Frühe Immunantworten bei Helminthen-Infektionen:
Untersuchungen zur Rolle des Chemokins
Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17) am Beispiel des Nagetier-Modells Litomosoides sigmodontis
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von Jutta Kirsten Frank
aus Lemgo
Bonn, 2011
Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
1. Gutachter: Prof. Dr. Achim Hörauf 2. Gutachter: Prof. Dr. Waldemar Kolanus
Tag der Promotion: 22. Juni 2011 Erscheinungsjahr: 2011
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... 2
Abkürzungsverzeichnis ... 5
1 Einleitung ... 6
1.1 Das angeborene Immunsystem ...6
1.1.1 Dendritische Zellen ...7
1.1.2 Mastzellen ...8
1.2 Das adaptive Immunsystem ...9
1.3 Chemokine ... 11
1.3.1 Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17) ... 12
1.4 Humane Filariose ... 13
1.4.1 Onchozerkose ... 13
1.4.2 Lymphatische Filariose ... 14
1.5 Mausmodell für Filariosen: Litomosoides sigmodontis (Chandler, 1931) ... 15
1.5.1 Lebenszyklus von L. sigmodontis ... 16
1.5.2 Zelluläre Immunantworten gegen L. sigmodontis ... 17
1.5.3 Zytokin-Antworten gegen L. sigmodontis ... 18
1.6 Wolbachia-Endosymbionten ... 19
1.7 Fragestellung ... 20
2 Material und Methoden ... 21
2.1 Material ... 21
2.1.1 Geräte ... 21
2.1.2 Verbrauchsmaterial ... 21
2.1.3 Chemikalien und Reagenzien ... 22
2.1.4 Lösungen und Puffer ... 23
2.1.5 Enzyme ... 24
2.1.6 Wachstumsmedien und Zusätze ... 25
2.1.7 Stimulanzien ... 25
2.1.8 Kits ... 25
2.1.9 Inhibitions-Antikörper ... 25
2.1.10 ELISA-Antikörper ... 26
2.1.11 FACSTM-Antikörper ... 26
2.1.12 Primer ... 26
2.1.13 Tierhaltung ... 27
2.2 Methoden ... 28
2.2.1 Zellkultur ... 28
2.2.1.1 Knochenmarks generierte dendritische Zellen (bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) ... 28
2.2.1.2 Knochenmarks generierte Mastzellen (bone marrow derived mast cells, BMMCs)... 28
2.2.2 Laborzyklus von Litomosoides sigmodontis ... 29
2.2.3 Natürliche Infektion mit Litomosoides sigmodontis ... 29
2.2.4 Isolierung von L3 Larven ... 29
2.2.5 LsAg-Präparation ... 29
2.2.6 Injektionsexperimente ... 30
2.2.7 Nachweis eGFP-exprimierender Zellen ... 30
2.2.8 Extraktion von Zellen und Würmern aus der Thoraxhöhle ... 30
2.2.9 Zytospin-Analyse ... 30
2.2.10 Aufreinigung monoklonaler Antikörper ... 31
2.2.11 Depletionsexperimente ... 31
2.2.12 In vivo Messung der vaskulären Permeabilität ... 31
2.2.13 Histologie Mastzellen ... 32
2.2.14 Behandlung mit Histamin-Rezeptor-Antagonisten ... 32
2.2.15 Mastzellstabilisierung ... 32
2.2.16 Durchflusszytometrie (FACSTM-Analyse)... 32
2.2.17 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ... 33
2.2.18 mRNA-Expression ... 33
2.2.18.1 RNA-Extraktion aus Hautproben ... 33
2.2.18.2 Reverse Transkription zu cDNA ... 33
2.2.18.3 Real-time PCR ... 34
2.2.18.4 Plasmid-Standards ... 34
2.2.19 Statistik ... 35
3 Ergebnisse ... 36
3.1 Expression von CCL17 durch Stimulierung mit Filarien-Antigen ... 36
3.1.1 Stimulierung mit Wurmextrakt von L. sigmodontis führt zur Aktivierung dendritischer Zellen ... 36
3.1.2 Expression von CCL17 nach natürlicher Infektion mit L. sigmodontis in Haut, ... Lymphknoten und Lunge ... 37
3.2 Immunantworten bei CCL17-Defizienz in der Pleura-Kavität ... 39
3.2.1 Erhöhte Wurmlast bei CCL17-Defizienz nach Infektion mit L. sigmodontis ... 39
3.2.2 Zelluläre Antworten bei CCL17-Defizienz nach Infektion mit L. sigmodontis ... 41
3.2.2.1 Erhöhte Wurmlast bei CCL17-Defizienz unabhängig von CD25+ Zellen ... 43
3.2.2.2 CCR4-unabhängige Immunabwehr bei Filarien-Infektionen ... 44
3.2.3 Zytokin-Antworten bei CCL17-Defizienz nach Infektion mit L. sigmodontis ... 45
3.2.3.1 Erhöhte Wurmlast bei CCL17-Defizienz unabhängig von IL-10 ... 46
3.3 Frühe Immunantworten bei CCL17-Defizienz in der Haut ... 47
3.3.1 Vermehrte Auswanderung von Larven aus der Haut bei CCL17-Defizienz ... 47
3.3.2 Zytokin- und Chemokin-Antworten bei CCL17-Defizienz in der Haut ... 48
3.3.3 Keine erhöhte Lymphangiogenese in der Haut bei CCL17-Defizienz ... 49
3.3.4 Erhöhte vaskuläre Permeabilität bei CCL17-Defizienz nach natürlicher Infektion und Injektion von L3 Larven oder Wurmextrakt von L. sigmodontis ... 52
3.3.5 Rolle von Mastzellen bei CCL17-Defizienz nach Infektion mit L. sigmodontis ... 53
3.3.5.1 Erhöhte Mastzelleinwanderung und -degranulation bei CCL17-Defizienz nach Infektion ... mit L. sigmodontis ... 54
3.3.5.2 Umkehrung von vaskulärer Permeabilität und Wurmlast bei CCL17-Defizienz durch Mastzell-Stabilisierung ... 56
3.3.5.3 Keine wichtige Bedeutung von VEGF-A bei der Immunabwehr von L. sigmodontis ... 57
3.3.5.4 Erhöhte Wurmlast bei CCL17-Defizienz abhängig von Histamin ... 60
3.3.6 Mastzelldegranulation und vaskuläre Permeabilität nach Infektion von L. sigmodontis abhängig von Wolbachia ... 62
3.3.7 Mastzelldegranulation, vaskuläre Permeabilität und Wurmlast nach Infektion mit L. sigmodontis abhängig von TLR2 ... 63
4 Diskussion ... 65
4.1 Eine CCL17-Expression durch dendritische Zellen ist für die Immunantwort gegen ... Filarien wichtig ... 65
4.2 Der Einfluss von CCL17 auf CCR4+ Zellen in der Thoraxhöhle ist nur von geringer ... Bedeutung für die Immunabwehr bei Filarieninfektionen ... 67
4.3 Frühe, durch L3 Larven induzierte Immunantworten in der Haut sind ... Lymphangiogenese-unabhängig ... 71
4.4 CCL17 besitzt eine antagonistische Wirkung auf die CCL5-abhängige Mastzell-Migration ... bei Filarieninfektionen ... 73
4.5 Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen Mastzelldegranulation, vaskulärer Permeabilität, Histamin-Freisetzung und Parasitenlast ... 76
4.6 Mastzelldegranulation, vaskuläre Permeabilität und Wurmlast sind abhängig von Wolbachia-Endosymbionten und einer TLR2-Aktivierung ... 79
5 Zusammenfassung ... 82
6 Summary ... 83
7 Literaturverzeichnis ... 84
Abbildungsverzeichnis ... 95
Tabellenverzeichnis ... 96
Danksagung ... 97
Abkürzungsverzeichnis
ADLA akute Dermatolymphangioadenitis AFL acute filarial lymphangitis
APC Allophycocyanin
BMDCs Knochenmarks generierte dendritische Zellen BMMCs Knochenmarks generierte
Mastzellen bp Basenpaare
CCL CC-Chemokin-Ligand CCR CC-Chemokin-Rezeptor CD cluster of differentiation cDCs konventionelle DCs cDNA komplementäre DNA
CLA cutaneous lymphocyte antigen
d Tag
DCs dendritische Zellen DNA Deoxyribonukleinsäure
dNTP Deoxyribonuklein Triphosphate EDTA Ethylendiamintetraacetat eGFP enhanced green fluorescent
protein
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter FCS Fötales Kälber-Serum
FITC Fluoresceinisothiocyanat h Stunde (hora)
HR Histamin-Rezeptor
ICAM-1 intracellular adhesion molecule-1 IFN Interferon
Ig Immunglobulin IL Interleukin L1/ L2/
L3/ L4
Larvenstadium 1/ 2/ 3/ 4 LF Lymphatische Filariose
LN Lymphknoten
LPS Lipopolysaccharid
LsAg Antigenextrakt von Litomosoides sigmodontis
LTA Lipoteichonsäure
lyDCs im Lymphgewebe-verweilende DCs
MCs Mastzellen mDCs wandernde DCs Mf Mikrofilarien
MHC major histocompatibility complex mRNA messenger RNA
NK natürliche Killerzellen NKT natürliche Killer-T-Zellen NOD Nucleotide Oligomerization
Domain
ns nicht signifikant OD Optische Dichte
PAMPs Pathogen-assoziierte molekulare Muster
PBS Phosphat Buffer Saline PCR Polymerase-Ketten-Reaktion pDCs plasmazytoide DCs
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin-Chlorophyll Protein PFA Paraformaldehyd
pi nach Infektion (post infection) PRRs Mustererkennungsrezeptoren RNA Ribonukleinsäure
s.u. siehe unten
SEA Schistosoma mansoni-egg-antigen ssp Unterart
TARC Thymus and activation-regulated Chemokine (CCL17)
TGF-β transforming growth factor-beta Th T-Helferzelle
Th1 T-Helferzelle Typ 1 Th2 T-Helferzelle Typ 2 TLR Toll-like Rezeptor TNF Tumor Nekrose Faktor Tregs regulatorische T-Zellen TSLP Thymic stromal lymphopoetin u.a. unter anderem
VEGF-A Vascular endothelial growth factor-A
WSP Wolbachia surface protein z.B. zum Beispiel
1 Einleitung
Alle Lebewesen sind in ihrer Umwelt einer Vielzahl verschiedener Pathogene ausgesetzt. Sowohl Mikroorganismen wie Bakterien und Viren als auch eukaryotische Parasiten wie Helminthen stellen dabei eine potentielle Bedrohung für die eigene Existenz dar. Evolutionär hat sich als Antwort auf diese Gefahr ein komplexes Immunsystem entwickelt, dessen Aufgabe es ist, die Integrität eines Lebewesens in der Auseinandersetzung mit Bakterien, Parasiten und anderen Noxen zu gewährleisten. Das Immunsystem von Vertebraten kann in zwei Komponenten unterteilt werden, in das angeborene (innate) Immunsystem und das erworbene (adaptive) Immunsystem.
Das phylogenetisch ältere angeborene Immunsystem dient als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene, deren klassische Strukturen durch ein geringes Repertoire an Immunzell- Rezeptoren erkannt werden können. Darüber hinaus kontrolliert es die Aktivierung des adaptiven Immunsystems und die Determination der Effektorklassen der adaptiven Immunantwort. Zellen des angeborenen Immunsystems sind u.a. dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen, Granulozyten und natürliche Killerzellen, welche zusammen mit löslichen Faktoren wie denen des Komplementsystems an der Immunantwort des angeborenen Immunsystems beteiligt sind, die rasch (innerhalb weniger Stunden) erfolgt, jedoch nicht sehr spezifisch ist.
Im Gegensatz zum angeborenen Immunsystem handelt es sich bei der adaptiven Immunantwort um vergleichsweise langsame Prozesse (von mehreren Tagen), bei denen klonal selektionierte T- und B-Lymphozyten eine Schlüsselrolle spielen. Sie exprimieren hoch-spezifische und vielfältige Antigen- Rezeptoren, welche durch somatische Rekombination während der Ontogenese entstehen. Nach Antigenkontakt proliferieren die entsprechenden Lymphozyten und differenzieren zu hochspezifischen Effektorzellen zur Eliminierung des Pathogens. Darüber hinaus ist das adaptive Immunsystem durch die Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses charakterisiert, welches dem Organismus langanhaltende Immunität verleihen kann (Janeway 2005).
1.1 Das angeborene Immunsystem
Die phylogenetisch älteren Abwehrfunktionen des innaten Immunsystems sind schnell aktivierbar oder konstitutiv vorhanden und in ihren einzelnen Bestandsteilen stark konserviert. Das angeborene Immunsystem ist bei Pflanzen, Invertebraten und Vertebraten vorhanden, während die Ausprägung einer adaptiven Immunantwort nur bei Vertebraten beobachtet werden kann (Medzhitov and Janeway 2000). Es wird auch als unspezifisch bezeichnet, da die eingeleiteten Abwehrmaßnahmen unabhängig vom jeweils eindringenden Erreger aktiv werden. Zu den ersten Abwehrmaßnahmen wird die Barrierefunktion von Epithelien (Haut, Respirationstrakt, Gastrointestinaltrakt, Urogenitaltrakt) gezählt, welche durch mechanische und chemische Prozesse den Eintritt von Bakterien verhindern. Zudem spielen das Flimmerepithel der Lunge, das saure Milieu des Magens und der Vagina und eine Reihe löslicher Faktoren eine tragende Rolle, u.a. anti-mikrobielle Enzyme, die Magensäure und von Schleimhäuten sezernierte antimikrobielle Substanzen, welche eine opsonierende Wirkung haben. Des Weiteren leistet das Komplementsystem einen wichtigen Beitrag als Bestandteil der humoralen Immunantwort (Abbas and Lichtman 2004). Dieses besteht aus einer Kaskade von proteolytischen Enzymen, die nach sequentieller Aktivierung zur Opsonisierung und Lyse von Mikroorganismen führen. Außerdem existiert eine Vielzahl an löslichen Mediatoren.
Interferone (IFN) und Interleukine (IL) üben zum einen direkte Effektorfunktionen aus und zum anderen ermöglichen sie neben Chemokinen die Kommunikation zwischen Zellen. Auf zellulärer Ebene vermitteln insbesondere dendritische Zellen sowie Makrophagen, natürliche Killerzellen, Mastzellen und Granulozyten (Eosinophile, Basophile und Neutrophile) die Abwehrmechanismen des angeborenen Immunsystems (Abbas and Lichtman 2004; Janeway 2005).
Das innate Immunsystem kann zwischen „Selbst“-Antigenen und fremden Pathogenen unterscheiden. Die Erkennung geschieht in hohem Maße über eine limitierte Anzahl Keimbahn- kodierter Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs). PRRs erkennen sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), eine heterogene Gruppe evolutionär konservierter molekularer Strukturen, die für das Überleben von infektiösen Organismen wie Bakterien, Viren, Pilzen und Parasiten essentiell sind, so dass sie kaum einer Variation durch Mutationen unterliegen. Bestimmte dieser invarianten Muster sind spezifische Merkmale von Mikroorganismen und existieren nicht in höheren Eukaryoten, wodurch es dem angeborenen Immunsystem ermöglicht wird zwischen Selbst- und Fremd-Antigenen zu unterscheiden. Klassische PAMPs sind die Strukturen von Lipopolysacchariden (LPS) und Lipoteichonsäuren (LTA), unmethylierte CpG-Dinukleotide, doppelsträngige RNA, Mannane, Flagellin und Peptidoglykan (Janeway 1989; Medzhitov and Janeway 1997).
PRRs werden vor allem auf Effektorzellen des angeborenen Immunsystems wie dendritischen Zellen und Makrophagen exprimiert, welche als Erste mit eindringenden Pathogenen in Kontakt kommen. Zu den PPRs werden u.a. Scavenger-Rezeptoren, Mannose-Rezeptoren, Mannose- bindendes Lektin, C-reaktives Protein, nucleotide oligomerization domain (NOD)-like Rezeptoren, retinoic acid-inducible gene-like Rezeptoren und Toll-like-Rezeptoren (TLRs) gezählt (Akira and Takeda 2004; Janeway 2005; Meylan, Tschopp et al. 2006).
Die Familie der TLRs gehört zu den bestuntersuchtesten PRRs. Die Membran-ständigen Toll-like- Rezeptoren lösen nach Erkennung bestimmter PAMPs eine intrazelluläre Signalkaskade aus, die zur Expression verschiedener Gene, z.B. proinflammatorischer Zytokine, Chemokine und kostimulatorischer Moleküle, führt und somit die Induktion von adaptiven Immunantworten einleitet. Die Membran-ständigen TLRs werden bei Säugetieren entweder an der Zelloberfläche oder in endosomalen/ lysosomalen Organellen exprimiert. Letztere detektieren hauptsächlich mikrobielle Nukleinsäuren wie doppelsträngige RNA (TLR3), einzelsträngige RNA (TLR7) und doppelsträngige DNA (TLR9). TLRs auf der Zelloberfläche erkennen dort zugängliche PAMPs meist mikrobieller und parasitärer Bestandteile, beispielsweise LPS (TLR4), LTA (TLR1/TLR2 und TLR2/TLR6) und Flagellin (TLR5) (Akira and Takeda 2004). Die Expression der verschiedenen TLRs ist Zelltyp-spezifisch.
1.1.1 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DCs) sind eine der ersten Zellen des angeborenen Immunsystems, welche auf eindringende Pathogene treffen und die Immunantwort einleiten. Sie sind über die Expression einer Reihe verschiedener Mustererkennungsrezeptoren wie Toll-like-Rezeptoren (Akira, Takeda et al.
2001), Scavenger-Rezeptoren (Aderem and Ulevitch 2000) und Peptidoglykan-Erkennungsproteine (Gottar, Gobert et al. 2002) in der Lage Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu erkennen und Abwehrmaßnahmen zur Elimination der Pathogene einzuleiten. Erkennt eine DC durch Bindung an einen (Oberflächen-) Rezeptor PAMPs, wird die Zelle aktiviert. Sie nimmt das Antigen auf, prozessiert es, um es dann als reife Antigen-präsentierende Zelle naiven T-Zellen zu präsentieren und induziert damit adaptive Immunantworten. Die DC erfüllt damit als Antigen-präsentierende Zelle wichtige regulatorische Funktionen zwischen dem innaten und adaptiven Immunsystem. Die Migration der DCs zu naiven T-Zellen in die drainierenden Lymphknoten wird von einer signifikanten Hochregulierung von major histocompatibility complex (MHC)-Molekülen begleitet (Cella, Engering et al. 1997), über welche die Präsentation der Antigene und die Erkennung durch T-Zellrezeptoren erfolgt, während die Fähigkeit zur Aufnahme von Antigen eingestellt wird. Zusätzlich kommt es zu einer erhöhten Expression von z.B. intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) und von kostimulatorischen Molekülen wie CD80, CD86 und CD40, die das kostimulatorische Sekundärsignal zur vollständigen Aktivierung naiver T-Zellen liefern. Aktivierte DCs erlangen zudem eine erhöhte Bereitschaft zur Sekretion T-Zell stimulierender Zytokine und Chemokine (Janeway 2005). Hat eine naive T-Helfer (Th)- Zelle beide Aktivierungssignale erhalten, kann sie sich zu einer T-Effektorzelle
differenzieren. Das Milieu von Zytokinen, das von den Antigen-präsentierenden DCs erzeugt wird, beeinflusst, in welche Effektorklasse (Th1 oder Th2) sich die Th-Zellen entwickeln. Dabei ist die Art, in der DCs auf die Differenzierung der Th-Zellen Einfluss nehmen, abhängig von der Aktivierung der DCs selbst. DCs werden durch PAMPs der verschiedenen Pathogene, die sie erkennen, und Gewebefaktoren, die von zahlreichen residenten Gewebezellen und Immunzellen in ihrer Nähe wie Epithelzellen, natürliche Killerzellen, Mastzellen, Makrophagen und Fibroblasten als Antwort auf die Pathogen-Invasion exprimiert werden, unterschiedlich polarisiert (Kapsenberg 2003). Die Expression von Interleukin-12 (IL-12) durch polarisierte, reife DCs z.B. führt eher zu einer Entwicklung von Th1- Zellen, die über die Sekretion von z.B. IFN-γ eine zelluläre Immunabwehr gegen intrazelluläre Bakterien und Viren vermitteln. Th2-Zellen hingegen, welche z.B. durch IL-4 induziert werden, regulieren die humorale Immunantwort und Immunmechanismen gegen extrazelluläre Parasiten über die Produktion von z.B. IL-4, IL-5 und IL-13.
Dendritische Zellen entwickeln sich wie viele andere Zellpopulationen aus multipotenten hämatopoietischen Stammzellen aus dem Knochenmark. Sie sind sehr heterogen (Shortman and Liu 2002), denn obwohl alle DCs zur Aufnahme, dem Prozessieren und der Präsentation von Antigen fähig sind, unterscheiden sich die verschiedenen DC-Subtypen doch anhand ihre Lokalisation im Organismus, den unterschiedlichen Migrationswegen, den genauen immunologischen Funktionen und in ihrer Abhängigkeit von Infektionen oder inflammatorischen Signalen für ihre Entwicklung (Shortman and Naik 2007). So werden DCs in wenigstens zwei Hauptgruppen eingeteilt, plasmazytoide DCs (plasmacytoid DCs, pDCs) und konventionelle dendritische Zellen (conventional DCs, cDCs).
Plasmazytoide DCs werden in ihrem Grundzustand zu Vorläufer-DCs gezählt. Dies sind nicht- dendritische, relativ langlebige und zirkulierende Zellen, die sich erst nach Stimulierung durch virale oder bakterielle Antigene zu pDCs mit dendritischer Form und Antigen-prozessierenden und -präsentierenden Eigenschaften entwickeln und große Mengen an Typ I Interferon ausschütten (Grouard, Rissoan et al. 1997; Liu 2005).
Konventionelle DCs können weiter unterteilt werden in wandernde DCs (migratory DCs, mDCs) und im Lymphgewebe-verweilende DCs (lymphoid-tissue-resident DCs, lyDCs) (Shortman and Naik 2007). Zu den mDCs werden Langerin+ Langerhanszellen gezählt sowie die meisten DCs in peripheren, nicht-lymphoiden Geweben wie dermale DCs und interstitielle DCs (Romani, Holzmann et al. 2003). mDCs agieren als Wächter im peripheren Gewebe und migrieren nach Antigen- Aufnahme zu den peripheren Lymphknoten, um dort T-Zellen Antigen zu präsentieren. Wenn sie den Lymphknoten erreichen, haben mDCs in der Regel einen vollentwickelten Phänotyp erreicht und die Möglichkeit zur Antigenaufnahme heruntergefahren (Shortman and Naik 2007). LyDCs umfassen die meisten DCs des Thymus und der Milz (Vremec, Pooley et al. 2000) und können anhand der Expression verschiedener Oberflächenmoleküle in weitere Subtypen unterteilt werden. Anders als mDCs migrieren sie nicht zu Lymphknoten sondern nehmen vor Ort Fremd- und Selbst-Antigene auf und präsentieren diese. Sie haben einen weniger entwickelten Phänotyp, sind aber aktiv in Antigen- Aufnahme und -Prozessieren (Shortman and Naik 2007). Bei früheren Einteilungen wurden dendritische Zellen anhand spezifischer Oberflächenmarker in plasmazytoide, lymphoide und myeloide DCs sowie Langerhanszellen unterteilt.
1.1.2 Mastzellen
Oft finden erste Immunreaktionen gegen eindringende Pathogene in der Haut statt. Neben DCs ist die Mastzelle unter den Zellen des angeborenen Immunsystems eine der Prominentesten dort.
Mastzellen befinden sich ebenso in großer Zahl in anderen Bereichen des Körpers, die in direktem Kontakt mit der Umwelt stehen wie den Atmungsorganen, das Lungengewebe und der gastrointestinale Trakt, wo sie im Bereich der Epithelien, insbesondere in direkter Nähe zu Blut- und Lymphgefäßen und Nerven, lokalisiert sind.
Mastzellen exprimieren, abhängig von ihrer Lokalisation sowie ihres Differenzierungs- und Aktivierungsstatus, eine Reihe verschiedener Rezeptoren, durch welche es auf unterschiedlichen Wegen zur Aktivierung der Zelle und Ausschüttung verschiedener Substanzen kommen kann. Die bekannteste physiologische Aktivierung von Mastzellen erfolgt über die Quervernetzung des hochaffinen IgE-Rezeptors FcεRI (high affinity immunoglobulin E (IgE)-binding receptor). Im Gegensatz zu anderen Fc-Rezeptoren wird der FcεRI ausschließlich von Mastzellen und Basophilen exprimiert. Er bindet reversibel, jedoch mit hoher Affinität die Fc-Region freier, monomerer IgE Moleküle, dabei die Fab-Region zur Antigen-Erkennung präsentierend. FcεRI sind in vivo stets mit IgE- Antikörpern beladen. Wird ein Antigen über die IgE-Moleküle von zwei oder mehreren FcεRI gebunden, kommt es zu einer Quervernetzung („crosslinking“) der FcεRI, woraufhin eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade ausgelöst wird, die in der Regel zur Ausschüttung inflammatorischer Mediatoren führt (Kambayashi, Larosa et al. 2009). Mastzellen exprimieren aber auch neben dem FcεRI u.a. IgG-Rezeptoren FcγRIIa (CD32a), FcγRI (CD64), verschiedene G-Protein gekoppelte Rezeptoren wie Prostaglandin E2 Rezeptor, Komplementrezeptoren C3a und C5a, verschiedene Zytokin-Rezeptoren, Chemokin-Rezeptoren und Toll-like Rezeptoren, über die sie aktiviert werden können (Stone, Prussin et al. 2010). Somit gibt es neben der Antikörper-vermittelten Mastzellaktivierung über FcεRI auch eine Reihe IgE-unabhängiger Aktivierungsmechanismen oder Stimuli, die ebenfalls zur Aktivierung der Mastzelle führen können.
Die Mastzell-Aktivierung kann durch verschiedene zeitliche Abfolgen in drei Phasen eingeteilt werden, bei denen verschiedene von der Mastzelle produzierte Mediatoren in die Umwelt abgegeben werden. Diese führen u.a. zu einer erhöhten vaskulären Permeabilität der Gefäße und Einwanderung inflammatorischer Zellen in das umliegende Gewebe (Marshall 2004; Kambayashi, Larosa et al. 2009). Innerhalb weniger Sekunden bis Minuten können in der ersten Phase durch den Prozess der Degranulation verschiedene vorgeformte, in Granula gespeicherte Mediatoren in das umliegende Gewebe freigesetzt werden. Dies sind u.a. Proteasen mit Tryptase-, Chymase- oder Carboxypeptidase-Aktivität, die unterschiedliche Rollen in Gewebeumstrukturierung und der Zellrekrutierung spielen (Marshall 2004). Daneben werden vasoaktive Amine wie Histamin freigesetzt, die zu einer erhöhten vaskulären Permeabilität der benachbarten Gefäße führen und zu einer erleichterten Einwanderung inflammatorischer Zellen und Mediatoren in das Gewebe.
Mastzell-Granula enthalten außerdem Proteoglykane wie Heparin, welche eine wichtige Rolle als Depot für Chemokine wie Tumor Nekrose Faktor (TNF) und Wachstumsfaktoren wie Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) spielen, die zur Rekrutierung von Effektor-Zellen bzw. der Steigerung der Angiogenese und erhöhter Permeabilität der Gefäße führen. In einer zweiten, zeitlich leicht verzögerten Phase kommt es zur Bildung von Lipid-Mediatoren und Arachidonsäuremetaboliten, die zusätzlich die Gefäßdurchlässigkeit erhöhen und zur Rekrutierung von Eosinophilen bzw. Neutrophilen beitragen. In der sich über Stunden ausdehnenden dritten Phase werden verschiedene Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren neu synthetisiert und sekretiert, die zur fortwährenden Rekrutierung inflammatorischer Zellen führen.
1.2 Das adaptive Immunsystem
Die Abwehrmechanismen des adaptiven Immunsystems unterscheiden sich von denen des angeborenen Immunsystems anhand der hochspezifischen Erkennung von Antigenen durch B- und T- Lymphozyten und der Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses. Durch somatische Rekombination, klonale Selektion und Hypermutation wird die Spezifität für eine große Anzahl verschiedener Antigene gewährleistet.
T- und B-Lymphozyten entwickeln sich aus hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark, wobei die Reifung von T-Zellen im Thymus erfolgt während sich B-Zellen mit Ausnahme von B1-Zellen im Knochenmark entwickeln. B-Zellen proliferieren nach Aktivierung durch eine spezifische Antigen- Erkennung über ihren B-Zell-Rezeptor in Plasmazellen, welche große Mengen von Antikörpern
(Immunglobulinen) sekretieren, durch welche Pathogene opsoniert und eliminiert werden können (Janeway 2005).
T-Zellen differenzieren sich in mehrere Subpopulationen, welche u.a. CD8+ zytotoxische T-Zellen, CD4+ T-Helfer-Zellen und regulatorische T-Zellen (Tregs) umfassen. Durch somatische Rekombination wird ein großes Repertoire von T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptoren erschaffen. Doch nur Zellen, welche von MHC-Molekülen präsentierte körpereigene Antigene über ihren T-Zellrezeptor erkennen und mit mittlerer Affinität binden und keine Autoantigene erkennen, reifen aus und gelangen als periphere, naive T-Lymphozyten in die Blutzirkulation. Während dieses Selektionsprozesses entscheidet sich auch über die Bindung des T-Zell-Rezeptors und seiner Korezeptoren an MHC Klasse I (MHC-I) oder II (MHC-II) Moleküle, ob sich ein T-Lymphozyt zu einer CD8- oder CD4-positiven T-Zelle entwickelt (Janeway 2005). CD4+ T-Zellen agieren als Regulatoren (sogenannten T-Helferzellen) der zellulären und humoralen (Antikörper-vermittelten) Immunantwort. CD8+ zytotoxische T-Zellen lysieren Tumorzellen und Zellen, welche mit intrazellulären Pathogenen (Viren und Bakterien) infiziert wurden, nach MHC-I vermittelten Antigen- Kontakt über die Sekretion zytotoxischer Proteine. Von CD8+ T-Zellen sezerniertes IFN-γ spielt zudem eine wichtige Rolle in der Induktion der Expression von MHC-I Molekülen auf Zellen und der Aktivierung von Makrophagen (Glik and Douvdevani 2006).
Zur Aktivierung von T-Zellen werden zwei Signale benötigt. Zunächst erhält eine T-Zelle durch die Interaktion ihres spezifischen T-Zell-Rezeptors mit einem Antigen, präsentiert über MHC-I oder II- Peptid-Komplexe auf einer Antigen-präsentierenden Zelle das Primär-Signal. Über MHC Klasse I Moleküle, welche auf der Zelloberfläche von nahezu allen nukleären Zellen exprimiert werden, erfolgt die Präsentation zytosolischer Peptide, die von CD8+ T-Zellen erkannt werden. MHC Klasse II Moleküle werden primär von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen wie DCs, Makrophagen und B-Zellen exprimiert. Sie präsentieren Antigene von meist extrazellulären Pathogenen wie Bakterien oder Parasiten, welche endozytotisch von den Zellen aufgenommen und degradiert wurden und werden vom T-Zell-Rezeptor auf CD4+ T-Zellen erkannt. Das Sekundär-Signal erfolgt über die Erkennung kostimulatorischer Moleküle wie z.B. CD80 oder CD86 auf der Oberfläche der Antigen- präsentierenden Zelle durch die Interaktion mit dem T-Zell eigenen CD28-Rezeptor (Janeway 2005).
Die spezifische Antigen-Erkennung und kostimulatorischen Signale führen zur Differenzierung naiver CD4+ T-Helferzellen (Th) in zwei unterschiedliche Subpopulationen, den Th1 oder Th2 Effektor- Zellen. Dabei beeinflusst das Zytokinmilieu, das nach Antigenkontakt durch die Antigen- präsentierenden Zellen erzeugt wird, die Polarisierung zur Th1 oder Th2 Differenzierung. IL-4 z.B. ist für die Induktion von Th2-Zellen nötig (Swain, Weinberg et al. 1990) und wird von CD4+ Gedächtniszellen, Mastzellen etc. produziert, während IL-12 die Differenzierung zu Th1-Zellen induziert (Seder, Gazzinelli et al. 1993) und von dendritischen Zellen und Makrophagen produziert wird. Th1-Zellen sezernieren typischerweise IL-2 und IFN-γ wohingegen Th2-Zellen hauptsächlich IL-4, IL-5, IL-10 oder IL-13 exprimieren. Dabei erleichtern Th1-Zellen generell Zell-abhängige Immunantworten, z.B. durch die Aktivierung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen zur Abwehr von intrazellulären Erregern. Th2-Zellen beeinflussen über die spezifische Zytokin-Produktion währenddessen die humorale Immunantwort hauptsächlich gegen extrazelluläre Pathogene wie Bakterien und helminthische Parasiten, indem B-Zellen zur Proliferation und Differenzierung zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen und Gedächtniszellen angeregt werden (Delves and Roitt 2000; Janeway 2005).
Die Polarisierung der Th-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen vollzieht sich meist in sekundären lymphoiden Organen, welche dem Infektionsherd nahe liegen und zu denen naive CD4+ T-Zellen vorzugsweise migrieren. Die differenzierten Th-Zellen müssen zur Ausübung ihrer spezifischen Effektorfunktion die lymphoiden Organe wieder verlassen und zur Infektionsstelle geleitet werden.
So können über eine unterschiedliche Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokin- Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche die unterschiedlichen T-Zellen zu spezifischen Stellen im Körper gelenkt werden (Janeway 2005). Durch die unterschiedliche Expression von Chemokin-Rezeptoren
auf Th1- und Th2-Zellen kann eine spezifische Rekrutierung erzielt werden (Oo, Shetty et al. 2010).
Beispielsweise exprimieren Th2-Zellen bevorzugt die Chemokin-Rezeptoren CCR4 und CCR8, welche als Rezeptoren für das Th2-assoziierte Chemokin CCL17 dienen (Bonecchi, Bianchi et al. 1998; Iellem, Mariani et al. 2001).
Eine weitere Subpopulation von T-Zellen sind neben anderen die regulatorischen T-Zellen (Tregs).
Sie sind in der Lage, die Aktivierung anderer T-Zellen zu unterdrücken. Ihre Hauptfunktion ist damit die Einschränkung der Pathologie von Infektionen durch Dämpfung inflammatorischer Immunreaktionen sowie die Kontrolle von Autoimmunreaktionen (Roncarolo, Gregori et al. 2006;
Sakaguchi, Ono et al. 2006). Dies geschieht zum einen über eine Zellkontakt-abhängige Suppression oder über die Inhibition mit immunsuppressiven Zytokinen wie IL-10 und TGF-β. Tregs werden in wenigstens zwei Subpopulationen unterteilt. Tr-1 Zellen produzieren IL-10 und werden als adaptiv bezeichnet, da sie sich aus naiven CD4+CD25- T-Zellen nach Antigen-Stimulierung in der Peripherie entwickeln (Roncarolo, Gregori et al. 2006). CD4+Foxp3+ T-regulatorische Zellen, die mehrheitlich CD25 konstitutiv exprimieren und deren regulatorischer Phänotyp sich durch die Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 auszeichnet, entwickeln sich entweder im Thymus (natürliche CD4+Foxp3+ T-regs) oder aus naiven peripheren CD4+ T-Zellen (induzierte CD4+Foxp3+ Tregs) (Jordan, Boesteanu et al. 2001; Sakaguchi, Ono et al. 2006; Taylor, van der Werf et al. 2009). Man unterscheidet zudem zwischen IL-10-exprimierenden und IL-10-negativen CD4+Foxp3+ T- regulatorische Zellen (Maynard, Harrington et al. 2007).
1.3 Chemokine
Für eine effiziente Immunabwehr ist es unabdingbar, dass sich Leukozyten wie T-Zellen am richtigen Ort zur richtigen Zeit befinden. Daher wird ein System wie das Chemokin-System benötigt, um die Migration und Positionierung von Effektor- und regulatorischen Leukozyten-Populationen in lymphoiden und nicht-lymphoiden Geweben zu regulieren (Oo, Shetty et al. 2010).
Chemokine sind etwa 8-14kDa große Heparin-bindende Zytokine ähnlicher Struktur, die die Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Leukozyten-Subpopulationen induzieren (Zlotnik and Yoshie 2000). Manche Chemokine haben zusätzlich zur chemotaktischen Aktivität eine regulierende Wirkung auf die Hämatopoese und Angiogenese (Cacalano, Lee et al. 1994; Nagasawa, Hirota et al.
1996).
Generell werden Chemokine in zwei funktionelle Subklassen unterteilt, in inflammatorische oder homöostatische/ konstitutive Chemokine. Diese funktionelle Einteilung beruht darauf, ob Chemokine durch eine Entzündung induziert werden oder ob sie konstitutiv exprimiert und in die homöostatische Immunregulation involviert sind. Manche Chemokine besitzen beide Funktionalitäten (Oo, Shetty et al. 2010).
Inflammatorische Chemokine werden in entzündetem Gewebe von lokalen oder das Gewebe infiltrierenden Zellen nach Stimulation durch pro-inflammatorische Zytokine oder nach Kontakt mit pathogenen Erregern exprimiert. Durch die Erkennung von Pathogenen über PRRs auf Epithel-, Bindegewebs- und Immunzellen werden Chemokine bereits sehr früh nach der Infektion sezerniert.
Sie rekrutieren zunächst Zellen des angeborenen Immunsystems ins entzündete Gewebe, darunter DCs, Granulozyten, Makrophagen, Natürliche Killerzellen und Mastzellen, welche alle inflammatorische Chemokin-Rezeptoren auf ihren Oberflächen exprimieren. Nach Antigen- spezifischer Aktivierung von Lymphozyten durch aktivierte DCs rekrutieren dann inflammatorische Chemokine Antigen-spezifische T-Effektor-Zellen zum Entzündungsherd. Gleichzeitig werden auch regulatorische T-Zellen angelockt, die die Entzündungsreaktionen wieder supprimieren, was entscheidend für den Ausgang der lokalen Entzündungsreaktion ist (Oo, Shetty et al. 2010).
Homöostatische Chemokine hingegen werden in bestimmten Bereichen lymphoider Gewebe (Knochenmark, Thymus, sekundäre lymphoide Organe) sowie in der Haut oder Mucosa exprimiert.
Diese konstitutiv freigesetzten Chemokine haben Einfluss auf die Migration und Positionierung von Zellen, auf die Antigen-Aufnahme in sekundären lymphoiden Geweben und die Immunüberwachung (Oo, Shetty et al. 2010).
Alle Chemokine werden zudem in vier strukturelle Unterfamilien aufgeteilt, wobei die Einteilung auf der Anordnung der zwei N-terminalen Cystein-Reste beruht. Bei der großen Gruppe der CXC- Chemokine befindet sich zwischen den ersten beiden Cystein-Resten eine Aminosäure, während in der zweiten großen Gruppe der CC-Chemokine beide benachbart sind. In der kleinen Gruppe der C- Chemokine fehlen Cystein eins und drei der typischen Chemokin-Struktur und CX3C-Chemokine haben 3 Aminosäuren zwischen den ersten zwei Cystein-Resten (Zlotnik and Yoshie 2000).
Die verschiedenen Chemokine üben ihre chemotaktische Wirkung über die Interaktion mit spezifischen 7-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Molekülen aus, die auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert werden. Die Chemokin-Rezeptoren werden entsprechend ihrer Liganden ebenfalls in 4 Gruppen eingeteilt, abhängig nach der Anordnung der N-terminalen Cystein- Reste ihrer Chemokin-Liganden (Zlotnik and Yoshie 2000). Die Bindung eines Chemokins an seinen Rezeptor löst die Abspaltung der Gα1 von den Gβ-γ Untereinheiten des heterotrimeren G-Proteins aus, was zu einem Kalziuminflux in der Zelle und der Aktivierung der Phosphatidylinositol 3-Kinase und Rho-GTPase Signalwege führt.
Das humane Chemokin-System umfasst mehr als 50 Chemokine und 20 Chemokin-Rezeptoren (Oo, Shetty et al. 2010). Das murine Chemokin-System ist dem humanen sehr ähnlich. Viele Chemokine der Maus können eindeutig den humanen Homologen zugeordnet werden (z.B.
CCL5/RANTES oder CCL17/TARC), während für einige wenige Chemokine noch keine humanen Homologe beschrieben wurden. Für manche humanen Chemokine (z.B. CXCL8/IL-8) konnte bisher kein murines Homolog gefunden werden (Zlotnik and Yoshie 2000).
1.3.1 Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17)
Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17) ist ein Mitglied der Gruppe der CC- Chemokine, das beide funktionellen Eigenschaften der Chemokine in sich vereint, d.h. CCL17 wird konstitutiv im Thymus exprimiert (Imai, Yoshida et al. 1996), kann aber auch von Zellen wie DCs nach Aktivierung über z.B. Toll-like Rezeptoren als inflammatorisches Chemokin induziert werden (Alferink, Lieberam et al. 2003).
CCL17 wird insbesondere von DCs (Alferink, Lieberam et al. 2003; Gorski, Shin et al. 2003), darunter Langerhans-Zellen (Xiao, Fujita et al. 2003), exprimiert. Aber auch für andere Zelltypen konnte eine Expression von CCL17 nachgewiesen werden, so für Endothelzellen (Campbell, Haraldsen et al. 1999), Keratinozyten (Vestergaard, Yoneyama et al. 1999), bronchialen Epithelzellen (Sekiya, Miyamasu et al. 2000), Fibroblasten (Yu, Koga et al. 2002), alternativ aktivierte Makrophagen (Katakura, Miyazaki et al. 2004), Mastzellen (Oliveira and Lukacs 2001), B-Lymphozyten (Alferink, Lieberam et al. 2003) und Eosinophilen (Liu, Bates et al. 2007).
Durch die Expression von CCL17 werden Leukozyten, die den Chemokin-Rezeptor CCR4 tragen, zum Entzündungsherd rekrutiert. CCR4 gilt als hochaffiner Rezeptor für CCL17 und CCL22 (Imai, Baba et al. 1997; Bonecchi, Bianchi et al. 1998), der speziell von differenzierten Th2-Zellen (Bonecchi, Bianchi et al. 1998), CD25+ regulatorischen T-Zellen (Iellem, Mariani et al. 2001) und cutaneous lymphocyte antigen-positiven (CLA+) skin-homing Lymphozyten (Campbell, Haraldsen et al. 1999) hoch exprimiert wird. Zudem wird CCR4 auf Mastzellen (Juremalm, Olsson et al. 2002), natürlichen Killerzellen (Inngjerdingen, Damaj et al. 2000), Makrophagen (Chvatchko, Hoogewerf et al. 2000), CD8+ T-Zellen (Yung, Mo et al. 2007) und B-Zellen (Johansson, Ahlstedt et al. 2005) exprimiert.
CCL17 wird ebenfalls als Ligand für CCR8 gehandelt, wobei in der Literatur gegensätzliche Meinungen dazu herrschen (Bernardini, Hedrick et al. 1998; Garlisi, Xiao et al. 1999). CCR8 wird von
einer kleinen Untergruppe zirkulierender Lymphozyten (Gombert, Dieu-Nosjean et al. 2005), CD25+ regulatorischen T-Zellen (Iellem, Mariani et al. 2001), natürlichen Killerzellen (Inngjerdingen, Damaj et al. 2000), Langerhans-Zellen und interstitialen DCs (Gombert, Dieu-Nosjean et al. 2005) exprimiert.
Nach der Entdeckung des Chemokins CCL17 im Jahre 1996 wurde vermutet, dass es eine wichtige Rolle in der Entwicklung von T-Zellen im Thymus als auch in der Rekrutierung und Aktivierung von Effektor-T-Zellen haben könnte (Imai, Yoshida et al. 1996). Es zeigte sich, dass CCL17, insbesondere durch das spezifische Expressionsprofil seines Rezeptors CCR4 (Bonecchi, Bianchi et al. 1998), wichtig für die Rekrutierung von Th2-Zellen und der Aufrechterhaltung von Th2-Immunantworten ist (Imai, Nagira et al. 1999).
Allergie-Studien zeigten, dass das Expressionslevel von CCL17 mit dem Schweregrad der Erkrankungen in einigen chronisch allergischen Pathologien korreliert wie z.B. Asthma (Sekiya, Yamada et al. 2002; Hirata, Arima et al. 2003; Leung, Wong et al. 2003), Atopische Dermatitis (Jahnz- Rozyk, Targowski et al. 2005; Tsunemi, Saeki et al. 2006) und kutanem Lupus Erythematodes (Wenzel, Henze et al. 2005). Auch bei der Allergen-induzierten Rekrutierung von Th2-Zellen ins betroffene Gewebe spielt die Interaktion von CCL17 mit CCR4 eine wichtige Rolle (Romagnani 2002).
1.4 Humane Filariose
Es gibt zahlreiche humanpathogene Helminthen, die im Intestinaltrakt oder im Gewebe ihres Wirts leben. Die unter dem Begriff der Filariose zusammengefassten Onchozerkose (Flussblindheit) und lymphatische Filariose sind parasitäre Infektionen hervorgerufen durch gewebsspezifische Helminthen. Von insgesamt 8 humanpathogenen Filarien-Spezies induzieren drei die lymphatische Filariose, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi und Brugia timori, während Onchocerca volvulus der Erreger der Onchozerkose ist.
Ca. 90% der etwa 120 Millionen geschätzten Fälle von lymphatischer Filariose werden durch W.
bancrofti verursacht und kommen weltweit in 83 meist tropischen Ländern vor. Die restlichen 10%
werden durch Infektionen mit B. malayi und B. timori herbeigeführt, die im Südosten und Osten Asiens bzw. Südost-Indonesien vorkommen (Taylor, Hoerauf et al. 2010). Die Infektion mit diesen Filarien wird als lymphatische Filariose bezeichnet, da die durch Moskitos übertragenden parasitären Larven sich zu adulten Würmern entwickeln, die sich in Nestern in Lymphgefäßen, meistens in denen der Extremitäten und der männlichen Genitalien, ansiedeln. Dies kann bei einigen Erkrankten zu Lymphödemen in den Extremitäten, Elefantiasis oder Hydrozelen führen (WHO 2000).
Die Onchozerkose ist in 34 Ländern endemisch, darunter 27 in West- und Zentralafrika, 6 in Süd- und Mittelamerika und im Jemen im Süden der Arabischen Halbinsel. Es wird geschätzt, dass ca. 90 Millionen Menschen in Afrika gefährdet sind an der Onchozerkose zu erkranken und fast 37 Millionen bereits mit O. volvulus infiziert sind (Basanez, Pion et al. 2006). Die Onchozerkose wird häufig auch als Flussblindheit bezeichnet, da es bei schweren Fällen zur Erblindung der betroffenen Erkrankten kommen kann und die Infizierten in der Nähe von schnell-fließenden, sauerstoff-reichen Wasserläufen siedeln, wo die als Vektor dienenden Kriebelmücken der Gattung Simulium brüten (Thylefors and Alleman 2006).
1.4.1 Onchozerkose
Die Kriebelmücke Simulium ssp. als obligater Zwischenwirt für O. volvulus nimmt während einer Blutmahlzeit an infizierten Individuen Mikrofilarien (Larvenstadium 1, L1) auf. Innerhalb von 10-12 Tagen entwickeln sich die L1 Larven über zwei Häutungen zu infektiösen Larven (Larvenstadium 3, L3) im Vektor. Bei einer erneuten Blutmahlzeit erfolgt durch den Stich des Vektors die Transmission der L3 Larven in die Haut des Wirts. Das adulte Stadium erlangen die Larven über zwei weitere
Häutungen innerhalb von 6-12 Monaten. Die adulten, geschlechtsreifen Weibchen, welche ein Alter von durchschnittlich 9-10 Jahren erreichen, sammeln sich in subkutanen oder in tiefer gelegenen intramuskulären Knoten (Onchozerkomen) und produzieren nach Paarung mit adulten Männchen Millionen von Mikrofilarien. Es wird vermutet, dass die 3-8 cm langen Männchen dabei von Knoten zu Knoten wandern, um die mit einer Länge von 30-80cm wesentlich größeren Weibchen zu begatten. Die aus den Knoten entlassenen Mikrofilarien, die etwa 6-30 Monate überleben können, migrieren durch subkutanes sowie konjunktivales und intraokulares Gewebe, und können durch den erneuten Stich einer Simulie aufgenommen werden (Hoerauf and Brattig 2002; Guerrant, Walker et al. in Vorbereitung).
Die Pathologie der Onchozerkose in Haut und Auge wird durch den Tod von Mikrofilarien ausgelöst, welche Ziel der inflammatorischen Immunreaktionen des Wirts werden. Neben den Onchozerkomen werden Symptome wie Dermatitis in unterschiedlichen Schweregraden und Augenschädigung bis hin zur Erblindung verursacht.
Anhand der Immunreaktionen gegen die Infektion mit den Parasiten können innerhalb der Onchozerkose drei klinische Gruppen klassifiziert werden. Die häufigste Manifestation der Krankheit in endemischen Gebieten ist die generalisierte Onchozerkose, welche durch eine massive Anzahl an dermalen Mikrofilarien und Onchozerkomen charakterisiert ist. Aber trotz der hohen Antigendichte werden nur eine schwache Entzündungsreaktion in der Haut und relativ milde Reaktionen wie Atrophie und Pigmentveränderungen ausgelöst, was die Fähigkeit der Filarien widerspiegelt, Immunmechanismen des Wirts zu supprimieren, um das eigene Überleben zu garantieren. Im Gegensatz dazu bleiben einige wenige Individuen, die als putativ immun oder endemisch normal bezeichnet werden, in hyperendemischen Gebieten frei von Infektionen trotz gleich hoher Exposition zum Parasiten. Eine Minderzahl von Patienten, die als Sowda-Patienten bezeichnet werden, entwickelt eine chronisch-hyperreaktive Onchodermatitis. Sowda-Patienten leiden an papulöser Dermatitis, Pruritus, hyperpigmentierten Hautveränderungen mit Läsionen und Lymphadenitis.
Charakteristisch sind eine geringe Mikrofilariendichte und wenige adulte Würmer in großen Knoten.
Die starke Abwehr der Parasiten in Sowda-Patienten impliziert das Fehlen regulatorischer Immunmechanismen, woraus hyperreaktive Immunantworten resultieren, die zu dem oben beschriebenen schweren Krankheitsbild führen (Hoerauf and Brattig 2002).
1.4.2 Lymphatische Filariose
Die lymphatische Filariose (LF) ist die zweithäufigste Ursache für chronische Behinderungen weltweit (WHO 1997). Neben den medizinischen Problemen haben schwächende und entstellende chronische Krankheitsmanifestationen (besonders Lymphödeme, Elephantiasis und Hydrozelen) schwere soziale und psychologische Konsequenzen für die Betroffenen in endemischen Gebieten (Dreyer, Noroes et al. 1997; WHO 1997).
Der Lebenszyklus von W. bancrofti bzw. von Brugia ssp ist dem von O. volvulus sehr ähnlich.
Anders als bei O. volvulus leben die adulten Würmer in den lymphatischen Gefäßen ihrer humanen Wirte, paaren sich dort und produzieren tausende von Mikrofilarien. Diese werden vom Zwischenwirt mit der Blutmahlzeit aufgenommen, in dem sie sich über zwei Häutungen zu infektiösen Larven entwickeln. Diese können dann mit der nächsten Blutmahlzeit auf einen neuen Wirt übertragen werden und migrieren durch die Haut in die lymphatischen Gefäße, um sich dort über zwei weitere Häutungen zu adulten Würmern zu entwickeln. Die adulte Filarien können für mehr als 20 Jahre überleben und Mikrofilarien bilden, im Durchschnitt ist die Lebensspanne jedoch kürzer. Weibliche W. bancrofti werden durchschnittlich 80-100cm lang, Männchen erreichen eine Länge von etwa 40cm. Die adulten Brugia ssp werden jeweils nur halb so lang. Als Zwischenwirte dienen mehrere Mücken-Spezies (Anopheles, Culex, Aedes, Mansonia ssp) (Cook and Zumla 2009;
Pfarr, Debrah et al. 2009).
In den Endemie-Gebieten für lymphatische Filariose sind drei verschiedene Gruppen von Individuen anzutreffen. Asymptomatische Mikrofilarämie ist die oft am häufigsten vorkommende Manifestation der LF und ähnelt der generalisierten Onchozerkose. Patienten mit Asymptomatischer Mikrofilarämie zeigen trotz hoher Mikrofilariendichte im Blut keine klaren Anzeichen für eine klinische Erkrankung (Melrose 2002). Es wird angenommen, dass eine durch die Filarien induzierte Immunsuppression das Überleben der Parasiten verlängert und die Ausbildung von Pathologien verhindert (Ottesen 1992). Einige Individuen sind in der Lage Mikrofilarien abzuwehren, entwickeln dabei eine klinische Erkrankung und ähneln damit Sowda-Patienten bei der Onchozerkose. Durch Immunreaktionen gegen tote oder sterbende adulte Würmer kommt es zu episodischen Attacken von Lymphangitis (acute filarial lymphangitis, AFL). Hierbei handelt es sich um lokale Entzündungsreaktionen, welche meistens einen milden Verlauf zeigen und selten in Lymphödeme resultieren (Dreyer, Medeiros et al. 1999; Melrose 2002). Sekundäre bakterielle Infektionen, nicht der Tod von adulten Würmern per se, lösen akute Dermatolymphangioadenitis (ADLA) aus. Diese lokalen Entzündungsreaktionen führen oft zu Ödemen in den betroffenen Gliedmaßen, welche sich in manchen Fällen zu chronischen Lymphödemen und Elephantiasis entwickeln können (Dreyer, Medeiros et al. 1999). Endemisch normale Individuen bleiben trotz ständiger Exposition zum Parasiten amikrofilarämisch, zeigen keine klinischen Krankheitssymptome und entsprechen putativ Immunen/ endemisch Normalen in Gebieten mit Onchozerkose. Dennoch scheinen einige dieser Individuen mit Filarien infiziert zu sein, da in ihrem Blut zirkulierendes Filarien-Antigen nachgewiesen werden kann (Weil, Ramzy et al. 1996).
1.5 Mausmodell für Filariosen: Litomosoides sigmodontis (Chandler, 1931)
Bei humanen Studien ist es schwierig anhand experimenteller Untersuchungen oder Feldstudien signifikante Wechselwirkungen zwischen parasitologischen, immunologischen und genetischen Faktoren und den verschiedenen klinischen Manifestationen der humanen Filariose nachzuweisen.
Daher sind standardisierte Mausmodelle zur Studie der Immunmechanismen von Filarien-Infektionen unerlässlich.
Es wurden verschiedene Mausmodelle untersucht, um die komplexen Immunreaktionen gegen Filarien zu charakterisieren. Dabei wurden insbesondere Brugia ssp und Onchocerca ssp Spezies zur experimentellen Infektion von Mäusen genutzt, doch haben diese Filarien den Nachteil, dass sie ihren Lebenszyklus in Labormäusen nicht vollenden können (Lawrence 1996; Horauf and Fleischer 1997; Hoffmann, Petit et al. 2000). Mastomys coucha und Meriones unguiculatus (Jirds) sind gegenüber B. malayi zwar völlig permissiv, doch können viele moderne immunologische Methoden, die für Labormäuse zur Verfügung stehen, in diesen Wirten nicht angewendet werden (Horauf and Fleischer 1997). Petit et al. konnten allerdings mit der Nagetier-Filarie Litomosoides sigmodontis ein adäquates Mausmodell für Filarien-Erkrankungen etablieren, in dem BALB/c Mäuse gänzlich suszeptibel gegenüber der Infektion sind und es dem Wurm erlauben, sich in ihrer Thoraxhöhle zu Adulten zu entwickeln und Mikrofilarien zu bilden (Petit, Diagne et al. 1992; Marechal, Le Goff et al.
1997; Hoffmann, Petit et al. 2000). L. sigmodontis gehört zur Familie der Onchocercidae (Ordnung Spirurida, Stamm Nemotoda), der auch die humanpathogenen O. volvulus, W. bancrofti, B.malayi und B. timori angehören (Xie, Bain et al. 1994). Der natürliche Wirt für L. sigmodontis ist die Baumwollratte Sigmodon hispidus, als Ersatzwirte können Jirds (Meriones unguiculatus) dienen (Hoffmann, Petit et al. 2000).
Mäuse auf BALB/c Hintergrund erwiesen sich als einzige immunkompetente Mäuse, in denen sich L. sigmodonitis bis zu einer patenten Infektion mit Blut-Mikrofilarämie in etwa 50% der Fälle entwickeln kann (Petit, Diagne et al. 1992; Al-Qaoud, Taubert et al. 1997). Aber auch andere genetische Hintergründe sind bis zu einem gewissen Grad suszeptibel gegenüber der Infektion –
während Mäuse auf BALB/c Hintergrund gänzlich suszeptibel sind, sind z.B. Mäuse auf schwarzem Hintergrund (C57BL/6) annähernd resistent, Stämme mit anderem Hintergrund wie C3H hingegen intermediär/ semi-resistent (Petit, Diagne et al. 1992). Bei resistenten C57BL/6 Mäusen entwickeln sich die Larven selten über das L4-Stadium hinaus, die Filarien werden stufenweise von Immunzellen eingekapselt und von etwa Tag 40 nach Infektion an zerstört und es entwickelt sich keine Mikrofilarämie (Le Goff, Lamb et al. 2002). Beim Mausstamm C3H/HeN hat sich hingegen gezeigt, dass, obwohl diese Mäuse keine patente Infektion entwickeln, sich sowohl in männlichen als auch weiblichen Mäusen adulte Würmer entwickeln, wobei in den Eileitern der weiblichen Würmer alle embryonalen Larvenstadien zu finden sind. Männliche Mäuse sind dabei suszeptibler gegenüber der Infektion als Weibliche (Petit, Diagne et al. 1992).
1.5.1 Lebenszyklus von L. sigmodontis
Abbildung 1: Lebenszyklus von Litomosoides sigmodontis
Der natürliche Wirt für die Filarie L. sigmodontis ist die Baumwollratte Sigmodon hispidus.
Während der Blutmahlzeit an der infizierten, mikrofilarämischen Ratte nimmt der Zwischenwirt, die Milbe Ornithonyssus bacoti, mit dem Blut Mirofilarien (erstes Larvenstadium, L1) auf, die sich innerhalb von 10-12 Tagen unter zweimaliger Häutung zu infektiösen Larven (Larvenstadium 3, L3) entwickeln (Abbildung 1).
Bei der nächsten Blutmahlzeit der Milbe werden infektiöse L. sigmodontis L3-Larven mit der Saliva auf den neuen Wirt übertragen. Sie dringen durch die Bissstelle in die Haut des natürlich infizierten Nagetiers ein und migrieren von der Haut über die lymphatischen Gefäße zum Herzen und gelangen über die Blutzirkulation in die Lunge, von wo aus sie letztendlich in die Thoraxhöhle penetrieren. In den ersten 48 Stunden nach Infektion werden etwa 60-70% der Larven im subkutanen Gewebe durch inflammatorische Reaktionen abgefangen, so dass nur ca. 30-40% aller Larven die Thoraxhöhle erreichen (Marechal, Le Goff et al. 1996). Nach frühestens 4 Tagen nach der Infektion wandern die Larven in die Pleurahöhle ein (Babayan, Ungeheuer et al. 2003). Bis Tag 10 nach Infektion haben fast alle Larven die Thoraxhöhle erreicht, sofern sie nicht den Abwehrmechanismen des Wirts- Immunsystems erlegen sind.
Über 2 weitere Häutungen entwickeln sich die infektiösen L3-Larven zu adulten Würmern.
Zwischen etwa Tag 10 und 28 nach Infektion befinden sich die meisten Larven im L4 Stadium. Ab Tag 25-33 nach Infektion entwickeln sich diese zu adulten Weibchen und Männchen, die mit sexueller Reife kopulieren, woraufhin die Weibchen Mikrofilarien bilden. Ab Tag 55-60 nach Infektion wandern die Mikrofilarien zum Herzen aus, und gelangen dort in die Blutzirkulation. Dort können sie bei einer erneuten Blutmahlzeit vom Zwischenwirt (der Milbe) aufgenommen und weiterverbreitet zu werden.
1.5.2 Zelluläre Immunantworten gegen L. sigmodontis
Das Mausmodell mit L. sigmodontis in BALB/c Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Immunreaktionen gegen die Stadien des Entwicklungszyklus der Filarie von der L3 Larve bis zur Freisetzung von Mikrofilarien. Bei der Charakterisierung der verschiedenen Immunreaktionen zeigte sich, dass eine Vielzahl verschiedener Zelltypen zur Immunabwehr gegen L. sigmodontis-Infektionen beitragen. Insbesondere CD4+ T-Zellen werden zur Abwehr adulter Würmer benötigt, da nach Infektion mit L. sigmodontis eine Depletion von CD4+ T-Zellen in BALB/c Mäusen zu einer signifikant erhöhten Wurmlast und Mikrofilarämie führt und auch die Mengen an Th2-Zytokinen, Eosinophilen und Parasiten-spezifischem IgE deutlich reduziert werden (Al-Qaoud, Taubert et al. 1997). CD8+ T- Zellen hingegen scheinen bei der Infektion mit L. sigmodontis keinen Einfluss auf die Abwehr adulter Würmer oder Mikrofilarien zu haben wie Depletionsexperimente gezeigt haben (Korten, Volkmann et al. 2002). Im Vergleich zeigte sich im Mausmodell mit Brugia ssp-infizierten Mäusen bei Defizienz aller T-Zell-Populationen, dass die Mäuse gegenüber der Infektion tolerant werden (Vickery, Vincent et al. 1983), nicht aber, wenn die einzelnen CD4+ (Rajan, Nelson et al. 1994) oder CD8+ (Rajan, Nelson et al. 1992) T-Zell-Subpopulationen fehlen.
Regulatorische CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen, die während einer Infektion mit L. sigmodontis zur Infektionsstelle rekrutiert werden und proliferieren, haben eine immunsuppressive Wirkung auf die Immunabwehr adulter Würmer. Die Depletion bereits vorhandener T-regulatorischer Zellen vor der Infektion mit L. sigmodontis beeinflusst zwar nicht die anfängliche Etablierung der Larven in der Pleura-Höhle, führt aber zu einer reduzierten Wurmlast und geringerer Patenz 60 Tage nach Infektion (Taylor, van der Werf et al. 2009).
Auch für B1-Zellen, die vor allem in der Peritoneal- und Thoraxhöhle zu finden sind, konnte eine besondere Rolle bei der Immunabwehr von Filarien nachgewiesen werden. B1-Zell-defiziente Xid- Mäuse entwickeln höhere Parasitenlasten als Wildtyp-Mäuse mit höherer Mikrofilarämie, während sich die Parasiten-spezifische Th2-Zytokin-Produktion von Zellen der Pleura-Höhle signifikant erniedrigt (Al-Qaoud, Fleischer et al. 1998). Konventionelle B2-Zellen weisen eine regulierende Rolle in der Immunabwehr in einer Studie mit B-Zell-defizienten µMT-Mäusen auf. Nach einer Primär- Infektion mit L. sigmodontis Larven im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen zeigte sich zwar kein Unterschied in der Wurmlast, es konnte jedoch keine patente Infektion in den B-Zell-defizienten Mäusen ausgebildet werden. Die Levels an Th1- und Th2-Zytokinen waren zudem deutlich gesenkt. In µMT-Mäusen, die mit irradizierten L3 Larven vakziniert wurden, war zudem der in vakzinierten Wildtyp-Mäusen gesehene Schutz supprimiert (Martin, Saeftel et al. 2001). NK und NKT-Zellen
migrieren während einer Infektion mit L. sigmodontis in die Pleura-Höhle und die Depletion dieser Zellen führt ebenfalls zu erhöhten Wurmlasten (Korten, Volkmann et al. 2002).
Die Eliminierung adulter Parasiten in der Pleura-Höhle erfolgt durch Einkapselung der Würmer in Knoten durch verschiedene Immunzellen. Neutrophile bilden dabei die innerste Zellschicht um adulte L. sigmodontis Würmer, während Eosinophile eine zweite Schicht bilden (Al-Qaoud, Pearlman et al.
2000). Eine ähnliche Formierung von Neutrophilen in direktem Kontakt zu den Parasiten und Eosinophilen und Mastzellen in äußeren Zellschichten kann auch bei verschiedenen Onchocerca ssp.
Spezies beobachtet werden (Wildenburg, Plenge-Bonig et al. 1997; Wildenburg, Korten et al. 1998).
Eine erhöhte Anzahl an Mastzellen und Eosinophilen findet sich in Onchozerkomen von Patienten mit generalisierter Onchozerkose, die Mikrofilarien-produzierende Weibchen enthalten, und besonders Onchozerkome mit toten weiblichen Würmern weisen signifikant erhöhte Mengen an Mastzellen im Vergleich zu Knoten mit lebenden Würmern auf (Wildenburg, Korten et al. 1998). U.a. zeigt sich eine Rolle für Eosinophile auf die Immunabwehr von Filarien indirekt in in vivo Studien mit L. sigmodontis durch die IL-5 abhängige Rekrutierung von Eosinophilen zum Infektionsherd (Martin, Le Goff et al.
2000). IL-5 transgene Mäuse, die vermehrt Eosinophile aufweisen, haben eine reduzierte Wurmlast 60dpi, die sich zwischen 10-30dpi entwickelte (Martin, Le Goff et al. 2000). Zudem erwiesen sich als wichtige Moleküle, die in der Abwehr von Filarien involviert sind, das Eosinophilen-spezifische Granula-Protein Eosinophil Peroxidase und das Major Basic Protein, welches ebenfalls von Eosinophilen durch Degranulation ausgeschüttet wird (Specht, Saeftel et al. 2006).
1.5.3 Zytokin-Antworten gegen L. sigmodontis
Verschiedene Studien haben gezeigt, dass sowohl Th1- als auch Th2-Zytokinantworten in der Abwehr gegen Filarieninfektionen involviert sind. So liegt z.B. 10-20 Tage nach einer Infektion mit L.
sigmodontis sowohl in suszeptiblen als auch resistenten Mausstämmen eine gemischte Th1/ Th2- Immunantwort vor, während in der patenten Phase ab Tag 58 Th2-Antworten dominieren (Marechal, Le Goff et al. 1997).
Die Depletion des Th1-assoziierten Zytokins IFN-γ resultiert in eine erhöhte Überlebensrate adulter Würmer und in eine erhöhte Mikrofilarämie durch einen Defekt in der Aktivierung neutrophiler Granulozyten und verringerte Knotenbildung um adulte Würmer (Saeftel, Volkmann et al. 2001). Im Gegenzug konnte eine ähnliche verringerte Neutrophilen-vermittelte Knotenbildung und höhere Mikrofilarämie nach der Neutralisierung des Th2-Zytokins IL-5 festgestellt werden (Al- Qaoud, Pearlman et al. 2000). IL-5 defiziente Mäuse erlauben die vermehrte Entwicklung von Larven zu adulten Würmern und höhere Wurmlasten während chronischer Infektionen (Volkmann, Bain et al. 2003). Auch spielt IL-5 eine essentielle Rolle bei der Vakzine-induzierten Immunität nach Filarienerkrankungen (Le Goff, Loke et al. 2000). Somit können sowohl Th1- als auch Th2-Antworten die Parasitenlast kontrollieren und sogar synergistisch wirken wie für IFN-γ und IL-5 gezeigt wurde (Saeftel, Arndt et al. 2003).
Während BALB/c Mäuse gänzlich permissiv gegenüber L. sigmodontis Infektionen sind, können sich in C57/BL6 Mäusen die Würmer nicht weiter als zum L4 Larvenstadium entwickeln (Le Goff, Lamb et al. 2002). In suszeptiblen BALB/c Mäusen führt der Knock-out von IL-4 zu einer erhöhten Mikrofilarämie, beeinflusst aber nicht die Knotenbildung und das Überleben der adulten Würmer (Volkmann, Saeftel et al. 2001; Volkmann, Bain et al. 2003). Die Depletion von IL-4 bricht jedoch die Resistenz der C57/BL6 Mäuse, führt zur vollständigen Entwicklung der Würmer und zur Verlängerung ihres Lebens und demonstriert, dass Th2-abhängige Mechanismen in resistenten, nicht-permissiven Wirten die Abwehr von Parasiten bestimmen (Le Goff, Lamb et al. 2002). Wird jedoch zusätzlich das regulatorische Zytokin IL-10 ausgeknockt, wird die Resistenz gegenüber der Wurminfektion wieder hergestellt, was auf eine antagonistische Aktivität zwischen IL-4 und IL-10 hinweist (Specht, Volkmann et al. 2004). Die Depletion von IL-10 erleichtert die Persistenz von Mikrofilarien
(Hoffmann, Pfaff et al. 2001), und IL-10 transgene Mäuse haben eine bessere Wurmentwicklung und Fertilität (Hoerauf, Satoguina et al. 2005).
1.6 Wolbachia-Endosymbionten
Der Großteil der Filarien, darunter auch die humanpathogenen W. bancrofti, O. volvulus und B.
malayi sowie die Nagetier-Filarie L. sigmodontis, führen eine mutualistische Symbiose mit Endobakterien der Gattung Wolbachia, welche eine wichtige Rolle in der Reproduktion, Entwicklung und Pathogenese der Filarien spielen (McLaren, Worms et al. 1975; Taylor, Bandi et al. 2005). Die α- Proteobakterien Wolbachia, die zur Ordnung Rickettsiales gezählt werden, finden sich in allen Entwicklungsstadien der Filarien, dabei besonders zahlreich in adulten Würmern (Taylor and Hoerauf 1999).
In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Wolbachia-assoziierte Antigene bei der Wirts-Immunantwort gegen Filarien eine große Rolle spielen. Die Erkennung dieser Antigene erfolgt über Toll-like Rezeptoren auf Zellen des angeborenen Immunsystems. Für Wolbachien-assoziierte Moleküle wie das Wolbachia surface protein (WSP) konnten LPS-ähnliche Immunantworten bei Zellen beobachtet werden, ausgelöst durch eine Aktivierung TLR2- und TLR4-abhängiger Mechanismen (Brattig, Bazzocchi et al. 2004). Jüngere Studien zweifeln jedoch an, ob Wolbachia tatsächlich über TLR4 erkannt werden. Hise, Daehnel et al. fanden heraus, dass die Immunantworten gegen Wolbachia in B. malayi und O. volvulus von u.a. TLR2 und TLR6 aber nicht von TLR4 abhängig sind (Hise, Daehnel et al. 2007). Zudem entdeckten Turner et al., dass Wolbachia-Lipoproteine als inflammatorische Moleküle agieren, die an TLR2 und TLR6 binden und dadurch angeborene und adaptive Immunantworten induziert werden (Turner, Langley et al. 2009).
Neben Anderen gehören Neutrophile zu den Zellen des angeborenen Immunsystems, die über Toll-like Rezeptoren konservierte molekulare Strukturen von z.B. Bakterien erkennen können (Kurt- Jones, Mandell et al. 2002). Wolbachien sind eine direkte bzw. indirekte Quelle für Signale, die zur Akkumulation von Neutrophilen rund um adulte O. volvulus Würmer bei Onchozerkose-Patienten führen. Behandlungen mit Doxyzyklin führen zu einer Depletion der Endobakterien in O. volvulus.
Durch die Depletion der Endobakterien konnte gesehen werden, dass die Infiltration der Onchozerkome durch Neutrophile direkt um die Filarien strikt abhängig ist von der Präsenz der Wolbachia (Brattig, Buttner et al. 2001).
1.7 Fragestellung
Die durch Filarien verursachten Erkrankungen Lymphatische Filariose und Onchozerkose stellen weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem dar. Während der Blutmahlzeit von Arthropoden werden die parasitischen Helminthen auf den Menschen übertragen und lösen dort chronische, langandauernde Infektionen durch die Suppression von Immunantworten im Wirt aus. Bei Untersuchungen der Immunabwehrreaktionen gegen Filarien konnte anhand von Mausmodellen für Filarien-Infektionen gezeigt werden, dass ein Großteil der in die Haut eindringenden infektiösen Larven innerhalb weniger Tage im subkutanen Gewebe abgewehrt wird und letztendlich nur ein kleiner Teil der initial infizierten Larven sich im Organismus etablieren kann (Marechal, Le Goff et al.
1996). Über diese spezifischen frühen Abwehrmechanismen gegen Filarien ist jedoch bisher wenig bekannt und insbesondere die Rolle von Chemokinen ist dabei noch nicht erforscht worden.
In der Haut treffen die eindringenden Filarien auf Zellen des angeborenen Immunsystems, die in der Lage sind, innerhalb kurzer Zeit über die Erkennung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern über spezielle Rezeptoren Abwehrmaßnahmen zur Elimination der Pathogene einzuleiten.
Dendritische Zellen können durch die Interaktion mit den infektiösen Larven innate und adaptive Immunantworten initiieren, wobei sie über die Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen andere Immunzellen beeinflussen und zur Infektionsstelle rekrutieren können. Über die Expression des Chemokins Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17) beispielsweise können DCs speziell Th2-Zellen und regulatorische T-Zellen, die für die Abwehr von Filarien von großer Bedeutung sind, an den Infektionsherd rekrutieren (Bonecchi, Bianchi et al. 1998; Campbell, Haraldsen et al.
1999; Iellem, Mariani et al. 2001; Alferink, Lieberam et al. 2003). Auch Mastzellen, die unter den Zellen des angeborenen Immunsystems neben den dendritischen Zellen zu den prominentesten Zellen in der Haut zählen und oftmals an ersten Immunreaktionen gegen eindringende Parasiten beteiligt sind, können sowohl CCL17 als auch CCR4, den Rezeptor für CCL17, exprimieren (Oliveira and Lukacs 2001; Juremalm, Olsson et al. 2002). CCL17 könnte somit eine entscheidende Rolle in der frühen Immunabwehr gegen Filarien spielen.
Mit dem Nagetier-Modell Litomosoides sigmodontis sollte daher in dieser Studie die Rolle des Chemokins CCL17 in der frühen Immunantwort gegen Filarien untersucht werden. Dazu sollten CCL17-defiziente Mäuse, die gleichzeitig als eGFP-Reporter-Mäuse dienten, natürlich mit L.
sigmodontis infiziert und CCL17-abhängige Immunantworten analysiert werden.
Im Detail sollten folgende Fragen bearbeitet werden:
1. Wird CCL17 während der Migration von der Haut zur Thoraxhöhle von L. sigmodontis L3 Larven induziert?
2. Welche Rolle spielt CCL17 bei der Etablierung einer frühen Immunantwort gegen Filarien im Wirt, d.h. welcher Einfluss auf Parasitologie und Immunologie kann zum Zeitpunkt der Etablierung der Filarien in der Thoraxhöhle bzw. kurz nach Infektion in der Haut festgestellt werden?
3. Induzieren Antigene des Endosymbionten Wolbachia oder Antigene der Filarie selbst mögliche CCL17-abhängige Immunmechanismen?
4. Sind TLR-abhängige Mechanismen bei der Induktion CCL17-abhängiger Immunantworten gegen Filarien involviert?
