Mischung und Injektion

Die Misch- und Injektionseinheit setzt sich aus einer 1 mL - Aufziehspritze, einem 6-Wege-Injektionsventil mit integrierter Injektionsschleife (100 µL) und einer Serum-injektionsnadel (45 µL) zusammen. Die Injektionsnadel befindet sich in einer Punk-tiernadel. Bei der Injektionsnadel handelt es sich um eine im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Spezialanfertigung. Die tulpenförmige Öffnung führt zu einer Vergrößer-ung der Apertur. Die Modifikation der Injektionsnadel war notwendig, um den Misch-vorgang der sedimentierten Vollblutprobe zu optimieren. Abb. 43 stellt die modifizier-te (tulpenförmige) und ursprüngliche (Standard) Öffnung der Injektionsnadeln sche-matisch dar.

Abb. 43: Schematische Darstellung der Spitze der verwendeten Injektionsnadeln;

I.D.: Innendurchmesser; A.D.: Aussendurchmesser

6.2.1.1 Aufmischen einer sedimentierten Vollblutprobe

Lässt man eine Vollblutprobe längere Zeit stehen, so sedimentieren die korpuskulären Bestandteile. Somit entsteht ein 2-Phasen-System mit Plasma im Überstand und Blut-zellen als Sediment. Soll eine Vollblutprobe quantitativ analysiert werden, muss sie bei der Injektion ins Analysesystem homogen, d.h. gut gemischt, sein. Das Aufmischen einer sedimentierten Vollblutprobe kann durch die Anwendung eines im Rahmen die-ser Arbeit entwickelten Mischverfahrens realisiert werden. Abb. 44 stellt diesen Vor-gang schematisch dar.

Abb. 44: Schematische Darstellung des Mischvorgangs einer sedimentierten Vollblutprobe unter Anwendung des Probengebers

Das aufzumischende Vollblut befindet sich in einem speziellen Probengefäß, das sich aus einem konventionellen LC-Vial und einem schmalen, konisch geformten, gering-volumigen Einsatz zusammensetzt. Der Mischvorgang beginnt mit dem Aufziehen von Luft in die Injektionsschleife. Die Injektionsnadel taucht dann in das Sediment der

injiziert. Aufgrund des tulpenförmigen Nadeldesigns werden große Luftblasen gene-riert, die sich zudem an die Größe des Einsatzes anpassen, zur Oberfläche wandern und dadurch zu einer sehr effizienten Durchmischung der Probe führen. Die Effizienz des Mischvorgangs lässt sich mit zwei unabhängigen Verfahren bestimmen. Dazu wird ein Aliquot der aufgemischten Probe direkt unterhalb der Schaumkrone entnommen.

Einerseits wird die Erythrozytenanzahl / µL Blut durch Auszählen der Erythrozyten in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Andererseits wird das nach Zugabe von Drab-kin´s Reagenz freigesetzte Hämoglobin photometrisch bei 546 nm bestimmt. Als Refe-renz dient eine durch manuelles Aufschütteln gemischte Probe. Beide Verfahren haben gezeigt, dass das Aufmischen einer sedimentierten Vollblutprobe auf diesem Wege sehr effizient ist.

6.2.1.2 Zugabe des Internen Standards

Das Signal des Detektors und somit die Peakfläche stellen ein Maß für die injizierte Substanz dar; jedoch erlaubt die Peakfläche keine direkte Aussage über die in der Pro-be enthaltene Substanzmenge. Anhand von Standards, d.h. mit ProPro-ben Pro-bekannter Kon-zentration, lassen sich Korrektur- bzw. Responsefaktoren ermitteln, mit denen sich die Peakfläche der Probe in die entsprechenden Substanzmengen umrechnen lassen. Im Idealfall besteht eine lineare Beziehung zwischen dem Detektorsignal und der appli-zierten Substanzmenge. Abweichungen von diesem Verhalten lassen sich durch die Injektion verschiedener Standardkonzentrationen und Erstellung einer Kalibrationsge-rade ermitteln. Bei der KalibriergeKalibrationsge-rade wird die Peakfläche gegen die Standardkon-zentration aufgetragen. Wird der Probe eine bekannte Menge eines Standards zuge-setzt, der sich von der zu analysierenden Substanz unterscheidet und einen zusätzlichen Peak im Chromatogramm erscheinen lässt, spricht man von der internen Standardmethode. Die Quantifizierung der Analyten beruht auf der Ermittlung des

Verhältnisses der Peakflächen des Internen Standards und des entsprechenden Analy-ten¹⁷⁴.

Der Interne Standard muss folgende Eigenschaften haben⁴²:

ƒ Sein Peak muss bei einer Retentionszeit liegen, bei der keine anderen Analyten eluieren

ƒ Sein Peak sollte möglichst nah bei dem Peak des zu untersuchenden Analyten liegen

ƒ Er sollte dem zu untersuchenden Analyten chemisch sehr ähnlich sein

ƒ Seine Anwesenheit in der ursprünglichen Analyse sollte mit Sicherheit ausgeschlossen werden können

ƒ Sein Responsefaktor sollte ähnlich groß sein wie der des zu untersuchenden Analyten

ƒ Er darf, auch bei höheren Temperaturen, keine chemische Reaktion mit einer anderen Komponente des Analysengemisches eingehen.

Die Zugabe des Internen Standards zu Vollblut ist eine Herausforderung. Im Falle der Immunsuppressiva, die in dieser Arbeit als Modellanalyten herangezogen werden, ist festzuhalten, dass sie und ihre Internen Standards aufgrund der stark ausgeprägten Li-pophilie nur in organischen Lösemitteln löslich sind. Die Zugabe eines organischen Lösemittels zu einer nativen Vollblutprobe in größerer Menge zieht eine Fällung der Proteine nach sich. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass sich kleine Volumina von beispielsweise Methanol nur schwer ohne Verlust pipettieren lassen. Eine Möglichkeit, die Konzentrationsschwankung aufgrund eines Pipettierfehlers möglichst gering zu

ternen Standardlösung. Doch wie bereits weiter oben erwähnt, führt die Addition eines großen Volumens an organischem Lösemittel zu einer Fällung der in der Probe enthal-tenen Proteine.

Die Zugabe des Internen Standards zu einer Vollblutprobe ist des Weiteren auf indirek-tem Wege möglich. Dabei wird der Interne Standard zuerst in beispielsweise Methanol gelöst. Diese Lösung wird dann zu Humanplasma der Blutgruppe AB (AB-HP) hinzu-pipettiert. Durch Verwendung von Humanplasma der Blutgruppe AB ist eine Aggluti-nation von Erythrozyten nach Zugabe dieses dotierten Plasmas zu der zu analysieren-den Vollblutprobe ausgeschlossen. Denn das Humanplasma der Blutgruppe AB enthält keine Antikörper gegen die Erythrozyten der Blugruppe A und B¹⁸.

Eine spezielle Software des Symbiosis™ Pharma Systems ermöglicht die Program-mierung des Zusammenpipettierens eines Aliquots der aufgemischten Vollblutprobe und beispielsweise eines Aliquots des mit Internem Standard dotierten Humanplasmas in ein separates Probengefäß mit anschließender quantitativer Vermischung. Auf die-sem eleganten Wege ist es möglich, der zu untersuchenden Vollblutprobe den Internen Standard hinzuzufügen. Die Absolutmenge an hinzugefügtem organischem Lösemittel ist in diesem Falle sehr gering.

Lösemittel wie bespielsweise DMSO sind relativ viskos und lassen sich sehr gut pipet-tieren. Immunsuppressiva und ihre Internen Standards lösen sich gut in DMSO. Aus diesem Grund ist es möglich, der zu untersuchenden Vollblutprobe den in DMSO ge-lösten Internen Standard hinzuzupipettieren. Der verwendete Probengeber ist in der Lage, Volumina bis 1 µL (µL-Pick-up) akkurat zu pipettieren⁴⁹.