Versuch der Synthese des PhoB(190-209)Linker [S. meliloti] mittels Fragmentkondensation

Um das Problem der Inkompatibilität von His(Trt) in einer Synthese am Safety-Catch-Harz zu umgehen, wurde eine Fragmentkondensation versucht. Hierzu wurde das Epitop aus PhoB [S. meliloti] ausgewählt, VDERTVDVHVGRLRKALNFS, da es an günstiger Stelle mitten in der Sequenz ein achirales Glycin enthält. Die Kupplung an dieser Stelle vermeidet die Möglichkeit einer Razemisierung während der Kupplung. Das N-terminale Fragment VDERTVDVHVG wurde am 2Cl-Trt-Harz synthetisiert, von dem es vollgeschützt abgespalten werden kann, und das C-terminale Fragment RLRKALNFS-Linker wurde am Safety-Catch-Harz synthetisiert. Anschließend sollten beide in Lösung gekuppelt werden.

Val-Asp-Glu-Arg-Thr-Val-Asp-Val-His-Val-Gly-OH6

Zur Synthese des N-terminalen Fragmentes wurde 2Cl-Trt-Harz mit Fmoc-Gly-OH beladen. Die Beladung des 2Cl-Trt-Harz erfolgte nach Quellen des Harzes in DCM mit 4.8 Äquivalenten DIPEA und 1.2 Äquivalenten der entsprechenden Fmoc-geschützten Aminosäure. Anschließend wurde mit DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1) gewaschen, um nicht abreagierte Kupplungspositionen am Harz zu cappen. Die Beladungsbestimmung nach Reinigung und Trocknung ergab eine Beladung von 0.68 mmol/g im Falle des Fmoc-Gly-OH. Der erste Versuch der Synthese erfolgte im Syntheseautomaten, mit 3 Äquivalenten TBTU, 6 Äquivalenten DIPEA und 3 Äquivalenten der jeweiligen Aminosäure. Die Abspaltung erfolgte mit 1% TFA in DCM, wobei das vollständig geschützte Peptid erhalten wurde. Bei der Aufreinigung mittels HPLC treten jedoch die bereits erwähnten Probleme der Hydrophobizität auf, das Produkt konnte erst nach mehreren Läufen von der HPLC-Säule gewaschen werden und war nicht rein.

Arg-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Asn-Phe-Ser-OH 7

Zur Synthese des C-terminalen Fragmentes wurde das Safety-Catch-Harz mit Fmoc-Ser(^tBu)-OH beladen. Die Beladung des Safety-catch-Harzes erfolgte nach Quellen des Harzes in Chloroform mit 5 Äquivalenten DIPEA und 3 Äquivalenten der entsprechenden Fmoc-geschützten Aminosäure bei -20°C unter Zugabe von 3

Äquivalenten PyBOP innerhalb von 8h.^[155] Die Beladungsbestimmung nach Reinigung und Trocknung ergab eine Beladung von 0.43 mmol/g im Falle des Fmoc-Ser(^tBu)-OH.

Die Synthese erfolgte im Syntheseautomaten, mit 3 Äquivalenten TBTU, 6 Äquivalenten DIPEA und 3 Äquivalenten der jeweiligen Aminosäure. Die Aktivierung des Harzes erfolgte unter Lichtausschluß unter Argon in NMP mit 20 Äquivalenten Iodacetonitril und 5 Äquivalenten DIPEA für 24 h. Die Abspaltung erfolgte durch Zugabe von 3 Äquivalenten N-tert-Butoxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctan zum in DMF unter Argon gequollenen Harz. Nach Schütteln über Nacht wurde das Harz abfiltriert und mehrfach mit DCM und DMF gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden zur Trockne eingeengt. Nach der Aufreinigung mittels HPLC konnte kein Produkt mehr isoliert werden.

Der nächste Syntheseversuch für das C-terminale Fragment erfolgte manuell am 2Cl-Trt-Harz 8. Gekuppelt wurde mit 3 Äquivalenten TBTU, 6 Äquivalenten DIPEA und 3 Äquivalenten der jeweiligen Aminosäure. Die Abspaltung der temporären Schutzgruppe erfolgte mit je 2% DBU und Piperidin in DMF für zweimal 15 min. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit HFIP in DCM im Verhältnis 1:4. Die Kupplung soll mit dem Rohprodukt durchgeführt werden.

Die nächste Synthese des C-terminalen Fragments erfolgte wieder automatisch, diesmal jedoch am 2Cl-Trt-Harz 9. Dies bedeutet, daß nach der Kupplung der Fragmente das Peptid C-terminal mit N-tert-Butoxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctan modifiziert werden muß. Die Beladung des 2Cl-Trt-Harzes erfolgte nach Quellen des Harzes in DCM mit 4.8 Äquivalenten DIPEA und 1.2 Äquivalenten der entsprechenden Fmoc-geschützten Aminosäure. Anschließend wurde mit DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1) gewaschen, um nicht abreagierte Kupplungspositionen am Harz zu cappen. Die Beladungsbestimmung nach Reinigung und Trocknung ergab eine Beladung von 1.26 mmol/g im Falle des Fmoc-Ser(^tBu)-OH. Die Synthese erfolgte im Syntheseautomaten mit 3 Äquivalenten TBTU, 6 Äquivalenten DIPEA und 3 Äquivalenten der jeweiligen Aminosäure zur Kupplung und je 2% DBU und Piperidin in DMF zur Abspaltung der temporären Schutzgruppe. Nach der Synthese wurde das Harz aufgeteilt, und das Peptid von der einen Hälfte mit HFIP in DCM im Verhältnis 1:4 abgespalten.

Arg-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Asn-Phe-Ser

10

Es wurde versucht, den C-Terminus dieses Fragments in Lösung mittels 2Cl-TrtCl zu schützen. Hierzu wurde wieder das Rohprodukt eingesetzt, und zu Berechnung der einzusetzenden Menge von 100% Ausbeute ausgegangen. Das Rohprodukt wurde in 2 mL DMF gelöst und 1.2 Äquivalente in 500 µL DMF gelöstes 2Cl-TrtCl sowie 4 Äquivalente DIPEA in 500 µL DMF wurden hinzugegeben. Die Reaktionskontrolle im MALDI-ToF-MS zeigte jedoch auch nach einer Reaktionszeit von mehreren Tagen nicht das gewünschte Produkt, sondern nur noch nicht identifizierbare Fragmente.

Ac-Val-Asp-Glu-Arg-Thr-Val-Asp-Val-His-Val-Gly-Arg-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Asn-Phe-Ser-Linker11

Mit der anderen Hälfte des Harzes wurde versucht, das komplette Peptid am Harz zu synthetisieren 11a. Hierzu wurde das Harz in 500 µL DMF gequollen, das Rohprodukt der manuellen Synthese des N-Terminus in 1750 µL DMF, 1.1 Äquivalente HATU in 1000 µL DMF gelöst und alles mit 2.2 Äquivalenten DIPEA zusammen gegeben. Nach 2 Tagen wurden nochmals 1.1 Äquivalente HATU und 2.2 Äquivalente DIPEA hinzugegeben, trotzdem war kein vollgeschütztes Peptid, sondern nur noch undefinierbare Fragmente im MALDI-ToF-MS zu finden.

Als nächstes wurde das C-terminale Fragment nochmals im Syntheseautomaten synthetisiert, und versucht, es in einem Medium zu lösen, mit dem die HPLC arbeiten kann. Dies geschah in der Hoffnung, daß ein Wechsel der Laufmittel eine Aufreinigung mittels HPLC ermöglicht. Es zeigte sich, daß das vollgeschützte C-terminal Fragment weder in 95 % Wasser, 5 % Acetonitril und 0.1% TFA noch in 95 % Acetonitril, 5 % Wasser und 0.1% TFA, den Standard-Eluenten der RP-HPLC, löslich war. Auch die Verwendung eines 100 mM KH₂PO₄ / NaHPO₄ Phosphatpuffers statt des Wassers änderte dies nicht. Die Zugabe der chaotropen Reagenzien 0.1 mM NaClO₄ oder 6M

Guanidinium·HCl verbesserten die Löslichkeit nicht. Selbst in DMSO war das vollgeschützte Peptid nicht löslich.

Dies läßt vermuten, daß eine Aufreinigung dieses vollgeschützten Fragmentes und vermutlich auch des vollgeschützten kompletten Peptides mittels HPLC nicht möglich ist.

4.1.2.4 Versuch der Synthese des PhoB(190-209) [S. meliloti] am 2Cl-Trt-Harz mit anschließender C-terminaler Funktionalisierung

Nachdem die Synthese am Safety-catch-Harz und die Versuche mit vollgeschützten Fragmenten fehlgeschlagen waren, erfolgte als nächstes der Versuch, das Fragment komplett am 2-Cl-Trt-Harz zu synthetisieren 11b, und es anschließend mit N-tert-Butoxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctan C-terminal zu funktionalisieren. Zu diesem Zweck wurde am mit Fmoc-Ser(^tBu)-OH beladenem 2Cl-Trt-Harz im Syntheseautomaten das vollständige Epitop des PhoB [S. meliloti], VDERTVDVHVGRLRKALNFS, aufgebaut. Die Kupplung erfolgte mit 3 Äquivalenten TBTU, 6 Äquivalenten DIPEA und 3 Äquivalenten der jeweiligen Aminosäure, die Abspaltung mit je 2% DBU und Piperidin in DMF. Es gelang jedoch nicht, das Peptid vollgeschützt vom Harz abzuspalten, weder mit 0,5% oder 1% TFA in DCM, noch mit HFIP in DCM im Verhältnis 1:4. Auch die Trityl-Schutzgruppen am Histidin- und/oder Glutamin-Rest wurden abgespalten, so daß kein vollgeschütztes Peptid zu finden war.

Da auch bei dieser Methode das schlecht lösliche vollgeschützte Peptid aufgearbeitet werden müßte, wurde diese Strategie zu Gunsten der nächsten nicht weiterverfolgt.