3 Ergebnisse
3.3 Frühe Immunantworten bei CCL17-Defizienz in der Haut
3.3.3 Keine erhöhte Lymphangiogenese in der Haut bei CCL17-Defizienz
L3 Larven zeigen die Tendenz in der Haut von CCL17-defizienten Mäusen scheinbar einfacher durch die Haut migrieren zu können (Abbildung 9). Zudem seigte sich, dass sich bei CCL17-Defizienz eine höhere Wurmlast etablieren kann (Abbildung 4). Ein möglicher Mechanismus, der den Larven dabei behilflich sein könnte, wäre eine direkte, von den Larven ausgelöste Veränderung des Lymphgefäßsystems in der Haut von CCL17-defizienten Mäusen durch z.B. eine Expansion der Lymphgefäße, die das Migrieren durch die Lymphgefäße erleichtern könnte. Solch eine Expansion könnte durch die Ausbildung größerer Lymphgefäße in der Haut oder durch Bildung neuer oder
weiter verzweigter Lymphgefäße erreicht werden, ausgelöst durch die Expression Lymphangiogenese-fördernder Faktoren.
Um Veränderungen im lymphatischen System der Haut von CCL17-/- Mäusen zu untersuchen, wurde die Expression verschiedener Lymphendothel-spezifischer Marker wie Prospero-related homeobox 1 (Prox1) und LYVE-1, Lymphangiogenese-fördernder Faktoren wie Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) und zellulärer Verbindungsproteine wie Occludin, JAM-1 und VE-Cadherin mittels real-time PCR quantifiziert.
Um zu überprüfen, dass keine Unterschiede im Lymphsystem der Haut vorliegen, die allein durch den Knock-out von CCL17 ausgelöst werden, wurde 1-2 Tage alten, naiven Mäusen die Haut entnommen und mittels real-time PCR die mRNA-Expression der Lymphendothel-spezifischen Marker LYVE-1 und Prox1 und die des Lymphangiogenese-induzierenden Wachstumsfaktors VEGF-A in der Haut analysiert. Durch die geringe Größe dieser jungen Mäuse war es möglich, fast die gesamte, noch haarlose Körperhaut zu vermessen und es konnte davon ausgegangen werden, dass diese so kurz nach der Geburt kaum durch Umwelteinflüsse, die Veränderungen an dem Lymphsystem hätten induzieren können, belastet wurde. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede im Expressionsmuster der Marker zwischen CCL17-defizienten und CCL17+/- Mäusen festgestellt werden (Abbildung 11), wodurch ausgeschlossen werden konnte, dass CCL17-defiziente Mäuse per se nicht mehr lymphatische Endothelzellen in der Haut besitzen als CCL17-positive Mäuse.
Abbildung 11: CCL17-Defizienz hat keinen Einfluss auf Lymphangiogenese-Faktoren bei Neugeborenen.
In der Haut von 1-2 Tage alten CCL17-/- (n=17) und CCL17+/- (n=8) Mäusen wurde mittels real-time PCR die mRNA-Expression der Lymphangiogenesefaktoren LYVE-1 (A), Prox1 (B) und VEGF-A (C) gemessen. Die Kopienanzahl von LYVE-1, Prox1 und VEGF-A wurden anhand der Kopienzahl von β-Actin normalisiert. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt und wurden mit dem Mann Whitney Test analysiert.
Um daher zu untersuchen, ob L3 Larven in der Haut von CCL17-defizienten Mäusen eine Veränderung des Lymphsystems hervorrufen, wurden CCL17-/- und CCL17+/- Mäuse natürlich mit L.
sigmodontis für 6h infiziert und ihnen und adulten, naiven Mäusen Hautproben aus der Lumbal-Region entnommen. Als Kontrolle für den Milbenbiss selbst wurden nicht-infizierte Milben genutzt.
Mittels real-time PCR wurde in den Hautproben die mRNA-Expression von LY1, Prox1, VEGF-A, VE-Cadherin, Occludin und JAM-1 gemessen.
Bei CCL17-defizienten Mäusen war bereits 6h nach Infektion mit L. sigmodontis eine erhöhte mRNA-Expression des Lymphendothel-spezifischen Markers LYVE-1 in der Haut messbar, allerdings löste allein der Milbenbiss selbst schon eine signifikant erhöhte Expression aus (Abbildung 12A). In CCL17+/- war Ähnliches zu beobachten. Zu diesem frühen Zeitpunkt waren sowohl zwischen CCL17 +/-und CCL17-/- Mäusen als auch zwischen naiven und infizierten Mäusen der jeweiligen Gruppen keine signifikanten Unterschiede in der LYVE-1 mRNA-Expression in der Haut feststellbar. Es war jedoch ein Trend zur erhöhten Expression von LYVE-1 nach Infektion mit L3 Larven in CCL17-/- Mäusen
erkennbar. Die Kopienzahl nach Infektion war zusätzlich tendenziell erhöht bei CCL17-Defizienz im Vergleich zu CCL17+/- Mäusen. Prox1 als weiterer Lymph-spezifischer Marker konnte nicht in der Haut adulter Mäuse detektiert werden weder im naiven Zustand noch nach Infektion.
Abbildung 12: Erhöhte mRNA-Expression von LYVE-1, VE-Cadherin und VEGF-A nach natürlicher Infektion.
Adulte CCL17-/- und CCL17+/- Mäuse wurden natürlich mit L. sigmodontis-haltigen (+L3) bzw. nicht-infizierten Milben (-L3) infiziert. 6h nach Infektion wurde die Haut der Lumbalzone entnommen und mittels real-time PCR in der Haut infizierter und naiver Mäuse die mRNA-Expression von LYVE-1 (A), VEGF-A (B), VE-Cadherin (C) und JAM-1 (D) analysiert. Die Ergebnisse von 10 bis 16 Hautproben/ Zustand werden als Mittelwerte ±
Standardabweichung dargestellt. Die Daten wurden mit Kruskal Wallis und Dunn’s Multiple Comparison Test getestet.
Ähnlich wie für LYVE-1 konnte 6h nach natürlicher Infektion mit L3 Larven ein starker Trend zur erhöhten mRNA Expression des Adherens-Junction Proteins VE-Cadherin in der Haut sowohl bei CCL17-defizienten als auch bei heterozygoten Mäusen festgestellt werden (Abbildung 12C).
Allerdings löste auch hier der Milbenbiss allein bei beiden Gruppen eine erhöhte Expression von VE-Cadherin aus. In der mRNA-Expression von JAM-1 konnte zwischen den Hautproben naiver und mit L.
sigmodonits infizierter Mäuse keine wesentlichen Unterschiede 6h nach Infektion festgestellt werden (Abbildung 12D). Occludin konnte mittels real-time PCR nicht detektiert werden.
Die mRNA-Expression von VEGF-A war nach Infektion mit L. sigmodontis L3 Larven signifikant erhöht im Vergleich zu naiven Mäusen, sowohl in CCL17-/- und CCL17+/- Mäusen (Abbildung 12B).
Doch auch hier zeigte sich, dass der Milbenbiss allein die erhöhte Expression hervorruft. So gab es keine signifikante Erhöhung der VEGF-A Expression nach Infektion mit L3 Larven im Vergleich zum
Biss des Vektors allein. Auch zwischen CCL17-/- und CCL17+/- Mäusen und der jeweiligen Behandlung waren keine signifikanten Unterschiede vorhanden.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass L3 Larven 6h nach Infektion selbst keine Lymphangiogenese und damit eine Lymphangiogenese-abhängige Expansion der Lymphgefäße in der Haut induzieren können. Jedoch scheint die Saliva der übertragenden Milbe eine solche auslösen zu können, wodurch den in die Haut eindringenden Larven allgemein die Migration erleichtert werden könnte. Da keine signifikanten Unterschiede in der Expression Lymphangiogenese- oder Lymphendothel-spezifischer Marker, die an sich auf größere oder vermehrte Lymphgefäße hinweisen, zwischen CCL17+/- und CCL17-/- Mäusen zu erkennen waren, ist anzunehmen, dass andere, Lymphangiogenese-unabhängige Mechanismen die Larven-Migration durch Haut und Lymphgefäße bei CCL17-Defizienz erleichtern.