µg/kg

Enrofloxacin Summe aus Enrofloxacin

und Cipro- floxacin

Muskel Fett + Haut Leber Niere

Sarafloxacin Sarafloxacin Fett + Haut Leber

10 µg/kg 100 µg/kg

Kein MRL für Eier angegeben

Oxolinsäure Oxolinsäure Muskel Fett + Haut Leber Niere

Flumequin Flumequin Muskel

400 µg/kg 250 µg/kg 800 µg/kg 1.000 µg/kg

Tabelle 1: Liste der bei Geflügel zugelassenen Chinolone, entnommen aus Anhang I der Verord- nung (EWG) Nr. 2377/90 (VETIDATA 2005)

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2.4 Fluorchinolonrückstände in Hühnereiern

Die am häufigsten beobachtete Ursache für das Vorhandensein von Arzneimittelrück- ständen in jeder Art Lebensmittel ist die Missachtung vorgeschriebener Wartezeiten (PAIGE u. KENT 1987; VAN DRESSER u. WILKE 1989; GUEST u. PAIGE 1991; PAI- GE 1994), die unsaubere Führung des Behandlungsbuches sowie die mangelhafte Kennzeichnung behandelter Tiere (SUNDLOF 1989).

Weiterhin kann es durch die Wiederaufnahme von mit antimikrobiellen Wirkstoffen kon- taminierten Exkreten zum einen zu einer Belastung von unbehandelten Tieren kommen (BEVILL 1984; MCCAUGHEY et al. 1990), zum anderen kann die Antibiotikaaufnahme bei vorbehandelten Tieren artifiziell verlängert werden.

Nicht zuletzt kann das unkorrekte Umwidmen eines Präparates oder die Anwendung eines Arzneistoffes, der für die fragliche lebensmittelliefernde Tierart nicht zugelassen ist, zu höchstmengenüberschreitenden Rückständen führen (PAPICH et al. 1993; KA- NEENE u. MILLER 1997; HIGGINS et al. 1999).

Im Hinblick auf die mögliche Rückstandsproblematik von Enrofloxacin und Ciprofloxacin ist es sinnvoll, sich mit den wichtigsten Mechanismen der Eibildung zu befassen.

2.4.1 Eibildung

Die Ovarien eines Huhnes sind ursprünglich paarig angelegt, wobei sich das rechte Ovar bis zum Erreichen der Geschlechtsreife zurückbildet. Insgesamt stehen etwa 2.500 Follikelanlagen zur Verfügung (SIEGMANN 1992).

Die Bestandteile des Eidotters sind vorwiegend Lipoproteine, die in der Leber gebildet werden und mit dem Blut zum Ovar transportiert werden (GILBERT 1971a). Die Dotter- kugel wird nach der Ovulation vom Eileitertrichter (Infundibulum) aufgenommen und er- hält dort die Hagelschnüre (Chalazen). Die dünnflüssigen Bestandteile des Eiweißes und die zähe Eiklarschicht werden im Magnum des Eileiters sezerniert (SIEGMANN 1992). Diese Proteine sind wasserlöslich (GILBERT 1971b). In der folgenden Eileiteren-

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ge (Isthmus) werden die paarigen Schalenmembranen gebildet, in die sich im Eihalter Calciumsalze aus der Schalendrüse einlagern. Letztgenannter Vorgang dauert etwa 20 Stunden (SIEGMANN 1992).

2.4.2 Zeitliche Einordnung der Entstehung von Fluorchinolonrückständen in Hühnereiern

Nach oraler Gabe von Fluorchinolonen werden diese im Magen-Darm-Trakt resorbiert und gelangen so in die Blutbahn. Dies ist die Grundvoraussetzung für die Möglichkeit der Wirkstoffverteilung über den ganzen Körper und damit auch in die Organe der Eibil- dung (KAN u. PETZ 2000). Enrofloxacin wird in der Leber teilweise zu Ciprofloxacin dealkyliert (LOLO et al. 2005).

Die ebenfalls in der Leber gebildeten Lipoproteine des Eidotters werden im Ovar Be- standteil von drei verschiedenen Follikeltypen: den weißen, carotinoidarmen Follikeln, deren Entwicklung Monate oder Jahre dauert; den Intermediärfollikeln, die sich über einen Zeitraum von bis zu 60 Tagen entwickeln und den innerhalb von etwa 10 Tagen schnell wachsenden Follikeln (GILBERT 1971a). Dort kumulierte Rückstände können bis zur Eiablage nicht wieder freigesetzt werden (DONOGHUE et al. 1996; KAN u. PETZ 2000) und über Jahre in Follikeln verbleiben. Die Entstehung der vom Magnum gebildeten wasserlöslichen Proteine des Eiklars dauert dagegen nur 1 – 2 Tage.

Vor diesem Hintergrund stellten KAN und PETZ (2000) fest, dass Arzneimittelrückstän- de abhängig von ihren pharmakokinetischen Eigenschaften zuerst im Eiweiß auftreten.

Die dort gefundenen Rückstände reflektieren die Plasmakonzentration und zeigen nach 2 – 3 Tagen ein entsprechend gleichmäßiges Niveau. Die Variabilität der gemessenen Rückstandsmengen im Eidotter gehen auf die unterschiedliche Geschwindigkeit der Fol- likelentwicklung zurück, in deren Verlauf die Plasmakonzentration des Wirkstoffes in der Regel nicht dauerhaft gleich ist. Erst nach 8 – 10 Tagen erreichen Rückstände im Eidot- ter ein gleichmäßiges Niveau.

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2.4.3 Verteilung von Fluorchinolonrückständen zwischen Eidotter und Eiklar

Tatsächlich würde man erwarten, dass sich Rückstände aus fettlöslichen Arzneimitteln eher im fettreichen Eidotter, die wasserlöslichen Anteile eher im Eiklar sammeln. Entge- gen dieser Annahme werden für die meisten Fluorchinolone deutlich höhere Rückstände im Eiklar als im Eidotter angegeben (GORLA et al. 1997). Zur Verteilung von Fluorchino- lonrückständen zwischen Eidotter und Eiklar liegen einige Studien vor, die zum Teil unterschiedliche Ergebnisse und Erklärungsansätze aufweisen.

Sowohl die Untersuchungen von ANHALT (1977) als auch die von HAFEZ (1991) erga- ben, dass vor allem der Eidotter als wichtigstes Kompartiment für Rückstände allgemein anzusehen ist.

GORLA et al. (1997) halten es für möglich, dass verschiedene Fettlöslichkeiten infolge einer unterschiedlichen chemischen Struktur die Penetrationsfähigkeit in bestimmte Zel- len in der Weise moduliert, dass die Verteilungsmuster von Enro- und Ciprofloxacin in Eidotter und Eiklar erklärt werden. Weiterhin ziehen diese Autoren die Möglichkeit in Betracht, dass die Enro- und Ciprofloxacinverteilung außer durch die physikochemi- schen Eigenschaften durch ein Übertreten von Wirkstoffen zwischen den zwei Phasen während der Lagerung bestimmt wird.

KAN und PETZ (2000) setzen der vermuteten Abhängigkeit von der Fettlöslichkeit ent- gegen, dass Ciprofloxacin als Hauptmetabolit zwar eine höhere Wasserlöslichkeit als Enrofloxacin aufweist, aber trotzdem vermehrt im Eidotter vorkommt.

ROUDAUT (1998) hält eine Diffusion von Wirkstoffen zwischen Eidotter und Eiklar wäh- rend der Lagerung für ausgeschlossen. Als Ursache für die Verteilung von Oxolinsäure im Ei sieht er die unterschiedliche Proteinbindungsfähigkeit.

In Studien von ROUDAUT und BOISSEAU (1990) waren Oxolinsäurerückstände im Ei- weiß über eine längere Periode nachweisbar als im Plasma. Auch Rückstände des Chi- nolons Flumequin können im Eiklar länger nachgewiesen werden als im Eidotter (VAN LEEUWEN u. VAN GEND 1989). Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass

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zwischen Chinolonen und den Eiklarproteinen bestimmte noch nicht geklärte Mecha- nismen ablaufen.

LOLO et al. (2005) begründen die höhere Ciprofloxacinkonzentration in Eidotter damit, dass die Lipoproteine als Hauptbestandteile mit der Leber den gleichen Syntheseort haben wie Ciprofloxacin.

2.5 Rückstandsproblematik von Fluorchinolonen in Lebensmitteln

Antibiotikarückstände in Lebensmitteln tierischen Ursprungs können auf vielfältige Wei- se zu Problemen führen. Neben toxikologischen Wirkungen sind vor allem Einflüsse auf die menschliche Darmflora und das Immunsystem ein zu beachtendes Risiko (GOR- BACH 1993; WALTER-TOEWS u. MCEWEN 1994; PERRIN-GUYOMARD et al. 2001).

Zusätzlich können sowohl human- als auch tierpathogene Mikroorganismen Resisten- zen entwickeln, die auf den Verzehr von rückstandsbelasteten Nahrungs- bzw. Futter- mitteln zurückzuführen sind (LEVY u. MILLER 1989; MOELLERING 1998).

Die minimale Hemmstoffkonzentration einiger Keime ist für Ciprofloxacin deutlich niedriger als für Enrofloxacin (KAARTINEN et al. 1997), somit könnten therapeutische Ciprofloxacindosen durch Rückstände schon frühzeitig durch die korrekte Ausdosierung von Enrofloxacin erreicht werden (KUNG et al. 1993; LANGSTON et al. 1996; MEN- GOZZI et al. 1996).

2.5.1 Unerwünschte Wirkungen von Fluorchinolonen

Fluorchinolone können toxische Effekte auf das Nervensystem, den Gastrointesti- naltrakt und das Herz-Kreislaufsystem haben und zusätzlich knorpel- und genschädi- gend, carcinogen und fototoxisch wirken (SCHLÜTER 1987; TAKAYAMA et al. 1995;

YOSHIDA et al. 1998). Bei unzureichender Flüssigkeitszufuhr während der Behandlung können Fluorchinolone im Urin auskristallisieren (MCKELLAR 1996).

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Enrofloxacin wird ausschließlich in der Veterinärmedizin therapeutisch eingesetzt (OTERO et al. 2001). Nach Herstellerangaben liegen für diesen Wirkstoff keinerlei Hin- weise auf teratogene, embryotoxische oder mutagene Auswirkungen vor, ebensowenig wie negative Effekte auf das Zentralnervensystem und das Herzkreislaufsystem (ALTREUTHER 1998). Bei jungen Hunden und Katzen wurden Knorpelschäden (VAN- CUTSEM 1990; LANGSTON 1996), bei Katzen allgemeine Veränderungen der Retina festgestellt (KAY-MUGFORD et al. 2001). Unter Enrofloxacingabe zeigten Legehennen keine Leistungsveränderungen hinsichtlich Anzahl, Gewicht und Stabilität der Eier (BAYER 1996).

In der Humanmedizin kommt der Enrofloxacinhauptmetabolit Ciprofloxacin zum Einsatz.

Toxische Effekte auf den Gastrointestinaltrakt können in Form von Diarrhoe, Vomitus und Spasmen auftreten. Als negative Auswirkung auf das Zentralnervensystem werden Schwindelgefühl, Zittern und in sehr seltenen Fällen Krampfanfälle beschrieben. Weiter- hin kann es zu Hautausschlägen, Gelenkschmerzen und Anämien kommen (HOFF- MANN-LAROCHE 1999).

Inwieweit mögliche Rückstände in Hühnereiern in ihrer verglichen mit der therapeuti- schen Dosis relativ geringen Konzentration einen der vorgenannten Effekte erzeugen können, wurde bisher nicht näher untersucht.

2.5.2 Antimikrobielle Wirkung auf die menschliche Darmflora

Die menschliche Darmflora stellt eine sehr komplexe, aber dennoch stabile ökologische Gemeinschaft von über 400 Bakterienarten dar (CARMAN et al. 1993). Unter dem Beg- riff der Kolonisationsresistenz versteht man die natürliche Abwehrkapazität der physiologischen Flora gegenüber der Verdrängung oder Überwucherung durch potentiell pathogene oder opportunistische Keime (BARZA et al. 1987; CORPET 1993). Durch anti- biotische Rückstände in Lebensmitteln kann diese Funktion empfindlich gestört werden (NORD u. EDLUND 1990); in welchem Ausmaß, hängt vom Wirkspektrum, der Dosis, der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik des angewandten Arzneimittels ab

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(SULLIVAN et al. 2001). In engem Zusammenhang mit der genannten Fehlfunktion innerhalb der Darmflora stehen einerseits die direkt durch die vorhandenen Rückstände verursachten Störungen, andererseits die Ausbildung multiresistenter Bakterienstämme durch den Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe am lebensmittelliefernden Tier, die mit dem Lebensmittel auf den Verbraucher übertragen werden können. Darüber hinaus kann sich die Resistenzentwicklung auch im menschlichen Darm selbst vollziehen, da die Rückstandskonzentrationen antimikrobiell wirksamer Stoffe in Lebensmitteln zur effekti- ven Bekämpfung bestimmter Keime nicht ausreichen, aber durchaus Unempfindlichkeit induzieren können (TURNIDGE 2004). Diese Sachverhalte sind als schwerwiegende Problematik einzustufen (COHEN 1992; FDA 2005) und sollen in den folgenden Kapitel näher beleuchtet werden.

2.5.3 Resistenzentwicklung geflügelrelevanter pathogener Mikroorganismen gegenüber Fluorchinolonen in Human- und Veterinärmedizin

Verschiedene Studien sehen einen eindeutigen Zusammenhang zwischen der Zulas- sung von Enrofloxacin zum Einsatz bei Geflügel und dem Auftreten multiresistenter Bak- terienstämme (THRELFALL 1997; THRELFALL 1999; CRUCHAGA et al. 2001; HIL- BERT et al. 2001; FDA 2005). Allerdings sei an dieser Stelle erwähnt, dass durchaus auch Untersuchungen existieren, die die zunehmend problematische Resistenzlage dem exzessiven Gebrauch antimikrobieller Arzneimittel in der Humanmedizin zuschrei- ben (MATHEWS 2001) und die den aus dem Einsatz am lebensmittelliefernden Tier verursachten Anteil neugebildeter Resistenzen mit nur etwa 10% beziffern (BERNICK 1999).

Werden Tiere antibakteriell behandelt, können sowohl physiologische als auch patholo- gische Darmkeime Resistenzen entwickeln und mit erhöhter Prävalenz auftreten (BA- GER u. EMBORG 2000). Es wurde schon mehrfach nachgewiesen, dass solche Bakte- rien das Fleisch behandelter Tiere im Rahmen der Schlachtung kontaminieren und da-

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nach im Verlauf der Nahrungskette auf den Menschen übertragen werden können (FDA 2005). Allerdings sind auch andere, tierassoziierte Übertragungswege auf den Men- schen möglich (PHILLIPS et al. 2004), unter anderem durch das Ei (ST.LOUIS et al.

1998; SOBEL et al. 2000; KHASCHABI et al. 2003). Außerdem besteht die Möglichkeit, dass opportunistische Keime der Darmflora aufgrund von antimikrobiell wirksamen Rückständen in Hühnereiern Resistenzen entwickeln, dadurch einen Selektionsvorteil erfahren und sich unverhältnismäßig vermehren (UNGEMACH 1999a). Rufen derartige Keime beim Menschen eine Infektion vor, so kann es aufgrund der vorhandenen Resis- tenzen besonderes bei älteren, sehr jungen oder immunsupprimierten Personen zu schwerwiegenden Komplikationen des Krankheitsverlaufs kommen (FDA 2005).

THRELFALL et al. (1999) beschreiben einen engen zeitlichen Bezug zwischen dem Auf- tauchen multiresistenter Campylobacterstämme sowie ciprofloxacinresistenter Salmo- nellen der Serovaren Typhimurium, Virchow und Hadar und der Zulassung von Enroflo- xacin als Arzneimittel für lebensmittelliefernde Tiere im Vereinigten Königreich. CRU- CHAGA et al. (2001) berichten ebenfalls von zunehmend resistenten Salmonellen des Serovars Hadar in Spanien, deren vermehrtes Auftreten auf den großzügigen Einsatz von Enrofloxacin in der Geflügelproduktion zurückzuführen ist.

Besonders beunruhigend ist die Tatsache, dass Salmonella typhimurium DT 104 als Bakterienstamm mit Resistenzen gegenüber diversen Antibiotika und als Auslöser schwerer Lebensmittelinfektionen sich seit 1994 auch häufiger unempfindlich gegenüber Fluorchinolonen erweist (THRELFALL et al. 1996; POPPE et al. 1998), was CRERAR et al. (1999) ebenfalls auf die gesteigerte Anwendung von Enrofloxacin bei Geflügel zu- rückführt. In den Untersuchungen von KHASCHABI et al. (2003) zeigte sich zwar kein S. typhimurium DT 104 Serovar resistent gegenüber Ciprofloxacin, allerdings war eine Erhöhung des MHK-Wertes von unter 0,1 µg/ml bei voll empfindlichen Wildstämmen (AARESTRUP et al. 2003) auf 0,125 – 1 µg/ml zu verzeichnen.

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Die FDA (2005) der Vereinigten Staaten gibt in einer Veröffentlichung zum Verbot von Enrofloxacin bei Mastgeflügel als Grund die zunehmende Unempfindlichkeit von Cam- pylobacter spp. gegenüber Fluorchinolonen an. Auch hier kann ein zeitlicher Bezug her- gestellt werden zur Zulassung von Enrofloxacin für die Anwendung beim Geflügel.

2.5.4 Risikobewertung von Enrofloxacinrückständen in Hühnereiern

Um eine angemessene Risikobewertung von Enrofloxacinrückständen in Hühnereiern gemäß der vorhandenen Literatur durchzuführen, ist eine Unterteilung in drei Fragen- komplexe vorzunehmen:

- Wie groß ist das Risiko einer Beeinträchtigung der menschlichen Gesundheit durch die übermäßige Vermehrung von pathogenen, fluorchinolonresistenten Mikroorganismen innerhalb der menschlichen Darmflora, deren Resistenzent- wicklung auf Enro- oder Ciprofloxacinrückstände in verzehrten Hühnereiern nach dem Einsatz von Enrofloxacin bei Legehennen zurückzuführen ist?

- Wie groß ist das Risiko einer Beeinträchtigung der menschlichen Gesundheit durch die Unterdrückung der physiologischen Darmflora aufgrund von Enro- oder Ciprofloxacinrückständen in verzehrten Hühnereiern nach dem Einsatz von En- rofloxacin bei Legehennen?

- Wie groß ist das Risiko, dass durch Enro- und Ciprofloxacinrückstände in verzehrten Hühnereiern eine Allergie des Menschen gegenüber Fluorchinolonen in- duziert wird?

Um diese Gefahren hinreichend genau abschätzen zu können, ist es zunächst für alle drei Fragestellungen von essentieller Wichtigkeit zu untersuchen, wie wahrscheinlich es ist, dass Hühnereier mit Enro- und Ciprofloxacinrückständen in den Verkehr gelangen.

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Wie aus Abb. 2 in Kapitel 2.1.4 zu entnehmen ist, macht der Fluorchinolonverbrauch in der EU und der Schweiz etwa 1,2 % aller eingesetzten antimikrobiell wirksamen Stoffe aus, das sind rund 42 t (FEDESA 2001). Allerdings liegen keine Statistiken vor, welchen Anteil davon Enrofloxacin einnimmt oder in welcher Menge Enrofloxacin zum Einsatz bei Legehennen umgewidmet wird.

Es ist nach wissenschaftlichem Kenntnisstand gesichert, dass Enrofloxacin die Entwick- lung von Resistenzen bei verschiedenen Bakterienarten induzieren kann, worauf in Ka- pitel 2.5.3 eingegangen wurde. Über die Fragestellung, ob und wie häufig es bisher vor- kam, dass Eier von mit Enrofloxacin behandelten Legehennen vor Ablauf der zehntägi- gen Wartezeit in den Handel gelangten, liegen keine Daten vor. Inwieweit nach oraler Gabe von Enrofloxacin überhaupt mit Rückständen über den 10. Tag nach Behandlung- sende hinaus gerechnet werden muss soll die vorliegende Arbeit klären.

Pro Gramm menschlicher Faeces kommen etwa 10¹¹ Bakterien vor, die meisten davon Anaerobier wie Bacteroides spp., Lactobacillus und Bifidobakterien sowie fakultative Anaerobier wie Escherichia coli und andere Enterokokken (MURRAY 1998). Diese komplexe Population stellt ein reichhaltiges Reservoir antibiotischer Resistenzgene dar, die auf pathogene Keime übertragen werden können, oder die bestimmten, in geringer Anzahl harmlosen Darmkeimen einen Selektionsvorteil gegenüber anderen Bakterien einräumen (SIMONSEN 1998; SØRENSEN 2001).

Fluorchinolonresistente Darmkeime machen einigen Studien zufolge weniger als 1 % aller Antibiotikaresistenzen aus (PHILLIPS et al. 2004), andere schätzen den Anteil als deutlich höher ein (THRELFALL et al. 1996; LECLERC 1996; OLIVER 2000; BJÖRK- HOLM 2001; CRUCHAGA 2001; DENAMUR 2002, GUSTAFFSON 2003). Wissen- schaftlich anerkannt ist allerdings die Tatsache, dass geringe Mengen antimikrobiell wirksamer Substanzen, wie bei Rückständen der Fall, deutlich öfter Resistenzen induzieren als therapeutische Dosierungen mit dem Ziel der Keimeliminierung (DAGAN 2000; DAGAN 2001; PHILLIPS et al. 2004). Auch der wiederholte Kontakt mit antimikrobiellen Stoffen führt zu hohen Mutationsraten und so zu einer Vervielfachung der resistenten Bakterienstämme (MAO 1997). Folglich ist die Annahme, dass bei einem

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allgemein geltenden ADI von 1,5 mg/Person/Tag keine adversen Effekte auf die menschliche Gesundheit mehr zu befürchten seien, nicht länger für alle Antibiotika auf- recht zu erhalten (FDA 2001).

Bezüglich der Fragestellung, wie wahrscheinlich es infolge der beschriebenen Imbalan- ce der menschlichen Darmflora im weiteren Verlauf zu einer schwerwiegenden Erkran- kung kommt, liegen keine gesicherten Erkenntnisse vor. Zwar gibt es beispielsweise zum Risiko einer Infektion mit resistenten Campylobacter spp. Risikobewertungen sowohl der WHO (2002) als auch der FDA (2001), beide stützen sich aber zum Teil auf wissenschaftlich unbelegte Aussagen (PHILLIPS et al. 2004).

Insgesamt kann aber trotzdem davon ausgegangen werden, dass das Risiko einer ge- fährlichen Infektion gerade für immunsupprimierte, ältere oder sehr junge Menschen nicht unwesentlich ist (FDA 2005).

In der Humanmedizin ist Ciprofloxacin ein häufig verwendeter Wirkstoff, der bei Erkran- kungen des Magen-Darm-Trakts regelmäßig zum Einsatz kommt. Wird nun eine Infekti- on durch fluorchinolonresistente Bakterien initial mit Ciprofloxacin behandelt, verlängert sich mit hoher Wahrscheinlichkeit die Krankheitsdauer und -schwere um ein bis zwei Tage (TRAVERS u. BARZA 2002).

Zusammenfassend kann damit ein Risiko, dass Fluorchinolonrückstände in diesen beschriebenen Zusammenhängen einen negativen Einfluss auf die menschliche Gesund- heit haben, nicht ausgeschlossen werden.

Um abzuschätzen, wie groß das Risiko einer Unterdrückung der physiologischen Darm- flora durch Fluorchinolonrückstände im Hühnerei ist, muss zunächst eruiert werden, welche Darmkeime gegenüber Enro- und Ciprofloxacin empfindlich sind.

Fluorchinolone wirken gegen ein breites Spektrum von Bakterien mit dem Schwerpunkt im gramnegativen Bereich. Viele Keime der physiologischen Darmflora sind gramnega- tiv und demzufolge empfindlich.

In den noch zu besprechenden Rückstandsstudien lagen die ermittelten Werte stets im einstelligen µg-Bereich pro Gramm Eiklar bzw. Eidotter oder darunter. Eine auf antimikrobielle Rückstände zurückzuführende Imbalance der Darmflora liegt damit im Be-

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reich des Möglichen, reguliert sich aber beim gesunden Menschen innerhalb weniger Tage nach letztmaliger Aufnahme der Substanz von selbst (SULLIVAN 2001). Dies er- scheint vor allem aufgrund der niedrigen Konzentrationen im Vergleich zur therapeutisch nötigen Dosierung plausibel. Allerdings stellt sich erneut die Frage der möglichen Aus- wirkungen bei Kindern, Greisen oder Kranken, für die wiederum ein Risiko nicht ausgeschlossen werden kann.

Um eine Hypersensitivitätsreaktion auszulösen, müssen arzneilich wirksame Substan- zen als Fremdmoleküle eine gewisse Größe haben und darüber hinaus als Haptene wirken (DEWDNEY et al. 1991). In der Folge sind verschiedene Szenarien möglich, die vom anaphylaktischen Schock über systemische Beeinträchtigungen bis zu einer milden allergischen Dermatitis reichen (DAYAN 1993; RIEDL u. CASILLAS 2003). Zwar kann eine allergisierende Wirkung durch antimikrobielle Rückstände in Lebensmitteln tierischen Ursprungs nicht kategorisch abgelehnt werden, insgesamt ist diese Wahrschein- lichkeit aufgrund der niedrigen Konzentrationen der antibiotischen Substanzen und der kurzen Expositionsdauer aber als eher gering einzustufen (DEWDNEY et al. 1991;

SUNDLOF et al. 2000). Das Fehlen von wissenschaftlichen Berichten über eine Indukti- on von Hypersensitivitätsreaktionen infolge Fluorchinolonaufnahme untermauern diese Einschätzung. In diesem Fall kann also mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass kein Risiko einer Gesundheitsgefährdung besteht.

2.6 Vorliegende Studien und Analyseverfahren

2.6.1 Analyseverfahren zum Nachweis von Enro- und Ciprofloxacinrückständen in Hühnereiern

Um eine effizientere Überwachung zu gewährleisten, ist es nötig, geeignete Analysever- fahren zum Nachweis und zur Bestimmung von pharmakologisch wirksamen Stoffen zu etablieren, für die auf nationaler oder auf europäischer Ebene Grenzwerte festgesetzt wurden oder die in Lebensmitteln überhaupt nicht vorkommen dürfen. Darüber hinaus

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besteht im Rahmen der betrieblichen Eigenkontrolle ein intensives Interesse an der Entwicklung geeigneter Nachweismethoden.

Sie werden aufgrund der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Pa- ragraph 64 LFGB als Screening-, Routine- oder Referenzmethode zugelassen und be- dienen sich unterschiedlicher Funktionsweisen: es können die biologische Aktivität einer Stoffgruppe (mikrobiologische Testsysteme), die Oberflächenstrukturen und die chemischen Eigenschaften (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Chromatographien) ausgenutzt werden oder ein chemischer Nachweis (Massenspektrometrie) angestrebt werden. Sie werden häufig durch die entsprechende Probenmatrix und die notwendige Ex- traktion limitiert (NOLLET 1996; BOTSOGLOU u. FLETOURIS 2001).

An dieser Stelle sollen vor allem die für den Nachweis von Enro- und Ciprofloxacin im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen angewandten Methoden besprochen und ein kurzer Überblick über mögliche andere Nachweisverfahren vermittelt werden.

2.6.1.1 High Performance Liquid Chromatography

Der Nachweis chemischer Strukturen mittels chromatographischer Verfahren ist in der analytischen Chemie weit verbreitet. Sie beruhen auf dem Prinzip des Gleichgewichtes einer Substanz zwischen zwei Phasen, von denen eine fest, die andere flüssig (Flüs- sigchromatographie) oder gasförmig (Gaschromatographie) sein kann. Die mobile Pha- se beinhaltet die Stoffe, die getrennt werden sollen, gelöst in einem organischen Lö- sungsmittel. Die Einzelkomponenten werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Wechsel- wirkungen mit der stationären Phase zurückgehalten (ZEECK et al. 2000). Gerade in der Analytik von Antibiotikarückständen werden häufig Ionenaustauscherchroma- tographien eingesetzt, wobei die Polarität der nachzuweisenden Substanzen in verschiedenen Lösungsmitteln ausgenutzt wird. Eine selektive Auftrennung ist abhängig von der Wahl der stationären und mobilen Phase für viele Stoffe, darunter auch Enro-

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und Ciprofloxacin, möglich. Ein großer Vorteil der Methode liegt darin, mit sehr sensitiven Detektoren selbst geringste Rückstandsmengen nachzuweisen.

Die High Performance Liquid Chromatography ist eine Weiterentwicklung der klassischen Flüssigkeitschromatographie, bei der innerhalb von Minuten eine hoch auflösen- de Auftrennung in einem feinen Strom der mobilen Phase entsteht. Sie wird in der Rückstandsanalytik häufig zum Einsatz gebracht. Ihre hohe Selektivität und Sensitivität ist auf die verwendete Trennsäule zurückzuführen. Die für die HPLC genutzten Säulen sind druckstabil, sehr fein gepackt und haben einen Durchmesser von 2-5 mm. Nach dem Verlassen der Trennsäule wird die mobile Phase durch einen Detektor geführt, der die eluierten Substanzen mit Hilfe optischer Messprinzipien erfasst. Aus dem entste- henden Chromatogramm kann die Retentionszeit und die Peakhöhe zur Identifikation der Substanz und ihrer Konzentration herangezogen werden. Durch die Möglichkeit, Probenaufarbeitung, Trennsäulen und mobile Phase verschieden zu kombinieren, kann eine Vielzahl von Substanzen sehr selektiv und sensitiv nachgewiesen werden, unter anderem auch die hier zur Untersuchung kommenden Stoffe (GEERTSMA et al. 1987;

NAGATA et al. 1992; BERGWERFF et al. 1998; STOEV u. MICHAILOVA 2000; GIGO- SOS et al. 2000). Nachteilig ist, dass sich die Selektivität der Trennsäulen stark unter- scheidet, so dass nicht automatisch auf alle Substanzen untersucht werden kann, sondern initial ein entsprechender Rückstandsverdacht vorliegen muss. Zusätzlich ist die Anschaffung einer HPLC-Anlage mit erheblichen Kosten verbunden, so dass dieses Verfahren nur für Laboratorien mit entsprechender Probenmenge in Frage kommt.

2.6.1.2 Agardiffusionstest

Das Prinzip dieses klassischen Verfahrens beruht auf der Diffusion eines antibakteriell wirksamen Arzneimittelrückstandes in einen festen Nährboden, der mit einem nach Art und Menge definierten Keim beimpft ist. Die Auswertung erfolgt über die Entstehung messbarer Hemmzonen des Keimwachstums. Als vorteilhaft ist der geringe labortechni- sche Aufwand und die damit verbundene Möglichkeit der Durchführung von Reihenun-

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tersuchungen einzustufen (KUNDRAT 1972; BOTSOGLOU et al. 2001). Nachteilig sind die unsichere Substanzidentifizierung und der fehlende Nachweis nicht mehr aktiver Me- tabolite. Außerdem ist nur bei Rückständen einzelner Substanzen unter genauer Kennt- nis des vorliegenden Stoffes eine Quantifizierung möglich.

Ohne Aufarbeitung ist der mikrobiologische Hemmstofftest nicht als Nachweismethode für Antibiotikarückstände in Eiern geeignet, da die Konsistenz des Eies eine Diffusion des nachzuweisenden Arzneimittelrückstandes in den Nährboden nahezu vollständig verhindert. Außerdem gibt DICKS (1973) zu Bedenken, dass die eieigenen Lysozyme zu falsch positiven Ergebnissen führen können und daher im Rahmen der Probenaufar- beitung sicher zerstört werden müssen.

Dies bringt einen erhöhten Zeitaufwand pro zu bestimmender Probe mit sich, darüber hinaus ist die Wiederfindungsrate meist geringer, als wenn die Probe direkt eingesetzt werden könnte.

2.6.1.3 Alternative Rückstandsnachweisverfahren von Enro- und Ciprofloxacin

Aufgrund der Vielzahl durchgeführter Studien mit dem Ziel der Optimierung des Rück- standsnachweises von Fluorchinolonen kann an dieser Stelle nur eine begrenzte Aus- wahl dargestellt werden.

Enro- und Ciprofloxacinrückstände in Lebergewebe lassen sich mit Hilfe der Kapillarzo- nenelektrophorese mit amperimetrischer Messung an der Endsäule nachweisen (WANG et al. 2005). Dabei ist es möglich unter Einhaltung von Optimalbereichen für Parameter wie pH-Wert, angelegter Stromstärke oder Geschwindigkeit der Probeninjektion sowohl Enro- als auch Ciprofloxacin in sehr niedrigen Konzentrationen zu messen. Die Nach- weisgrenze ist dabei 7 mal niedriger als der festgesetzte MRL-Wert. Diese Methode ist als wenig zeitintensiv, kostengünstig und trotzdem effektiv anzusehen und kann auch auf andere Gewebe angewendet werden (WANG et al. 2005).

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Eine weitere Möglichkeit des Nachweises von Antibiotikarückständen in Form einer se- miquantitativen Analyse ist die Kombination von Dünnschichtchromatograpie mit einem auf mikrobiologischer Basis arbeitenden Testkit (CHOMA et al. 2004). Dabei konnten sowohl Enro- als auch Ciprofloxacin in Mengen nachgewiesen werden, die unterhalb des festgelegten MRL lagen.

YUAN et al. (2001) verglichen mittels HPLC ermittelte Ergebnisse von Rückstandsun- tersuchungen auf Ciprofloxacin in Schweinefleisch mit denen, die mittels ELISA erzielt wurden. Mit beiden Methoden konnte Ciprofloxacin in Konzentrationen bis zu 10 ng/ml oder darunter nachgewiesen werden. Der ELISA wird insgesamt als sensitiveres Scree- ning-Verfahren, die HPLC als genaueres Bestätigungsverfahren eingeschätzt.

Beim Nachweis von Enro- und Ciprofloxacinrückständen mittels Agardiffusionstest eig- net sich eine mit E.coli vorbeimpfte Platte insofern am besten, da die ermittelte Nach- weisgrenze bei 1,5 ng für Enro- und bei 0,5 ng für Ciprofloxacinreinsubstanz liegt (OKERMAN et al. 2001). Der Test ist auch auf einer mit Bacillus subtilis vorbeimpften Platte durchführbar, allerdings verschiebt sich die Nachweisgrenze dann auf 4 bzw. 10 ng.

BENDIX et al. (2005) untersuchten die Eignung einer Kombination aus Festphasenex- traktion und Agardiffusionstest zur Ermittlung von Enrofloxacinrückständen in gespikten Volleiproben. Antibiotikafreie Eier wurden mit 16 – 80 µg Enrofloxacinreinsubstanz ver- setzt, über eine SA-Säule aufgereinigt und auf Platten aufgetragen, die mit Bac. subtilis BGA, Bac. stearothermophilus var. calidolactis und E. coli bei unterschiedlichen pH- Werten, z. T. unter Zusatz von Trimethoprim, beschickt worden waren. Hierbei lag die Nachweisgrenze trotz schlechter Wiederfindungsraten mit 20 µg/kg Vollei auf der E. coli Platte am niedrigsten.

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2.6.2 Vorliegende Rückstandsstudien zu Enro- und Ciprofloxacin

Im Folgenden soll eine Auswahl der vorliegenden Studien zum Rückstandsverhalten von Enro- und Ciprofloxacin im Hühnerei dargestellt werden.

LOLO et al. (2005) verabreichten 5 Legehennen, die getrennt aufgestallt wurden, an fünf aufeinander folgende Tagen 15 mg Enrofloxacin pro Tag intramuskulär, 5 weitere erhiel- ten 12 mg Enrofloxacin pro Tag oral mit dem Trinkwasser. Die Eier wurden vom ersten Tag der Behandlung bis 25 Tage über das Behandlungsende hinaus gesammelt und mittels Zweiphasen-Dialysen-Extraktion und anschließender HPLC-MS-Analyse untersucht. Die ersten Rückstände wurden 48 Stunden nach Therapiebeginn nachgewiesen, wobei die ermittelten Enrofloxacinkonzentrationen hundertfach höher waren als die von Ciprofloxacin. Beide Rückstandskurven stiegen bis zum fünften Tag an, was der Be- handlungsdauer entspricht. Danach gingen die Enrofloxacinkonzentrationen schnell zu- rück, im Gegensatz dazu blieb der Ciprofloxacinspiegel noch über mehrere Tage hoch und erreichte sein Maximum erst nach 7 Tagen (intramuskuläre Applikation) bzw. 9 Ta- gen (orale Applikation). Die Autoren erklären dieses Phänomen mit der Verstoffwechse- lung von Enrofloxacin zu Ciprofloxacin in der Leber, die erst vollzogen werden muss, bevor Maximalwerte erreicht werden können. Die höchsten gemessenen Konzentratio- nen waren für Enrofloxacin 6.484,2 µg/kg Eiklar und 2.935,7 µg/kg Eidotter, für Ciproflo- xacin 129,7 µg/kg Eiklar und 294,7 µg/kg Eidotter.

In einer Untersuchung von CHO et al. (2004) wurde bei vergleichbarem Versuchsansatz ebenfalls festgestellt, dass Enrofloxacinrückstände in höheren Konzentrationen nachgewiesen werden konnten als Ciprofloxacinrückstände, bei oraler Applikation bis 7 Tage und bei intramuskulärer Applikation bis 5 Tage nach Behandlungsende. Die höchsten gemessenen Enrofloxacinkonzentrationen lagen bei 892 µg/kg Eidotter bzw. 1.293 µg/kg Eiklar und 1.173 µg/kg Vollei am 5. Behandlungstag. Sowohl Enro- als auch Ciprofloxacin erreichten im Eiklar höhere Konzentrationen als im Eidotter, wobei im Ei- dotter länger Rückstände nachweisbar waren. Nach intramuskulärer Gabe war Ciproflo- xacin bis zum 5. Tag nach Behandlungsende nachweisbar, nach oraler Gabe bis zum