Cytochrom P450-Enzymen in der
Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen in
Zellkulturen von Linum spec.
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem
Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Stephan Kuhlmann aus Wuppertal
Erstgutachter: Prof. Dr. Maike Petersen Zweitgutachter: Prof. Dr. A.W. Alfermann Tag der mündliche Prüfung am 14.01.2004
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Lignane – Vorkommen und Einteilung 1
1.2 Lignane in der Gattung Linum 2
1.3 Podphyylotoxin und seine Derivate 3
1.4 Ansätze zur biotechnologischen Produktion von Podophyllotoxin 6 1.5 Frühe Biosynthese – Phenylpropanstoffwechsel 8 1.6 Frühe Lignan-Biosynthese –
Von Coniferyl-Alkohol zu Matairesinol 10
1.7 Späte Lignan-Biosynthese –
verschiedene Modelle und Hypothesen 11
1.8 Cytochrom P450 Systeme in Pflanzen 14
1.9 Aufgabenstellung 16
2 Material und Methoden
2.1 Pflanzliche Zellkulturen 17
2.2 Zellkulturmedien 17
2.2.1 Zusammensetzung des Kulturmediums MS-Li 17
2.2.2 Zusammensetzung des Kulturmediums MS-Lf 18
2.3 Elicitierungs- und Biotransformationsversuche 19
2.4 Lignan-Extraktion aus Zellkulturen 20
2.5 Lignan-Extraktion aus frischem Pflanzenmaterial 20 2.6 Chemische Umwandlung von 4’-Demethyl-PTOX
zu 4’-Demethyl-DOP 22
2.7 Kopplungsversuch von 4’-Demethyl-DOP an Sepharose 6B 22
2.8 Mikrosomenpräparation 23
2.9 Enzymtest für die DOP 6-Hyxdroxylase (DOP6H) 24
2.10 Weitere Enzymtests 25
2.11 HPLC 26
2.12 Fraktionierung des Mikrosomenextraktes durch
doppelte Phasentrennung mit Triton X-114 26
2.13 Proteinfällung mit Methanol und Chloroform 27
2.14 SDS-PAGE 28
2.15 LDS-PAGE 29
2.16 Silberfärbung von Proteingelen 29
2.17 Luminol-Färbung von Proteingelen 30
2.18 RNA-Isolierung 31
2.19.1 Reverse Transkription 33
2.19.2 PCR 33
2.19.3 RACE-PCR 34
2.20 Agarosegele 35
2.21 Aufreinigung der PCR-Produkte 35
2.22 Ligation 36
2.23 Transformation 36
2.24 Plasmidpräparation 38
2.25 Sequenzierungen 38
2.26 Durchsuchen einer cDNA-Bank von Linum album 38
2.26.1 Ausplattieren der Zellen 39
2.26.2 Plaque-lifting 39
2.26.3 Hybridisierung der Sonde 40
2.26.4 in-vivo-Excision 41
Geräteliste 42
Chemikalien 42
Lignanstandards 42
3 Ergebnisse
3.1 Mikrosomenpräparation – Elektrophoretische Untersuchungen 44
3.2 Lignanextraktion aus Zellkulturen 46
3.3 Biotransformationsversuche mit Linum-Zellkulturen 46
3.4 Elicitierungsversuche 48
3.5 Enzymtests mit verschiednen potenziellen Substraten 50 3.6 Nachweis und Charakterisierung der
DOP6H aus Linum nodiflorum 52
3.6.1 Km-Werte für DOP und NADPH 54
3.6.2 Vergleich der Cosubstrate NADPH und NADH 58
3.6.3 Inhibitoren der DOP6H 59
3.7 Isolierung und Synthese von DOP 62
3.7.1 Katalytische Hydrierung von PTOX und
4’-Demethyl-PTOX 62
3.7.2 Lignanextraktion aus Wurzeln von Anthriscus sylvestris 64 3.8 Versuch zur Affinitätschromatographie mit 4’-Demethyl-DOP 65 3.9 Versuch zur biotechnologischen Anwendung von Mikrosomen 68 3.10 Klonierung von cDNAs der NADPH:Cytochrom
P450-Reduktase aus Linum spec. 69
3.10.2 RT-PCR und Klonierung 70
3.10.3 RACE-PCR und cDNA-Bank screening 75
4 Diskussion
4.1 Yatein wurde in zellfreien Mikrosomenpräparationen aus Linum-Zellkulturen nicht enzymatisch umgesetzt – mögliche Gründe 77 4.1.1 Yatein ist kein Intermediat im Stoffwechselweg zu
DOP in Linum spec. 77
4.1.2 Die Umsetzung von Yatein ist nicht
Cytochrom P450-abhängig 79
4.1.3 Ein spezifisches Cytochrom P450-Enzym ist im
verwendeten Testverfahren nicht nachweisbar 80 4.1.4 Ein spezifisches Enzym ist zu gering exprimiert,
um nachweisbar zu sein 82
4.1.5 Schlussfolgerung und Hypothese 83
4.2 Desoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase (DOP6H) 84
4.2.1 Charakterisierung des Enzyms 84
4.2.2 Bedeutung der Cosubstrate NADH und NADPH 86
4.2.3 Bedeutung der Inhibitoren der DOP6H 87
4.2.4 Die Bedeutung von DOP in der Lignan-Biosynthese 88 4.2.5 Biotechnologische Verwendbarkeit der
DOP6H – Ausblick 89
5 Zusammenfassung 91
Abkürzungsverzeichnis
4’-Demethyl-PTOX 4’-Demethylpodophyllotoxin 4’-Demethyl-YAT 4’-Demethyl-Yatein 7-Hydroxy-MAT 7-Hydroxymatairesinol AHP Anhydropodorhizol Anc Ancymidol APS Ammoniumperoxydisulfat ATP Adenosintriphosphat BAP Benzylaminopurin CA ZimtsäurecDNA komplimentäre DNA
Cyt. c Cytochrom c DIECA Natriumdiethyldithiocarbaminat DMFA dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxy-Ribonukleinsäure DOP Desoxypodophyllotoxin
DOP6H DOP 6-Hydroxalase
DOP7H DOP 7-Hydroxylase
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ER Endoplasmatisches Retikulum
FPLC fast protein liquid chromatography
HPLC high performance liquid chromatography
IES Indolyl-3-Essigsäure
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid
Km-Wert Michaelis-Menten Konstante
LB Luria-Bertani-Vollmedium für Bacillus
LDS Lithiumdodecylsulfat
M Molar (mol/l)
MAT Matairesinol
MAT7H MAT 7-Hydroxylase
Met Metyrapon
Mic Miconazol
MPTOX 6-Methoxypodophyllotoxin
MS-Lf Murashige & Skoog-Medium für Linum flavum
NAA Naphthylessigsäure
NADH Nicotinamid Adenin-Dinukleotid
NADPH Nicotinamid Adenin-Dinukleotid-Phosphat
nt Nukleotide
NZY Bakterienmedium mit NZ-Aminen und
Hefeextrakt
OD optische Dichte
p.a. pro analysi
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PAM β-Peltatin-A Methylether
PAM7H PAM 7-Hydroxylase
PBS phosphate buffered saline
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PHD Prohexadion-Calcium
PMG steriles getrockenetes Zellwandmaterial des Pilzes
Phytophtora megasperma var. glycineae
POD Podorhizol
PTOX Podophyllotoxin
RACE rapid amplification of cDNA ends
RNA Ribonukleinsäure
RP reversed phase
rpm rounds per minute
RT-PCR
Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
SDS Natriumdodecylsulfat
SM Natrium-Magnesium-Puffer
SSC Natrium-Natriumcitrat-Puffer
TBE Tris Borat EDTA-Puffer
TBS Tris buffered saline
TE Tris-EDTA-Puffer
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
Tet Tetcyclacis
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan
v/v Volumen pro Volumen
w/w Gewicht pro Gewicht
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-thiogalactosid
YAT Yatein
Ergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht:
Vorträge und Poster:
S. Kuhlmann, M. Petersen: Screening for cytochrome P450 enzymes in late lignan biosynthesis (Vortrag). 2. EU-Symposium LIGNOCANCER, 13.-16.1.2000, Groningen (Niederlande).
S. Kuhlmann, M. Petersen: News about DOP5H.(Vortrag) 3. EU-Symposium LIGNOCANCER, 6.-7.10.2000, Salamanca (Spanien).
J. Schmitt, K. Kranz, S. Kuhlmann, M. Petersen: Studies on lignan production and lignan biosynthesis in plant cell cultures (Vortrag). 4. EU-Symposium
LIGNOCANCER, 26.-29.4.2001, Düsseldorf.
S. Kuhlmann, K. Kranz, B. Lücking, A.W. Alfermann, M. Petersen: Aspects of
cytotoxic lignan biosynthesis in suspension cultures of Linum nodiflorum (Poster). PSE-Symposium „Plant Biotechnology – Better Products from Better Plants“, 11.-13.6.2001, Helsinki (Finnland).
S. Kuhlmann, G. Molog, U. Empt, W. Van Uden, N. Pras, A.W. Alfermann, M. Petersen: Biosynthese von Lignanen des Aryltetrahydronaphthalentyps in
Suspensionskulturen von Linum spec.: Charakterisierung der Desoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase (Vortrag). 3. Tagung der Sektion "Pflanzliche Naturstoffe" der Deutschen Botanischen Gesellschaft, 6.-8.7.2001, Lutherstadt Wittenberg.
S. Kuhlmann, K. Kranz, M. Petersen: Enzymes of the biosynthesis of cytotoxic lignans in Linum species - deoxypodophyllotoxin 6-hydroxylase; (Vortrag) Phytochemistry and Biology of Lignans; 6. bis 9. April 2003, Walberberg,
S. Kuhlmann, G. Molog, U. Empt, W. van Uden, N. Pras, A.W. Alfermann, M. Petersen:
Characterisation of Deoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase (DOP6H), a Cytochrome P450-dependent Enzyme in Lignan Biosynthesis of Linum species (Poster) Tagung der Gesellschaft für Arzneipflanzenforschung, 2001, Erlangen; Posterpräsentation
S. Kuhlmann, G. Molog, U. Empt, M. Petersen, W. van Uden, N. Pras, A.W. AlfermannLignan-Biosynthesis in Linum Species: Deoxypodophyllotoxin 5-Hydroxylase is important for determining the end product (Poster) 5th International Symposium on P450 Biodiversity, 2000, Ellsinore, Denmark;
Publikationen:
Molog GA, Empt U, Kuhlmann S, van Uden W, Pras N, Alfermann AW, Petersen M Deoxypodophyllotoxin 6-hydroxylase, a cytochrome P450 monooxygenase from cell cultures of Linum flavum involved in the biosynthesis of cytotoxic lignans.
Planta. 2001 Dec;214(2):288-94.
Kuhlmann S, Kranz K, Lücking B, Alfermann AW, Petersen M
Aspects of cytotoxic lignan biosynthesis in suspension cultures of Linum nodiflorum Phytochemistry Reviews 2002; 1; 37-43
1 Einleitung
1.1 Lignane – Vorkommen und Einteilung
Lignane sind eine im Pflanzenreich weit verbreitete Gruppe sekundärer Inhaltsstoffe. Sie gehören zur Gruppe der phenolischen Substanzen und leiten sich von der aromatischen Aminosäure Phenylalanin ab. Lignane kommen sowohl bei Gymnospermen und Angiospermen, als auch bei Moosen und Farnen vor. Es wurde spekuliert, dass die Fähigkeit zur Synthese dieser Stoffklasse zusammen mit der Landbesiedlung entstand (Lewis & Davin 1999).
Die physiologischen Bedeutungen von Lignanen für die jeweiligen Pflanzen können recht unterschiedlich sein. Am häufigsten ist eine Rolle als fakultativer Fraßschutz, aber auch antioxidative, antimikrobielle und fungizide Effekte werden diskutiert (zur Übersicht: Lewis & Davin 1999). Bei Gymnospermen können sehr hohe Lignan-Konzentrationen in der Bildungsregion neuer Äste, den sog. Knoten gefunden werden (Willfor et al., 2003). Des weiteren konnte gezeigt werden, dass Lignane die Samenkeimung und das Wurzelwachstum benachbarter Pflanzen hemmen können (Oliva et al., 2002; Cutillo et al., 2003).
Auch in der menschlichen Nahrung sind Lignane enthalten, die zu den sogenannten Phytoöstrogenen gezählt werden. Sie kommen z.B. in Sesam (Sesamin) und Leinsamen (Matairesinol, Secoisolariciresinol) vor. Insbesondere letztgenannte können von der Darmflora in Enterolacton und Enterodiol umgewandelt werden. In klinischen Studien konnte eine krebsprotektive Wirkung der Lignane in Leinsamen bestätigt werden (Adlercreutz, 1999; Cho et al., 1999).
1 6 5 4 3 2 8 9 5 4 1 2 7 7 3 6 8 9 R2 R1 R2 R1 OH OH R1 R2 CH2OH 2x
Abbildung 1: Lignan-Grundgerüst mit 8-8’ Verknüpfung zweier Monolignoleinheiten
Was genau Lignane sind, bzw. welche Verbindungen unter diesem Begriff subsummiert werden können, wird von verschiedenen Autoren unterschiedlich gesehen. Einigkeit besteht darüber, dass Dimere von Zimtsäurederivaten, die über ihre β-C Atome miteinander verknüpft sind, als Lignane bezeichnet werden. Damit leiten
sie sich vom Phenylpropanstoffwechsel und letztlich von der aromatischen Aminosäure Phenylalanin ab.
Im engeren Sinne steht tatsächlich nur Dimeren der genannten häufigsten Verknüpfungsart, die auch 8-8’ genannt wird, der Begriff Lignane zu (siehe Abbildung 1). Sind die Monolignoleinheiten auf eine andere Art verknüpft, so werden sie als Neolignane bezeichnet. Norlignanen fehlt dagegen das C9 bzw. das C9’ Atom oder eine Methoxygruppe am aromatischen Ring. Sind Norlignane anders als 8-8’ verknüpft handelt es sich um Norneolignane (zur Übersicht über die Strukturvielfalt siehe: Ward, 1993; Ward, 1995;Ward, 1997;Ward, 1999).
Diese Begriffswahl hat historischen Ursprung. In neueren Publikationen z.B. von Lewis & Davin 1999 wird gefordert, alle Oligomere aus Zimtsäure-Derivaten als Lignane zu bezeichnen. Allerdings hat sich diese Vereinfachung bisher nicht allgemein durchgesetzt. Die in dieser Arbeit besprochenen Lignane gehören zum „klassischen“ häufigsten Typ, weshalb sie auch im engeren Sinn als Lignane zu bezeichnen sind. Zur bisher ebenfalls unterschiedlich gehandhabten Nummerierung der Atome in Lignanmolekülen hat die IUPAC eine Empfehlung herausgebracht, die für diese Arbeit übernommen wurde (http://www.chem.qmw.ac.uk/iupac/lignan/).
1.2 Lignane in der Gattung Linum
Innerhalb der Familie die Linaceae bildet die Gattung Linum die größte Gruppe mit geschätzten 230 Spezies. Verschiedene
Linum-Arten kommen überall auf der Welt vor, wobei die
größte wirtschaftliche und kulturelle Bedeutung sicherlich
Linum usitatissimum zufällt. Lein ist eine der ältesten
Kulturpflanzen der Menschen, wobei verschiedene Varianten zur Faser- oder Ölgewinnung verwendet werden (Muir & Westcott, 2003).
Aufgrund von morphologischen und phytochemischen Daten kann die Gattung in verschiedene Sektionen unterteilt werden, wobei die genaue Einteilung allerdings umstritten ist. Die für diese Arbeit übernommene Nomenklatur unterscheidet die Sektionen Linum, Syllinum, Dasyllinum, Linastrum und Cathartolinum.
Lignane können in jeder dieser Sektionen gefunden werden, weshalb ihnen chemotaxonomisch keine große Bedeutung zugestanden wird. Es fällt jedoch auf, dass Lignane vom
Podophyllotoxin-Typ insbesondere (allerdings nicht ausschließlich) in der Sektion Syllinum gefunden werden. Mohagheghzadeh et al. (2003) versuchen aufgrund von eigenen und Literaturdaten diese Sektion weiter zu unterteilen. Dabei kommen sie zu
Abbildung 2: Linum
dem Ergebnis, dass ausdauernde Arten mit weißen, heterostylen Blüten eher Podophyllotoxin akkumulieren, während in ausdauernden Arten mit gelben, heterostylen Blüten eher 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX) zu finden ist. Einen besonderen Platz nimmt in dieser Einteilung Linum nodiflorum (Abbildung 2) ein, da es sich um eine nicht ausdauernde Art mit homostylen, gelben Blüten handelt. Auch die phytochemischen Untersuchungen von Velasco & Goffman 2000, die sich auf Tocopherol, Plastochromatol und Fettsäuren konzentrierten, um zu einer Einteilung der Gattung zu kommen, weisen L. nodiflorum einen besonderen Platz innerhalb der Sektion Syllinum zu.
Das Vorkommen von 6-Methoxypodophyllotoxin in L. nodiflorum wurde von Konuklugil (1996) beschrieben. Ein Vertreter der weiß blühenden Gruppe ist Linum
album, in dem von Weiss et al., 1975 Podophyllotoxin nachgewiesen wurde. Als
gelbblühende Art ist u.a. Linum flavum zu nennen, in dem BROOMHEAD & Dewick 1990 MPTOX nachgewiesen haben.
Außerhalb der Sektion Syllinum wurden Lignane vom Podophyllotoxin-Typ bisher nur sehr vereinzelt gefunden, so z.B. in Linum austriacum (Konuklugil, 1996), das der Sektion Linum zugerechnet wird. Lignane abweichenden Bautyps sind jedoch in der Gattung Linum, wie erwähnt, weit verbreitet. Bekannt ist das Vorkommen der Lignane Secoisolariciresinol (SEC) und Matairesinol (MAT) in den Samen von L. usitatissimum (Sektion Linum), den Leinsamen (siehe auch Abbildung 7). In L. austriacum konnten außerdem Justicidin B und Isojusticidin B nachgewiesen werden (Mohagheghzadeh et al., 2002).
1.3 Podophyllotoxin und seine Derivate
Podophyllotoxin (PTOX) ist ein Lignan vom Aryltetrahydronaphthalen-Typ (Abbildung 3). Es ist stark cytotoxisch und wurde zuerst aus Wurzeln und Rhizomen von Pflanzen der Gattung Podophyllum isoliert, deren Vertreter in Nord-Amerika (P.
peltatum) und der Himalaja-Region (P. hexandrum, Synonym P. emodi) vorkommen.
Beide Arten sind als traditionelle Heil- bzw. Giftpflanzen bekannt und wurden vielfältigen Verwendungen zugeführt. So benutzten die Ureinwohner Nord-Amerikas wässrige Extrakte aus P. peltatum (Abbildung 4) als Laxans, Kathartikum, Anthelminthikum und wahrscheinlich sogar zur Tumorbehandlung, aber auch als Antidot bei Schlangenbissen sowie zur rituellen Selbsttötung. Unter den europäischen Einwanderern wurden Podophyllum-Extrakte als Emetikum, Kathartikum und Cholagogum verwendet (Imbert, 1998, Lloyd 1910).
O O O R2 R3 O OMe MeO R1 R1 R2 R3 PTOX OH H OCH3
MPTOX OH OCH3 OCH3
DOP H H OCH3
α-PELT H OH OH
β-PELT H OH OCH3
PAM H OCH3 OCH3
4’-Demethyl-Serie -- -- OH
Abbildung 3: C2-C7' Cyclolignane; Podophyllotoxin (PTOX), 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX), Desoxypodophyllotoxin (DOP), α-Peltatin (α-Pelt), β-Peltatin (β-Pelt), β-Peltatin-A Methylether (PAM)
In Europa wurden Extrakte aus Juniperus spec., die ebenfalls Podophyllotoxin enthalten, und aus Anthriscus sylvestris, dem Wiesenkerbel, der reich an Desoxy-podophyllotoxin und Yatein ist, verwendet (siehe auch Abbildung 8). Entsprechende Berichte von Dioscorides und Plinius dem Älteren, reichen zurück bis ins erste Jahrhundert (Imbert, 1998).
Ein harziger Extrakt aus Podophyllum-Wurzeln wird Podophyllin genannt. Dieses Podophyllin, das in Amerika seit 1850 kommerziell erhältlich ist (Lloyd 1910), wurde und wird zur äußerlichen Anwendung gegen Feigwarzen (Condyloma acuminata) eingesetzt. In den 40er und 50er Jahren des 20. Jahrhunderts konnte Podophyllotoxin als wirksames Prinzip in Podophyllin erkannt und isoliert werden. Im Deutschen Arzneimittelkodex (DAC) ist Podophyllin seit 1973 monographiert. Damit ist in Deutschland, aber auch in anderen Ländern wie Österreich, Schweiz oder den USA die von Podophyllum peltatum stammende Droge gemeint, wogegen in Großbritannien seit 1902 das von P. hexandrum stammende
Podophyllin verwendet wird. Die beiden Drogen unterscheiden sich sowohl in der Zusammensetzung als auch in der absoluten Menge der darin enthaltenden Lignane (Albert, 1999, sowie darin genannte Zitate). Einen Überblick über die Chronologie der Verwendung von Extrakten aus Podophyllum gibt Abbildung 5.
Als Alternative zu Podophyllin sind inzwischen Cremes (Wartec®) oder Gele (Condylox®) mit reinem Podophyllotoxin als Wirkstoff erhältlich. Da sie deutlich weniger Nebenwirkungen zeigen als Podophyllin, gilt dieses heute als obsolet.
Podophyllotoxin ist ein Spindelgift. Es bindet an Tubulin-Dimere an derselben Stelle und in derselben Stärke wie das bekanntere Colchicin und verhindert somit den Aufbau, aber nicht den Abbau der Mikrotubuli. Da auf diese Weise eine mitotische Teilung verhindert wird, lag es nahe, Podophyllotoxin als Cytostatikum einzusetzen. Aufgrund schwerer Nebenwirkungen (z.B. Hepatotoxizität) konnte sich
diese Anwendung aber nicht durchsetzen. Allerdings wurden zahlreiche Derivatisierungen durchgeführt, wobei u.a. die halbsynthetischen Glykoside Etoposid und Teniposid entwickelt wurden, die heute Bedeutung in der Krebstherapie haben. Interessanterweise haben Etoposid, Teniposid und auch Etopophos® (Etoposid-Phosphat) einen gänzlichen anderen Wirkmechanismus als Podophyllotoxin. Sie sind Inhibitoren der Topoisomerase II und verhindern damit die DNA-Replikation. Der Vorteil von Etopophos®, einem „Pro-drug“ zu Etoposid, liegt in der höheren Wasserlöslichkeit. Zusätzlich zu den bereits eingesetzten Glykosiden werden weitere Derivate von Podophyllotoxin auf ihre medizinische Anwendbarkeit getestet. Dazu gehören z.B. die Verbindungen TOP 53, GL-331 und NK-611.
Ein anderes halbsynthetisches Glykosid von Podophyllotoxin trägt die Bezeichnung CPH 82, oder Rheumacon®. Es wird gegen rheumatoide Arthritis eingesetzt und hat den Wirkmechanismus der Ausgangssubstanz Podophyllotoxin, d.h. es hemmt die Bildung von Mikrotubuli. Zwar zeigten klinische Studien vielversprechende Ergebnisse (Svensson & Pettersson 2003), aber auch erbgutschädigende Nebenwirkungen werden diskutiert (Dahlqvist & Nordenson 1996).
Des weiteren werden auch antivirale Wirkungen für Podophyllotoxinderivate diskutiert (Gordaliza et al., 2000; Übersicht: Charlton, 1998).
Die Hauptbedeutung von Podophyllotoxin liegt heute in der Verwendung als Ausgangssubstanz für die Synthese von Etoposid und ähnlichen Derivaten. Da die chemische de-novo Synthese von Podophyllotoxin verhältnismäßig aufwändig ist, liefern nach wie vor Wildsammlungen von Podophyllum-Pflanzen die Hauptquelle für seine Gewinnung. Im Falle des im Himalaja heimischen P. hexandrum hat dies zu einer Bedrohung der Art geführt. (Appendix II der convention for international trades in
endangeres species CITES; World Conservation Monitoring Centre 2001). Abbildung 4: Podophyllum
Abbildung 5: Zeitlinie über die Verwendung von Extrakten und Inhaltsstoffen aus Podophyllum Spezies. Daten entnommen aus Imbert, 1998 und Bohlin & Rosen 1996.
1.4 Ansätze zur biotechnologischen Produktion von Podophyllotoxin
Zwar ist eine chemische de-novo Synthese von Podophyllotoxin über verschiedene Strategien möglich, doch erweist sich diese insbesondere aufgrund der Stereochemie des Endproduktes als recht aufwändig und daher nicht wirtschaftlich im Vergleich zur Isolierung des Naturstoffes aus Pflanzen.
Um von den Wildsammlungen unabhängig einen konstanten Nachschub von Podophyllotoxin zu gewährleisten, wurden deshalb in den vergangenen Jahren verschiedene biotechnologische Verfahren getestet. So wird z.B. die in Amerika heimische Art Podophyllum peltatum als Alternative zu P. hexandrum untersucht. (Moraes et al., 2002) konnten zeigen, dass Podophyllotoxin in den Blättern von P.
peltatum akkumuliert wird. Darüber hinaus konnte eine spezifische β-Glucosidase nachgewiesen werden (Dayan et al., 2003).
Zwar ist der Gesamtgehalt an Lignanen in P. peltatum geringer als in P. hexandrum (Chatterjee, 1952), aber P. peltatum hat den Vorteil, in Amerika östlich der Rocky Mountains ubiquitär vorzukommen. Beim Ernten der Blätter würden außerdem die Pflanzen nicht vernichtet, wie es bei der Isolierung aus den Rhizomen bzw. Wurzeln
der Fall ist. Ob sich der Anbau von P. peltatum zur Podophyllotoxin-Produktion rentiert, muss sich in den nächsten Jahren erweisen.
Einen anderen biotechnologischen Ansatz stellen pflanzliche Zellkulturen dar. Sie bieten den Vorteil, von jahreszeitlichen und witterungsbedingten Schwankungen unabhängig zu sein. Auch für biochemische Untersuchungen sind Zellkulturen ein günstiges System, da sie in kurzen Zeiträumen größere Mengen an Biomasse produzieren als intakte Pflanzen, wodurch Testverfahren eher standardisiert werden können. Allerdings ist in den meisten Kultursystemen der Gehalt insbesondere an sekundären Inhaltsstoffen für eine kommerzielle Nutzung zu gering. Große Bedeutung haben pflanzlicher Zellkulturen jedoch für die Vermehrung von Pflanzen durch die sogenannte Mikropropagation (Alfermann et al. 1994), bei der aus pathogenfreiem Pflanzenmaterial über Kalli eine Vielzahl von Pflanzen gewonnen werden kann.
Eine Reihe unterschiedlicher Spezies wurde für die Produktion von Podophyllotoxin und ähnlichen cytotoxischen Lignanen in Zellkulturen herangezogen (zur Übersicht: Petersen & Alfermann 2001). In Linum spec. konnte die größte Menge an Podophyllotoxin (28 mg pro Liter nach 11 Tagen) in einer Suspensionskultur von
Linum album gefunden werden (Smollny et al., 1998, Empt et al., 2000). MPTOX
wurde in der bisher größten Menge (121 mg pro Liter) in Suspensionskulturen von
Linum flavum (Berlin et al., 1986) nachgewiesen. Insbesondere Linum spec. scheinen
also für die Lignan-Produktion in sogenannten Bioreaktoren geeignet zu sein. Allerdings werden auch Produktionsansätze mit Suspensionskulturen von P.
hexandrum verfolgt. Die Optimierung der Kulturbedingungen führte dabei zu einer
maximalen Podophyllotoxin-Menge von 48,8 mg / l nach einer Kulturperiode von 60 Tagen (Chattopadhyay et al., 2003).
Eine neue interessante Variante ist die Co-Kultivierung von Linum flavum hairy root Kulturen mit Zellsuspensionen von P. hexandrum (Lin et al., 2003). Dabei produzieren die Wurzelkulturen Coniferin, dass von den undifferenzierten Podophyllum-Zellen aufgenommen und zu Podophyllotoxin umgesetzt wird.
1.5 Frühe Biosynthese – Phenylpropanstoffwechsel
Als Phenylpropanoidweg bezeichnet man die biochemischen Reaktionen, die von Phenylalanin ausgehend zur Bildung der sogenannten Monolignoleinheiten, 4-Cumaryl-Alkohol, Coniferyl-Alkohol und Sinapyl-Alkohol führen. Diese Alkohole wiederum sind die Bausteine der Zellwandsubstanz Lignin, nach Cellulose das zweithäufigste organische Polymer in der Natur. Lignane dagegen sind oligomere, meist dimere, Verbindungen von Monolignoleinheiten und anders als Lignin zumeist optisch aktiv.
Die Vorstellung von diesem Stoffwechselweg hat sich in den vergangenen Jahren mehrfach verändert, zuletzt insbesondere durch Ergebnisse der Genomanalyse von
Arabidopsis thaliana. Einen Überblick über das zur Zeit diskutierte Modell gibt
Abbildung 6.
Phenylalanin wird zunächst von der Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) desaminiert und die so entstandene Zimtsäure von der Zimtsäure Hydroxylase (C4H) zur 4-Cumarsäure umgesetzt. Diese ersten Schritte sind seit langem bekannt, und PAL sowie C4H gehören zu den best untersuchten Enzymen des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels.
A bbildung 6: Ü be rbl ic k ü be r d en P he ny lpr op anst of fwec hsel , ent nom m en aus Hum ph rey s & C ha ppl
Lange Zeit war unklar, auf welcher Stufe eine Hydroxylierung des 4-Cumaroyl-Restes an Position C3 zum entsprechenden Kaffeesäure-Derivat erfolgt. Sowohl die Säuren, als auch ihre CoA-Ester sowie die abgeleiteten Aldehyde, wurden diskutiert.
Neuere Untersuchungen sprechen dafür, dass über die Zwischenstufe 4-Cumaroyl-CoA zunächst Cumaroyl-Shikimat bzw. –Chinat Ester gebildet werden (Van Doorsselaere et al. 1995), die dann als Substrate für die 3-Hydroxylierung des 4-Cumaroylrestes genutzt werden (Schoch et al. 2001, Franke et al. 2002). Nach erneuter Bildung eines CoA Esters und der Übertragung einer Methylgruppe durch die Caffeoyl-CoA-O-Methyltransferase (CCoAOMT) entsteht Feruloyl-CoA (Kneusel et al. 1989), das von der Cinnamoyl-CoA Reduktase (CCR) zu Coniferyl-Aldehyd und von der Cinnamyl Alkohol Dehydrogenase (CAD) schließlich zu Coniferyl-Alkohol umgesetzt wird. Die Biosynthese der Lignane vom Podophyllotoxin-Typ startet meist mit zwei Molekülen Coniferyl-Alkohol (Lewis & Davin 1999). Für die Bildung von Lignin spielen auch 4-Cumaryl-Alkohol und Sinapyl-Alkohol, sowie das Verhältnis der drei Einheiten zueinander eine Rolle (Humphreys & Chapple 2002).
Alle Hydroxylasen, die in diesem Stoffwechselweg vorkommen sind Cytochrom P450 abhängige Enzyme, wobei die C4H das häufigste und am leichtesten zu detektierende Enzym darstellt.
1.6 Frühe Lignan-Biosynthese – Von Coniferyl-Alkohol zu Matairesinol
Genau wie für Lignin sind auch für die Biosynthese der Lignane Monolignoleinheiten wie Coniferyl-Alkohol die Ausgangsverbindungen (Abbildung 7). Im ersten Schritt der Biosynthese werden zwei Einheiten stereospezifisch miteinander verknüpft. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass dies über radikalische Zwischenstufen geschieht, so dass der Mechanismus der Pinoresinol-Synthase dem einer Laccase ähnelt. Die Stereospezifität wird dabei durch ein sogenanntes Dirigierendes Protein gewährleistet, das selbst keine enzymatische Aktivität aufweist, aber die Stereochemie des Produktes festlegt (Davin et al., 1997, Davin & Lewis 2000). Da in Forsythia spec. (+)-Pinoresinol gefunden wird, in Linum usitatissimum dagegen (-)-(+)-Pinoresinol, geht man von verschiedenen Dirigierenden Proteinen in den unterschiedlichen Pflanzen aus. In Zellkulturen von Linum album konnte ein Einbau der 13C-markierten Ferulasäure in DOP und Podophyllotoxin gezeigt werden (Seidel et al., 2002). Auch in Podophyllum
hexandrum wurde der Einbau von Ferulasäure, sowie von Zimtsäure und Phenylalanin
in Podophyllotoxin gezeigt (Jackson & Dewick 1984b). Demnach weisen die Monolignoleinheiten für die Lignan Biosynthese ein 4-Hydroxy-3-methoxy Muster auf, während die weiteren Hydroxylierungen und Methylierungen erst im späteren Verlauf eingefügt werden.
Die Pinoresinol/Lariciresinol Reduktase (PLR) katalysiert die Umwandlung von Pinoresinol über Lariciresinol in Secoisolariciresinol in Abhängigkeit von NADPH. Auch diese Reaktionen laufen stereospezifisch ab und auch für dieses Enzym wurden verschiedene Isoformen in unterschiedlichen Pflanzen gefunden, die jeweils zu (+)-oder (-)-Secoisolariciresinol führen. Die Klonierung und kürzlich erfolgte Kristallisation der PLR zeigte eine Verwandtschaft zu Isoflavon-Reduktasen (Chu et al., 1993, Dinkova-Kostova et al., 1996, Min et al., 2003, J. Biol. Chem., in press). Die Secoisolariciresinol Dehydrogenase schließt den Lactonring zwischen C9 und C9’ zum Matairesinol. Das etwa 32 kDa große, NAD-abhängige Enzym konnte aus
Forsythia intermedia und Podophyllum peltatum aufgereinigt und heterolog exprimiert
(Xia et al., 2001), nachdem seine Aktivität bereits zuvor in zellfreien Extrakten von F.
intermedia nachgewiesen worden war (Umezawa et al., 1991)
CH2OH OH OMe O O H H O H OH OMe OMe O H H OH OMe O H OMe OH O H H H OH MeO MeO OH OH O O H H H OH MeO MeO O 2x
Coniferyl-Alkohol (+)-Pinoresinol (+)-Lariciresinol
(-)-Secoisolariciresinol (-)-Matairesinol
(1) (2)
(2)
(3)
Abbildung 7: Lignan-Biosynthese – von Coniferyl-Alkohol zu Matairesinol (1) Pinoresinol Synthase; (2) Pinoresinol/Lariciresinol Reduktase, (3) Secoisolariciresinol Dehydrogenase
1.7 Späte Lignan-Biosynthese – verschiedene Modelle und Hypothesen
Im Gegensatz zur Bildung von Matairesinol ist die weitere Biosynthese von Podophyllotoxin und Derivaten wie MPTOX nicht vollständig geklärt. Um die Reaktionsfolge zu klären wurden verschiedene Modellsysteme herangezogen (Abbildung 8):
Podophyllum spec.: Durch Fütterungsversuche mit radioaktiven Vorstufen
konnte gezeigt werden, dass Matairesinol der gemeinsame Vorläufer sowohl für die 4’-O-Methyl Serie (DOP, β-Peltatin, Podophyllotoxin), als auch für die 4’-Demethylserie (4’-Demethyl-DOP, α-Peltatin, 4’-Demethyl-Podophyllotoxin) ist (Broomhead et al., 1991, Phytochem. 30, 1489-92). Auf der Stufe der C2-C7’-Cyclolignane wie DOP wurden diese beiden Serien nicht mehr ineinander überführt (Jackson and Dewick, 1984, Phytochem., 23, 1037-42). Außerdem wurde nachgewiesen, dass in P.
hexandrum Pflanzen radioaktiv markiertes Yatein in Podophyllotoxin eingebaut wird,
nicht aber Podorhizol (POD) oder Anhydropodorhizol (AHP), obwohl auch diese Lignane in P. hexandrum vorkommen (Kamil and Dewick, 1986b, Phytochem. 25, 2093-102). Als direkte Vorstufe von α- und β-Peltatin konnten 4’-Demethyl-DOP bzw. DOP in P. peltatum und P. hexandrum bestätigt werden (Kamil and Dewick, 1986a, Phytochem. 25, 2089-92). Daraus lässt sich folgender Syntheseweg ableiten: Auf der Stufe von Matairesinol trennen sich die Biosynthesen der 4’-Demethyl und der 4’-O-Methyl Serie. Weitere Zwischenstufen sind Yatein und DOP, das die Vorstufe sowohl von β-Peltatin, als auch von Podophyllotoxin ist (entspechendes gilt für die 4’-Demethyl Analoga). Für die Bildung von POD und AHP wird ein Chinon-Intermediat von Yatein vorgeschlagen, das gleichzeitig die reaktive Zwischenstufe bei der Umwandlung zu DOP sein könnte.
Anthriscus sylvestris: Vor kurzem wurde von Sakakibara et al. die Biosynthese
von Yatein ausgehend von Matairesinol in Anthriscus sylvestris aufgeklärt (Sakakibara et al., 2003).. Für diese Untersuchungen wurde A. sylvestris Pflanzen [13C]-markiertes Phenylalanin gefüttert. Demnach erfolgen am hängenden, aromatischen Ring nacheinander zunächst die Hydroxylierung und anschließende Methylierung am C5’-Atom, danach die Methylierung der OH-Gruppe an C4’ und abschließend die Knüpfung der Methylendioxybrücke am zweiten Benzylring zwischen C4 und C5. Biotransformationsversuche mit Suspensionskulturen zeigten, dass DOP in Podophyllotoxin überführt wurde, nicht aber Yatein, das für die Zellen toxisch war, oder AHP (Koulman et al., 2003a). In-planta akkumulieren vor allem DOP und Yatein, Podophyllotoxin dagegen nur in geringen Mengen. Durch eine verfeinerte GC-MS-Methode (Koulman et al., 2001) konnten sowohl in Wurzeln, als auch in den oberirdischen Teilen weitere Lignane detektiert werden, von denen manche, wie z.B. 7-Hydroxymatairesinol nicht mit den von Sakakibara et al. gefundenen Zwischenstufen übereinstimmen. Allerdings wurden diese Lignane nur in sehr geringen Mengen gefunden.
Linum spec.: Für Wurzeln von Linum flavum beschreiben Xia et al., 2000 die
Bildung von 7-Hydroxymatairesinol aus radioaktiven Vorstufen und dessen Einbau in das Endprodukt MPTOX.
O O H O OH OMe MeO OH OMe O H OH OMe
MeO MeO OMe
OMe O O H O OH OMe MeO OH O O O O OMe MeO OMe O O O O OMe MeO OMe O O O O OH Ar O O O Ar O OH O O O Ar O OMe O O O Ar O OMe OH O O O Ar O OGluc O O O Ar O OGluc OH OMe MeO OMe ? ? MAT DOP PTOX MPTOX PAM PELT 7H-MAT YAT
A.s. A.s. A.s.
A.s. P.p. P.h. L.f. L.f. L.f. L.f. L.f. L.a. L.f. A.s. P.p. P.h. = Ar
Abbildung 8: Metabolisierung von Matairesinol in verschiedenen Untersuchungssystemen; A.s.
Anthriscus sylvestris, P.p. Podophyllum peltatum, P.h. Podophyllum hexandrum, L.f. Linum flavum, L.a. Linum album
Umfangreiche Biotransformationsversuche in Suspensionskulturen von Linum flavum zeigten jedoch eine Umwandlung von Desoxypodophyllotoxin, sowie β-Peltatin in MPTOX und MPTOX-Glukosid (Van Uden et al., 1995a Van Uden et al., 1997, Van Uden 1997b). In denselben Kulturen war Podophyllotoxin nicht in MPTOX-Glukosid überführbar, obwohl dies das hauptsächlich gebildete Lignan ist. Stattdessen akkumulierte Podophyllotoxin-β-D-Glukosid (van Uden et al., 1992, van Uden 1993). Entsprechende Versuche mit Suspensionskulturen von Podophyllum hexandrum zeigten eine Biotransformation von Desoxypodophyllotoxin zu Podophyllotoxin und seinem Glukosid.
Diese Versuche sprechen dafür, dass Desoxypodophyllotoxin (DOP) in Linum flavum ein Intermediat im Biosyntheseweg zu MPTOX ist. Wird allerdings, wie von Xia et al., 2000 beschrieben bereits auf der Stufe von Matairesinol eine OH-Gruppe am C7-Atom eingeführt, ist eine Beteiligung von Desoxypodophyllotoxin nur schwer vorstellbar, da dies die Entfernung eben dieser OH-Gruppe voraussetzen würde.
In Zellkulturen von Linum album konnte die Umwandlung von DOP zu Podophyllotoxin gezeigt werden (Seidel et al., 2002, Empt et al., 2000), wobei dieser Schritt als geschwindigkeitsbestimmend diskutiert wird.
1.8 Cytochrom P450 Systeme in Pflanzen
Cytochrom P450-abhängige Enzyme werden sowohl als Mono-Oxygenasen, als auch als mischfunktionale Oxygenasen (mixed-function) bezeichnet. Beide Begriffe beschreiben den prinzipiellen Reaktionsablauf, bei dem molekularer Sauerstoff O2 von
der Häm-Gruppe des Cytochroms gebunden wird und üblicherweise ein Sauerstoff-Atom auf das jeweilige Substrat (Mono-Oxygenase) übertragen und das zweite zu Wasser reduziert wird, wobei die beiden Protonen vom Co-Faktor NADPH zur Verfügung gestellt werden. Ein vereinfachtes Reaktionsschema könnte also folgendermaßen formuliert werden:
RH + O2 + NADPH + H+ Æ ROH + H2O + NADP+
Es werden demnach zwei unterschiedliche Moleküle oxidiert (gemischt-funktional). Im Gegensatz dazu übertragen Di-Oxygenasen beide Sauerstoffatome des molekularen Sauerstoffs auf dasselbe Substrat.
P450 Systeme stellen eine Elektronentransportkette dar, bei der die für die Reduktion des Sauerstoffes notwendigen Elektronen von der NADPH:Cytochrom P450-Reduktase auf das Cytochrom-tragende Protein übertragen werden. In mindestens einem Fall ist in Pflanzen außerdem Cytochrom b5 als Elektronendonor für die maximale katalytische
Aktivität notwendig (de Vetten et al., 1999). Bei in-vitro Tests kann die Zugabe von H2O2 die Aktivität der Reduktase ersetzen.
Cytochrom P450 Enzyme sind membranständig und in den meisten Fällen im Endoplasmatischen Reticulum lokalisiert. In Zellaufschlüssen ist ihre Aktivität daher in der mikrosomalen Fraktion nachweisbar.
Die Bezeichnung P450 beschreibt ein Pigment, das nach Bindung von Kohlenstoffmonoxid CO eine deutliche Absorptionsbande bei 450 nm aufweist. Dieses CO-bindende Pigment wurde zuerst 1958 in den Mikrosomen von Rattenlebern und Schweinelebern nachgewiesen (Klingenberg, 1958, Garfinkel, 1958). Welche große physiologische Bedeutung diese Enzymklasse in allen höheren Lebewesen hat, wurde erst nach und nach entdeckt (Übersicht: Omura, 1999, 1999).
Der ersten Belege für die Existenz von Cytochrom P450 Enzymen in Pflanzen stammen aus den Jahren 1967 (Russell & Conn 1967) und 1969 (Frear et al., 1969). Letztere Veröffentlichung beschreibt die N-Demethylierung von Monuron, einem Herbizid auf Phenylharnstoffbasis, durch Mikrosomen von Baumwolle, erstere die Aktivität einer Zimtsäure 4-Hydroxylase (C4H) in Erbsen-Keimlingen.
Es zeigte sich, dass neben den „klassischen“ Hydroxylierungen eine Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen von Cytochrom P450-abhängigen Enzymen katalysiert werden kann, wie Isomerisierungen, Dimersierungen, Epoxidierungen, Dealkylierungen und Decarboxylierungen, Oxidierungen von Stickstoff und Schwefel, Dehalogenierungen und Desaminierungen (zur Übersicht siehe u.a Schuler, 1996; Schuler & Werck-Reichhart 2003; Halkier, 1996).
Cytochrom P450 Enzyme sind an vielen pflanzlichen Biosynthesewegen beteiligt wie dem Phenylpropanstoffwechsel, der Biosynthese von Alkaloiden, Terpenoiden, Glucosinolaten, Fettsäuren, Flavonoiden, Isoflavonoiden (Humphreys & Chapple 2000) und Cumarinen und der Detoxifizierung von Fremdstoffen wie Herbiziden (Übersichtsartikel: Bolwell et al., 1994, Durst 1988). Eine umfassende Behandlung von Cytochrom P450 Enzymen in Pflanzen würde den Rahmen dieser Einleitung sprengen. Die große Vielfalt der beschriebenen P450-katalysierten Reaktionen macht deutlich, dass viele oxidative Schritte der Lignan-Biosynthese P450-abhängig sein könnten. Dazu gehören die verschiedenen Hydroxylierungen, aber auch die Knüpfung der Methylendioxybrücke zwischen C4 und C5, sowie die Ringschlussreaktion zwischen C2 und C7’.
Vorausgegangene Arbeiten haben gezeigt, dass die C6 und C7 Hydroxylierungen von DOP zu β-Peltatin bzw. Podophyllotoxin in Zellkulturen von Linum album und Linum
flavum Cytochrom P450 abhängig sind (Molog, 1997). Desweiteren sprachen
Untersuchungen mit einer Suspensionskultur von Linum album für die Beteiligung einer Cytochrom P450-Oxygenase an der Bildung von Podophyllotoxin aus DOP (DOP7H) (Henges, 1999).
1.9 Aufgabenstellung
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, Erkenntnisse über späte Biosyntheseschritte zu Lignanen vom Podophyllotoxin-Typ in Linum spec. zu gewinnen. Dazu standen neben Suspensionskulturen von Linum album und Linum
flavum auch mehrere Linien einer Kultur von Linum nodiflorum zur Verfügung.
Von Interesse war insbesondere die Rolle von Desoxypodophyllotoxin (DOP), das als direkte Vorstufe sowohl von Podophyllotoxin (PTOX), als auch β-Peltatin angesehen wird. Zum einen sollte untersucht werden, ob sich Yatein in den Zellkulturen enzymatisch zu DOP umsetzen lässt, d.h. ob es eine Zwischenstufe in der Lignan-Biosynthese darstellt.
Zum anderen wurde die Metabolisierung von DOP insbesondere in Linum nodiflorum untersucht. Ziel dabei war es, die beteiligten Enzyme näher zu charakterisieren und Strategien für ihre weitere Konzentrierung zu entwickeln, sowie ihre biotechnologische Verwendbarkeit zu beurteilen.
Da die DOP6H als Cytochrom P450-Enzym nachgewiesen war, wurden außerdem Versuche unternommen, die für die Etablierung eines Reaktionssystems vorteilhaften homologen NADPH:Cytochrom P450-Reduktasen aus den beschriebenen Linum spec. molekularbiologisch zu identifizieren.
2 Material
und
Methoden
2.1 Pflanzliche Zellkulturen
Suspensionskulturen undifferenzierter Zellen verschiedener Linum Spezies (L. album, L.
nodiflorum) wurden in 50 ml MS-Li Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben kultiviert.
Alle sieben Tage wurden 5 g Zellen (Frischgewicht) unter sterilen Bedingungen in neues Medium überführt. Bei dem verwendeten Medium handelt es sich um eine Abwandlung des Mediums nach Murashige & Skoog 1962. In Einzelfällen wurde CB2-Medium verwendet (Petersen & Alfermann 1988)
Kalluskulturen wurden auf 100 ml MS-Li Agar in Glasgefäßen gehalten und alle 4-5 Wochen auf frisches Medium überführt.
2.2 Zellkulturmedien
2.2.1 Zusammensetzung des Kulturmediums MS-Li:
Makroelemente (40fach): Mikroelemente (100fach)
KNO3 47,5 g/l H3BO3 620 mg/l MgSO4 x 7H2O 9,25 g/l ZnSO4 x 7H2O 860 mg/l KH2PO4 x H2O 4,25 g/l MnSO4 x H2O 1,69 g/l CaCl2 x 2H2O 11 g/l KJ 83 mg/l NH4NO3 41,25 g/l Na2MoO4 x 2H2O 25 mg/l CuSO4 x 5H2O 2,5 mg/l CoCl2 x 6H2O 2,5 mg/l FeSO4 x 7H2O 2,78 g/l Na2 x EDTA 3,73 g/l Vitaminlösung:
Thiamindichlorid 100 mg/100 ml; Pyridoxin x HCl und Nicotinsäure je 500 mg/100 ml
Naphthylessigsäure-Stammlösung (NAA):
20 mg NAA wurden in einem Eppendorf-Gefäß in 1 ml reinem Ethanol gelöst und unter Rühren zu ca. 80 ml Wasser gegeben. Anschließend wurde die Lösung in einem Messkolben auf genau 100 ml aufgefüllt. Die Stammlösung wurde bei 4 °C gelagert.
Die Lösungen der Makro- und Mikroelemente wurden autoklaviert und ein Liter des Mediums wie folgt zusammengesetzt:
1l MS-Li
Lösung der Makroelemente 40 ml Lösung der Mikroelemente 10 ml 100 mg myo-Inosit
30 g Saccharose 2 ml NAA-Lösuung 1 ml Vitamin-Lösung
1 ml Glycin-Lösung (200 mg/100 ml)
Der pH-Wert des Mediums wurde mit 0,5 N KOH auf 5,8 eingestellt.
Für die Herstellung eines festen Nährmediums wurde jeweils 1 g Agar auf 100 ml MS-Li Medium in ein Glasgefäß eingewogen und anschließend autoklaviert.
2.2.2 Zusammensetzung des Kulturmediums MS-Lf:
Für Zellkulturen von Linum flavum wurde ein anderes abgewandeltes MS-Medium verwendet. Die Kulturbedingungen waren wie oben beschrieben. Der pH-Wert des Mediums wurde mit 0,5 M KOH auf 5,9 eingestellt.
Indolyl-3-essigsäure Lösung (IES):
50 mg IES wurden zunächst in 1 ml reinem Ethanol vorgelöst, zu ca. 80 ml Wasser zugegeben und anschließend auf 100 ml aufgefüllt. Die Stammlösung wurde bei 4 °C gelagert.
Benzylaminopurin-Lösung (BAP):
20 mg BAP wurden in einem Eppendorf-Gefäß in 1 ml 0,5 M warmer HCl gelöst und anschließend unter Rühren zu ca. 80 ml Wasser gegeben. Anschließend wurde in einem Messkolben auf 100 ml aufgefüllt. Die Stammlösung wurde bei 4 °C gelagert.
1l MS-Lf
Lösung der Makroelemente 40ml Lösung der Mikroelemente 10 ml 40 g Saccharose, 100 mg myo-Inosit 1 ml Glycin-Lösung (200 mg / 100 ml) 1 ml Vitamin-Lösung
2.3 Elicitierungs- und Biotransformationsversuche:
Die Zeitpunkte, zu denen den jeweiligen Kulturen Substrate, Hemmstoffe oder Elicitoren zugesetzt wurden, variierten mit den Zellkulturen.
Die PTOX bildende Kultur von L. nodiflorum wies nach dem 10. Kulturtag noch einen deutlichen Anstieg ihres PTOX-Gehaltes auf. In diesem Fall wurden das Substrat DOP, die Hemmstoffe Tetcyclacis und Prohexadion-Calcium und die Lösungsmittel Aceton und Methanol als Negativ-Kontrolle am 6. Kulturtag zugegeben, und die Ernte erfolgte am 14. Tag. Tetcyclacis ist ein spezifischer Hemmstoff für Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen, während Prohexadion-Calcium 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen hemmt. Falls einer der Hemmstoffe eine Reduktion des PTOX Gehaltes bewirkt, so wäre dies ein Hinweis auf die Natur des gesuchten Enzyms, in diesem Fall also der DOP7H, die DOP direkt zu PTOX umsetzt.
Tetcyclacis wurde in Form einer 100 mM Stammlöung in Aceton gelöst und in 1000facher Verdünnung den Kulturen zugegeben (25 µl auf 25 ml Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben).
Prohexadion-Calcium (PHD) wurde als 10 mM Stammlösung in Wasser gelöst und in 100facher Vedünnung zugegeben (250 µl auf 25 ml Medium). Die Endkonzentration beider Hemmstoffe betrug also 100 µM.
Von DOP wurde eine 25 mM Lösung in Methanol hergestellt. Den Kulturen wurden je 50 µM DOP zugegeben. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden Negativkontrollen durchgeführt, bei denen nur die Lösungsmittel Methanol bzw. Aceton zugegeben wurden, um deren Effekte auf die PTOX Bildung ausklammern zu können.
Im Falle von Mediumsvariationen, wie dem NAA-Gehalt oder unterschiedlichen Konzentrationen von Metallionen wie Ca2+, Mg2+ und Mn2+ wurden die entsprechend veränderten Medien hergestellt. Es wurden Medien mit dem 2, 4, 10 und 20fache des üblichen Gehaltes an MnSO4, MgSO4 und CaCl2 verwendet. Außerdem wurden Medien
mit dem doppelten, einem Viertel oder der Hälfte der üblichen Menge NAA von 0,4 mg / l angesetzt. Die Zellen wurden direkt in diese Medien überführt und nach sieben bis neun Tagen geerntet.
Elicitoren wie Methyljasmonat oder Salicylsäure wurden in Ethanol p.a. bzw. in Wasser gelöst, über einen Spritzenfilter sterilfiltriert und am dritten oder vierten Tag den Kulturen zugegeben. Methyljasmonat kam in Endkonzentrationen von 20, 50, 100 und 200 µM zum Einsatz. Das Lösungsmittel Ethanol wurde auch alleine zu den Zellen gegeben, um dessen Effekt, von dem des Methyljasmonat zu trennen. Dabei wurden maximal 100 µl Ethanol p.a. pro 25 ml Kulturansatz verwendet. Salicylsäure wurde in Endkonzentrationen von 0,1, 0,5 und 1 mM zugegeben.
Der pilzliche Elicitor PMG wurde in aqua dest. aufgekocht, kurz gerührt und am dritten bis fünften Tag den Kulturen zugegeben. Die Endkonzentrationen betrugen 0,1, 0,2 und 0,5 mg PMG pro ml Kulturansatz, bei 25 ml also insgesamt 2,5, 5 und 12,5 mg. Zur
genaueren Charakterisierung eines PMG-Effektes wurden Kulturen am dritten Tag zusätzlich auf 10 µM Tetcyclacis eingestellt, oder es wurde das entsprechende Volumen (25 µl) des Lösungsmittels Aceton zugegeben.
Von dem Glucan Nigeran aus Aspergillus japonicus wurden 5 mg gelöst in 1 ml Ethanol p.a. zu einem Kulturansatz gegeben. Da es sich als schwer löslich erwies, wurde von weiteren Experimenten abgesehen.
Die Mediumsvariationen und Versuche mit verschiedenen Elicitoren wurden hauptsächlich mit Linum album Zellen durchgeführt, die Hemmstoffversuche mit Linum
album und Linum nodiflorum Zellen.
2.4 Lignan-Extraktion aus Zellkulturen
Die zu extrahierenden Zellen wurden über einem Büchner-Trichter mit Rundfilter vom Medium befreit, bei –20 °C oder bei –70 °C eingefroren und danach für mindestens 24 Stunden gefriergetrocknet. Die trockenen Zellen wurden im Mörser zerrieben und jeweils 0,2 g für die Extraktion in ein Reagenzglas eingewogen. Anschließend wurden 2 ml Methanol p.a. zugegeben und die Zellen 2 x 30 Sekunden im Ultraschallbad weiter aufgeschlossen, wobei dazwischen eine 30 sekündige Kühlung auf Eis erfolgte, um eine Überhitzung zu vermeiden.
Danach wurden 8 ml H2O zugegeben (mit H3PO4 auf pH 5 eingestellt), sowie 1 mg
β-Glucosidase aus Mandeln (> 1000 U / mg; Roth). Während einer 3,5 stündigen Inkubation bei 35 °C wurden die glycosidierten Lignane in ihre Aglyka überführt. Anschießend wurden 10 ml Dichlormethan zugegeben, 20 min gerührt, weitere 20 min bei 900 g zur Phasentrennung zentrifugiert und die Dichlormethanphasen (unteren Phasen) gesammelt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 3 x 500 µl Methanol p.a. gelöst, in ein Eppendorfgefäß überführt und zur Sedimentierung von Schwebeteilchen 5 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert.
Die so gewonnenen Extrakte wurden nach Bedarf mit Methanol p.a. oder 90% Methanol verdünnt und mittels HPLC und externer Standards auf ihren Lignangehalt überprüft.
2.5 Lignan-Extraktion aus frischem Pflanzenmaterial
Die Sammlung von Anthriscus sylvestris Rhizomen und Wurzeln erfolgte am 10.6.2002. Zu diesem Zeitpunkt trugen die Pflanzen nur noch wenige Blüten, aber z.T. schon reife Früchte. Es wurden Pflanzen aus dem Garten des Instituts für Pharmazeutische Biologie in Marburg (917 g Frischgewicht), sowie von Grünflächen aus Gießen (700 g Frischgewicht) verwendet..
Die Rhizome wurden von Erde befreit, ca. 2 Stunden bei 50 °C in einem Inkubator vorgetrocknet und anschließend kleingeschnitten. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C. Um das Auftreten von DOP in den unterirdischen Teilen zu verifizieren, wurde zunächst eine Lignanextraktion (siehe vorhergehendes Kapitel) sowie anschließende HPLC-Analyse mit getrocknetem Material durchgeführt.
Für die HPLC-Analyse wurde 35% Acetonitril als Laufmittel und eine HyPURITY Elite C-18-Säule verwendet, die Flussrate betrug 1,8 ml / min, die Detektionswellenlänge 280 nm.
Mit Hilfe eines externen Standards wurde der DOP Gehalt in den Rhizomen bestimmt. Bei der Charge aus Marburg betrug er ca. 7 mg DOP / g Trockengewicht (also etwa 0,7%), beim Material aus Gießen dagegen ca. 4,5 mg / g Trockengewicht.
Für die eigentliche Extraktion wurde etwa die Hälfte der kleingeschnittenen Rhizome zunächst gefriergetrocknet, in einem Mörser homogenisiert und in einen 6 l Rundkolben überführt. Das Homogenat wurde in jeweils 1,5 l Methanol drei mal acht Stunden unter Rückfluss gekocht. Die gefilterten methanolischen Auszüge wurden gesammelt und am Rotationsverdampfer bis auf einen zähflüssigen braunen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wurde mit dreimal 200 ml Petrolether ausgeschüttelt. Der Petroletherphase wurden wenige Gramm Kieselgel 60 (mesh 70-230) zugegeben und anschließend zur Trockne eingeengt.
Das mit dem Extrakt überzogene Kieselgel wurde auf eine voräquilibrierte Säule (45 cm x 4,5 cm i.D.) desselben Materials aufgetragen. Als Laufmittel wurde n-Hexan/Aceton 2:1 (v/v) verwendet. Es wurden Fraktionen von ca. 15 ml gesammelt, deren DOP Gehalt mittels HPLC und externem Standard überprüft wurde. Die DOP-enthaltenden Fraktionen wurden zur weiteren Aufreinigung vereinigt.
Nach Literaturangaben (Vanuden et al., 1997) sollte ein weiterer Reinigungseffekt durch Chromatographie an einer Amberlite-XAD2-Säule (35 cm x 2,5 cm i.D.) mit Methanol als Fließmittel erzielt werden können, weshalb dieses Verfahren als nächster Schritt gewählt wurde. Allerdings war die Fokussierung von DOP nicht gut genug, um eine signifikante Abtrennung der restlichen Substanzen zu erreichen. Auch eine zweite Chromatographie an Kieselgel 60 (Säule: 35 cm x 2,5 cm i.D., Laufmittel analog zur ersten Chromatographie an Kieselgel 60) brachte nicht den gewünschten Erfolg.
Die Trennung der Einzelsubstanzen erfolgte schließlich über eine semipräprative Hypersil-ODS-Säule (250 x 8,0 mm, 5 µ) mittels HPLC, wobei als Laufmittel 60 % Methanol in Wasser verwendet wurde. Dabei wurden die beiden Hauptpeaks manuell aufgefangen. Das Volumen der gesammelten Fraktionen wurde am Rotationsverdampfer reduziert, wobei ein erster Teil der gelösten Substanzen ausfiel. Nach Einengung zur Trockene wurden die Rückstände in dreimal 500 µl Ethylacetat resuspendiert, in 1,5 ml Eppendorf-Gefäße überführt und über Nacht im Exsikkator erneut getrocknet. Resuspension in 200 µl Methanol p.a. mit Hilfe eines Ultraschallbades führte zu einem flockig weißem Niederschlag.
DOP wurde in der HPLC-Analyse mit Hilfe eines authentischen Standards nachgewiesen.
2.6 Chemische Umwandlung von 4’-Demethyl-PTOX zu 4’-Demethyl-DOP
4’-Demethylpodophyllotoxin wurde freundlicherweise von T.F. Imbert zur Verfügung gestellt. Die katalytische Hydrierung zum entsprechenden Desoxypodophyllotoxin Derivat erfolgte wie von Jackson & Dewick 1984a beschrieben.
Dazu wurden 50 mg 4’-Demethyl-PTOX mit zusammen mit derselben Menge eines Pd-C Katalysators (10 %) in 10 ml Essigsäure gelöst. Das Gemisch wurde in einem Ölbad auf 95 °C erhitzt und eine Stunde unter ständigem Rühren und mit Hilfe einer Pasteur-Pipette leicht mit Wasserstoff durchspült. Anschließend wurde der Reaktionsansatz durch Zugabe von 50 ml Ethanol / Wasser (1:1, v/v) verdünnt und über einen Filter gegeben, wobei der Pd-C Katalysator im Filter verblieb. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt, in einer kleinen Menge Methanol resuspendiert und in Eppendorfgefäße überführt. Nach erneuter Trocknung ließ sich das zurückgewonnene Gewicht bestimmen. Die Vollständigkeit der Umsetzung wurde mittels HPLC überprüft, wobei Acetonitril / Wasser (40:60, v/v) als Laufmittel verwendet wurde. Trennung erfolgte über eine HyPURITY Elite C18-Säule, die Flussrate betrug 1,8 ml / min, Detektionswellenlängen waren 330 nm und 280 nm.
2.7 Kopplungsversuch von 4’-Demethyl-DOP an Sepharose 6B
4’-Demethyl-DOP sollte als spezifischer Ligand der DOP6H für eine Affinitäts-chromatographie verwendet werden, da das eigentliche Substrat DOP keine funktionellen Gruppen aufweist, über die es sich an eine Säulenmatrix koppeln ließe. Als passendes Säulenmaterial wurde epoxy-aktivierte Sepharose 6B von Amersham/Pharmacia gewählt, die eine Kopplung über Hydroxylgruppen erlaubt. Gleichzeitig erfolgt die Bindung an dieses Material über sogenannte Spacer-Moleküle, die gewährleisten, das auch niedermolekulare Liganden an der Säule sterisch zugänglich bleiben.
Die Kopplung wurde im Wesentlichen durchgeführt wie vom Hersteller empfohlen. Zunächst wurde die Sepharose in destilliertes Wasser gegeben, wobei durch Quellung das eigentliche Gel entsteht, das anschließend über eine Glasfritte mit 100 ml H2O / g
Sepharose gewaschen wurde. Es wurden 3 g Sepharose eingesetzt.
Die Kopplungsreaktion wurde in einem Natriumcarbonat-Puffer durchgeführt, der auf pH 9 eingestellt wurde. 20 mg 4’-Demethyl-DOP wurden in 1ml Dimethylformamid (DMFA) gelöst und der Kopplungspuffer auf 15 % DMFA eingestellt, um den Liganden in Lösung zu halten. Da DMFA die Elektrode schädigen könnte, wurde der
pH-Wert mit Hilfe von Universal-pH-Papier überprüft. Nach Zugabe der Sepharose wurde der Ansatz bei 40 °C über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag wurde das Säulenmaterial über einen Büchner-Trichter mit Filter zunächst mit Kopplungspuffer und destilliertem Wasser gewaschen und anschließend abwechselnd mit einem 0,1 M Boratpuffer (pH 8,0, 0,5 M NaCl) und einem Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 4,0, 0,5 M NaCl). Die erste Waschfraktion wurde aufgefangen, um eventuell darin enthaltenen Liganden wieder extrahieren zu können.
Auf eine Behandlung mit Ethanolamin zur Sättigung der verbliebenen reaktiven Gruppen am Säulenmaterial wurde verzichtet, da dieses stark basisch wirkt und dadurch den Liganden hätte schädigen können.
Die gekoppelte und gespülte Sepharose wurde dann mit Hilfe eines Glasstabes luftblasenfrei in eine FPLC-Säule (10 cm x 1 cm i.D.) gefüllt.
2.8 Mikrosomenpräparation
Sieben bis neun Tage alte Zellen wurden über einen Büchner-Trichter mit Rundfilter vom Medium getrennt, das Frischgewicht bestimmt und ca. 20% dieses Gewichtes an Polyclar 10 zugegeben. Das Gemisch wurde in einem auf Eis vorgekühlten Mörser zusammen mit 1 ml Mikrosomenpuffer pro Gramm Frischgewicht gemörsert.
Mikrosomenpuffer:
Tris / HCl 0,1 M pH 7,4
DTT 1 mM
DIECA 1 mM
DTT und DIECA wurden direkt vor der Präparation aus 1 M Stammlösungen zugegeben.
Anschließend wurden die zerkleinerten Zellen 20 min bei 4 °C und 8000 x g in einem SS34 Rotor zentrifugiert. Das Volumen des Überstandes wurde bestimmt, durch langsames Zutropfen auf 50 mM MgCl2 eingestellt und 20 min auf Eis gerührt. Nach
einer weiteren Zentrifugation für 20 min bei 4 °C und 37500 x g im SS34 Rotor wurde der Überstand dekantiert und verworfen, das Sediment in 1 ml Mikrosomenpuffer resupendiert und in einem 5 ml Glashomogenisator homogenisiert. In einigen Fällen wurde diese Präparation anschließend auf eine PD10 Größenausschlußsäule gegeben, um den Hintergrund an endogenen niedermolekularen Substanzen für die HPLC Analyse herabzusetzen. Die PD10-Säule wurde zuvor mit mindestens 20 ml Mikrosomenpuffer äquilibriert und anschließend mit demselben Volumen gespült. Das Auftragsvolumen betrug 3 ml.
Die so gewonnenen Mikrosomenpräparation wurde in ein graduiertes Reagenzglas überführt, mit Mikrosomenpuffer auf ein definiertes Volumen aufgefüllt und die Gesamtproteinkonzentration mit der Methode von Bradford (1976) bestimmt.
2.9 Enzymtest für die DOP 6-Hydroxylase (DOP6H)
Der Standard-Enzymtest für die DOP6H hatte ein Volumen von 500 µl. Die Inkubationszeit betrug sieben bis zehn Minuten bei der Bestimmung der Km-Werte, war
aber innerhalb einer Testreihe stets einheitlich. Für den Nachweis der DOP6H Aktivität bzw. weitere Charakterisierungen wurde eine Reaktionszeit von 20 min gewählt. Bei Nachweisreaktionen für andere Enzymaktivitäten als die der DOP6H wurde bis zu 24 Stunden inkubiert. Die Tests wurden in einem Wasserbad bei 30 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen (50 µl) 6 N HCl abgestoppt. Anschließend wurde jeder Ansatz dreimal mit 1 Volumen Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organischen Phasen wurden gesammelt und in einem Exsikkator bis zur vollständigen Trockene eingedampft. Die so behandelten Proben wurden in 100 µl 90 %igem Methanol resuspendiert und zur Sedimentierung von Schwebeteilchen 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert.
Standard-Test:
DOP (10 mM in Methanol p.a.) 5 µl
NADPH (50 mM) 5 µl
Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,4) 40 µl
Mikrosomenpräparation (Proteinkonz.: 0,6-1 mg/ml) 450µl
Um die Rolle von NADH als Cofaktor zu testen, wurde es anstelle von NADPH im Enzymtest verwendet (10 µl einer 50 mM Stammlösung, da eine geringere Aktivität zu erwarten war). Die beiden Cofaktoren wurden außerdem in verschiedenen Konzentrationen miteinander kombiniert, um einen möglichen synergistischen Effekt detektieren zu können (siehe Abschnitt 3.6.2). Für die Bestimmung der Km-Werte von
NADPH und DOP mussten diese in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben werden. Dazu wurden verschiedene Stammlösungen erstellt (50, 5, 0,5 mM NADPH und 10, 1, 0,1 mM DOP). Unterschiedliche Volumina bei der Zugabe des in Methanol gelösten DOP wurden durch zusätzliches Methanol p.a. ausgeglichen, um einen störenden Einfluss des Lösungsmittels auszuschließen.
2.10 Weitere Enzymtests
Zusätzlich zu Tests auf die Beteiligung von Cytochrom P450-abhängigen Enzymen wurden auch Tests für 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen und Peroxidasen durchgeführt. Enzyme dieser beiden Klassen befinden sich im Cytosol, weshalb nicht die Mikrosomenpräparation für die Enzymtests eingesetzt wurde, sondern der Rohextrakt genannte erste Zellaufschluss nach dem Sedimentieren der schwereren Zellbestandteile. Die Proteinkonzentration des Rohextraktes wurde nach Bradford (1976) bestimmt und der Extrakt zumeist ohne weitere Verdünnung im Enzymtest eingesetzt, wodurch sich Konzentrationen von 2 – 3,5 mg / ml Gesamtprotein im eingesetzten Rohextrakt ergaben. Neben 2-Oxoglutarat wurden Na-Ascorbat und Fe(II)-sulfat als Cofaktoren zugegeben. Die Testansätze wurden bei 30 °C zwischen 15 und 90 min inkubiert. In Einzelfällen wurde den Ansätzen Katalase zugegeben (10 µl einer Stammlösung 0,2 mg / ml; 65000 U / mg). Die Tests wurden gestoppt und weiterverarbeitet, wie für den DOP6H-Test beschrieben.
Dioxygenase-Test
5 µl 2-Oxoglutarat (25 mM) 5 µl Fe(II)-sulfat (10 mM) 5 µl Na-Ascorbat (0,5 M)
10 µl Substrat (z.B. Yatein oder MAT, 10 mM) 25 µl Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,4 )
450 µl Rohextrakt
Bei Tests auf Peroxidase-Aktivität wurde neben dem zu testenden Substrat nur H2O2 als
Cofaktor zugegeben (5 µl einer 10 mM Stammlösung pro 500 µl Testvolumen). Inkubation erfolgte analog zu den Dioxygenase-Tests.
Außerdem wurde der Standardtest auf Cytochrom P450-Aktivität abgewandelt, um den möglichen Umsatz von anderen Substraten als DOP detektieren zu können. Als Zeitpunkt der Mikrosomenpräparation wurden die Kulturtage 5-13 getestet, die Menge des im Mikrosomenpuffer enthaltenen DTT wurde variiert (1 mM, 0,1 mM, ohne DTT), ebenso wie die Inkubationstemperatur (23, 25, 30, 35 °C), das Ansatzvolumen (1, 5, 10 ml) und die Menge des eingesetzten Substrats (bei Yatein: 50 µM, 100 µM, 500 µM Endkonzentration im Test). Es wurden Testansätze mit geöffneten Deckeln inkubiert um den Austausch von Sauerstoff, der für Oxygenase-Reaktionen essentiell ist, zu fördern. In einigen Fällen wurde zur Kontrolle die Aktivität der Zimtsäure 4-Hydroxylase in den Mikrosomenpräparationen getestet, da diese das häufigste Cytochrom P450-Enzym in pflanzlichen Zellen ist. Der Test wurde entsprechend dem für die DOP6H durchgeführt, mit Zimtsäure (Stammlösung: 10 mM in 50 % Methanol) anstelle von DOP als Substrat und verlief stets positiv, d.h. es konnte die Bildung von
p-Cumarsäure in der HPLC-Analyse nachgewiesen werden. Dadurch konnte ein systemischer Fehler bei der Präparation der Mikrosomen ausgeschlossen werden.
2.11 HPLC
Es wurden HPLC-Systeme der Firmen Kontron (Kontron Instruments, HPLC-Pump 422, Detctor 430A) und Merck (Merck-Hitachi L-6000 Pump, D2500 Chromato-Integrator, Spectro Monitor® 3200 von LDC-Analytical) verwendet. Bei analytischen Trennungen handelte es sich um eine Chromatographie an einer RP-C18-Säule (HyPURITY Elite C18, 250 x 4,6 mm, 5µ + Vorsäule 2 cm), d.h. es wurden polare Laufmittel (mobile Phase) verwendet, und die Retentionszeiten der zu trennenden Substanzen an der unpolaren Säule waren um so länger, je unpolarer die jeweilige Substanz war. Um zu verhindern, dass Schwebteilchen sich auf der Säule absetzen wurden die Proben in einer Eppendorf-Zentrifuge 5 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Außerdem waren der Trennsäule jeweils Vorsäulen vorgeschaltet, die bei Bedarf in Methanol p.a. durch kurze Behandlung im Ultraschallbad gereinigt wurden.
Für semipräparative Trennungen wurde eine Hypersil ODS Säule (250 x 8,0 mm, 5 µ + Vorsäule 2 cm) verwendet
Die ursprüngliche Aufgabe bestand darin, ein einfaches, isokratisches Protokoll für die Trennung von Yatein und DOP zu etablieren. Mit Methanol-Wasser-Gemischen als Laufmittel ließ sich allerdings keine zufriedenstellende Trennung der beiden Lignane erreichen, weshalb auf Acetonitril-Wasser-Gemische umgestellt wurde. In den meisten Fällen wurde 40 % Acetonitril (v/v) verwendet. Das Laufmittel wurde in einem Standzylinder angesetzt und 10 min im Ultraschallbad entgast. Für analytische Zwecke wurde das Laufmittel im geschlossenen Kreislauf zurückgeführt und wiederverwendet, nicht jedoch bei präparativen Fragestellungen. Je nach Bedarf (Analyse von Lignanextrakten, Enzymtests, semipräparative Trennung) wurde das verwendete Laúfmittel von 30 % bis 50 % Acetonitril variiert.
Die Detektionswellenlänge betrug 280 nm, Flussraten variierten bei analytischen Messungen zwischen 1,5 und 1,9 ml / min, bei präparativen Anwendungen zwischen 4 und 6 ml / min.
2.12 Fraktionierung des Mikrosomenextraktes durch doppelte Phasen-trennung mit Triton X-114
Das Prinzip der doppelten Phasentrennung mit Triton X-114 wurde von Andersen & Moller (1998) beschrieben. Durch diese Methode sollen insbesondere Proteine der Cytochrom P450 Familie angereichert werden, da sie sich nach der
temperaturinduzierten Phasentrennung je nach Zusammensetzung des Puffers in der Triton-armen oder der Triton-reichen Phase ansammeln.
Zunächst wurde eine Mikrosomenpräparation durchgeführt. Nach der zweiten Zentrifugation wurde das Mikrosomensediment in ca. 3 ml des ersten Phasentrennungspuffers aufgenommen. Die Lösung wurde auf 1 % Triton X-114 eingestellt und 30 min in einem Eisbad gerührt. Um die Phasentrennung herbeizuführen, wurde anschließend für 25 min bei 24500 x g in einem auf 22 °C temperierten Rotor zentrifugiert. Unter den eingestellten Bedingungen sollen sich die Cytochrom P450 Proteine in der oberen, Triton-armen Phase befinden.
Als nächstes mußte ein Puffer-Austausch in den 2. Phasentrennungspuffer erfolgen. Dies geschah entweder, wie bei Andersen & Moller (1998) beschreiben, durch Dialyse (3 x 20 min) oder mit Hilfe einer PD10-Säule (Amersham), also einer Größenausschluß Chromatographie. Zur Dialyse wurde ein Schlauch aus dem ZelluTrans®-System von Roth verwendet (nominales MWCO 12000-14000, Wandicke 20 µm, Volumen / cm 1,98 ml).
Die zweite Phasentrennung erfolgte entsprechend der ersten, allerdings sollte sich die Cytochrom P450 Fraktion diesmal in der oberen, Triton-reichen Phase befinden. Bei einem Glycerinanteil zwischen 20 und 30 % im Puffer stellt sich keine Phasentrennung ein, daher wurde besonders auf eine ausreichende Glycerinmenge geachtet.
Da die hochviskosen Triton-reichen Phasen nur schwer zu pipettieren sind, wurde in jedem Fall die Triton-arme Phase abgenommen.
1. Phasentrennungspuffer 2. Phasentrennungspuffer 30 mM Borsäure / KOH 120 mM Phosphat Puffer
1 mM DTT 30 % Glycerin 15 % Glycerin pH 7,9 pH 8,6 Dialysepuffer 50 mM Kalium-Phosphat Puffer 2 mM DTT 10 % Glycerin pH 7,9
2.13 Proteinfällung mit Methanol und Chloroform
Um die Proteine für die elekrophoretische Auftrennung zu konzentrieren, wurde versucht, sie mit Hilfe von Methanol und Chloroform auszufällen. Dazu wurde ein definiertes Volumen einer Proteinlösung (Rohextrakt oder Mikrosomen) mit dem
vierfachen Volumen Methanol p.a. versetzt und gemischt. Anschließend wurde das doppelte Volumen der Proteinlösung an Chloroform zugegeben und wiederum gemischt. Nach Zugabe des dreifachen Ursprungsvolumens an Wasser und erneuter Mischung, sowie einminütiger Zentrifugation bei 9000 g stellt sich eine Phasentrennung ein, wobei sich die ausgefällten Proteine in der Interphase befinden. Die obere Phase wurde verworfen, die Interphase im Reaktionsgefäß belassen. Nach erneuter Zugabe von Methanol p.a. (dreifaches Volumen der ursprünglichen Proteinlösung) und Zentrifugation bei 9000 g für zwei Minuten befanden sich die Proteine im Sediment. Diese Fällung wurde je nach Ausgangsvolumen in 1,5 ml Reaktionsgefäßen oder in 50 ml Greiner-Röhrchen durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass sich die gefällten Proteine, insbesondere der mikrosomalen Fraktion, nach der Fällung nur sehr schlecht wieder lösen ließen. Auch in SDS-Auftragspuffer und nach Erhitzung auf 95 °C für 5 Minuten verblieb ein unlöslicherRückstand. Im weiteren wurden daher die ungefällten Extrakte für die Elektrophorese verwendet. Dies beschränkte die Auftragsmenge pro Spur auf maximal 200 µg.
2.14 SDS-PAGE
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde durchgeführt, wie bei Lämmli (1970) beschrieben. Es wurden 20 x 20 cm große Glasplatten und 1,5 mm tiefe Spacer verwendet. Zwischen die vertikal angeordneten Platten wurde zunächst das 10 %ige Trenngel gegossen und während der Polymerisation mit ca. 2 ml wassergesättigtem n-Butanol überschichtet. Nach ca. 1 h konnte das n-n-Butanol abgegossen, das Trenngel mit etwas Wasser gespült und das 4,5 %ige Sammelgel aufpolymerisiert werden.
Trenngel 1,5 M Tris/HCl pH 8,8 15 ml 30 % Acrylamid + 0,8 % Bisacrylamid 20 ml 20 % SDS 0,3 ml H2O demin. 23,8 ml 5 % TEMED 0,3 ml 3 % APS 0,6 ml Sammelgel 0,5 Tris/HCl pH 8,8 2,5 ml 30 % Acrylamid + 0,8 % Bisacrylamid 3,35 ml 20 % SDS 0,1 ml H2O demin. 13,35 ml 5 % TEMED 0,1 ml 3 % APS 0,6 ml
Da APS die radikalische Polymerisation startet, wurde es als letztes zugegeben. Die Elektrophorese wurde entweder über Nacht bei 60 V oder innerhalb von 3-4 h bei 250 V durchgeführt.
2.15 LDS-PAGE
Für die Luminol-Färbung Häm-tragender Proteine wurde eine Lithium-Dodecylsulfat (LDS)-PAGE durchgeführt. Es ist in der Literatur (Bonfils et al., 1995, und Zitate darin) beschrieben, dass bei Verwendung von LDS anstelle von SDS, die prosthetischen Häm-Gruppen während der Elektrophorese eher an der Proteinen verbleiben. Die Abwandlungen zur SDS-PAGE sind bei Bonfils et al., 1995.
LDS-Elektrophoresepuffer 1 l LDS-Auftragspuffer
3 g Tris 50 mM Tris/HCl pH 8,9
14,4 g Glycin 10 % Glycerin
1 g LDS 1 % LDS
0,37 g EDTA 0,1 % Bromphenolblau
Beim Gießen von Trenn- und Sammelgel wurde auf LDS verzichtet. Stattdessen wurde das Detergenz während einer Vorelektrophorese von einer Stunde bei 200 V eingeführt.
2.16 Silberfärbung von Proteingelen
Elektrophoretisch aufgetrennte Proteine können in einer Polyacrylamidmatrix mit Silbernitrat angefärbt werden. Das Prinzip dieser Färbung ist bei Blum et al. (1987) beschrieben. Allerdings konnten die dort angegebenen Inkubationszeiten reduziert werden:
Fixierung a) 50 % Ethanol, 12 % Essigsäure 20 min
b) 30 % Ethanol 10 min
Verstärkung 0,2 g / l Na-thiosulfat 1 min
Waschen H2O demin. 3 x 10s
Färbung 2 g / l Silbernitrat, 0,75 ml / l Formaldehyd 20 min
Waschen H2O demin. 3 x 10s
Entwicklung 60 g / l Na-carbonat, 0,5 ml / l Formaldehyd
200 ml / l Na-thiosulfatlösung var.
Die Fixier-, sowie die Entwicklerlösung wurden jeweils frisch hergestellt (ca. 200 ml pro Gel) und einmalig verwendet. Die Silbernitratlösung konnte dagegen mehrmals verwendet werden, falls nach zwei bis drei Färbungen Formaldehyd wieder frisch zugefügt wurde.
Die Entwicklung erfolgte bis die Banden die gewünschte Intensität erreicht hatten, die abschließende Fixierung bis keine Bläschenbildung mehr zu beobachten war.
Die Gele wurden entweder durch Photographien dokumentiert (Nikon Coolpix 995), oder zwischen zwei Lagen Zellophan in einem Kunststoffrahmen getrocknet.
2.17 Luminol-Färbung von Proteingelen
Proteine, die eine Häm-Gruppe enthalten, können durch Luminol mittels Chemolumineszenz detektiert werden, wie von Bonfils et al. (1995) beschrieben. Die Detektionslösung bestand dabei aus:
Luminol-Lösung PBS pH 7,4
phosphate buffered saline (PBS) 100 ml 137 mM NaCl
0,1 M Luminol in DMSO 2 ml 2,7 mM KCl
0,02 M Iodophenol in DMSO 2 ml 10 mM Na2HPO4
30 % H2O2 40 µl 2 mM KH2PO4
Da die in der Literatur beschriebene Detektionsapparatur nicht zur Verfügung stand, wurden verschiedene Alternativen getestet. Dabei war darauf zu achten, dass die gesamte Gelfläche gleichmäßig mit der Luminol-Lösung in Kontakt kommt, sich das Gel während des Detektionszeitraums nicht verschiebt und die Luminol-Lösung nicht in Berührung mit dem Röntgenfilm kommt, sofern ein solcher verwendet wurde.
Zunächst wurde versucht, das Gel zusammen mit der Luminol-Lösung in Plastikfolie einzuschweißen und die Chemolumineszenz auf einem Röntgenfilm in einer Expositionskassette zu detektieren. Allerdings kam es dabei zu einem Austritt der Luminol-Lösung. Daher wurde das Gel stattdessen mit der Luminol-Lösung in einem durchsichtigen Plexiglasrahmen deponiert, wie er für das Gießen horizontaler Agarosegele verwendet wird, und dieser direkt auf einen lichtempfindliche Röntgenfilm gestellt. Der Aufbau wurde durch Kartonagen im Dunkelraum vor Lichteinwirkung geschützt und der Film nach zwei bis drei Stunden entwickelt.
Die dritte Variante war die Verwendung eines Bioimagers (raytest, Detektionssoftware Diana II, Messung mit Chemolumineszenzfilter). Hierbei wurden Gel und Luminol-Lösung wiederum im Plexiglasrahmen in Kontakt gebracht, und die Chemolumineszenz wurde in einem abgedunkelten Behältnis von einer CCD-Kamera aufgenommen. Der Detektionszeitraum lag zwischen fünf Minuten und einer Stunde.
