Eines der Ziele der vorliegenden Arbeit war es, mittels routinemäßig durchführbarer Rückstandsnachweisverfahren Ausscheidungskurven für den Wirkstoff Enrofloxacin und seinen Hauptmetaboliten Ciprofloxacin zu ermitteln sowie die aufgrund unterschiedlicher Haltungsformen oder Dosierungen zu erwartende Unterschiede im Rückstandsverhalten zu vergleichen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Sensitivität eines relativ we-nig kosten- und zeitintensiven Verfahrens wie des Agardiffusionstests im Vergleich zur Sensitivität der Hochleistungsflüssigchromatographie bezüglich ihrer Aussagekraft aus-reichend ist.
Die Untersuchungen wurden im Zentrum für Lebensmittelwissenschaften der Tierärztli-chen Hochschule Hannover durchgeführt.
3.1 Tiermaterial und Versuchsanordnung
Für den Versuch wurden 90 Hennen der Rasse Brown Leghorn verwendet. Die Tiere waren 30 Wochen alt und befanden sich im ersten Drittel der ersten Legeperiode.
Die Versuchsräume wurden durch selbstregulierende Heizkörper und eine vollautomati-sche Entlüftung klimatisiert. Die Raumtemperatur wurde auf 20°C bei einer rel. Luft-feuchtigkeit von 80% eingestellt. Die Tiere wurden in drei Gruppen zu je 30 Tieren zufäl-lig aufgeteilt und in verschiedene Haltungssysteme verbracht.
3.1.1 Versuchsansatz 1
30 Hühner wurden in Einzelkäfigen einer Größe von 40 x 40 x 40 cm aufgestallt. Pro Tier standen separate Wasser- und Futteraufnahmeplätze zur Verfügung. Wasser und ein antibiotikafreies, pelletiertes Alleinfutter für Legehennen wurden ad libitum
angebo-ten. Die Tiere standen auf schrägen Gitterrosten, um ein Abrollen der Eier aus dem Auf-enthaltsbereich der Hennen zu gewährleisten.
Eine Gruppe von 25 Hennen wurde als “Käfig 1“, weitere 5 Tiere als „Nullgruppe Käfig 1“ bezeichnet.
3.1.2 Versuchsansatz 2
Eine Gruppe von 30 Hühnern wurde analog der unter 3.1.1 beschriebenen Versuchsan-ordnung in Käfighaltung aufgestallt.
24 Hennen wurden nummeriert und als Gruppe “Käfig 2“ zusammengefasst, weitere 6 Tiere mit den Nummern 1, 2, 3, 10, 11 und 12 wurden als „Nullgruppe Käfig 2“ bezeich-net.
3.1.3 Versuchsansatz 3
25 Tiere wurden in Bodenhaltung auf einer Fläche von 4 qm aufgestallt. Der Bereich wurde mit Ruheplätzen in leicht erhöhter Position, 5 Legenestern sowie an der Decke befestigten, freihängenden Futtertrögen und Wasseraufnahmesystemen zur ad libitum Versorgung der Tiere ausgestattet. Als Einstreu dienten handelsübliche Sägespäne, die im Versuchsablauf alle drei Tage abdeckend nachgestreut wurden.
Diese Tiergruppe wurde als “Boden“ bezeichnet. Fünf Hennen wurden unter gleichen Bedingungen separat gehalten. Diese Tiere wurden als “Nullgruppe Boden“ bezeichnet.
3.2 Eingesetzte Arzneimittel und Versuchsdurchführung
Bei dem zur Anwendung gekommenen Arzneimittel handelte es sich um handelsübli-ches Baytril® 10% - Orale Lösung, zur Verabreichung über das Trinkwasser,
zugelas-sen für Mastgeflügel, der Firma Bayer Leverkuzugelas-sen (Zul. Nr.:13113.02.02, Ch.-B.:
ZZ8869). Laut Herstellerangaben werden eine 3-tägige Behandlung zur Prophylaxe und Therapie leichter und eine 5-tägige Behandlung zur Therapie schwerwiegender Erkran-kungen empfohlen.
3.2.1 Versuchsansatz 1
Die Tiere der Gruppe „Käfig 1“ wurden über fünf Tage täglich mit 1%iger Baytril-Lösung ad libitum behandelt (entspricht 1 g Enrofloxacin pro Liter Trinkwasser). Die gelegten Eier wurden ab dem ersten Behandlungstag gesammelt, aufgeschlagen, Eidotter und Eiklar getrennt, danach gewogen und bis zur Untersuchung bei -20°C gelagert. Die Pro-bennahme erfolgte täglich bis zum 40. Tag nach Behandlungsbeginn.
3.2.2 Versuchsansatz 2
Die Tiere der Gruppe „Käfig 2“ wurden über einen Zeitraum von drei Tagen mit einer 0,5%igen Baytril-Lösung ad libitum behandelt (entspricht 0,5 g Enrofloxacin pro Liter Trinkwasser). Die gelegten Eier wurden über einen Zeitraum von 40 Tagen ab dem ers-ten Behandlungstag gesammelt und wie oben beschrieben gekennzeichnet und gela-gert.
3.2.3 Versuchsansatz 3
Die Tiere der Gruppe „Boden“ wurden ebenfalls über einen Zeitraum von drei Tagen mit einer 0,5%igen Baytril-Lösung ad libitum behandelt (entspricht 0,5 g Enrofloxacin pro Liter Trinkwasser). Aus der Menge der gelegten Eier wurde täglich über einen Zeitraum von 40 Tagen ab dem ersten Behandlungstag eine Stichprobe von 5 Eiern gezogen und wie im Folgenden beschrieben weiterbehandelt.
3.2.4 Eingesetzte Proben
Folgende Proben wurden auf Rückstände untersucht:
Käfig 1
- Eiklar und Eidotter der Eier vom 1.-20. Tag nach Behandlungsbeginn - Eidotter der Eier vom 21.-40. Tag nach Behandlungsbeginn
Käfig 2
- Eiklar und Eidotter der Eier vom 1.-40. Tag nach Behandlungsbeginn
Boden
- Eiklar und Eidotter der Eier vom 1.-13. Tag nach Behandlungsbeginn
- Eiklar und Eidotter der Eier ab dem 14. Tag nach Behandlungsbeginn im Abstand von vier Tagen
Die von den Legehennen vor Beginn des Ausscheidungsversuches gelegten Eier wur-den ebenfalls mit iwur-dentischer Methodik auf Rückstände von Enrofloxacin und Ciprofloxa-cin untersucht.
3.3 Laboruntersuchungen
3.3.1 Material
3.3.1.1 Reinsubstanzen
Enrofloxacinhydrochlorid
- VP 2674
- PT-Nr. GRK 5022-3 - Aktivität: 89,56 %
- Herstellung der Enrofloxacin-Stammlösung:
o 1 mg = 0,8956 mg RS; 1,116 mg Einwaage 1 mg RS/ml Lsg.
Ciprofloxacin-Tabletten 250 mg®
- 1 Tablette = 0,3791 g = 250 mg RS - Herstellung der Ciprofloxacin-Stammlösung
o 0,3791 g = 250 mg RS; 1,516 g Einwaage 1 mg RS/ml Lsg.
Trimethoprim
- Chargen-Nr. 41491
- BP, PN 63/81
- Herstellung der Trimethoprim-Lösungen
• Stammlösung: 10 mg Trimethoprim/10 ml Ethanol
• Gebrauchslösung (5 µg/ml): 500 µl Stammlösung + 99,5 ml Bidest.
3.3.1.2 Nährmedien
Testagar pH 7,2
Herstellung: 25,8 g/l in destilliertem Wasser durch Erhitzen im Dampftopf lösen, pH-Wert prüfen und einstellen, autoklavieren (15 min. bei 121° C)
Fertignährboden Merck Art.-Nr. 7883 in der Zusammensetzung (g/l):
- Pepton 7,0
- Natriumchlorid 5,0
- Agar-Agar 13,0
- Tri-Natriumphosphat-12-hydrat 0,8
Seed-Agar zum Anzüchten der Testkeime
Herstellung: 27 g/l in Phosphatpuffer nach Sörensen, durch Erhitzen im Dampftopf lö-sen, pH-Wert prüfen und einstellen, autoklavieren (15 min. bei 121° C)
Fertignährboden Oxoid in der Zusammensetzung (g/l):
- Agar Nr.1, neutral 11,5 - Fleischpepton 6,0
- Caseinpepton 4,0
- Hefeextrakt 3,0
- Fleischextrakt “Lab-Lemco“ 1,5
- Glukose 1,0
Brain-Heart-Infusion-Lösung zur Keimanzüchtung
Herstellung: 37g/l in destilliertem Wasser lösen, zu 4,5 ml-Portionen in Reagenzgläser abfüllen und autoklavieren (15 min bei 121° C)
Fertignährboden Oxoid in der Zusammensetzung (g/l):
- Kalbshirninfusion 12,5
- Proteose-Pepton 10,0
- Rinderherzinfusion 5,0 - Natriumchlorid 5,0
- Dinatriumhydrogenphosphat 2,5
- Glukose 2,0
3.3.1.3. Testkeime
- Bacillus subtilis (BGA), Sporensuspension (107 KbE/ml) o Herkunft: BGA, Berlin, Lyophilisat Januar 1983 o Abschwemmung: 05.10.1998
- Escherichia coli, Stamm 14, Bayer AG, Keimsuspension (107 KbE/ml) o Herkunft: Bayer AG, Leverkusen
o Abschwemmung: 02.10.1998
3.3.1.4. Festphasensäule
- Chromabond SA-Säulen:
o Macherey-Nagel, Art. Nr. 73 00 77
o 500 mg Kationenaustauscher
3.3.1.5. Chemikalien
- Methanol: Firma Roth, Lot-Nr. 72843, Art.-Nr. P717.1
- Glycerin 98 %ig: chemisch rein, DAB 7: Firma Riedel-de-Haën - Essigsäure 100 %ig: Firma Roth, Ch.-B. 51838593, Art.-Nr. 3738.2 - Ammoniak 25 %ig: Firma Roth, Bestell-Nr. 5460.2
- Acetonitril: J.T. Baker Chemicals, Lot-Nr.0013830009, Bestell-Nr. 3-8143 - destilliertes Wasser: bidestilliert mit Quarz, Bi-Destillierapparat
- 0,01 molare Phosphorsäure - Triethylamin
- 1 % Essigsäure in Methanol zur Eiaufarbeitung:
o 1 ml 100 %iger Essigsäure mit 99 ml Methanol versetzt - 5 % Essigsäure in Methanol zur Säulenkonditionierung:
o 5 ml 100 %ige Essigsäure mit 95 ml Methanol versetzt - Ammoniakalische Methanollösung zur Elution der SA-Säule:
o 25 ml einer 25 % Ammoniaklösung mit 75 ml Methanol gemischt
3.3.2 Geräte
Material für die Keimanzüchtung und Abschwemmung:
- Rouxflaschen - Magnetrührer - Glasperlen
- Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml) - Platinöse
- Pasteurpipetten
Material für den Agardiffusionstest
- Glasplatten 23,5 x 44 cm
- Kunstoffringe 19 cm Innendurchmesser - Glaspetrischalen Durchmesser 19 cm - Erlenmeyerkolben 500 ml
- Reagenzgläser
- Korkbohrer 11 mm Durchmesser - Finnpipette 200 - 1000 µl
- Eppendorfpipette 100 µl
- Feststellbarer Stechzirkel und Lineal - Wasserfester Filzschreiber
- Wasserbad, Firma Memmert für 56° C
- Brutschränke, Firma Memmert für 30, 37 und 63° C
- pH-Meter: pH 530, Wissenschaftlich - Technische Werkstätten, Weilheim
Material für die Aufarbeitung der Eiproben:
- Zentrifugengläser 80 ml, Schott Duran - Waage: Omnilab OLX-300, max. 300 g - Waage: Sartorius BP 221S, max. 220 g - Metallspatel
- Pipetten, 20 ml Ex, Brand, B-Qualität - Pipetus-Akku: Hirschmann Laborgeräte - Ultraschallbad: Bransonic 12, Firma Jürgens - Kühlzentrifuge: Hermle Z383 K
- Ultraturrax: Micra RT, Stufe B = 17.800 U/min
Material für die Festphasenextraktion:
- Vakuumkammer: J.T. Baker
- Wasserstrahlpumpe
- 50 ml Plastikspritzen mit Adapter - graduierte Spitzröhrchen
- Spitzkölbchen für den Rotationsverdampfer
- Rotationsverdampfer: Vaccubrand Membranpumpe, Büchi Rotavapor®
HPLC-Anlage der Firma Shimadzu:
- Pumpe: mit Injektionsventil (20 µl), Knauer
- Trennsäule: Merck RP18 LiChrospher-100 HPLC - Fluoreszenzdetektor: HPLC Monitor RF 535 - Integrator: Chromatopac C-R5A
3.4 Methoden
3.4.1 Festphasenextraktion
Um die Eiproben mittels Festphasenextraktion aufreinigen zu können, mussten die Pro-ben von großen korpuskulären Partikeln befreit werden, da die Säule sonst unmittelbar nach dem Aufbringen der Proben verstopfte.
3.4.1.1 Probenvorbereitung
Die Einzelproben wurden mittels Rührstab homogenisiert und ein Aliquot von zwei Gramm mit 20 ml einer 1%igen Essigsäure in Ethanol im Ultraturrax vermischt. Um die Eibestandteile im größtmöglichen Umfang zu zerkleinern und damit die vorhandenen Rückstände der Untersuchung zuführen zu können, wurde die Probe im nächsten Schritt für 3 Minuten in einem Ultraschallbad behandelt. Nach anschließender fünfminü-tiger Zentrifugation bei 5000 Umdrehungen wurde der Überstand durch ein Filterpapier dekantiert. Mit dem so gewonnenen Filtrat wurden für Versuchsansatz 2 und 3 mit dem Ziel einer weiteren Verfahrenssensibilisierung die gesamten Extraktionsschritte wieder-holt. Die vereinten Überstände konnten dann zur Festphasenextraktion auf die konditio-nierte SA-Kationenaustauschersäule aufgebracht werden.
3.4.1.2 Festphasenextraktion mittels SA-Säule
Die SA-Säule wurde vor dem Aufbringen der Probe mit einem Säulenvolumen 5 %iger Essigsäure in Methanol konditioniert. Vor der Elution wurde nacheinander mit 5 ml Me-thanol, 10 ml Aqua Bidest. und erneut 5 ml Methanol gewaschen. Die Elution erfolgte mit 5 ml ammoniakalischer Methanollösung in graduierte Spitzröhrchen.
3.4.1.3 Einengung der Eluate
Die gewonnenen Eluate wurden im Rotationsverdampfer bei 40° C bis zur Trockene eingeengt und anschließend in 1 ml Eluent aus 0,01 molarer Phosphorsäure und Ace-tonitril, mit Triethylamin auf einen pH-Wert von 3 eingestellt, aufgenommen. In dieser Aufbereitung konnte die Probe der Hochleistungsflüssigchromatographie zugeführt wer-den.
3.4.2 High Performance Liquid Chromatography
3.4.2.1 Eichung der HPLC-Anlage
Zur Eichung der HPLC-Anlage, die täglich vor Probenbeginn und bei Bedarf auch inter-mittierend stattfand, wurden Enrofloxacin- und Ciprofloxacinlösungen definierter Kon-zentrationen hergestellt. Zu diesem Zweck wurde sowohl eine Enrofloxacin- als auch eine Ciprofloxacin-Stammlösung einer Konzentration von 1000 µg Wirkstoff/ml herge-stellt und bei -18° C für den Zeitraum der Untersuchung eingefroren. Durch Zugabe des-tillierten Wassers wurden vier verschiedene Konzentrationen eingestellt (0,1 µg/ml; 0,05 µg/ml; 0,025 µg/ml; 0,01 µg/ml) und als Probe aufgebracht. Mit Hilfe der so ermittelten Eichwerte wurde die Empfindlichkeit der HPLC-Anlage an jedem Untersuchungstag, zum Teil mehrfach, neu errechnet.
3.4.2.2 Wiederfindungsversuche
Um die ermittelten Ergebnisse abzusichern, wurden täglich einige Eier der so genannten Nullgruppen mit einer definierten Menge an Enrofloxacin- und Ciprofloxacinreinsubstanz gespiked (1 ml Reinsubstanz der Konzentration 0,1 µg/ml, 0,01 µg/ml oder 0,025 µg/ml) und analog der anderen Proben untersucht. Anhand der so ermittelten Werte konnte festgestellt werden, wie hoch die prozentuale Wiederfindung der gesuchten Substanzen war.
3.4.2.3 Durchführung der HPLC
Jeweils 20 µl der unter 3.4.1.3 beschriebenen Eluate wurden zur Analyse injiziert und im isokratischen Lauf bei 0,7 ml/min getrennt. Die Detektion von Enrofloxacin und Ciproflo-xacin erfolgte dann am Fluoreszenzdetektor Shimadzu RF 535 (Ex. 278 nm; Em. 445 nm).
Die Analyse der Proben aus Versuchsansatz 1 diente zur initialen Überprüfung und in der Folge zur Optimierung und Sensibilisierung des gesamten Verfahrens. So wurden aufgrund der im Rahmen dieser ersten Versuchsreihe gemachten Erfahrungen die Pro-ben der ersten Beobachtungstage aus Versuchsansatz 2 und 3 im Verhältnis 1:10 ver-dünnt. Dies war wegen der hohen Sensitivität der HPLC nötig, um auch Mengen in ho-hen Konzentrationsbereicho-hen nach erfolgter Rückrechnung so genau wie möglich ermit-teln zu können.
3.4.2.4 Mathematische Weiterverarbeitung der Messwerte
Die Ergebnisse der HPLC-Messungen stellen integrierte Flächengrößen dar. Diese Wer-te müssen zur weiWer-teren Verwertbarkeit in matrixbezogene Konzentrationsbereiche um-gerechnet werden (µg/kg). Zudem reagiert das HPLC-Gerät sensibel auf Umwelteinflüs-se wie bspw. Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Um dieUmwelteinflüs-ser möglicherweiUmwelteinflüs-se wechUmwelteinflüs-selnden Empfindlichkeit der Anlage Rechnung zu tragen, wurde nach jeweils 20 Proben eine Eichreihe, wie unter 3.4.3.4 erläutert, durchgeführt.
Die Ergebnisse der Eichreihen wurden gemittelt. Aus diesem Mittelwert kann mathema-tisch ein Faktor errechnet werden, mit dem alle Messergebnisse der Versuchsproben multipliziert werden, die in zeitlicher Nähe der Eichreihe ermittelt wurden. Im Ergebnis konnten die Integrale der Messkurven in Werte mit der Einheit µg/kg umgerechnet wer-den.
Konzentr. d. Eichproben * Wert d. Probe * 1000
Formel: --- = x Mittelwert d. Eichproben * 2 (µg Einwaage)
Anschließend erfolgte eine Wiederfindungskorrektur. Aus den täglichen Wiederfindungs-raten aller drei Versuchsansätze wurden sowohl für Enro- als auch für Ciprofloxacin je-weils für Eidotter und Eiklar Mittelwerte bestimmt, die als Umrechnungsfaktoren Anwen-dung fanden. Zur Berechnung der Gesamtbelastung der Eier mit Rückständen wurde von einem Gewichtsverhältnis von 1/3 Eidotter zu 2/3 Eiklar ausgegangen.
Auf dieser Basis wurden für alle Versuchsgruppen Ausscheidungskurven ermittelt und verglichen. In der Gruppe Käfig 2 wurde zusätzlich für jedes Huhn eine individuelle Aus-scheidungskurve errechnet. Alle Rückstandskonzentrationen wurden in µg/kg angege-ben.
3.4.3 Testkeimgewinnung
3.4.3.1. Herstellung der Sporensuspension
Vom Keim Bacillus subtilis BGA wurde durch folgendes Verfahren eine Sporensuspen-sion hergestellt:
Zuerst wurde ausgehend von einer vorhandenen Sporensuspension ein Reinheitsaus-strich auf Nähragar angefertigt. Am nächsten Tag wurden 6 ml einer Brain-Heart-Infusion–Bouillon (BHI) mit einer Einzelkolonie dieser Kultur beimpft und für 18 Stunden bei 30° C bebrütet.
Für die weitere Anzucht von Bac. subtilis wurden 200 ml Seed-Agar in eine sterile Rouxflasche gegeben. Dieser Nährboden wurde nach dem Erstarren mit 200 µl der vor-bebrüteten BHI-Bouillon beimpft und bei 30° C für 10 Tage inkubiert. Nach Ende der Bebrütungszeit wurde der dichte Keimrasen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung unter Verwendung steriler Glasperlen abgeschwemmt. Die so gewonnene Bakterien-suspension wurde für 30 Minuten bei 4500 U/min zentrifugiert, der Überstand abpipet-tiert und verworfen. Das Zentrifugat wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette in steriler
phy-siologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendierung wur-den noch zwei Mal wiederholt, anschließend wurde die Keimsuspension zur Abtötung der vegetativen Keime 10 Minuten bei 80° C inkubiert.
Die Keimdichte wurde sowohl durch das Koch´sche Plattengussverfahren als auch durch Oberflächenspatelverfahren bestimmt. Anschließend wurde mittels steriler physio-logischer Kochsalzlösung eine Keimdichte von 1-3 x 107 koloniebildende Einheiten/ml (KbE/ml) eingestellt und diese mit 7,5 % sterilem Glycerin versetzt. Im letzten Schritt wurden 1 ml – Portionen steril in Eppendorf - Reaktionsgefäße abgefüllt und bis zur wei-teren Verwendung bei –18°C eingefroren.
3.4.3.2. Anzucht von Escherichia coli
Zunächst wurde ausgehend von einer vorhandenen Keimsuspension ein Reinheitsaus-strich hergestellt. Am nächsten Tag wurden 6 ml einer Brain-Heart-Infusion-Bouillon (BHI) mit einer Einzelkolonie dieser Kultur beimpft und für 18 Stunden bei 30° C bebrü-tet.
Für die weitere Anzucht von Escherichia coli wurden anschließend 200 ml Standard-II-Agar in eine sterile Rouxflasche gegeben. Dieser erstarrte Nährboden wurde anschlie-ßend mit 200 µl der vorbebrüteten BHI-Bouillon beimpft und für 24 Stunden bei 30° C bebrütet. Nach Ende der Bebrütungszeit wurde der dichte Keimrasen mit steriler physio-logischer Kochsalzlösung unter Verwendung steriler Glasperlen abgeschwemmt. Die so gewonnene Bakteriensuspension wurde für 30 Minuten bei 4500 U/min zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und verworfen. Das Zentrifugat wurde mit Hilfe einer Pasteurpi-pette in steriler physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.
Die Bestimmung der Keimdichte erfolgte sowohl durch Koch´sches Plattengussverfah-ren als auch durch OberflächenspatelverfahPlattengussverfah-ren. Anschließend wurde mittels steriler phy-siologischer Kochsalzlösung eine Keimdichte von 5 x 107 KbE/ml eingestellt und diese mit 7,5% sterilem Glycerin versetzt. Anschließend wurden 1 ml - Portionen steril in Ep-pendorf-Reaktionsgefäße abgefüllt und bis zur weiteren Verwendung bei –18° C einge-froren.
3.4.4 Agardiffusionstest
Das Nachweisprinzip dieser Methode beruht wie unter 2.6.1.2 beschrieben auf der Dif-fusion eines antibakteriell wirksamen Antibiotikarückstandes in einen festen Nährboden mit definierter Keimeinsaat unter Ausbildung messbarer Hemmzonen nach Inkubation.
3.4.4.1 Herstellung der Testplatten
Die Herstellung der verwendeten Testplatten fand erst unmittelbar vor dem Ansetzen der Proben statt.
Zunächst wurden Kunststoffringe mit einem Innendurchmesser von 19 cm auf sterile Glasplatten aufgelegt. Bis zur Befüllung der Ringe mit den beiden Testagartypen wur-den die Platten mit sterilen Glasplatten abgedeckt, um einer möglichen Kontamination vorzubeugen.
Testplatte mit Bac. subtilis BGA, pH 7,2 + Trimethoprim
Der Testagar mit einem pH – Wert von 7,2 wurde im Dampftopf verflüssigt und im Was-serbad auf eine Temperatur von 56° C eingestellt. Daraufhin wurde in einem sterilen Erlenmeyerkolben 60 µl der Sporensuspension von Bac. subtilis BGA (107 KbE/ml) vor-gelegt und 60 ml des Agars dazugegeben. Anschließend wurden 600 µl der Tri-methoprim-Gebrauchslösung (Konzentration: 5 µg/ml) hinzugefügt. Nach gründlicher
Durchmischung wurde der keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegeben. So-bald der Nährboden erstarrt war wurden mit dem Korkbohrer Löcher mit einem Durch-messer von 11 mm eingestanzt, in die später 100 µl der aufbereiteten Probensuspensi-on pipettiert wurden. Nach dem Aufbringen der Proben wurden die Platten bei 30° C für 18 Stunden bebrütet und die entstandenen Hemmzonen in Millimetern gemessen.
Testplatte mit E. coli Stamm 14 Bayer AG, pH 7,2 + Trimethoprim
Der Testagar mit einem pH – Wert von 7,2 wurde im Dampftopf verflüssigt und im Was-serbad auf eine Temperatur von 56° C eingestellt. Daraufhin wurde in einem sterilen Erlenmeyerkolben 60 µl der Keimsuspension von E. coli Stamm 14 Bayer AG (107 KbE/ml) vorgelegt und 60 ml des Agars dazugegeben. Anschließend wurde 600 µl der Trimethoprim-Gebrauchslösung (Konzentration 5 µg/ml) hinzugefügt. Nach gründlicher Durchmischung wurde der keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegeben. So-bald der Nährboden erstarrt war, wurden mit dem Korkbohrer Löcher mit einem Durch-messer von 11 mm eingestanzt, in die später 100 µl der aufbereiteten Probensuspensi-on pipettiert wurden. Nach dem Aufbringen der Proben wurden die Platten bei 30° C für 18 Stunden bebrütet und die entstandenen Hemmzonen in Millimetern gemessen.
3.4.4.2 Erstellung von Verdünnungsreihen
Zur Ermittlung der Konzentration, die gerade noch eine Hemmwirkung (MHK = Minimale Hemmstoffkonzentration) zeigte, wurden Verdünnungsreihen mit Enrofloxacin- und Ciprofloxacinlösung definierter Konzentrationen angefertigt. Zu diesem Zweck wurden Stammlösungen mit einer Konzentration von 1000 µg Wirkstoff/ml hergestellt und bei -18° C für den Zeitraum der Untersuchung eingefroren. Durch Zugabe destillierten Was-sers wurden Versuchsreihen erstellt, wobei im Konzentrationsbereich von 1 µg/ml bis 0,25 µg/ml die Verdünnung immer in Abstufungen von 0,25 µg, in den Bereichen des MHK-Wertes allerdings in kleineren Abstufungen von 0,1 – 0,05 µg erfolgte. Aus den so
ermittelten Hemmhöfen wurden für beide Testkeime Eichreihen erstellt, von denen dann auf die Rückstandskonzentrationen der Proben geschlossen werden konnte.
3.4.4.3 Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung wurde analog den in den Kapiteln 3.4.3.1 bis 3.4.3.3 dargestell-ten Verfahrensweisen durchgeführt. Vor dem Aufbringen von 100 µl Probensuspension auf die Nährböden wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.
3.4.4.4 Auswertung der Hemmhöfe
Nach Ende der Bebrütungszeit wurden die Nährböden im Durchlicht betrachtet. Mit Hilfe eines Stechzirkels wurde der entstandene Hemmhof vom Rand des gestanzten Loches bis zum Beginn des Keimwachstums gemessen. Die Ermittlung der Hemmhofgröße er-folgte in Millimetern. War zwischen Stanzloch und Beginn des Keimwachstums keine keimfreie Zone entstanden, sondern lediglich eine geringere Keimdichte feststellbar, so wurde dieses Phänomen als Aufhellung bezeichnet. Zeigte sich keinerlei sichtbare Hemmwirkung, so wurde der entstandene Hemmhof mit 0 mm bewertet.
3.4.5 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary/North Carolina, USA, 1998). Neben der deskriptiven Statistik wurden vor al-lem Korrelationsanalysen nach Pearson durchgeführt.
4. Ergebnisse
4.1 Versuchsansatz 1
4.1.1 Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und Ciprofloxacinrückstände
Die im Rahmen der Hochleistungsflüssigchromatographie ermittelten Rückstände von Enrofloxacin erreichten in Eidotter Maximalwerte von 291,32 µg/kg (s = ± 231,65) am 4. Behandlungstag bzw. 294,03 µg/kg (s = ± 111,67) am 3. Tag nach Behandlungsende.
Rückstände waren bis zum 34. Tag nach Behandlungsende nachweisbar (0,22 µg/kg;
s = ± 0,44). Die Maximalwerte von Ciprofloxacin in Eidotter lagen bei 17,27 µg/kg (s = ± 20,44) am 4. Behandlungstag bzw. 79,26 µg/kg (s = ± 53,93) am 3. Tag nach
Be-handlungsende. Rückstände waren bis zum 27. Tag nach Behandlungsende nachweis-bar (1,22 µg/kg; s = ± 1,75) (Abb. 4.1.1).
1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06
1 3 5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Tag
µg/kg * 10
Enrofloxacin Ciprofloxacin
Behandlungsende
Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und Ciprofloxacinmenge in Eidotter in µg/kg * 100 während und nach fünftägiger oraler Applikation von 1% Baytril® - Orale Lösung (entspricht 1 g Enrofloxacin / l Trink-wasser), n = 25, Käfighaltung. (Abb. 4.1.1)
Im Eiklar wurden für Enrofloxacin Maximalwerte von 1.369,36 µg/kg (s = ± 1.638,18) am 5. Behandlungstag bzw. von 1.405,81 µg/kg (s = ± 1.100,98) am 1. Tag nach Behand-lungsende ermittelt. Rückstände waren bis zum 16. Tag nach BehandBehand-lungsende nach-weisbar (0,31 µg/kg; s = ± 0,92). Die Maximalwerte von Ciprofloxacin in Eiklar lagen bei
204,72 µg/kg (s = ± 286,80) am 5. Behandlungstag bzw. bei 208,56 µg/kg (s = ± 212,92) am 2. Tag nach Behandlungsende. Rückstände waren bis zum 9. Tag
nach Behandlungsende nachweisbar (1,90 µg/kg; s = ± 4,92) (Abb. 4.1.2).
1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06
1 3 5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tag
µg/kg * 100
Enrofloxacin Ciprofloxacin
Behandlungsende
Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und Ciprofloxacinmenge in Eiklar in µg/kg * 100 während und nach fünftägiger oraler Applikation von 1% Baytril® - Orale Lösung (entspricht 1 g Enrofloxacin / l Trink-wasser), n = 25, Käfighaltung. (Abb. 4.1.2)
Die Rückstandsmenge von Enrofloxacin in Vollei wurde wie unter 3.4.2.4 beschrieben aus den ermittelten Konzentrationen der Stoffe in Eidotter und Eiklar unter Berücksichti-gung der Gewichtsanteile im Verhältnis 1:2 bestimmt. Der Maximalwert lag bei 1.587,89 µg/kg (s = ± 560,59) am 5. Behandlungstag bzw. 1.626,36 µg/kg (s = ± 378,04) am 1. Tag nach Behandlungsende. Rückstände waren bis zum 34. Tag nach Behand-lungsende nachweisbar (0,22 µg/kg; s = ± 0,44). Die Maximalwerte von Ciprofloxacin in
Vollei lagen bei 221,13 µg/kg (s = ± 98,02) am 5. Behandlungstag bzw. bei 243,40 µg/kg (s = ± 71,93) am 2. Tag nach Behandlungsende. Rückstände waren bis zum 27. Tag nach Behandlungsende nachweisbar (1,22 µg/kg; s = ± 1,75) (Abb. 4.1.3).
1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06
1 3 5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tag
Enrofloxacin Ciprofloxacin
Behandlungsende
Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und Ciprofloxacinmenge in Vollei in µg/kg * 100 während und nach fünftägiger oraler Applikation von 1% Baytril® - Orale Lösung (entspricht 1 g Enrofloxacin / l
Mittels HPLC festgestellte Enrofloxacin- und Ciprofloxacinmenge in Vollei in µg/kg * 100 während und nach fünftägiger oraler Applikation von 1% Baytril® - Orale Lösung (entspricht 1 g Enrofloxacin / l