Keine wichtige Bedeutung von VEGF-A bei der Immunabwehr von L. sigmodontis

Mastzellen sind in der Lage Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) zu produzieren und zu sezernieren. Die Ausschüttung gespeicherten VEGF-A kann schnell nach Aktivierung der Mastzelle erfolgen und die Sekretion durch Synthetisieren neuen VEGF-A Proteins aufrechterhalten werden (Boesiger, Tsai et al. 1998). Da VEGF-A als einer der Haupt-Regulatoren der Angiogenese von Blut- und Lymphgefäßen zählt und über die Beeinflussung des vaskulären Endothels die vaskuläre Permeabilität der Gefäße erhöhen kann, wurde die Frage gestellt, ob VEGF-A an der beobachteten erhöhten vaskulären Permeabilität der Gefäße in der Haut nach Stimulierung mit L3 Larven oder LsAg im Zusammenhang mit der erhöhten Degranulation von Mastzellen bei CCL17-Defizienz beteiligt sein könnte.

Auf mRNA-Ebene konnte bereits gezeigt werden, dass die Expression von VEGF-A in der Haut bei CCL17-defizienten Mäusen nach natürlicher Infektion mit Milben induziert wird (Abbildung 12B). Um VEGF-A auch auf Protein-Ebene nach Stimulierung mit Wurm-Antigen nachzuweisen, sollte in der Haut produziertes VEGF-A in drainierenden Lymphknoten nachgewiesen und eventuelle Unterschiede in der Expression zwischen CCL17-defizienten und Kontroll-Mäusen analysiert werden.

Halin et al. konnten zeigen, dass in drainierenden Lymphknoten VEGF-A Protein nachgewiesen werden kann, dass im entzündeten Gewebe und nicht im Lymphknoten selbst von Zellen produziert wird (Halin, Tobler et al. 2007). Daher wurden CCL17-defizienten und heterozygoten Mäusen LsAg bzw. L3 Larven subkutan in den Fuß injiziert, welcher nur von einem Lymphknoten (poplitealen LN) drainiert wird. Als Kontrollen dienten Medium- und LPS-behandelte bzw. contra laterale, unbehandelte Lymphknoten. 48h nach Injektion wurde den Mäusen der den Fuß drainierende popliteale Lymphknoten entnommen, homogenisiert und die Konzentration von VEGF-A im Homogenisat per ELISA gemessen.

In CCL17-defizienten Mäusen konnte in den LN nach LsAg-Injektion signifikant mehr VEGF-A nachgewiesen werden als in den Medium oder LPS Kontrollen (Abbildung 17A). In CCL17^+/- Mäusen führte LsAg hingegen zu keiner erhöhten VEGF-A Expression in den Lymphknoten auf Proteinebene.

Zudem zeigte sich im Vergleich zum contra lateralen, unbehandelten Lymphknoten eine signifikante Erhöhung an VEGF-A Protein bei CCL17^-/- Mäusen nach Injektion von L3 Larven, nicht aber bei CCL17^+/- Mäusen (Abbildung 17B).

Abbildung 17: Erhöhte VEGF-A Level in Lymphknoten CCL17-defizienter Mäuse nach Injektion von LsAg und L3-Larven nicht aber nach natürlicher Infektion von L3 Larven.

(A) CCL17^+/- und CCL17^-/- Mäusen wurde 10µg LsAg, 20ng LPS oder Medium subkutan in den Fuß injiziert und 48h später im Homogenisat der poplitealen Lymphknoten mittels ELISA die Menge an VEGF-A gemessen.

Dargestellt werden repräsentative Daten aus einem von drei unabhängigen Experimenten als Mittelwerte ± Standardabweichung (n=4). (B) VEGF-A wurde 48h nach Injektion von 35 L3 Larven in den drainierenden und den unbehandelten, contra lateralen poplitealen Lymphknoten von CCL17^+/- und CCL17-defizienten Mäusen gemessen. Die Daten eines Experiments werden dargestellt als Mittelwerte ± Standardabweichung (n=3). (C) CCL17^+/- und CCL17^-/- Mäusen wurden natürlich mit L. sigmodontis (+L3) oder mit uninfizierten Milben (-L3) infiziert. 48hpi wurde mittels ELISA im Homogenisat poplitealer und inguinaler Lymphknoten VEGF-A-Mengen bestimmt. Dargestellt werden Daten eines Experiments als Mittelwerte ± Standardabweichung (n=3). Alle Daten wurden mit Kruskal-Wallis und Dunn’s Multiple Comparison Test getestet.

Als Vergleich der Ergebnisse nach Injektion von Wurm-Antigen oder L3 Larven wurden CCL17 -/-und CCL17^+/- Mäuse natürlich mit infektiösen L3-Larven tragenden Milben oder mit nicht-infizierten Milben infiziert, die als Kontrolle für den Biss der Milbe selbst dienten. Im Homogenisat der peripheren poplitealen und inguinalen Lymphknoten wurde 48hpi die Menge an VEGF-A per ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die natürlich infizierten L3 Larven in beiden Mausgruppen kaum eine

Erhöhung von VEGF-A Protein in den peripheren Lymphknoten induzierten im Vergleich zu Mäusen, die von unifizierten Milben gebissen wurden (Abbildung 17C), wobei nicht kontrolliert werden konnte, ob und wieviele Milben in dem Bereich der untersuchten Lymphknoten gebissen hatten.

Auch zwischen den Gruppen konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.

Die Ergebnisse der Injektionsexperimente zeigen, dass sowohl Wurmextrakt von L. sigmodontis als auch L3 Larven selbst in der Haut von CCL17-defizienten Mäusen erhöhte Mengen an VEGF-A induzierten und lassen eine Rolle für VEGF-A in der Veränderung der Homöostase der Haut bei Infektion mit L. sigmodontis vermuten. Im Vergleich jedoch konnte mit natürlich übertragenen L3 Larven, auch bei CCL17-defizienten Mäusen, keine erhöhten Mengen an VEGF-A in den die Haut drainierenden Lymphknoten gemessen werden. Dies könnte auf Schwächen im natürlichen Infektionsmodell bezüglich gezielter Milbenbisse in Nähe der drainierenden Lymphknoten zurück zu führen sein.

Da nach Stimulierung mit Wurm-Antigen in CCL17-defizienten Mäusen, zumindest im Injektionsmodell, ein deutlicher Anstieg von VEGF-A nachgewiesen werden konnte, sollte der Einfluss von VEGF-A auf die Abwehr der Parasiten bei einer Filarien-Infektion untersucht werden.

Dazu wurden zum einen VEGF-A transgene Mäuse mit einer Überexpression von VEGF-A in Keratinozyten der Epidermis unter Kontrolle des Keratin-14 Promotors und Wildtypkontrollen auf FvB-Hintergrund natürlich mit L. sigmodontis infiziert. 10 Tage nach Infektion zeigten VEGF-A transgene Mäuse trotz der Überexpression von VEGF-A in der Haut keine erhöhte Wurmlast in der Pleura-Höhle im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (Abbildung 18A). Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Anzahl der Zellen in der Pleura-Höhle (Abbildung 18B) und in mediastinalen Lymphknoten (Abbildung 18C) zwischen den beiden Mausgruppen ebenfalls nicht unterschiedlich waren. Die Zellzahlen der die Haut drainierenden peripheren Lymphknoten waren insgesamt jedoch bei VEGF-A transgenen Mäusen deutlich erhöht (Abbildung 18D). 60dpi, wo suszeptible BALB/c Mäuse eine Mikrofilarämie entwickeln können, konnten FvB-Wildtyp- und VEGF-Tg Mäuse die Infektion mit L.

sigmodontis fast löschen, nur sehr wenige Würmer waren noch in der Pleura-Höhle zu finden. Dabei bestanden auch hier keine Unterschiede in der Wurmanzahl zwischen den Mausgruppen und keine Mikrofilarämie wurde ausgebildet (Daten nicht gezeigt).

Dies lässt vermuten, dass VEGF-A keine gesonderte Rolle bei der Abwehr von Filarien spielt, da eine Überproduktion von VEGF-A nicht dazu führen konnte, den eindringenden L3 Larven die Etablierung im Wirt zu vereinfachen.

Desweiteren wurden mit anti-VEGF-A Antikörper behandelte und unbehandelte CCL17-defiziente Mäuse und CCL17^+/- Mäuse natürlich mit L. sigmodontis infiziert, um den Einfluss von VEGF-A in vivo bei einer natürlichen Infektion mit L. sigmodontis bei CCL17-Defizienz zu untersuchen. Es zeigte sich keine Reduktion der Wurmanzahl in der Pleura-Kavität bei einer Depletion von VEGF-A in CCL17 -/-Mäusen 10dpi im Vergleich zu unbehandelten CCL17^-/- Mäusen (Abbildung 18E). Die Wurmlast war sogar leicht erhöht in anti-VEGF-A behandelten Mäusen. Beide CCL17-defizienten Mausgruppen waren signifikant erhöht im Vergleich zu CCL17^+/- Mäusen.

Die Ergebnisse lassen vermuten, dass VEGF-A keine wichtige Rolle bei den Immunabwehrmechanismen gegen Filarien spielt, da eine Überexpression von VEGF-A nicht dazu führen konnte, den eindringenden L3 Larven die Etablierung im Wirt zu vereinfachen. Zudem konnte die Depletion vorhandenen VEGFs vor und freigesetzten VEGFs nach der Infektion nicht verhindern, dass die in die Haut eingedrungenen L3 Larven sich in CCL17-defizienten Mäusen in höherem Maße etablieren konnten. Daher ist eher anzunehmen, dass andere vasodilatorische Substanzen, die Mastzellen nach ihrer Aktivierung ausschütten können, die vaskuläre Permeabilität in CCL17 -/-Mäusen stärker beeinflussen und eine weit wichtigere Rolle als VEGF-A spielen.

Abbildung 18: Kein Einfluss von VEGF-A auf die Parasitenlast nach Infektion mit L. sigmodontis.

(A-D) FvB-Wildtyp (Wt) und VEGF-A transgene (Tg) Mäuse wurden natürlich mit L. sigmodontis infiziert und 10dpi die Anzahl der Parasiten (A) und der Zellen in der Pleura-Höhle (B) sowie die Zellzahl der mediastinalen (C) und peripheren (politealen, inguinalen, axialen) Lymphknoten (D) nach Kollagenase-Verdau bestimmt. Es werden Ergebnisse eines von zwei vergleichbaren Experimenten gezeigt (A, Mann Whitney Test; B-D,

ungepaarter t-Test). (E) Mit anti-VEGF-A Antikörper behandelte und unbehandelte CCL17-defiziente Mäuse und CCL17^+/- Mäuse wurden natürlich mit L. sigmodontis infiziert und die Parasitenlast in der Pleura-Höhle 10dpi bestimmt. Ergebnisse eines Experiments werden als Streudiagramm mit Mittelwerten dargestellt, die Daten wurden mit Kruskal-Wallis-Test und Dunn’s Multiple Comparison Test getestet.