Zugabe von Acetonitril

Für die zusätzlich ermittelten Prozessparameter gilt ebenfalls, dass sich mit zuneh-mendem Methanolgehalt und identischer Temperatur die ermittelten Werte für tmin und die daraus resultierenden Werte für theat zu den kürzen Heizdauern hin verschieben.

Wieder sind die tmin- und theat-Werte für die beiden Ansätze mit 5 vol. % Methanol ver-gleichbar. Das bedeutet wiederum, dass auch tmin bei identischer Temperatur nicht vom Hämatokrit der Probe, sondern allein vom Methanolgehalt abhängig ist.

Festzuhalten gilt, dass bei konstantem Gehalt an Methanol, die Prozessparameter tem-peraturabhängig sind. Mit sinkender Temperatur steigt der Wert für tG und tmin. Daraus folgt, dass die Probe länger erhitzt werden kann bis ein Gel entsteht. Zudem muss sie länger erhitzt werden, um eine quantitative Desintegration der Erythrozyten zu errei-chen. Der ideale Temperaturbereich ist abhängig vom Methanolgehalt der Probe. Ent-hält die Vollblutprobe 2,5 vol. % Methanol, so liegt der optimale Temperaturbereich für die Prozessierung zwischen 75 und 80°C. Bei einer Probe mit einem Gehalt an 5 vol. % Methanol verschiebt er sich auf 75°C. Wird der Methanolgehalt der Probe auf 10 vol. % erhöht, so sinkt die optimale Prozessierungstemperatur auf 70°C. Allgemein gilt: Werden die Proben bei Temperaturen oberhalb des Idealbereichs prozessiert, lie-gen die Werte für tmax und tmin sehr nah beisammen oder sind sogar identisch. Das bringt die Gefahr eine Gelbildung während der Hitzeschockbehandlung von Proben mit Hämatokrit-Werten > 0,4 mit sich.

auf und ist in der eluotropen Reihe aufgrund seiner geringeren Polarität hinter Metha-nol eingestuft¹⁵⁴.

Zu einer Vollblutprobe können maximal 10 vol. % Acetonitril hinzugefügt werden, ohne dass es zu einer Denaturierung bzw. Fällung von Proteinen kommt.

In der hier beschriebenen Versuchsreihe wurde der Effekt von Acetonitril auf alle vier Prozessparameter in einem Temperaturbereich von 60 bis 95°C untersucht. Die Proben wurden in Glaskapillaren gefüllt und manuell prozessiert. Als Probe diente zum einen Vollblut, das 5 vol. % Acetonitril enthielt, zum anderen wurde Vollblut 1:1 mit AB-Humanplasma verdünnt, das 5, 10 oder 20 vol. % Acetonitril enthielt. Die verdünnten Vollblutproben enthielten somit ein Gesamtvolumen zwischen 2,5 und 10 % Aceto-nitril. Der Hämatokrit der nativen Vollblutprobe betrug 0,4. Abb. 33 zeigt die experi-mentell ermittelten tG-Werte für die verschiedenen Acetonitril-Vollblut-Mischungen.

55 60 65 70 75 80 85 90 95

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

t_G [sec]

Temperatur [°C]

VB:ACN (95/5, v/v) VB:AB-HP:ACN (50/47,5/2,5, v/v/v) VB:AB-HP:ACN (50/45/5, v/v/v) VB:AB-HP:ACN (50/40/10, v/v/v)

Abb. 33: Gelbildungsgrenze (t_G) von Vollblut mit unterschiedlichen Anteilen an Acetonitril bei verschiedenen Temperaturen

Die ermittelten tG-Werte der untersuchten Acetonitril-Vollblut-Mischungen für den gesamten Temperaturbereich sind in Tab. 23 zu sehen.

VB:ACN (95/5, v/v)

VB: AB-HP: ACN (50/47,5/2,5, v/v/v)

VB: AB-HP: ACN (50/45/5, v/v/v)

VB: AB-HP: ACN (50/40/10 v/v/v)

95 - - -

-90 3 4 4

-85 4 6 4

-80 6 11 6 4

75 10 22 10 5

70 19 41 21 6

65 47 151 50 15

60 181 735 256 31

Temperatur [°C]

t_G [sec]

Tab. 23: Ermittelte t_G-Werte für Vollblut mit verschiedenen Anteilen an Acetonitril für einen Temperaturbereich von 65 bis 95°C

Aus dieser Tabelle lassen sich zwei Schlüsse ziehen. Erstens wird deutlich, dass mit steigendem Volumengehalt an Acetonitril und identischer Temperatur, sich die ermit-telten Werte für tG zu einer kürzeren Heizdauer hin verschieben. Zweitens wird auch hier klar ersichtlich, dass der Gehalt an zugefügtem Acetonitril ausschlaggebend für tG

ist und nicht der Hämatokrit der Probe. Inhaltlich sind diese beiden Schlussfolgerun-gen mit denen der methanolischen Vollblutproben zu vergleichen (s. Kapitel 5.6.2).

Auch hier gilt: Je höher das zugesetzte Volumen an Acetonitril, desto niedriger ist die Temperatur, mit der die Bestimmung der tG-Werte beginnt. Acetonitril hat einen höhe-ren Siedepunkt (81-82°C) als Methanol¹⁵³. Aus diesem Grund können die Prozesspa-rameter der Acetonitril-haltigen Vollblutprobe in der Regel schon ab 90°C bestimmt werden. Tab. 24 zeigt die experimentell bestimmten Werte der verbleibenden Parame-ter.

tmax [sec] tmin [sec] theat [sec] tmax [sec] tmin [sec] theat [sec] tmax [sec] tmin [sec] theat [sec] tmax [sec] tmin [sec] theat [sec]

95 - - - - - - - - - - -

-90 2 2 2 3 3 3 3 3 3 - -

-85 3 3 3 5 2 4 3 3 3 - -

-80 5 5 5 10 5 8 5 5 5 3 1 2

75 9 9 9 21 2 12 9 2 6 4 1 3

70 18 9 14 40 5 23 20 5 13 5 1 3

65 46 11 29 150 9 80 49 12 31 14 1 8

60 180 45 113 734 11 373 255 31 143 30 1 16

VB: AB-HP: ACN (50/47,5/2,5, v/v/v) VB: AB-HP: ACN (50/45/5, v/v/v) VB: AB-HP: ACN (50/40/10, v/v/v) Temperatur

[°C]

VB:ACN (95/5, v/v)

Tab. 24: Ermittelte Werte für tmax, tmin und theat für Acetonitril-haltige Vollblutproben im Temperaturbereich von 60 bis 95°C

Es zeigt sich auch aus den Werten der Tab. 24, dass sich mit steigendem Gehalt an Acetonitril in der Probe tmin, tmax und das daraus resultierende theat bei identischer Tem-peratur zu den kürzeren Zeiten hin verschieben. Somit lassen sich Proben, die weniger Acetonitril enthalten, bei konstanter Temperatur länger erhitzen bis sie ein Gel bilden.

Sie müssen zudem auch länger prozessiert werden, um eine vollständige Desintegrati-on der Erythrozyten zu erzielen. Ein Vergleich der Prozessparameter der beiden Ansät-ze, die 5 vol. % Acetonitril beinhalten, lässt vermuten, dass auch in diesem Falle bei konstanter Temperatur nur der Volumenanteil an zugegebenem organischem Lösemit-tel und nicht der Hämatokrit für den Zeitpunkt der Gelbildung und der quantitativen Desintegration der Erythrozyten verantwortlich ist.

Bestätigt wird diese Aussage durch folgende Untersuchung. Vollblut wurde 1:1 mit AB-HP verdünnt, das 10 vol. % ACN enthielt. Somit betrug das Gesamtvolumen an ACN in der Probe 5 %. Es wurden mehrere Ansätze mit der gleichen Zusammenset-zung hergestellt, jedoch variierte der Hämatokrit des Vollblutanteils zwischen 0,65 und 0,2. All diese Ansätze wurden bei 75°C off-line prozessiert und die Prozessparameter tG, tmax, tmin und theat bestimmt. In Tab. 25 sind die ermittelten Werte der Prozesspara-meter zusammengefasst.

Ansatz Hct der

Gesamtprobe tG [sec] tmax [sec] tmin [sec] theat [sec]

VB:AB-HP:ACN

(50/45/5, v/v/v) 0,325 11 10 2 6

0,280 11 10 2 6

0,250 11 10 2 6

0,200 13 12 2 7

0,150 13 12 2 7

0,100 13 12 2 7

Tab. 25: Prozessparameter einer VB:AB-HP:ACN (50/45/5, v/v/v)-Probe mit

Diese Ergebnisse verdeutlichen nochmals, dass der Hämatokrit einer Probe kaum Ein-fluss auf die Prozessparameter hat, wenn es sich um einen Ansatz handelt, der organi-schen Modifier enthält. Das bedeutet, Proben, die sich aus VB:AB-HP:ACN (50/45/5, v/v/v) zusammensetzen, können unabhängig vom Hämatokrit des Vollblutanteils unter identischen Bedingungen prozessiert werden, ohne der Gefahr, ein Gel zu generieren oder eine unvollständige Desintegration der Erythrozyten zu erlangen.

Der ideale Temperaturbereich zur Hitzeschockbehandlung der Probe ist vom Aceto-nitrilgehalt der Probe abhängig. Je höher der Volumenanteil an organischem Lösemit-tel ist, desto stärker verschiebt sich die optimale Prozessierungstemperatur in den unte-ren Temperaturbereich. Vollblutproben, die 2,5 vol. % Acetonitril enthalten, werden optimal bei Temperaturen zwischen 75 und 80°C prozessiert. Ein idealer Temperatur-bereich zwischen 70 und 75°C ergibt sich für Vollblutproben mit einem Volumenanteil von 5 % Acetonitril. Vollblut, das mit 10 vol. % Acetonitril versetzt ist, wird optimal im Bereich zwischen 60 und 65°C prozessiert.