Rolle von Cytochrom P450 2C für die endothelabhängige Vasodilatation peripherer Leitungsgefäße bei Gesunden und bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz

Aus der Abteilung Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Rolle von Cytochrom P450 2C

für die endothelabhängige Vasodilatation peripherer Leitungsgefäße bei Gesunden und bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Marian Hospely aus Bratislava

Hannover, 2007

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 15.12. 2008

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: PD Dr. med. Ulf Landmesser

Referent: Prof. Dr. med. Christian Strassburg Korreferent: PD Dr. med. Kambiz Norozi

Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2008

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Hermann Haller Prof. Dr. Rainer Nustede Prof. Dr. Christoph Klein

Inhaltsverzeichnis

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... IV

1 Einleitung ...1

1.1 Das Endothel ...1

1.2 Endothelabhängiger hyperpolarisierender Faktor (EDHF)...3

1.3 Stickstoffmonooxid (NO)...8

1.4 Prostazyklin ...9

1.5 Endotheldysfunktion ...10

1.6 Zielsetzung ...13

2 Methodik ...14

2.1 Probanden- und Patientenkollektiv ...14

2.2 Flussabhängige Vasodilatation als Indikator der Endothelfunktion...16

2.3 A-Mode-Ultraschallverfahren zur Durchmesserbestimmung ...19

2.4 Dopplersonographie zur Blutflussbestimmung ...21

2.5 Blutdruck und Herzfrequenz ...22

2.6 Materialien ...23

2.7 Aufbau und Durchführung...24

2.8 Immunhistochemie...28

2.9 Auswertung...29

2.9.1 Durchmesser der Arteria radialis ...29

2.9.2 Blutfluss...29

2.9.3 Statistische Auswertung ...31

3 Ergebnisse ...32

3.1 Ergebnisse der flussabhängigen Dilatation bei gesunden Probanden32 3.1.1 Flussabhängige Dilatation nach NaCl-Infusion (Kontrolle) ...32

3.1.2 Flussabhängige Dilatation nach Sulfaphenazol-Infusion ...32

3.1.3 Flussabhängige Dilatation nach L-NMMA-Infusion...33

3.1.4 Flussabhängige Dilatation nach Co-Infusion von Sulfaphenazol und L-NMMA...33

3.1.5 Zusammenfassung und Vergleich der flussabhängigen Dilatationen...33

3.2 Baseline-Messungen bei gesunden Probanden ...35

3.2.1 Blutfluss...35

3.2.2 Arteriendurchmesser ...36

3.2.3 Blutfluss bei reaktiver Hyperämie ...36

3.3 Flussabhängige Dilatation bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz ...37

3.3.1 Flussabhängige Dilatation nach NaCl-Infusion (Kontrolle) ...37

3.3.2 Flussabhängige Dilatation nach Sulfaphenazol-Infusion ...37

3.3.3 Flussabhängige Dilatation nach L-NMMA-Infusion...37

3.3.4 Flussabhängige Dilatation nach Co-Infusion von Sulfaphenazol und L-NMMA...37

3.3.5 Zusammenfassung und Vergleich der flussabhängigen Dilatationen...38

3.4 Baseline-Messungen bei herzinsuffizienten Patienten...39

3.4.1 Blutfluss...39

3.4.2 Arteriendurchmesser ...39

3.4.3 Blutfluss bei reaktiver Hyperämie ...40

IV 3.5 Auswirkung des Sulfaphenazols auf die endothelunabhängige

Dilatation ...40

3.6 Immunhistochemie...42

4 Diskussion und Zusammenfassung ...43

4.1 Diskussion ...43

4.2 Zusammenfassung ...50

5 Literaturverzeichnis...52

Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 der Promotionsordnung der Medizinischen Hochschule Hannover...68

Lebenslauf ...69

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildung 2: Wirkmechanismus des EDHF ...7

Abbildung 3: Abhängigkeit des Durchmessers vom Blutfluss ...18

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines A-Mode-Bildes ...20

Abbildung 5: Momentaufnahme vom PC-Monitor (Software HEMO 300) ...20

Abbildung 6: Momentaufnahme des Doppler-Ultraschallbildes...21

Abbildung 7: Vorrichtung zur Endothelfunktionsprüfung in unserem Labor ...22

Abbildung 8: FDD-Vergleich bei gesunden Probanden...34

Abbildung 9: FDD-Vergleich bei herzinsuffizienten Patienten...38

Abbildung 10: Endothelunabhängige Dilatation nach SNP-Infusion und nach Co-Infusion von SNP und Sulfaphenazol...41

Abbildung 11: Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung ...42

Tabelle 1: Biometrische Werte der Probanden ...15

Tabelle 2: Ein- und Ausschlusskriterien zur Studienteilnahme ...15

Tabelle 3: Charakteristika der chronisch herzinsuffizienten Patienten ...16

Tabelle 4: Tabellenförmige Darstellung des Versuchsprotokolls...26

Tabelle 5: Blutfluss während der Baseline-Messung bei Gesunden ...35

Tabelle 6: Arteriendurchmesser während der Baseline-Messung...36

Tabelle 7: Maximaler Blutfluss während der reaktiven Hyperämie...36

Tabelle 8: Blutfluss während der Baseline-Messung bei herzinsuffizienten Patienten...39

Tabelle 9: Arteriendurchmesser während der Baseline-Messung...39

Tabelle 10: Maximaler Blutfluss während der reaktiven Hyperämie...40

1 Einleitung

1.1 Das Endothel

Das Endothel übernimmt als Grenzschicht zwischen dem zirkulierenden Blut und dem Gefäßsystem viele wichtige Funktionen. Eine zentrale Rolle kommt den Endothelzellen bei der Regulation des lokalen Gefäßtonus über vasoaktive Substanzen zu [44]. Diese werden entweder nach Stimulation im Endothel ge- bildet oder im Endothel metabolisiert, um dann ihre Wirkung entfalten zu kön- nen. Es gibt drei endothelabhängige vasodilatierende Systeme, die nebenein- ander bestehen. Dabei sind folgende Faktoren von Bedeutung:

1. Endothelabhängiger hyperpolarisierender Faktor (EDHF) 2. Stickstoffmonooxid (NO)

3. Prostazyklin (PGI₂)

Abbildung 1: Mechanismen der endothelabhängigen Vasodilatation.

Es stehen drei Systeme zur Verfügung: NO, Prostazyklin (PGI2) und EDHF. Endpunkt ist die Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur.

Quelle: Ulf Landmesser, modifiziert durch Marian Hospely Hemmung durch

L-NMMA

Hemmung durch ASS

Hemmung durch Sulfaphenazol

1 Einleitung 2 Weiterhin ist die Umwandlung des Angiotensin I in das vasoaktive Angiotensin II mit Hilfe des membranständigen Angiotensin-Converting-Enzyme-Systems, oder die Inaktivierung des vasodilatierenden Bradykinins durch dasselbe Enzym bedeutsam. Darüber hinaus spielt das Endothel eine Rolle bei der Kontrolle der Homöostase, dem Stoffaustausch zwischen intra- und extravasalem Raum und dem Mitwirken bei Entzündungsreaktionen. Letzteres ist insbesondere wichtig bei der Entstehung der Atherosklerose [77].

Endothelzellen interagieren mit anderen Zellen im Blutstrom. Über Zytokine und exprimierte Oberflächenadhäsionsmoleküle können so zum Beispiel Leukozy- ten aus der Blutbahn in das Gewebe einwandern und zur Inflammation führen.

Hierbei spielt auch die endotheliale Permeabilität eine große Rolle, die einer- seits als Schutz und andererseits als physiologische Transportmöglichkeit fun- giert. Durch die Bildung von antithrombotischen und antikoagulatorischen Fak- toren, wie z.B. Prostazyklin und dem Plasminogen-aktivierenden Faktor, greift das Endothel in die Homöostase ein. Schließlich kann es über die Bildung von Matrixproteinen auch strukturelle Veränderung der Gefäßwand bewirken. Eine zentrale Bedeutung bei vielen dieser Funktionen kommt dem Stickstoffmono- oxid (NO = nitric oxide) zu, da man dieser Substanz wichtige anti- inflammatorische und antithrombotische Eigenschaften zuschreibt [77].

Von großer Bedeutung für die Regulation des Gefäßtonus ist die Produktion von sogenannten Autakoiden, körpereigenen vasoaktiven Substanzen und Ge- webshormonen. Eine Einteilung erfolgt in vasokonstriktorische und vasorelaxie- rende Substanzen. Zu den konstriktorischen zählt z.B. das Endothelin [129], zu den relaxierenden das Prostazyklin, das NO und der EDHF (endothelial derived hyperpolarizing factor). Dabei hängt es unter anderem vom Gefäßbett und der Spezies ab, in welchem Verhältnis die einzelnen Faktoren zur Vasorelaxation beitragen. In Leitungsgefäßen übernimmt NO zum Beispiel die wichtigste dila- tierende Wirkung.

Die NO-Produktion und Freisetzung aus dem Endothel kann durch vielzählige endogene Agonisten, wie z.B. dem Acetylcholin, Bradykinin [16], Histamin [45], Serotonin [20] und Substanz P [130] stimuliert werden. Es handelt sich hierbei um eine rezeptorvermittelte Signalkaskade, die bei Acetylcholin über einen muskarinergen [44] und beim Bradykinin über einen BK-2-Rezeptor vermittelt

wird. Jedoch wird NO auch unter Ruhebedingungen kontinuierlich freigesetzt [125] und schwächt somit die sympathisch adrenerg vermittelte Konstriktion der Gefäße ab. Diese basale Ausschüttung wird zusätzlich durch physikalische Stimulationen verstärkt, die ununterbrochen auf das Endothel einwirken. Zu diesen Stimulantien zählen die durch strömendes Blut verursachten Scherkräfte [49], die durch die Herzaktion entstehende Pulsaktivität, die mechanische De- formation der Gefäße in der Skelettmuskulatur und eine Absenkung des arterio- lären Sauerstoffpartialdruckes.

Die endogenen Agonisten Acetylcholin, Serotonin und ATP (Adeno- sintriphosphat) lösen eher eine Gefäßkonstriktion aus, wenn sie nicht über die Endodthelzellen, sondern direkt auf die glatte Gefäßmuskulatur wirken [44].

Folglich setzt sich die Antwort auf Agonistenstimulation aus einer direkten und einer indirekten Wirkung zusammen. Dieses Gleichgewicht ist unter pathologi- schen Bedingungen, wie z.B. beim Diabetes mellitus, bei der arteriellen Hyper- tonie oder bei der Hypercholesterinämie gestört. Für eine optimale Perfusion aller Gewebe des Körpers ist eine intakte Endothelfunktion notwendig. Unter bestimmten Bedingungen ist diese Funktion jedoch eingeschränkt, was kritische Zustände nach sich ziehen kann. Daher hat der Begriff der Endotheldysfunktion an Bedeutung gewonnen, so dass sich viele Arbeitsgruppen mit der Entste- hung, der Dynamik sowie der Prävention beschäftigen. Die Endotheldysfunktion wird im Kapitel 1.5 näher erläutert.

Die Schwierigkeit bei der Beurteilung der Endothelfunktion liegt in der Messbar- keit der einzelnen Funktionen. Da aber NO eine ganz besondere Rolle spielt, kann man anhand der Messung der flussabhängigen endothelvermittelten Va- sodilatation, die zum größten Teil über NO vermittelt wird, eine Aussage über das gesamte Funktionsspektrum treffen. Wir haben in unserer Studie eine be- währte Methode gewählt, die später näher beschrieben wird.

1.2 Endothelabhängiger hyperpolarisierender Faktor (EDHF)

Nach Inhibition der Cyclooxygenase und der endothelialen NO-Synthase (eNOS) wird die Relaxation nach Stimulation zwar abgeschwächt, aber nicht ganz aufgehoben. Dieses Phänomen wurde zuerst besonders in Coronar-, Re-

1 Einleitung 4 nal- und Mesenterialgefäßen beobachtet [42]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es neben dem Prostazyklin und dem NO noch mindestens einen zu- sätzlichen endothelabhängigen Vasodilatator geben muss [6, 15, 33, 62].

Félétou et al. konnten im Jahre 1988 beweisen, dass die schon zuvor beobach- tete Hyperpolarisierung der glatten Gefäßmuskelzellen nach Stimulation mit Acetylcholin, die der Relaxation vorausgeht, auf eine Substanz zurückzuführen war, die vom Endothel freigesetzt wurde [7, 33, 43, 69, 93]. Die Eigenschaften dieses Faktors (EDHF) wurden in den Folgejahren genauer untersucht. Eine genaue Identifizierung blieb bis heute jedoch aus. Es liegen viele Arbeiten vor, die sich mit der EDHF-vermittelten Vasodilatation befasst haben. Die Ergebnis- se sind jedoch oft unterschiedlich, was vor allem an den abweichenden Unter- suchungsbedingungen liegt. Es wurden diverse Substanzen als EDHF- Kandidaten vorgestellt. Zu den meist untersuchten zählen Kalium-Ionen, Was- serstoffperoxid (H₂O₂) und Arachidonsäuremetabolite, die im P450- Enzymsystem entstehen. Da es mehrere Hinweise darauf gibt, dass das P450- System eine entscheidende Rolle zu spielen scheint, konzentriert sich diese Arbeit auf den EDHF, der in diesem System entsteht.

Es ist bekannt, dass durch Agonistenstimulation die Calcium-Konzentration in den Endothelzellen ansteigt. Dadurch wird die Phospholipase C aktiviert, die Arachidonsäure aus der Zellmembran freisetzt [51]. Die Arachidonsäure kann dann über die Cyclooxygenase, Lipooxygenase oder das P450-Enzymsystem metabolisiert werden und fungiert somit als Vorläufer von vasoaktiven Substan- zen [79, 92, 106, 107].

Das Cytochrom-P450-System besteht aus membrangebundenen Häm-haltigen Oxidasen, die eine wichtige Funktion bei zum Teil komplexen intrazellulären Vorgängen wie z.B. der Oxidation, Peroxidation und/oder Reduktion von unter anderem Cholesterol, Vitaminen und vielzähligen pharmakologischen Substan- zen übernehmen. Es entstehen Produkte mit wichtiger biologischer Aktivität.

Aufgrund der hohen Anzahl an Isoenzymen werden die Enzyme ihren Eigen- schaften entsprechend in Familien eingeteilt [42]. Die Epoxygenasen der CYP 2C Familie erfüllen die Kriterien einer EDHF-Synthase. Menschliche Isoformen sind unter anderem 2C9, 2C10, 2C17, 2C18 und 2C19. Dabei ist die Expressi- on der CYP-Enzyme durchaus inhomogen. Eine besondere Bedeutung hinsicht- lich der Rolle bei der Vasotonusregulation kommt der Isoform CYP 2C9 zu, weil

gezeigt werden konnte, dass der selektive Inhibitor dieser Form, Sulfaphenazol [35, 81], die EDHF-Wirkung in Schweinekoronarien aufheben konnte [39]. Die Expression von CYP 2C9 konnte unter anderem in Blutgefäßen, in der Leber, im Herzen, im lymphatischen Gewebe und in der Haut nachgewiesen werden [30].

Die CYP-Enzyme sind in der Lage, neben den relaxierenden EDHFs auch Sau- erstoffradikale zu bilden, die wiederum für die Vasorelaxation eine interessante Rolle spielen [41], auf die noch später eingegangen wird.

In Endothelzellen sind Epoxyeicosatriensäuren, sogenannte EETs, die einzigen Arachidonsäuremetaboliten, die im P450-Enzymsystem entstehen [111]. Erste indirekte Hinweise, dass EDHF ein Produkt des P450-Systems sein könnte, hatten schon Rubanyi et al. im Jahre 1987 gezeigt [112]. Die bei den Untersu- chungen eingesetzten Inhibitoren des CYP-Systems waren jedoch nicht selektiv und konnten auch unvermittelt die Aktivität von Kalium-Kanälen beeinflussen.

Den ersten direkten Beweis für die Rolle des CYP-Systems als EDHF-Synthase lieferten Fisslthaler et al., als sie 1999 in der Zeitschrift Nature postulierten, man könne durch CYP-Induktion die Produktion von 11,12-EETs und somit die Hy- perpolarisation und Dilatation von Koronararterien steigern [39].

EETs sind endogene Lipidderivate, die aufgrund ihrer potenten vasodilatatori- schen Eigenschaft in manchen Gefäßbetten als EDHF vorgeschlagen wurden [75]. Darüber hinaus übernehmen sie protektive Aufgaben, indem sie der In- flammation, der Plättchenaggregation und der Migration der glatten Gefäßmus- kulatur entgegenwirken [40, 67, 97, 118] und dadurch antiatherogene Eigen- schaften besitzen.

Nachfolgend werden die möglichen Wege („Pathways“) der Hyperpolarisierung der glatten Gefäßmuskulatur durch EDHF bzw. durch EET erläutert. Dabei ist zu beachten, dass eindeutige und allgemein geltende Mechanismen noch nicht vorliegen. Die „Pathways“ können jeweils abhängig von Gefäßbett oder Spezies einzeln oder kombiniert auftreten (siehe Abbildung 2):

1 Einleitung 6 Einerseits werden Calcium-abhängige Kalium-Kanäle der Endothelzellen geöff- net, indem ihre Sensitivität für Calcium erhöht wird [4, 76]. Dadurch hyperpolari- sieren die Endothelzellen. Die Änderung der Ladung wird dann über myoen- dotheliale „tight junctions“ an die glatte Gefäßmuskulatur weitergeleitet. „Tight junctions“ sind Verbindungsglieder zwischen Endothel- und Muskelzellen, die der interzellulären Kommunikation dienen. Durch die Hyperpolarisation werden in den glatten Gefäßmuskelzellen spannungsabhängige Calcium-Kanäle (VOC) geschlossen [123].

Andererseits wird durch den Kalium-Efflux aus den Endothelzellen die Kalium- konzentration im interzellulären Spalt erhöht. Dieser Anstieg kann dann die Ka- lium IR-Kanäle (IR = inward rectifying) und die Na-K-ATPase an den Zellen der glatten Gefäßmuskulatur aktivieren [95]. Durch den erhöhten Umsatz wird dann über den Na-Ca-Austauscher vermehrt Calcium aus den Muskelzellen ge- schleust.

Darüber hinaus diffundieren die EETs aus den Endothelzellen und aktivieren direkt an den Muskelzellen Kalium-Kanäle [83].

Der Endpunkt dieser Mechanismen ist die Hyperpolarisation der Muskelzellen und der damit verbundene Abfall der intrazellulären Calcium-Konzentration, der in einer Relaxation resultiert.

Die endothelabhängige Hyperpolarisation der glatten Gefäßmuskelzellen durch EDHF spielte zuerst besonders in Widerstandsgefäßen eine entscheidende Rolle [86]. Erste in vivo Beweise dafür hatten Nishikawa et al. im Jahre 1999, als sie zeigen konnten, dass in Hundekoronararteriolen EDHF entscheidend an der Relaxation beteiligt war und als ein P450-Produkt die Öffnung von Calcium- abhängigen Kalium-Kanälen bewirkte [96]. Mit der Abnahme der Gefäßgröße nimmt der EDHF-Anteil bei der endothelvermittelten Relaxation zu [113]. Im Coronar- und Renalsystem ist EDHF jedoch auch in Leitungsgefäßen von gro- ßer Bedeutung. In unserer Studie haben wir erstmals die Bedeutung des P450 2C-Systems in humanen Leitungsgefäßen untersucht. Neueren Studien zufolge wird das CYP-Enzymsystem auch in menschlichen Mammaria-Arterien und im Coronarsystem exprimiert, wo es relaxierende 11,12-EETs bildet [3].

Abbildung 2: Wirkmechanismus des EDHF

Schematische Darstellung der hypothetischen Pathways der Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur durch den EDHF. Durch Stimulation (Scherkräfte, Agonisten) wird die Calcium-Konzentration in der Endo- thelzelle erhöht, wodurch die Bildung von EDHF initiiert wird. Durch Stimulation von Kaliumkanälen kommt es zum Kalium-Efflux nach extrazellulär. Die Kaliumionen aktivieren Kaliumkanäle und die Na-K-ATPase an den Muskelzellen. EDHF diffundieren auch aus den Endothelzellen an Kaliumkanäle der glatten Mus- kelzellen und führen zum Kaliumefflux. Endpunkt dieser Mechanismen ist die Hyperpolarisation, wodurch die spannungsabhängigen Calciumkanäle (VOC) geschlossen werden. Das Resultat ist die Abnahme der Calciumkonzentration und die Relaxation der Muskelzellen.

Quelle: eigene Darstellung

1 Einleitung 8

1.3 Stickstoffmonooxid (NO)

Furchgott und Zawadzki postulierten schon im Jahre 1980 einen endothelab- hängigen relaxierenden Faktor, einen sogenannten EDRF (endothelial derived relaxing factor), der in den Endothelzellen gebildet wurde und der neben dem Prostazyklin nach Cyclooxygenase(COX)-Inhibition zu einer Acetylcholin- induzierten Relaxation am Gefäß führte [44]. Der neue vasoaktive Faktor muss- te in den Endothelzellen gebildet werden, weil es in Gefäßen mit fehlendem oder geschädigtem Endothel nach Acetylcholinstimulation zu einer Vaso- konstriktion gekommen war. Einige Jahre später wurde dieser Faktor als Stick- stoffmonooxid identifiziert [47]. Die intrazelluläre Calcium-Konzentration in den Endothelzellen kann rezeptorabhängig über Agonistenstimulation und darauf folgende Signalkaskaden oder über einwirkende Scherkräfte angehoben wer- den. Dieser Anstieg resultiert in einer Zunahme der NO-Produktion und muss also eine Induktion der NO-Synthase bewirken [110]. Heute werden unter dem Begriff des EDRF nicht nur das NO, sondern auch EDHF und Prostazyklin ver- standen.

Im Arteriensystem herrscht eine kontinuierliche Freisetzung von NO. Dadurch wird im Normalfall ein Dilatatortonus aufrechterhalten [125]. Mindestens drei Isoformen der NO-Synthase (NOS) sind bekannt:

• iNOS (induzierbar)

• nNOS (neuronal)

• eNOS (endothelial)

Die induzierbare, cytosolische NOS wird durch Endotoxine und Cytokine indu- ziert [117]. Sie spielt eine Rolle bei der nichtspezifischen Immunabwehr und kommt überwiegend in Granulozyten und Makrophagen, jedoch auch in Endo- thelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen vor. Die neuronale nNOS ist im Cyto- sol von Neuronen anzufinden. Schließlich und im Zusammenhang dieser Arbeit sehr wichtig ist die eNOS, die zum größten Teil membrangebunden und über- wiegend in Endothelzellen vorkommt.

Die Vorläufersubstanz des vasodilatierenden NO ist das L-Arginin, eine Amino- säure [99]. Dieses wird in einem NADPH-abhängigen Schritt zu NO und Citrullin oxidiert [89]. Die Aktivität und die Expression der NO-Synthase sind von vielen verschiedenen Faktoren abhängig. Zum Beispiel wirken Analoga des Arginins, wie das von uns verwendete L-NMMA, inhibierend [99], wohingegen Calcium und Calmodulin (CaM) die NOS aktivieren. Darüber hinaus sind noch weitere Co-Faktoren und Stimuli, insbesondere auch die Scherkräfte, die auf das Gefäß einwirken, an der Regulation beteiligt, die über Signalkaskaden die Funktion der NOS modulieren [101].

Die physiologischen Eigenschaften des NO sind mannigfaltig. Auf das Gefäß- system wirkt es relaxierend: NO diffundiert aus den Endothelzellen in die glatte Gefäßmuskulatur und stimuliert dort die lösliche Guanylatcyclase. Der resultie- rende Anstieg des cyklischen Guanosinmonophospats (cGMP) führt über Prote- inkinase abhängige Signalwege zum Abfall der Calcium-Konzentration in den Muskelzellen und somit zur Relaxation. Der Anstieg des cGMP hemmt wieder- um die Aktivierung der Thrombozyten und somit deren Adhäsion an der Gefäß- wand [28], was einer antithrombotischen Wirkung entspricht. Zudem konnte auch eine antiproliferative Wirkung des NO auf glatte Gefäßmuskulatur nach- gewiesen werden [48]. Demzufolge kann NO als ein Schutzfaktor vor arteri- osklerotischen Veränderungen gesehen werden [91]. Bei der Betrachtung der Pathophysiologie der Endotheldysfunktion im Kapitel 1.5 wird die zentrale Rolle des NO nochmals deutlich.

1.4 Prostazyklin

Eine weitere relaxierende Substanz, die in den Endothelzellen gebildet wird, ist das Prostaglandin I2, Prostazyklin genannt [94]. Dieses Cyclooxygenase- Produkt ist ein Derivat der Arachidonsäure, das bei steigender intrazellulärer Calcium-Konzentration über die aktivierte Phospholipase A2 freigesetzt wird.

PGI2 diffundiert aus den Endothelzellen in die Zellen der glatten Gefäßmuskula- tur und stimuliert dort die Adenylatcyclase. Der resultierende Anstieg des cycli- schen Adenosinmonophosphats (cAMP) führt über eine Modulation von Kalium- Kanälen [64] zur Hyperpolarisation [102] mit nachfolgendem Absinken der intra-

1 Einleitung 10 zellulären Calcium-Konzentration und somit zur Relaxation der Muskulatur [71].

Ein weiterer Wirkungsmechanismus wurde beschrieben, bei dem anstatt des cAMP ein G-Protein die Schlüsselrolle zu spielen scheint [120]. Neben seiner vasoaktiven Eigenschaft zeichnet sich Prostazyklin besonders durch seine Thrombozyten-aggregationshemmende Wirkung aus [90].

1.5 Endotheldysfunktion

Bei Patienten mit kardiovaskulären Störungen wie der Arteriosklerose [24], der Koronaren Herzkrankheit [131], dem Diabetes mellitus [127], dem Hypertonus [100]), der Hypercholesterinämie [17] und der chronischen Herzinsuffizienz [68]

ist die endothelvermittelte Vasodilatation, verglichen mit der gesunden Bevölke- rung, vermindert. Man spricht dabei von der sogenannten Endotheldysfunktion.

Klinisch wird damit die eingeschränkte Relaxation der Gefäße interpretiert, der eine verminderte NO-Verfügbarkeit zugrunde liegt [27].

Bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz beobachtet man neben einer verminderten Auswurfleistung des Herzens insbesondere eine periphere Vaso- konstriktion. Die eingeschränkte vasodilatierende Reaktion der Gefäße bei kör- perlicher Belastung oder nach Agonistenstimulation ist nicht nur in Wider- standsgefäßen, sondern auch in Leitungsgefäßen nachgewiesen [61]. Die re- duzierte NO-Verfügbarkeit ist hierbei mitunter auf eine verminderte Genexpres- sion der vaskulären eNOS zurückzuführen [115]. Interessanterweise führt der Mangel an NO nicht nur zur Abnahme der endothelvermittelten Dilatation, son- dern trägt auch zum ventrikulären Remodelling und zur ventrikulären Dysfunkti- on bei [73]. Weitere Gründe für einen Mangel an NO sind z.B.:

• ein aktiviertes RAAS (Renin-Angiotensin-Aldosteron-System) [58], bei dem die Konzentration des NO-freisetzenden Bradykinins niedrig und des Superoxid-Anionen fördernden Angiotensins II hoch ist

• eine verstärkte Inaktivierung von NO durch Sauerstoffradikale (ROS)

• eine endogene Hemmung der eNOS [54] durch ADMA (asymmetrisches Dimethyl-L-Arginin)

• ein erhöhter Zytokin-Spiegel (TNFalpha) [2]

Die anderen Funktionen des Endothels dürfen jedoch bei der Definition des Begriffs der Endotheldysfunktion nicht außer Acht gelassen werden. Das Aus- maß der Folgen einer Funktionsstörung wird bei Betrachtung der verschiedenen Funktionen klar:

Regulation von: vermittelt durch:

Gefäßtonus Bildung/Umbau/Abbau von vasoaktiven Sub-

stanzen

Homöostase Bildung von Faktoren, die an der Thrombo-

lye/Fibrinolyse beteiligt

sind

Regulation der Thrombo-

zytenadhäsion

Leukozytenadhäsion und Lipid-Uptake

Expression von Adhäsi- onsmolekülen und Sekre- tion von beteiligten Fakto-

ren

Remodelling Bildung des profilferati- onshemmenden NO

Entzündungsreaktion selektive Permeabilität

So kann man sich vorstellen, dass es im Rahmen einer Dysfunktion z.B. zur Inflammation bis hin zur Atherosklerose, zur Thrombose oder zu strukturellen Veränderungen der Gefäßwand kommen kann. Letzteres ist besonders beim Diabetes mellitus ein Problem.

Ist die endothelvermittelte Dilatation gestört, kann davon ausgegangen werden, dass auch die übrigen Funktionen des Endothels eingeschränkt sind. Da NO größtenteils zur Relaxation beiträgt uns es darüber hinaus noch andere Aufga- ben erfüllt, kann die endothelvermittelte Dilatation gut als repräsentativer Mar- ker für die Endothelfunktion eingesetzt werden, da diese klinisch relativ einfach messbar ist. Die durch Celermajer et al. eingeführte nicht-invasive Messung der flussabhängigen Dilatation wird seither weltweit von vielen Arbeitsgruppen zur Bestimmung der Endothelfunktion verwendet [14]. Die Beurteilung der Endo-

1 Einleitung 12 thelfunktion, insbesondere die Aufdeckung der Dysfunktion, mag prognostische Werte für spätere kardiovaskuläre Ereignisse haben.

Der Ausgangspunkt der Endotheldysfunktion ist die verminderte Verfügbarkeit von NO. Dies kann einerseits bedeuten, dass die eNOS nicht genug NO produ- ziert, wie z.B. bei Mangel an Co-Faktoren, oder andererseits, dass das NO in- aktiviert wird und somit seine biologische Aktivität nicht mehr entfalten kann. Bei der Inaktivierung spielen besonders Sauerstoffradikale, ROS (reactive oxygen species), eine bedeutende Rolle.

Eine erhöhte Produktion von ROS, also ein erhöhter oxidativer Stress, führt zur Arteriosklerose und somit zur Endotheldysfunktion [12, 74]. Prädisponierende Faktoren wie z.B. die Hypercholesterinämie, Hypertonus, Diabetes und Zigaret- tenrauchen sind mit erhöhtem oxidativen Stress assoziiert [12]. Eine erhöhte Konzentration an ROS führt unter anderem zur Aktivierung des Transkriptions- faktors NFkappaB, der proinflammatorische, proliferative und proarterioskleroti- sche Signaltransduktionswege initialisiert. Hingegen wirkt NO der Entstehung der Arteriosklerose entgegen, indem es in physiologischen Konzentrationen NFkappaB inhibiert [105].

Sauerstoffradikale entstehen allgemein bei Vorgängen, an denen Enzymsyste- me wie die NADPH-Oxidase, die Phospholipase 2, die Cyclooxygenase und die Xanthin-Oxidase beteiligt sind [128]. Eine weitere Quelle stellt die eNOS dar.

Bei Mangel an Co-Faktoren, insbesondere des Tetrahydrobiopterin (BH4), pro- duziert sie neben dem NO auch Superoxidanionen [21]. Dieses Phänomen wird als „eNOS uncoupling“ bezeichnet. Interessanterweise können auch bestimmte CYP-Epoxygenasen freie Sauerstoffradikale generieren [9, 109]. Zu diesen zählt z.B. auch die von uns untersuchte CYP 2C9 [41].

Die Abnahme der NO-Verfügbarkeit zieht eine Zunahme der EDHF-Synthase- Aktivität nach sich [5]. Es findet eine Verlagerung von NO-vermittelter zur EDHF-vermittelten Relaxation statt [18, 80]. Somit kann in Abwesenheit von NO der Vasotonus über einen EDHF Mechanismus reguliert werden.

1.6 Zielsetzung

Eine Cytochrom P450 Epoxygenase der Familie 2C konnte kürzlich als EDHF- Synthase identifiziert werden, welche durch Sulfaphenazol spezifisch gehemmt werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass dieses komplexe Enzymsystem an der endothelvermittelten Vasodilatation in Schweinekoronarien beteiligt ist.

Bislang wurde die Bedeutung von EDHF nur in der Mikrozirkulation untersucht.

Wir haben uns daher die Aufgabe gestellt, die Bedeutung dieses Systems für die endothelabhängige Vasodilatation in humanen Leitungsgefäßen zu charak- terisieren.

Darüber hinaus beschäftigte uns die Frage, welchen Stellenwert der EDHF- Mechanismus im Falle einer Endotheldysfunktion einnimmt. Dazu untersuchten wir, ob bei Patienten mit einer chronischen Herzinsuffizienz eine Veränderung der Aktivität des CYP 2C-Systems vorliegt.

Für beide Teilaspekte der Arbeit haben wir die Wirkung des selektiven CYP 2C- Inhibitors Sulfaphenazol auf die flussabhängige Vasodilatation in der Radialar- terie von Menschen untersucht.

Um sicher zu stellen, ob im untersuchten Gefäßbett das CYP 2C-System vor- kommt, haben wir dessen Expression mit immunhistochemischen Verfahren untersucht.

2 Methodik

2.1 Probanden- und Patientenkollektiv

Die Studie wurde an zwölf gesunden Probanden ohne kardiovaskuläre Risiko- faktoren (Gruppe 1) und an zwölf Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (Gruppe 2) durchgeführt. Das Kollektiv der gesunden Probanden setzte sich aus drei Frauen und neun Männern mit einem Durchschnittsalter von 24±3 Jah- ren zusammen. Die andere Untersuchungsgruppe bestand aus elf Männern und einer Frau mit einem Durchschnittsalter von 66±2 Jahren. Nach einem ausführ- lichen Aufklärungsgespräch gaben die Probanden und Patienten ihre schriftli- che Einwilligung, an der Studie teilnehmen zu wollen. Das Studienprotokoll war von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover im Vorfeld geprüft und genehmigt worden.

Eine instabile Angina pectoris und einen innerhalb der letzten zwei Wochen vor Studienbeginn erlittenen Myokardinfarkt haben wir bei allen Studeinteilnehmern anamnestisch ausschließen können. Alle Mitglieder der gesunden Gruppe wa- ren Nichtraucher und normotensiv. Sie hatten keine Dislipoproteinämie und standen zum Zeitpunkt der Untersuchung unter keiner medikamentösen Thera- pie. Die Probandinnen nahmen keine oralen Kontrazeptiva ein. Weitere Infor- mationen und insbesondere die Medikation der chronisch herzinsuffizienten Patienten sind aus den Tabellen 1 und 3 zu entnehmen. Die Einstufung der her- zinsuffizienten Patienten nach den NYHA-Kriterien (NYHA = New York Heart Association) erfolgte kurz vor Aufnahme in die Studie. Eine eventuell vorhande- ne Schwangerschaft, ein bekanntes Ulkusleiden sowie eine bekannte Antibioti- ka-Unverträglichkeit wurden anamnestisch ausgeschlossen. Letzteres war auf- grund des Schwefelanteils des Sulfaphenazols und der damit verbundenen Verwandschaft mit Sulfonamiden von Bedeutung.

Gruppe 1 Gruppe 2

n=12; 9 3 n=12; 11 1

Alter [Jahre] 24,2±3,3 66,8±2,1 Natrium [mmol/l] 141,8±0,7 137,0±1,2 Kalium [mmol/l] 4,1±0,1 4,5±0,2 Kreatinin [µmol/l] 80,8±2,9 104,0±12,0 Hämoglobin [g/dl] 13,9±0,4 13,7±0,7 HbA1c [% von Hb] 5,4±0,2 7,3±0,3 Cholesterin [mg/dl] 158,8±10,7 175,0±20,0 LDL [mg/dl] 103,3±9,8 110,0±15,0 HDL [mg/dl] 54,4±2,4 43,0±5,1

CRP [mg/l] 3,3±0,8 17,0±9,0

Tabelle 1: Biometrische Werte der Probanden

Werte sind als Mittelwert±SEM (SEM=standard error of mean=Standardmessfehler des Mittelwertes) angegeben

Einschlusskriterien Ausschlusskriterien

Gruppe 1 instabile Angina pectoris

Gesunde ohne kardiovaskuläre

Risikofaktoren Myokardinfarkt innerhalb der letzten zwei Wochen vor Studienbeginn Gruppe 2

systolischer Blutdruck im Sitzen

unter 100 mm Hg

chronische, stabile Herzinsuffizienz unkontrollierbare arterielle

Hypertonie

NYHA (II-III) Schwangerschaft

Ulkusleiden in der Anamnese

bekannte Unverträglichkeit gegen

Antibiotika

parallele Teilnahme an anderen wissenschaftlichen Studien

Tabelle 2: Ein- und Ausschlusskriterien zur Studienteilnahme

2 Methodik 16

n (%)

Kardiologische Einstufung Ischämische Kardiomyopathie 8 (75) Dilatative Kardiomyopathie 4 (25)

NYHA II 3 (25)

NYHA III 9 (75)

Hypertonus 8 (75)

Medikamentöse Behandlung

ASS 9 (75)

ACE-Hemmer/AT-Blocker 12 (100)

ß-Blocker 11 (92)

Diuretika 10 (83)

Spironolacton 8 (67)

Statine 8 (67)

Tabelle 3: Charakteristika der chronisch herzinsuffizienten Patienten Anzahl (n) und prozentualer Anteil angegeben

Einteilung der Chronischen Herzinsuffizienz nach der New York Heart Association in vier Stufen (NYHA I-IV)

2.2 Flussabhängige Vasodilatation als Indikator der Endo- thelfunktion

Es ist bekannt, dass der Gefäßtonus physiologischerweise über den Blutfluss reguliert wird [53]. Veränderungen des Blutflusses wirken als Scherkräfte auf die Endothelzellen ein und initiieren über das Zytoskelett eine Reaktionskette, die die intrazelluläre Calciumkonzentration erhöht und dann über NO, Prosta- zyklin oder EDHF zu einer Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur führt. Die- ses Phänomen der flussabhängigen Dilatation (flow dependant dilation = FDD) hat man bereits an verschiedenen Gefäßen untersucht und sowohl in Leitungs- gefäßen als auch in Widerstandsgefäßen nachgewiesen [63, 66, 108]. In wel- chem Ausmaß die einzelnen Faktoren zur Dilatation beitragen, hängt vom Ge- fäßbett, Gefäßgröße und Spezies ab. Zum Beispiel schien NO bislang mehr in größeren Gefäßen wie den Coronararterien [114] und EDHF eher in der Mikro- zirkulation [84] eine Rolle zu spielen.

Bei klinischen Untersuchungen kann man sich des Prinzips der FDD bedienen, um Aussagen über die Endothelfunktion zu treffen. Während man für die Beur- teilung von Coronararterien stark invasive Methoden wie die Herzkatheterunter- suchung anwenden muss, kann an peripheren Gefäßen, wie z.B. an der Arteria brachialis, die Endothelfunktion einfacher gemessen werden, indem man intraarteriell Acetylcholin als Stimulus infundiert und dann sonographisch die Gefäßfunktion beurteilt. Erste nicht-invasive Untersuchungen stellten Celerma- jer et al. vor [14]. Dabei werden Stimuli wie die Zunahme der Scherkräfte für die Triggerung der Endothelfunktion eingesetzt. In unserer Studie wurde an der Arteria radialis eine reaktive Hyperämie nach mehrminütiger Okklusion des Handgelenks verursacht. Die reaktive Hyperämie ist ein Automatismus, den man nach einer Ischämiephase beobachten kann. Durch lokale Mediatoren wird im betroffenen Gebiet die Durchblutung gesteigert, was gleichzeitig im zufüh- renden Gefäß zu einer Blutflusssteigerung führt. Die Zunahme des Blutflusses triggert dann die Dilatation, die man mit Hilfe von Ultraschallsonden apparativ auswerten kann. Wir haben in unserer Studie zeigen können, dass die Infusio- nen der einzelnen Substanzen (Sulpfaphenazol und L-NMMA) keinen Einfluss auf den Blutfluss hatten, dass aber nach Einsetzen der reaktiven Hyperämie der Fluss anstieg. Dies initiierte die Endothelfunktion, d.h. der Gefäßdurchmesser nahm zu, es kam zur Relaxation. Nach Normalisierung des Blutflusses erreichte auch der Durchmesser des Gefäßes wieder den Ausgangswert. Diese Phase der Endothelfunktion dauerte etwa fünf Minuten.

Der Stellenwert der Untersuchung der Endothelfunktion scheint in letzter Zeit zugenommen zu haben. In einigen Arbeiten konnte eine entdeckte Dysfunktion mit späteren kardiovaskulären Ereignissen assoziiert werden [11, 34, 36, 104].

2 Methodik 18

Zeitlicher Ablauf einer FDD

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 180,00 200,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320

Zeit (sec)

Blutfluss (ml/min)

3,300 3,320 3,340 3,360 3,380 3,400 3,420 3,440 3,460 3,480 3,500 3,520 3,540 3,560 3,580 3,600 3,620

Arteriendurchmesser (mm)

Blutfluss Durchmesser

Abbildung 3: Abhängigkeit des Durchmessers vom Blutfluss

Nach Anstieg des Blutflusses kommt es zunehmend zu einer Vasodilatation

Dargestellt ist eine ausgesuchte Messreihe, die repräsentativ die Gegebenheiten widerspiegelt

Bei der Ermittlung der flussabhängigen Vasodilatation haben wir uns eines Ver- fahrens bedient, das 1992 von Celermajer et al. vorgestellt wurde und seitdem sowohl in unserer als auch in anderen Forschungsgruppen erfolgreich ange- wandt wird [14, 26, 56, 57, 58, 59, 61, 122].

Die flussabhängige Reaktion des Gefäßes wurde durch einen erhöhten Blut- fluss getriggert. Eine achtminütige Handgelenksokklusion nutzten wir zur Induk- tion einer reaktiven Hyperämie mit anschließender Blutflusszunahme in den zuführenden Gefäßen des Armes, insbesondere in der Arteria brachialis und der Arteria radialis. Mit Hilfe eines hochauflösenden Ultraschallgerätes konnte der Durchmesser der Arteria radialis während der Untersuchung beurteilt wer- den. Dieser nicht-invasiven Methode wurde mehrfach in Untersuchungen eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zugeschrieben [116]. Anderson et al.

haben die enge Korrelation zwischen dieser Methode und der Endothelfunkti- onsmessung an Koronararterien hervorgehoben [1].

2.3 A-Mode-Ultraschallverfahren zur Durchmesserbestim- mung

Die nicht-invasive Bestimmung des Durchmessers der Arteria radialis führten wir mit dem hochauflösenden Ultaschallgerät DIARAD der Firma ASULAB (Neuchâtel, Schweiz) durch.

Der 10 MHz Schallkopf sendet Ultraschallwellen aus, die im Gewebe reflektiert werden und abhängig von der Entfernung des Reflektionsortes mit unterschied- licher Latenzzeit am Schallkopf wieder eintreffen. Die dadurch ermöglichte räumliche Trennung der reflektierenden Strukturen, in diesem Fall der Vorder- und Hinterwand der Arterie, wird durch die sogenannte „oversampling“ Technik, bei der das reflektierte Signal 312 mal pro Sekunde registriert und zusätzlich in Bezug auf Störsignale filtriert wird, noch präzisiert. Dadurch wird eine Genauig- keit der Messwerte von ±2µm erreicht [78, 121].

Das registrierte Signal wird auf einem Oszilloskop in Form eines A-Mode- Ultraschallbildes abgebildet (siehe Abbildung 4). Nachdem der Untersucher die Arterienwände als solche identifiziert und markiert hat, kann das Gerät während der gesamten Messung den Gefäßdurchmesser aus den Signalen der einzel- nen Wände wiedergeben.

Für jeden einzelnen Wert wird das Signal über vier Sekunden aufgezeichnet und mit Hilfe der Software HEMO 300 graphisch umgewandelt. Da die Signale der anterioren und der posterioren Arterienwände zeitlich verschoben registriert werden, erhält man auf dem Bildschirm getrennte Kurven für die Wände und für den daraus berechneten Diameter. Der gemittelte Durchmesser wird am Bild- schirm abgelesen (siehe Abbildung 5), im Protokoll notiert und darüber hinaus nach der Messung auf einem Speichermedium gesichert.

Die Ultraschallsonde wurde senkrecht zur Blutflussrichtung der Arterie positio- niert. Die korrekte Lage wird mit Hilfe des Pulsdopplers und der visuellen Dar- stellung sichergestellt.

2 Methodik 20

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines A-Mode-Bildes

Der linke Signalausschlag repräsentiert die Vorderwand, der rechte Ausschlag die Hinterwand des Gefäßes

Abbildung 5: Momentaufnahme vom PC-Monitor (Software HEMO 300)

Die Signale vom Ultraschallgerät werden graphisch umgewandelt. Oben wird die posteriore, in der Mitte die anteriore Wand und unten im Bild der Durchmesser (jeweils im Kurvenverlauf aufgrund der pulsatilen Bewegung des Gefäßes) dargestellt. Oben rechts im Bild erscheinen die numerischen Werte.

2.4 Dopplersonographie zur Blutflussbestimmung

Zur Bestimmung der Blutflussgeschwindigkeit in der Arteria radialis benutzten wir das Ultraschall-Doppler-Gerät Vasocsope III der Firma Kranzbühler Deutschland.

Die vom stiftförmigen Schallkopf ausgesandten Wellen werden von den fließen- den korpuskulären Bestandteilen des Blutes reflektiert und mit veränderter Fre- quenz registriert. Das frequenzmodulierte Signal wird verarbeitet und auf dem Monitor in Form einer Kurve dargestellt (siehe Abbildung 6). Zusätzlich wird die Frequenzverschiebung aus drei Herzzyklen gemittelt und als sogenannter TAM- Wert (TAM = time average mean) angezeigt. Mit Hilfe dieser TAM-Werte lässt sich dann die Blutflussgeschwindigkeit berechnen (siehe Kapitel 2.9.2). Das Signal wird während der gesamten Messung auf ein Speichermedium aufge- zeichnet, um später die mitgeschriebenen Werte gegebenenfalls kontrollieren zu können.

Die 8 MHz-Sonde wird in einem Winkel von 45° zur Blutflussrichtung der Arteria radialis über der Haut am Unterarm platziert. Als leitendes Medium dient her- kömmliches Ultraschallgel.

Abbildung 6: Momentaufnahme des Doppler-Ultraschallbildes

Die zur späteren Berechnung des Blutflusses benötigten TAM-Werte werden unten rechts im Bild darge- stellt

2 Methodik 22

Abbildung 7: Vorrichtung zur Endothelfunktionsprüfung in unserem Labor 1) Ultraschallsonde zur Blutflussbestimmung

2) Ultraschallgel als leitendes Medium

3) Ultraschallsonde zur Erfassung des Arteriendurchmessers 4) Kinderblutdruckmanschette zur Handgelenksokklusion 5) Fixierrolle (zur Minimierung der Bewegungsartefakte)

6) unter dem Weißen Abdecktuch verbirgt sich eine verstellbare Unterarmschiene

2.5 Blutdruck und Herzfrequenz

Der systemische Blutdruck wurde während der gesamten Messung am domi- nanten Arm nach der nicht-invasiven Methode von Riva-Rocci mit einem auto- matischen, handelsüblichen Blutdruckmessgerät gemessen.

Die Herzfrequenz wurde kontinuierlich mit dem Dopplersignal erfasst und auf ein Speichermedium aufgezeichnet.

2.6 Materialien

Verabreichte Wirkstoffe

Aspisol^® von Bayer

Wirkstoff: DL-Lysinmonoacetylsalicylat (ASS)

Etwa 30 Minuten vor Beginn der Messung haben wir 2,5ml Aspisol i.v. verab- reicht, was einer Menge von 250mg ASS entspricht. Diese Dosis inhibiert effek- tiv die vaskuläre Cyclooxygenase und verhindert somit die Prostaglandinfrei- setzung [13]. Durch diese Gabe von ASS wird dementsprechend der durch Prostaglandin vermittelte Anteil der Gefäßdilatation inhibiert.

NG-Monomethyl-L-Arginin, Monoacetat-Salz, von Calbiochem^®

Wirkstoff: L-N-Methyl-M-Arginin

Die Bildung von NO aus L-Arginin wird durch L-NMMA, einem L-Arginin- Analogon, selektiv gehemmt [88].

Während der fünfminütigen intraarteriellen Infusion wurden 7µmol/min L-NMMA verabreicht. Diese Dosis inhibiert effektiv die endotheliale NO-Synthase, wie in einer Arbeit von Reif et al. und in vorangegangenen Studien unserer Arbeits- gruppe gezeigt werden konnte [56, 59, 60, 110]. L-NMMA hemmt den durch NO vermittelten Anteil der Vasodilatation.

Sulfaphenazol von Clinalfa AG

Wirkstoff: Sulfaphenazol-Natrium

Sulfaphenazol inhibiert selektiv und effektiv das Isoenzym 2C des Cytochrom P450-Oxidoreduktasesystems, welches als Quelle für den Endothelial Derived Hyperpolarizing Factor (EDHF) identifiziert wurde [39].

Bei der fünfminütigen intraarteriellen Infusion wurden 4mg/min Sulfaphenazol verabreicht. Mit dieser Dosierung konnte bei einer Untersuchung an der Univer-

2 Methodik 24 sitätsklinik Frankfurt (Abteilung Physiologie, Prof. Dr. R. Busse) bei gesunden Probanden die Bradykinin-induzierte Zunahme des Unterarm-Blutflusses signi- fikant reduziert werden, ohne systemische Effekte zu erzielen. Sulfaphenazol hemmt den durch EDHF vermittelten Anteil der Gefäßdilatation.

Nipruss^® von Pharma Schwarz

Wirkstoff: Nitroprussidnatrium (SNP)

Nitroprussidnatrium fungiert als exogener NO-Donor und führt zu einer endothe- lunabhängigen Vasodilatation. Dadurch wird die Dilatationskapazität des Gefä- ßes ermittelt.

Bei früheren Arbeiten in unserem Labor konnte gezeigt werden, dass eine Do- sis von 10µg/min, infudiert über 5 Minuten, eine maximale Relaxation der Arte- ria radialis bewirken kann [56, 59].

2.7 Aufbau und Durchführung

Vor der schriftlichen Einwilligung zur Teilnahme an unserer Studie wurden die Probanden in einem persönlichen Gespräch genau über die Vorbereitungen, die Durchführung, die Bedeutung und die Risiken der geplanten Untersuchung des Endothels aufgeklärt. Nach ausführlicher Anamneseerhebung folgte eine orientierende körperliche Untersuchung. Um die Störfaktoren bei der Messung der FDD auf ein Minimum zu beschränken, wurden die Probanden gebeten, am Untersuchungstag auf Kaffee, Tee, Alkohol, Tabak und andere vasoaktive Sub- stanzen zu verzichten. Ein leichtes Frühstück war erlaubt.

Zu Beginn der Messung hatten die Probanden nochmals die Gelegenheit, even- tuell aufgetretene Unklarheiten zu besprechen.

Die Messung fand auf einer Untersuchungsliege statt. Nachdem sich der Pro- band hingelegt und beide Arme von seiner Kleidung befreit hatte, brachten wir am dominanten rechten Arm eine Blutdruckmanschette an, die an einem auto- matischen Blutdruckmessgerät angeschlossen war. Zusätzlich platzierten wir im selben Arm eine venöse Verweilkanüle, über die wir Blut für Laboruntersuchun-

gen gewannen. Im Anschluss daran verabreichten wir 2,5ml Aspisol i.v., um die endotheliale Cyclooxygenase zu inhibieren.

Am nicht dominanten linken Arm wurde unter Lokalanästhesie mit Scandicain 1% (10mg Mepivacainhydrochlorid pro ml) ein arterieller Verweilkatheter in Sel- dinger-Technik in die Arteria brachialis am distalen Oberarm eingeführt und an ein Infusionssystem angeschlossen, über das während der Messung die ver- schiedenen Substanzen infundiert wurden.

Anschließend wurde am linken Arm um das Handgelenk eine Kinderblutdruck- manschette angelegt, mit der wir später die Okklusion durchführten. Um jegli- che Bewegungsartefakte so gering wie möglich zu halten, wurde der linke Un- terarm zusätzlich in einer Schiene fixiert (siehe Abbildung 7). Die Untersu- chungszeit betrug etwa drei Stunden. Vor Beginn der Messung vergewisserten wir uns nochmals, dass die Probanden sich den Umständen entsprechend in ihrer Position wohl fühlten und so auch für längere Zeit verweilen konnten.

Etwa zehn bis zwölf Zentimeter proximal der Kinderblutdruckmanschette wurde die Ultraschallsonde des 8 MHz-Dopplergerätes in einem Winkel von 45° zur Arteria radialis über der Haut platziert. Als leitendes Medium diente handelsüb- liches Ultraschallgel. Über das akustische und Bild gebende Feedback des Ge- rätes vergewisserten wir uns über die korrekte Lage. Die Sonde des Gerätes für die Bestimmung des Arteriendurchmessers wurde etwa 5-7cm distal des Dopplerschallkopfes und orthogonal zur Arterie über der Haut angebracht. Mit Hilfe des akustischen Signals wurde auch diese Ultraschallsonde korrekt einge- stellt. Anschließend wurden bis zum Erreichen eines „steady state“ diverse Werte gesammelt. Beide Signale mussten dafür annähernd konstant sein. Da- nach konnten wir unser Messprotokoll beginnen, welches sich vereinfachend in folgende Abschnitte einteilen lässt:

• Baselinemessung und FDD Bestimmung der Ausgangssituation (Kontrolle)

• Infusion(en) und dazugehörige FDD(s)

• Endothelunabhängige Dilatation Bestimmung der Dilatationskapa- zität

2 Methodik 26 Im Detail verlief die Messung folgendermaßen:

Abschnitt Phase Infusion

FDD - Ausgangssituation Baseline 1

Okklusion 1 NaCl 0.9%

FDD 1

FDD nach Baseline 2 NaCl 0.9%

Sulfaphenazol-Infusion Baseline 3 Sulfaphenazol 4mg/min

Okklusion 2 NaCl 0.9%

FDD 2

FDD nach L-NMMA-Infusion Baseline 4 NaCl 0.9%

Baseline 5 L-NMMA 1.665mg/min

Okklusion 3 NaCl 0.9%

FDD 3

FDD nach Coinfusion Baseline 6 NaCl 0.9%

von Sulfaphenazol und

L-NMMA Baseline 7 Sulfaphenazol 4mg/min

+ L-NMMA 1.665mg/min

Okklusion 4 NaCl 0.9%

FDD 4

Endothelunabhängige Baseline 8 NaCl 0.9%

Dilatation (EIDC) EIDC 1 Nitroprussid-Natrium 10mg/min EIDC während Sulfaphenazol-

Infusion

EIDC 2 Nitroprussid-Natrium 10mg/min + Sulfaphenazol 4mg/min Tabelle 4: Tabellenförmige Darstellung des Versuchsprotokolls

FDD = flow dependent dilation (flussabhängige Dilatation)

EIDC = endothelial independent vasodilatory capacity (endothelunabhängige vasodilatierende Kapazität)

Die einzelnen Phasen des Protokolls lassen sich wie folgt beschreiben:

Baseline

Der Arteriendurchmesser wurde alle 30 Sekunden ermittelt. Zu jedem Diameter wurden einige TAM-Werte für die Berechnung des mittleren Blutflusses notiert (siehe Kapitel 2.9.2). Kurz vor Abschluss der Baseline-Messung, sobald sechs konstante Diameter- und TAM-Werte vorlagen, wurden Blutdruck und Puls kon- trolliert.

Okklusion und FDD

Die Handblutdruckmanschette wurde auf 40mm Hg über den kurz davor be- stimmten systolischen Blutdruck für acht Minuten aufgepumpt. Die Ultraschall- signale wurden während der Okklusionsphase auf den Monitoren überwacht und gegebenenfalls korrigiert. Nach Ablauf der acht Minuten wurde der Druck aus der Manschette abgelassen. Im durch die Okklusion mit Sauerstoff unter- versorgten Gewebe distal der Manschette wurde nun eine reaktive Hyperämie

mit erhöhtem Blutfluss in den zuführenden Gefäßen, unter anderem der Arteria radialis, induziert. Als Reaktion auf die Blutflusszunahme nahm der Arterien- durchmesser zu, die Endothelfunktion wurde getriggert. Die zu untersuchenden Parameter wurden engmaschig beobachtet und registriert. Während der ersten zwei Minuten nach der Okklusionslösung wurde der Diameter im Zwanzigse- kundentakt gemessen. In den darauf folgenden drei Minuten alle 30 Sekunden, bis der Wert zum Schluss der Phase annähernd wieder dem Baseline-Wert ent- sprach. Zeitgleich erfolgte wieder eine Kontrolle von Blutdruck und Puls.

Infusion

Die verabreichten Wirkstoffe wurden jeweils über fünf Minuten intraarteriell in- fundiert. Zuerst das Sulfaphenazol, im nächsten Protokollabschniit das L-NMMA und zu guter Letzt beide Substanzen als Co-Infusion. Während dieser Phasen wurden die Parameter analog der Baseline-Messung kontinuierlich beobachtet und registriert. Vor Ablauf der fünf Minuten der Infusion kontrollierten wir noch- mals Blutdruck und Puls.

Endothelunabhängige Dilatation

Nach der letzten Baseline-Messung wurde über fünf Minuten Nitroprussid- Natrium (SNP) infundiert, um die endothelunabhängige Dilatationskapazität des Gefäßes zu erfassen. Die Parameter wurden im Dreißigsekundentakt registriert.

Eine engmaschige Kontrolle des Blutdruckes und Pulses war wegen der maxi- malen Dilatation und daraus eventuell resultierendem Blutdruckabfall notwen- dig.

Nach der fünfminütigen SNP-Infusion folgte noch eine Co-Infusion von Sul- faphenazol und SNP, um die Annahme zu untermauern, dass Sulfaphenazol nur die endothelabhängige Dilatation beeinflusst.

Mit dieser Phase wurde das Messprotokoll beendet. Nachdem der Diameter wieder zum Ausgangswert zurückgekehrt war und Blutdruck- und Puls erneut kontrolliert worden waren, wurden zuerst der arterielle Verweilkatheter und an- schließend die venöse Verweilkanüle entfernt. Die Punktionsstellen wurden manuell ordnungsgemäß komprimiert. Die arterielle Punktionsstelle wurde zu-

2 Methodik 28 sätzlich mit einem Druckverband versorgt, der innerhalb der folgenden sechs Stunden nicht entfernt werden durfte.

Die Infusionen von Sulfaphenazol und L-NMMA wurden gut vertragen und es konnten keine unerwünschten Nebenwirkungen beobachten werden. Nennens- werte Komplikationen haben wir zu keiner Zeit verzeichnen können.

2.8 Immunhistochemie

Die Gewebeproben aus Radialarterien für die immunhistochemische Untersu- chung stammen von Patienten, die sich einer Coronarbypass-Graft-Operation unterzogen haben (n=6). Es handelt sich hierbei nicht um dieselben Patienten, die am anderen Teil der Studie teilgenommen haben. Einerseits hätten sie auf- grund der Indikation zu einer Bypass-Operation die Ein- und Ausschlusskrite- rien für den Teil nicht erfüllt. Andererseits muss eine Entnahme der Radialarte- rie medizinisch indiziert sein. Diese Indikation war bei den Bypass-Patienten gegeben, so dass Segmente des entnommenen Gefäßes in unserer Studie un- tersucht werden konnten.

Frisch isolierte Segmente der Arterien wurden mit eiskaltem PBS (phosphate buffered saline = mit Phopshat gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen und umgehend in Gefriermedium für Gewebe von Jung eingebettet und bei -80°C gelagert. Gefrierschnitte wurden in phosphatgepufferter Formaldehydlösung (4%) fixiert, mit Triton X-100 (0.2%) permeabilisiert und mit Rinderserumalbu- minlösung (3%) und Pferdeserum (5%) in phosphatgepufferte Kochsalzlösung gelegt. CYP 2C konnte mit Hilfe eines spezifischen polyklonalen CYP 2C Anti- körpers (Sigma) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. E. Morgan, Atlanta, GA, USA) und das ß-Aktin mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers detektiert werden. Die Präparate wurden anschließend gewaschen, mit fluores- zenten Sekundärantikörpern (Alexa) inkubiert und wiederum gewaschen. Mit einem Laser Scan Mikroskop (LSM 510 meta, Carl Zeiss, Jena, Germany) konnten am Ende Aufnahmen gewonnen werden.

2.9 Auswertung

2.9.1 Durchmesser der Arteria radialis

Für die Ermittlung des Arteriendurchmessers unter Ruhebedingungen wurden jeweils die letzten sechs Werte einer Messreihe, die über mehrere Minuten im Dreißigsekundentakt gemessen wurden, gemittelt. Im Folgenden wird dieser Wert Baseline genannt.

Die während der Infusion aufgezeichneten Werte für den Diameter wurden glei- chermaßen verrechnet und ergaben somit die korrigierte Baseline nach Infusi- on.

Nach der achtminütigen Okklusion wurde der Durchmesser in den ersten zwei Minuten jede 20 Sekunden und danach alle 30 Sekunden, insgesamt über fünf Minuten gemessen. In dieser Zeit konnte man die Relaxation des Gefäßes beo- bachten. Um eine Aussage über die flussabhängige endothelvermittelte Dilata- tion treffen zu können, wurde der maximale Wert nach Lösen der Okklusion zum jeweils davor gemessenen Ausgangswert (Baseline) in Relation gesetzt.

Somit wurde sowohl die absolute als auch die prozentuale Veränderung der Gefäßweite ermittelt.

2.9.2 Blutfluss

Wie anhand einer später dargestellten Formel demonstriert werden kann, benö- tigt man für die Berechnung des Blutflusses die Blutflussgeschwindigkeit. An dieser Stelle spielen die von uns notierten TAM-Werte eine Rolle. Mit Hilfe einer mathematischen Formel lässt sich die Flussgeschwindigkeit folgendermaßen berechnen:

2 Methodik 30

Formel 1: Berechnung der Blutflussgeschwindigkeit

Nun kann die Geschwindigkeit in eine andere Formel eingesetzt und für die Be- rechnung des Blutflusses benutzt werden:

Formel 2: Berechnung des Blutflusses

Fasst man beide Formeln durch Vereinfachung zusammen, so erhält man fol- gende Formel für die Berechnung des Blutflusses:

Formel 3: Vereinfachte Formel zur Berechnung des Blutflusses

0066 .

2 0

⋅

⋅

=d TAM

F

F: Blutfluss d: Diameter

: Blutflussgeschwindigkeit

f : Frequenzverschiebung (TAM); [Hz]

c: Schallgeschwindigkeit im Körper; [m/s]; ca. 1560 m/s f0: Ultraschallfrequenz des Schallkopfes; [Hz]; 8 MHz : eingeschlossener Winkel zwischen Arterie und Ultra-

schallsonde; 45°

2

cos ⋅

⋅

⋅

= ∆

α ν

fo c f

F: Blutfluss

A: Gefäßquerschnittsfläche; (*r²)

: Blutflussgeschwindigkeit; (siehe Formel 1)

ν

⋅

= A F

Diese Vereinfachung ist durchaus legitim, weil man davon ausgehen kann, dass die Schallgeschwindigkeit im Körper, die Ultraschallfrequenz und der Winkel zwischen Messsonde und Gefäß stets konstant bleiben.

Während der Baseline-Messung wurden zu jedem Wert des Arteriendurchmes- sers vier TAM-Werte notiert und gemittelt. Der Blutfluss wurde dann anhand von Formel 3 berechnet. Gleichermaßen wurde auch der Blutfluss zur korrigier- ten Baseline während der Infusion berechnet. Während der reaktiven Hyperä- mie wurden zu jedem Arteriendurchmesser etwa sieben TAM-Werte notiert, um den Blutflussanstieg genauer auswerten zu können. Der Maximalwert des Flus- ses wurde jeweils zum davor bestimmten Blutfluss unter Ruhebedingungen in Relation gesetzt, um die prozentuale Blutflusszunahme berechnen zu können.

2.9.3 Statistische Auswertung

Die errechneten Ergebnisse wurden als Mittelwert±SEM (Standardfehler des arithmetischen Mittels) angegeben.

Um die Daten der flussabhängigen Dilatation nach den verschiedenen Infusio- nen untereinander vergleichen zu können, wurden die ANOVA-Analyse (Analy- sis Of VAriance) und der Student Newman Keuls Test durchgeführt.

Ein p-Wert von p<0,05 (entspricht einem Konfindenzintervall von <5%) wurde für statistisch signifikant erachtet.

3 Ergebnisse

3.1 Ergebnisse der flussabhängigen Dilatation bei gesunden Probanden

3.1.1 Flussabhängige Dilatation nach NaCl-Infusion (Kontrolle)

Im untersuchten Gefäß wurde eine reaktive Hyperämie mit ansteigendem Blut- fluss durch die achtminütige Handgelenksokklusion erreicht. Der erhöhte Blut- fluss triggerte die Endothelfunktion, der Arteriendurchmesser nahm nach Lösen der Okklusion zu.

Um eine Aussage zur Auswirkung der infundierten Substanzen auf die FDD treffen zu können, musste zuerst ein Ausgangswert vorliegen. Dazu diente die FDD nach NaCl-Infusion.

Nach der Okklusion weitete sich bei der Gruppe 1 das Gefäß vom mittleren Ba- seline-Durchmesser 2,692±0,099mm auf 3,010±0,119mm, was einem prozen- tualen Anstieg, also einer FDD, von 11,5±0,9% entspricht.

Der Blutfluss stieg dabei von 19,79±3,31ml/min auf einen Maximalwert von 43,66±5,86ml/min.

3.1.2 Flussabhängige Dilatation nach Sulfaphenazol-Infusion

Nach der Infusion von Sulfaphenazol, durch die der EDHF-vermittelte Anteil der Vasodilatation inhibiert wird, war die FDD deutlich vermindert.

Das Gefäß erweiterte sich dieses Mal in der Gruppe 1 vom korrigierten, mittle- ren Baselinedurchmesser 2,692±0,094mm nur auf 2,883±0,107mm, was einer FDD von 7,4±1,0% entspricht.

Der Blutfluss nahm von 15,06±3,40ml/min auf ein gemitteltes Maximum von 44,57±5,33ml/min zu.

3.1.3 Flussabhängige Dilatation nach L-NMMA-Infusion

Auch nach der Infusion von L-NMMA, durch die der NO-vermittelte Anteil der Dilatation inhibiert wird, war die FDD im Vergleich zur Kontrolle signifikant redu- ziert. Im Vergleich zur FDD nach Sulfaphenazol-Infusion fiel diese FDD noch geringer aus, auch wenn der Unterschied nicht signifikant war.

In der Gruppe 1 nahm der mittlere Arteriendruchmesser von 2,707±0,081mm auf 2,872±0,088mm zu. Dies entspricht einem prozentualen Anstieg, bezie- hungsweise einer FDD, von 6,0±0,7%.

Der Blutfluss änderte sich vom mittleren Baseline-Blutfluss, der 18,78±2,36ml/min betrug, auf einen Spitzenwert von 44,04±6,05ml/min.

3.1.4 Flussabhängige Dilatation nach Co-Infusion von Sul- faphenazol und L-NMMA

Nach der Co-Infusion von Sulfaphenazol und L-NMMA konnten wir eine erheb- liche Reduktion der FDD beobachten.

In der Gruppe 1 ist der mittlere Durchmesser der Arterie von 2,725±0,083mm auf 2,831±0,094mm angestiegen und entspricht somit einer FDD von 3,9±0,7%.

Der Blutfluss stieg vom Baselinewert 15,16±3,78ml/min auf einen Maximalwert von 45,18±5,46ml/min an.

3.1.5 Zusammenfassung und Vergleich der flussabhängigen Dilatationen

Die endothelabhängige Dilatation nach NaCl-Infusion war bei unseren gesun- den Probanden der Gruppe 1 im Mittel 11,5±0,9%. Dieses Ergebnis liegt unse- ren Erfahrungen nach im Bereich der Normwerte für gesunde Erwachsene.

Nach der fünfminütigen Infusion von Sulfaphenazol war die FDD auf 7,4±1,0%

gesunken und wurde somit im Vergleich zur Kontrolle hochsignifikant reduziert (p<0,01).

3 Ergebnisse 34 Eine noch schwächere Dilatation wurde durch die Infusion von L-NMMA er- reicht. Sie war mit 6,0±0,7% wieder hochsignifikant geringer (p<0,01) als die Kontrolle.

Die FDD nach Co-Infusion von Sulfaphenazol und L-NMMA war noch geringer als nach alleiniger Infusion der Wirkstoffe und erreichte lediglich einen Wert von 3,9±0,7%. Der Unterschied zur Kontrolle und zur FDD nach Sulfaphenazol war hochsignifikant (p<0,01), zur FDD nach L-NMMA signifikant (p<0,05).

FDD - Vergleich bei gesunden Probanden

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00

NaCl Sulfaphenazol L-NMMA Coinfusion

FDD [%]

p<0,05 p<0,01

p<0,01

p<0,01

Abbildung 8: FDD-Vergleich bei gesunden Probanden Angabe der Signifikanz der Unterschiede