Zusammenfassung: Zugabe von verschiedenen organischen Lösemitteln 145

5.6.6 Zusammenfassung: Zugabe von verschiedenen

kür-zeren Heizdauer hin verschiebt. Gleichzeitig lässt sich aus dem Graphen herauslesen, dass die Polarität des verwendeten Lösemittels, die Gelbildungsgrenze beeinflusst. Je unpolarer das organische Lösemittel, desto niedriger ist der Wert für tG. Eine mögliche Erklärung könnte die Wechselwirkung des Lösemittels mit der Zellmembran liefern.

Die Membran der Zelle lässt sich mit dem von Lenard und Singer vorgeschlagenen Fluid-Mosaik-Modell beschreiben. Die Membran besteht demnach aus einer Lipid-doppelschicht, in die Proteine wie Inseln ein- oder aufgelagert sind und dabei ein Mo-saik bilden. Membranüberbrückende Proteine stellen Poren in der Lipiddoppelschicht dar. Aufgrund der dauernden Veränderung der Membran, stellt man sich diese dyna-misch und nicht statisch vor. Zwei prinzipiell unterschiedliche Membranstrukturen stehen für den Stoffdurchtritt zur Verfügung. Die Lipidschicht für die Aufnahme li-pophiler Stoffe und die wassergefüllten Poren für die Penetration hydrophiler Substan-zen¹¹⁴. Die Membran der Erythrozyten besteht aus ca. 50 % Protein und 40 % Lipid¹⁵⁵. Quantitativ gesehen steht die Diffusion durch die Lipidmatrix im Vordergrund. Die in den Membranen enthaltenen Poren besitzen nur für die Resorption schlecht lipidlösli-cher Nichtelektrolyte sowie vollständig ionisierter Stoffe mit relativ niedrigem Mole-kulargewicht eine gewisse Bedeutung. Je apolarer das organische Lösemittel ist, desto besser kann es sich in die Lipiddoppelschicht einlagern. Durch die auf diese Art her-beigeführte Lyse tritt Hämoglobin aus der Zelle aus und wird aufgrund der Hitzezufuhr denaturiert. Es bildet sich ein Gel. DMSO ist das apolarste der in dieser Arbeit einge-setzten organischen Lösemittel. Zu erwarten wäre, dass in Gegenwart von DMSO der entsprechende Wert für tG am kleinsten ist. Dimethylsulfoxid stellt eine Ausnahme dar.

Es scheint, die Aggregation bzw. Denaturierung von freigesetztem Hämoglobin zu verzögern. Aus der Darstellung ist auch deutlich zu erkennen, dass der Zusatz von hu-manem AB-Plasma zu Vollblut und die dadurch resultierende Herabsetzung des Häma-tokrits zu einer Verzögerung der Gelbildung führen.

Im Laufe der Untersuchungen hat sich herausgestellt, dass die ideale Prozessierungs-temperatur der Vollblutprobe abhängig von der Art und Menge der zugesetzten organi-schen Lösemittel ist. Um die ideale Prozessierungstemperatur festzulegen, ist es von Bedeutung, dass das Fenster zwischen t und t groß genug ist. Zusätzlich darf der

Wert für theat nicht zu groß sein, denn das Endziel dieser Untersuchungen ist der Trans-fer der off-line ermittelten Ergebnisse in ein on-line System, in dem die Probe in-line prozessiert wird. Die Verweilzeit der Probe im Heizelement wird dann über den Fluss geregelt. Ausserdem soll die Prozessierung der Probe so schnell und sicher wie mög-lich durchgeführt werden, um eine zeiteffiziente und robuste Methode zu erhalten.

Tab. 29 stellt die optimalen Prozessierungstemperaturen für verschiedene Vollblutan-sätze dar. Anzumerken ist, dass die DMSO- und Ethanol-haltigen AnVollblutan-sätze nur bei einer Temperatur von 75°C untersucht wurden.

Ansatz VB VB:AB-HP (50/50, v/v)

ideale

Prozessierungs-temperatur [°C] 70-75 75-85

Ansatz VB:AB-HP:MeOH (50/47,5/2,5, v/v/v)

VB:AB-HP:ACN (50/47,5/2,5, v/v/v)

VB:AB-HP:EtOH (50/47,5/2,5, v/v/v)

VB:DMSO (97,5/2,5, v/v)

ideale

Prozessierungs-temperatur [°C] 75-80 75-80 75 75

Ansatz VB:AB-HP:MeOH (50/45/5, v/v/v)

VB:MeOH (95/5, v/v)

VB:AB-HP:ACN (50/45/5, v/v/v)

VB:ACN (95/5, v/v)

VB:AB-HP:EtOH (50/45/5, v/v/v)

VB:DMSO (95/5, v/v)

ideale

Prozessierungs-temperatur [°C] 75 75 70-75 70 75 75

Ansatz VB:AB-HP:MeOH (50/40/10, v/v/v)

VB:AB-HP:ACN (50/40/10, v/v/v)

VB:AB-HP:EtOH (50/40/10, v/v/v)

VB:DMSO (90/10, v/v)

ideale

Prozessierungs-temperatur [°C] 70 60-65 75 75

2,5 vol. % organischer Modifier

5 vol. % organischer Modifier

10 vol. % organischer Modifier kein organischer Modifier

Tab. 29: Optimale Temperaturen für die Prozessierung von Vollblut nach Zusatz verschiedener Additive

Vergleicht man die Methanol- mit den Acetonitril-haltigen Vollblutproben, die in ei-nem Temperaturbereich zwischen 60 bis 95°C off-line prozessiert wurden, so lässt sich ableiten, dass mit zunehmender Apolarität des organischen Lösemittels die ideale Pro-zessierungstemperatur sinkt. Weiterhin fällt auf, dass mit zunehmendem Volumenanteil

an organischem Lösemittel der Bereich der idealen Prozessierungstemperatur hin zu niedrigeren Temperaturen verschoben wird.

5.7 Desintegration von Leukozyten

Die Leukozyten stellen mit 0,1 % die kleinste Fraktion an zellulären Bestandteilen im Blut dar. Wie in Kapitel 2.1.1 erwähnt, werden die Leukozyten unterteilt in Mono-zyten, Granulozyten und Lymphozyten. Bei den Granulozyten wird unterschieden zwi-schen den Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen. Die Lymphozyten sind unter-teilt in B- und T-Lymphozyten. Die Leukozytensubtypen kommen in unterschiedlicher Häufigkeit vor. Die Anzahl der Leukozyten ist abhängig vom Alter, wie in Tab. 30 dargestellt.

Entwicklungsstadium Alter Leukozyten/µL Neugeborene bei der Geburt 9 000 - 30 000

2 Wochen alt 5 000 - 20 000

Kinder 1-3 Jahre 6 000 - 17 500

4-7 Jahre 5 500 - 15 500 8-13 Jahre 4 500 - 13 500

Erwachsene 4 300 - 10 000

Tab. 30: Referenzwerte der Leukozyten in verschiedenen Entwicklungsstadien des Menschen¹⁴³

Eine Veränderung der Gesamtleukozytenzahl oder dem Verhältnis zwischen den Leu-kozytensubtypen gibt Hinweise auf Krankheiten. Mittels eines Differentialblutbildes können wichtige Hinweise für die Differenzialdiagnose oder in manchen Fällen sogar eine Diagnosestellung erfolgen. Dazu wird ein Blutausstrich erstellt, der nach Giemsa oder Pappenheim gefärbt wird¹⁴³. Die Färbung nach Pappenheim setzt sich aus zwei Lösungen, der May-Grünwald und der Giemsa-Lösung, zusammen. In diesen Lösun-gen sind der saure Farbstoff Eosin und die basischen Farbstoffe Azur 1, Azur 2 und Methylenblau enthalten. Mit den basischen Farbstoffen werden die sauren Gruppen der Nukleinsäuren und Proteine gefärbt, Eosin hingegen hat eine hohe Affinität zu basi-schen Gruppen und färbt diese. Nach Trocknung des Ausstriches wird dieser unter dem Mikroskop mit einer 100-fachen Vergrößerung an einer geeigneten Stelle meanderför-mig durchmustert. Es werden 100 Leukozyten ausgezählt und prozentual der monozy-tären, granulozytären oder lymphatischen Fraktion zugeordnet. In Tab. 31 ist die pro-zentuale Verteilung der Leukozyten bzw. die absolute Anzahl der entsprechenden Fraktion dargestellt. Von Erwachsenen und Neugeborenen ist das Differentialblutbild sehr ähnlich. Das Verhältnis von Lymphozyten und Neutrophilen ist im Alter von 1 Jahr exakt invers¹⁴³.

Leukozytenart Vorkommen [%] Vorkommen/µL

Neutrophile 40-75 2 500 - 7 500

Eosinophile 1-6 40 - 400

Basophile 0-1 0 - 100

Monozyten 2-8 200 - 800

Lymphozyten 20-45 1 500 - 3 500

Tab. 31: Referenzwerte für das Vorkommen verschiedener Leukozytenarten im Differentialblutbild¹⁴³

5.7.1 Quantitative mikroskopische Bestimmung der