Ala-Scan

sich unspezifische Wechselwirkungen mit der DNA getrennt ermitteln lassen. Für die Messung wurde jedesmal für 3 min die Peptidlösung injiziert, und dann 10 min lang die Dissoziation der Peptide von der DNA beobachtet. Die abschließende Regeneration erfolgt mit 0.5 M NaCl und 50 mM NaOH für 15 Sekunden.

Die Messungen mit Flußraten von 5µL / min bis 30 µL / min ergaben keinen Hinweis auf eine Massentransferlimitierung, jedoch zeigte sich später, daß mit noch höheren Flußraten gemessen werden müßte, um den Einfluß der Massentransferlimitierung zu minimieren.

Die folgenden Messungen wurden bei 20 µL / min durchgeführt.

4.1.3.1.4 Bindungsstudien mit den aus dem Alanin-Scan stammenden Peptiden

Für die Messung wurde jedesmal während 3 min die Peptidlösung injiziert, und dann während 10 min die Dissoziation der Peptide von der DNA beobachtet. Die abschließende Regeneration erfolgte mit 0.5 M NaCl und 50 mM NaOH für 15 Sekunden. Für die Bindungsanalyse wurden unterschiedliche Konzentrationen von 2 mM bis 0.001 mM untersucht. Auf der Messzelle waren 2118 RU der komplementären DNA (Sequenz siehe 6.1.3.1), auf der Referenzzelle die entsprechende Menge des pFPR-Fragmentes der EBNA-DNA (Sequenz siehe 6.1.3.3) immobilisiert.

Es zeigt sich, daß das Peptid mit der Sequenz PhoB(190-209) R193A [E. coli] einen höheren ∆RU_max Wert erreicht als das mit der nativen Sequenz PhoB(190-209) [E. coli].

Das Peptid PhoB(190-209) R203A [E. coli] zeigt sogar eine negative Bindung, es scheint an der Referenzzelle besser zu binden als an der Meßzelle. Von den übrigen Peptiden zeigt nur noch PhoB(190-209) R201A eine nennenswerte Bindung, die anderen zeigen keine spezifische Bindung mehr an die DNA (Abb. 54).

Abb. 55: Vergleich der Sensogramme des Peptides PhoB(190-209) R193A [E. coli] im Konzentrationsbereich von 0.05 mM bis 0.25 mM

Ein Beispiel für eine Konzentrationsreihe ist in Abb. 55 für das Peptid PhoB(190-209) R193A [E. coli] zwischen 0.05 mM bis 0.25 mM dargestellt. Der erreichte ∆RU_max-Wert ist eindeutig von der Konzentration abhängig. Bei hohen Konzentrationen sind genug Moleküle vorhanden, um die DNA soweit abzusättigen, daß eine langsamere Zunahme der Response eintritt, bei geringeren nicht, so daß die Assoziationsphase dort noch im Bereich des nahezu linearen Anstiegs der Sättigungskurve ist.

4.1.3.1.5 Datenanalyse

In diesem Kapitel wird die Anwendung verschiedener Methoden zur Gewinnung kinetischer Daten aus den erhaltenen Sensogrammen beschrieben. Zunächst wurden die Meßbedingungen für die SPR so gewählt, daß sie mit denen der Kraftspektroskopie möglichst gut vergleichbar sind. Um die Meßergebnisse vergleichen zu können, wird dasselbe System für die CD-Spektroskopie und die Untersuchungen mittels

Oberflächenplasmonresonanz verwendet. Das komplementäre DNA-Fragment ist mit 360 bp sehr lang, besonders wenn man bedenkt, daß ein Peptidmolekül nur 11 bp bei der Bindung bedeckt. Es ist also eine Vielzahl unspezifischer Bindungen möglich, deren Anzahl die der spezifischen Bindungen übersteigen kann. Dieser Effekt soll über die Differenzbildung mit der Referenzzelle herausgerechnet werden, an die das pFPR Fragment der EBNA-DNA in gleicher Menge immobilisiert ist.

Für eine zuverlässige Analyse mit BIAevaluation^©, der vom Hersteller zum Gerät gelieferten Software, sollte der gemessene RUmax-Wert auf den einzelnen Flußzellen 100 RU nicht überschreiten. Daher ist es praktisch unmöglich, für die spezifischen Wechselwirkungen getrennt kinetische oder thermodynamische Daten zu bestimmen.

All diese Einschränkungen führen dazu, daß die Ergebnisse der Bindungsanalyse der Sensogramm mit Unsicherheit behaftet sind.

Zur Datenanalyse wurde die globale Analyse und die Einzelanalyse mittels BIAevaluation^© verwendet. Außerdem wurde eine Auswertung durch Scatchard Plots^[537]

und einen Fit an eine Sättigungskurve mittels Datafit^© versucht. Auch ein Vergleich der Meßergebnisse der Meßzelle mit denen der Referenzzelle und der aus ihnen mit den vorgenannten Methoden zur Datenanalyse erhaltenen kinetischen Daten wurde versucht.

Alle Versuche, verläßliche kinetische Daten zu erhalten, sind jedoch gescheitert.

4.1.3.1.6 Maßnahmen zur Verbesserungen der Sensogramme

Es wurden verschiedene Maßnahmen ergriffen, um die Qualität der erhaltenen Sensogramme in diesem System zu verbessern.

Als erstes wurden Messungen in einem anderen Puffer durchgeführt, der zwar weiterhin 100mM KH₂PO₄ bei einem pH von 7.4 enthält, dessen NaCl-Gehalt jedoch von 50mM auf 200 mM erhöht wurde. Der höhere NaCl-Gehalt soll durch vermehrte Wechselwirkungen zwischen Na⁺ und DNA die unspezifische Bindung der Peptide an die DNA verringern.

Das grundsätzliche Problem bleibt hierbei jedoch bestehen, da auch weiterhin mit unspezifischer Wechselwirkung zu rechnen ist.

Weiterhin wurden die Gegenionen des Peptids ausgetauscht. Nach der Peptidsynthese liegt das Peptid als TFA-Salz vor, durch Lyophilisation aus verdünnter HCl-Lösung sollte erreicht werden, daß das Peptid nur noch Cl^- als Gegenionen enthält. Dies sollte bewirken, daß mögliche unerwünschte Bulk-Effekte, die durch sprunghafte Änderung des Brechungsindices der Lösung, bedingt durch z.B. Dichteänderungen der Lösung durch das

enthaltene Peptid oder durch vorher nicht vorhandene Ionen, hervorgerufen werden, minimiert werden.

Eine dritte Möglichkeit die Daten zu verbessern, ist eine geringere Beladung der Sensoroberfläche, also eine geringere Immobilisierung von DNA auf den jeweiligen Flußzellen. Dies verhindert sowohl Crowding-Effekte, bei denen zu viele immobilisierte Moleküle vorhanden sind, die sich gegenseitig bei der Bindung behindern, als auch Massentransfer-Effekte, da weniger Bindungspartner auf der Oberfläche vorhanden sind, und aus diesem Grund weniger Moleküle aus der Lösung für Bindungen „verbraucht“

werden. Andererseits vergrößert eine Verringerung der Beladung das Problem des Verhältnisses von unspezifischer zu spezifischer Bindung, das in 4.1.3.1.5 beschrieben wurde, da eine verringerte Beladung auch zu einem verringerten ∆RU_max-Wert führt.

Als letzte Möglichkeit wurde noch eine Erhöhung der Flußgeschwindigkeit auf 50 µL / min vorgenommen. Dies soll mögliche Massentransfereffekte, die im Test auf Massentransfereffekte (4.1.3.1.3) nicht aufgefallen sind, verhindern. Eine drastische Erhöhung der Flußrate wird jedoch durch die Injektionsdauer eingeschränkt, da daß verwendete Gerät nur maximal insgesamt 300 µL injizieren kann. Dies könnte ein Grund dafür sein, daß die Auswertung über den Scatchard Plot und die Analyse mittels Datafit^© keine brauchbaren Ergebnisse liefert. Es konnte keine Messung bis zum Gleichgewicht durchgeführt werden, da nur ein gewisses Volumen maximal injiziert werden kann, und damit in keinem der untersuchten Flußraten / Injektionsdauer / Konzentrationsbereich – Systeme das Gleichgewicht erreicht wurde, die DNA erschien nie abgesättigt.

Für erneute Messungen wurden auf den Flußzellen jeweils ca. 120 RU immobilisiert, als Puffer wird ein Phosphatpuffer mit 100 mM KH₂PO₄ und 200 mM NaCl mit einem pH von 7.4 verwendet.

Als erstes zeigt sich, daß der erreichte ∆RU_max-Wert mit ca. 440 RU eine ähnliche Größenordnung erreicht wie bei den ersten Messungen im anderen Puffer mit der höheren Beladung der Flußzellen, dort waren es ca. 380 RU. Auch ein Vergleich der Sensogramme der einzelnen Flußzellen zeigt, daß ähnliche ∆RUmax-Werte im Bereich von 4100 RU für die Meßzelle im Vergleich zu ca. 4500 RU bei der ersten Messung und 3700 RU im Vergleich zu ca. 4100 RU unter den alten Bedingungen. Die geringere Beladung führt wie erwartet zu insgesamt etwas niedrigeren Werten für die RUmax-Werte. Die Assoziationsphase zeigt nun zu Beginn keinen steilen Anstieg mehr, so daß anscheinend vorhandene Bulk-Effekte tatsächlich durch den Austausch des Gegenions vermindert werden konnten. Die Kurve des Differenz-Sensogrammes zeigt zu Beginn negative

∆RU_max-Werte. Das Peptid scheint zuerst schneller an die Referenz-DNA zu binden, erst nach ungefähr 130 Sekunden ist die Bindung an die komplementäre DNA größer. Dies könnte mit einer Massentransferlimitierung erklärt werden. Die Lösung läuft nicht gleichzeitig über beide Zellen, sondern zuerst über die Referenzzelle, anschließend über die Meßzelle. Wenn nun die DNA auf der Referenzzelle einen großen Teil der in Lösung befindlichen Peptidmoleküle „wegfängt“, ist die Konzentration der Lösung beim Fluß durch die Meßzelle geringer, und die Assoziation erfolgt dementsprechend langsamer. Erst wenn die Referenz-DNA mit Bindungspartner abgesättigt ist, stände dann die volle Konzentration für die Bindung an die komplementäre DNA zur Verfügung. Bei den ersten Messungen konnte dieser Effekt vermutlich deswegen nicht beobachtet werden, weil die Assoziationsphase durch den Bulk-Effekt dominiert wurde.

4.1.3.2 Bindungsstudien mit den verschieden N- und C-terminal modifizierten Peptiden

Zur Untersuchung des Einflusses der N- und C-terminalen Modifikation mit einer Acetyl-Gruppe und dem Linker wurden vier Peptide synthetisiert, die beide, keine und nur jeweils eine Modifikation enthalten. Durch Bindungsstudien mittels der Oberflächenplasmonresonanz soll dann untersucht werden, welchen Einfluß die Modifikationen auf die Bindungseigenschaften der Peptide haben.

Die Bindungsstudien mit den Peptiden mit den unterschiedlichen N- und C-terminalen Modifikationen wurden bei einem Fluß von 20 µL / min über 5 Minuten durchgeführt, die Regeneration der Flußzellen erfolgte mit 0.5% SDS im Puffer für eine Minute wiederum bei einer Flußrate von 20 µL / min. Als Puffer wurde ein Phosphatpuffer mit 100 mM KH₂PO₄ und 50 mM NaCl mit einem pH von 7.4 verwendet. Zur Untersuchung wurde auf einem Biacore SA-Chip über die Streptavidin/Biotin-Bindung auf der Meßzelle das entsprechende DNA-Fragment (Sequenz 6.1.3.1) immobilisiert, auf der Referenzzelle das pFPR-Fragment der EBNA-DNA (Sequenz 6.1.3.3). Da eine quantitative Auswertung aufgrund der in 4.1.3.1.5 genannten Gründe nicht sinnvoll erscheint, erfolgt nur eine qualitative Betrachtung der erhaltenen Sensogramme.