Zusammenfassung und Ausblick

Peptidsynthese und Affinitätsuntersuchungen vorgestellt. Als Drittes wird noch die Synthese sowie UV-spektroskopische Untersuchungen eines photoschaltbaren Interkalators beschrieben.

Die Synthese des Peptids PhoB (190-209), das dem DNA-bindenden Epitop des Proteins, der amphiphilen α-Helix α³, entspricht, erfolgte im Syntheseautomaten. Die Modifizierung des Harzes mit anschließender Beladung mit der ersten Aminosäure erwies sich als beste Methode und erlaubt die Synthese C-terminal modifizierter Peptide. Auf diesem Weg wurden alle Peptide für den Ala-Scan und den Arg-Scan synthetisiert.

Diese Peptide wurden auf makroskopischer Ebene in Bindungsstudien mit Oberflächenplasmonresonanz untersucht, sowie auf Eintelmolekülniveau mit Kraftspektroskopie. Die Bindungsstudien mit Oberflächenplasmonresonanz zeigten, daß das für optimale Ergebnisse bei der Kraftspektroskopie gewählte Versuchs-Setup mit einem ziemlich langen DNA-Fragment nicht gut für makroskopische Experimente geeignet ist, da es ein hohes Maß an unspezifischer Bindung erlaubt. Alle gewählten Methoden zur Datenanalyse mit den bei diesem Setup erstellten Konzentrationsreihen weisen einen sehr großen Fehler auf, so daß die Ergebnisse als nicht zuverlässig betrachtet werden können.

Der Arg-Scan ergibt keine verbesserte spezifische Bindung der Peptide an die DNA, allerdings scheint die Assoziation schneller und die Dissoziation langsamer zu verlaufen, was durch eine bessere Assoziation und schnellere Rückbindung an die immobilisierte DNA erklärt werden kann. Dies beruht vermutlich auf einer erhöhten Amphiphilie der DNA-bindenden α-Helix durch die zusätzlich eingeführten basischen Aminosäurereste.

Der Ala-Scan ergibt eine Verbesserung der Bindung des Peptids PhoB(190-209) R193A [E. coli] im Vergleich mit dem Peptid mit der nativen Sequenz PhoB(190-209) [E. coli].

Die anderen Peptide binden mit geringerer Affinität.

Als Ausblick bleibt zum ersten Projekt, den Bindungsstudien von PhoB [E. coli] an der komplementären DNA, zu sagen, daß Messungen mit einem viel kürzeren DNA-Strang, z.B. dem mit der Sequenz, die auch für die Röntgenstrukturanalyse verwendet wurde, mit der Sequenz GAGCTGTCATAAAGTTGTCACGG. Dies Fragment hat nur 23 bp, würde also nur 2 Molekülen Platz zur Bindung geben. Da es außerdem 2 spezifische Bindungsstellen enthält, könnte unspezifische Bindung nahezu ausgeschlossen werden. Die Vergleichbarkeit mit den aus der Kraftspektroskopie erhaltenen Daten ist dann nicht wirklich zulässig, da ein anderes System vermessen wird. Trotzdem sollten diese Messungen Sensogramme liefern, aus denen bei der Datenanalyse brauchbare kinetische

Daten extrahiert werden können. Mit einem so kurzen Fragment sollten auch CD-spektroskopische Untersuchungen zur Konformationsanalyse möglich sein, da der Größenunterschied des Peptids und der DNA nicht mehr so groß ist.

Die kraftspektroskopischen Untersuchungen wurden mit vier ausgewählten Peptiden durchgeführt, von denen das PhoB(190-209) R193A [E. coli] mit höherer Affinität bindet als das mit der nativen Sequenz PhoB(190-209) [E. coli]. PhoB(190-209) H198A [E. coli]

zeigte kaum Bindung, und PhoB(190-209) R203A [E. coli] zeigte so wenige Bindungsereignisse, daß keine statistische Auswertung möglich war. Für die übrigen Peptide ergeben sich für die thermische off-Rate und die molekularen Reaktionslängen die in Tab. 18 dargestellten Ergebnisse.

Tab. 18: Vergleich der aus der dynamischen Kraftspektroskopie erhalten thermischen off-Raten und molekulare Reaktionslängen.

Mutation Peptidsequenz koff / s^-1 xβ / Å - Ac-VEDRTVDVHIRRLRKALEPG-Linker 3.1 ± 2.1 6.8 ± 1.2 R193A Ac-VEDATVDVHIRRLRKALEPG-Linker 0.071 ± 0.053 9.3 ± 2.6 H198A Ac-VEDRTVDVAIRRLRKALEPG-Linker 49.5 ± 21.2 7.2 ± 3.5

Es zeigt sich, daß die Untersuchung auf Einzelmolekülniveau mittels Kraftspektroskopie der Untersuchung der Bindungseigenschaften im Molekülensemble offensichtlich überlegen ist.

Ein weiteres Ziel der Arbeit war das Auffinden des DNA-bindenden Epitops des Transkriptionsaktivators ExpG mittels epitope mapping. Hierzu wurden Peptide synthetisiert, die jeweils 15 Aminosäureresten aus der 194 Aminosäurereste langen Primärsequenz des Proteins entsprechen. Diese überlappen sich um jeweils 10 Aminosäurereste, so daß der gesamte Sequenz-Raum durchgescannt wird. Mit diesen Peptiden wurden Affinitätsuntersuchungen an der zum ExpG komplementären DNA durchgeführt. Dabei wurden nur 6 Peptide gefunden, die überhaupt an die DNA binden.

Aus den Messungen und Analysen der Primärstruktur resultiert der Bereich der Aminosäurereste 131 - 174 als möglicher Bereich für das DNA- bindende Epitop.

Aus der Serie der 20-Peptide mit jeweils 17 überlappenden Aminosäureresten zeigten ExpG(134-153) und ExpG(137-156), signifikante Bindung. Damit wird vorgeschlagen, daß die DNA-bindende Region von ExpG in den Bereich der Aminosäuren 134-153 liegt.

In diesem Epitop liegen 6 basische Reste, es entspricht bei einem Sequenzvergleich mit

MarR einem bei diesem vorhergesagten HTH-Motiv, MarR-C. Für die Zukunft wären vergleichende Bindungsstudien mit dem Protein ExpG und der DNA interessant.

Weiterhin wurde im Rahmen der Dissertation ein photoschaltbarer Bis-Interkalator synthetisiert. Als natürliche Vorlage diente dafür das GC-selektive Triostin A und das AT-selektive TANDEM. In dem mit AzoTANDEM bezeichneten, photoschaltbaren Derivat wurde die Cystin-Einheit durch ein Azobenzolderivat, 4,4’-Diazendiylphenylalanin ersetzt (Abb. 122).

Die Syntheseroute verläuft über mit Chinoxalin modifizierte Tridepsipeptide, die unter Pseudo-Hochverdünnung zuerst an das geschützte, photoschaltbare Azobenzolderivat gekuppelt und anschließend, wiederum unter Pseudo-Hochverdünnung, cyclisiert werden.

Die UV-spektroskopischen Untersuchungen zeigen, daß das Molekül mittels Bestrahlung bei 360 nm reproduzierbar vom trans-Isomer zum cis-Isomer geschaltet werden kann, und daß die Rückschaltung entweder durch Sonnenlicht, oder, allerdings viel langsamer, thermisch erfolgen kann.

N N

NH O

O

O

HN

O

N H O

N O

N

O

NH

O H

H

HN

O O

O N

O H

N N

N N

6

Abb. 122: Struktur des photoschaltbaren Derivates trans-AzoTANDEM

Für die Zukunft wären eine NMR-Konformationsanalyse beider Isomere des AzoTANDEMS interessant, und auch eine Röntgenstrukturanalyse im Komplex mit der DNA. Die Syntheseroute für das AzoTANDEM sollte dahingehend überarbeitet werden, daß noch mehr orthogonale Schutzgruppen verwendet werden. Als N-terminale

Schutzgruppe des Val sollte, wenn möglich, Fmoc nicht benutzt werden, da dessen Abspaltung immer auch einen gewissen Anteil an basenkatalysierter Spaltung der Esterbindung hervorruft. Eventuell würde der Einsatz der leicht hydrogenolytisch abspaltbaren Z-Schutzgruppe die Synthese an dieser Stelle vereinfachen. Die Funktionalisierung des AzoTANDEMs mit einem Linker, um es für Kraftspektroskopie an die Spitze oder auf der Oberfläche zu immobilisieren erscheint schwer möglich, da kaum eine funktionelle Gruppe im Molekül vorhanden ist, die nicht an der Bindung beteiligt ist.

Es könnte jedoch die Bindungsart durch Zugexperimente mit AT-reicher DNA identifiziert werden. Hierzu würde die DNA am einen Strang auf der Oberfläche, mit dem anderen an der Spitze immobilisiert und die Spitze von der Oberfläche entfernt, sowohl nur im Lösungsmittel als auch in Anwesenheit des AzoTANDEMs. Durch die Unterschiede in den erzielten Kraft-Distanz Kurven ließe sich die Bindungsart bestimmen.

Wenn es möglich wäre, während der Messung die Meßzelle mit unterschiedlichen Wellenlängen zu bestrahlen, sollte die Abhängigkeit der Bindung von der Struktur des AzoTANDEMS untersucht werden.