Zusammenfassende Darstellung und Ausblick

Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten Hinweise liefern, dass TGF-β Entwicklungsprozesse des embryonalen Vorderhirns beeinflussen kann. Konkret wurde eine Hemmung der Proliferation und eine vermehrte neuronale Differenzierung nach neurogenen Zellteilungen von kultivierten Progenitoren des embryonalen Vorderhirns beobachtet.

Die Identität einiger der in dieser Arbeit identifizierten TGF-β-Zielgene unterstützen diese Beobachtung. In Abbildung 33 sind diese Zielgenregulationen, zugeordnet zu den Zelltypen in denen sie vermutlich überwiegend stattfinden, und ihre mögliche Funktionen schematisch dargestellt. So kam es in den Progenitoren zu einer Regulation von Zellzykluskontrollgenen wie p21, p57 und CyclinD1/2, die zum Zellzyklusarrest der Progenitoren beitragen. Darüber hinaus waren in den Progenitoren und/oder jungen Neuronen Gene induziert, die bekanntermaßen differenzierungsfördernd wirken können. Dazu gehörten Nedd9, Gata2, Tle3 und Runx1 sowie die Reduzierung des inhibitorisch auf die Differenzierung wirkenden Faktors Id3.

Für Nedd9 konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der TGF-β-abhängigen Expressionssteigerung dieses Gens und der Induktion der Neurogenese gefunden werden, da der shRNA vermittelte Verlust der Nedd9-Expression die vermehrte Differenzierung von Neuronen durch TGF-β verhinderte. Ein zweiter Hinweis ergab sich daraus, dass Nedd9 nicht in cortikalen Kulturen aus E14,5 Embryonen durch TGF-β induzierbar war und diese Kulturen auf TGF-β auch nicht mit einer vermehrten neuronalen Differenzierung reagierten, wie es in den Kulturen von E16,5 Embryonen der Fall war. In adulten Mäusen wurde dagegen ebenfalls eine Induktion von Nedd9 nach Verletzungen des Gehirns beschrieben, die mit der vermehrten Generierung neuer Neurone korrelierte (Sasaki et al., 2005). Nedd9 könnte also ein Zell-intrinsischer Faktor sein, der das unterschiedliche Antwortverhalten von Progenitoren des Stadiums E14,5 gegenüber späteren Stadien erklärt.

Ein positiver Effekt von TGF-β auf die Differenzierung von Neuronen ist auch bei der Entwicklung von dopaminergen Neuronen des Mittelhirns beschrieben worden (Roussa et al., 2006). Hier führte die Behandlung von kultivierten Progenitoren des ventralen und dorsalen Mittelhirns aus E12,5 Mäuseembryonen mit TGF-β zur Generierung von dopaminergen Neuronen. In Einklang damit war die Entwicklung dopaminerger Neurone in TGF-β2/TGF-β3 Doppelmutanten an E14,5 gestört (Roussa et al., 2006). Welche molekularen Mechanismen zu diesem Effekt führen, konnte allerdings noch nicht gezeigt

werden. Daher wäre ein zukünftiges Ziel, zu überprüfen, ob Nedd9 auch in diesem Kontext eine Rolle spielt.

Aufgrund der Tatsache, dass TGF-β nicht nur die Genexpression der Progenitoren, sondern auch die der Astrozyten und Neurone beeinflussen kann, deuten sich, neben der in dieser Arbeit beobachteten differenzierungsfördernden Wirkung auf Progenitoren zu Neuronen, noch weitere Funktionen von TGF-β an (Abbildung 33). Über die Regulation der ECM-Moleküle, insbesondere der Integrine, TenascinC und auch des Fokal-Adhäsionsproteins Nedd9, könnte TGF-β migrationsfördernde Eigenschaften ausüben, wofür bereits Hinweise aus Experimenten in cortikalen Schnittkulturen existieren (Siegenthaler und Miller, 2004).

Auch Auswirkungen auf die Entwicklung postmitotischer Neurone, wie z.B. die Beeinflussung von Dendritenwachstum oder Synapsenbildung durch Notch- und Wnt-Signale und Deltex1 wären denkbar. Diese möglichen Funktionen müssten in weiteren Studien überprüft werden.

In den verschiedenen Zelltypen des Vorderhirns, wie Progenitoren, Neuronen und Astrozyten scheinen die intrazellulären Signalkaskaden von TGF-β zu differieren, da unterschiedliche Gene reguliert werden und somit unterschiedliche Signalwege beeinflusst werden. Dabei spielen Zell-intrinsische Faktoren eine Rolle, wie die Zusammensetzung bestimmter transkriptioneller Co-Faktoren, aber auch die Intergration zahlreicher anderer Signale, die von außen auf die Zelle einwirken. Da Progenitoren, Astrozyten und Neurone mit einem unterschiedlichen Repertoire an Rezeptoren und internen Mediatoren für solche Signale ausgestattet sind, die sich auch in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium der Zelle noch ändern können, kann es zu Zelltyp- und Entwicklungsstadien-spezifischen Interaktionen der verschiedenen Signalwege kommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Cross-talk von TGF-β mit Notch- und Wnt-Signalwegen festgestellt. Durch die Fähigkeit von TGF-β, mit diesen in der Entwicklung sehr bedeutsamen Signalwegen zu interagieren, ergibt sich ein erheblich vergrößertes Potential von genau aufeinander abgestimmten Antworten der Zelle in ihren jeweiligen temporalen und spatialen Kontext. Dabei schien TGF-β auch innerhalb dieser Signalwege sehr differentiell einzugreifen, da im Fall von Notch nur bestimmte Notch-Liganden (Notch2 und 3) induziert wurden und auch innerhalb der Familie der Wnt-Proteine kam es zu Induktionen oder Repressionen verschiedener Wnt-Familienmitglieder. Diese Regulationen könnten ebenso bei TGF-β vermittelten Entwicklungsprozessen von Progenitoren des Vorderhirns von Bedeutung sein bzw. posmitotische Entwicklungsprozesse betreffen. Die genaue Bedeutung konnte jedoch noch nicht geklärt werden. Für eine mehr detaillierte Untersuchung der Bedeutung dieses Cross-talks wäre eine höhere zeitlich und räumliche Auflösung der verschiedenen Genexpressionen nötig, um sequentielle Wirkungen der entsprechenden Faktoren mit fortschreitender Entwicklung zu erfassen.

Durch die getroffene Vorauswahl der überprüften Zielgen-Kandidaten auf der Basis von Microarray-Studien in nicht-neuronalen Zellen, konnten in dieser Arbeit mit Sicherheit noch nicht alle durch TGF-β beeinflussten Gene erfasst werden. Im Hinblick auf den neurogenen Effekt von TGF-β wäre daher insbesondere die Expressionsanalyse der die für die neuronale Entwicklung wichtigen proneuralen und neuronalen bHLH Faktoren interessant (s. Kapitel 1.2.2).

Abbildung 33: Zusammenfassende Darstellung der TGF-β-Zielgenregulationen in den verschiedenen Zelltypen der hippokampalen Kulturen und ihre möglichen Funktionen

Durch die Induktion der Zellzyklusinhibitoren p21 und p57 sowie die Reduktion der Cycline D1und D2 bewirkt TGF-β einen Austritt der Progenitoren aus dem Zellzyklus. Die Regulationen weiterer Faktoren in Progenitoren und jungen Neuronen bzw. deren Übergangsstadien, welche bekanntermaßen in die neuronale Differenzierung

involviert sind wie Nedd9, Gata2, Runx1, Id3 und Tle3 unterstützen die beobachtete vermehrte Neurogenese in hippokampalen und cortikalen Kulturen nach TGF-β-Behandlung. Die Regulation von Molekülen der extrazellulären Matrix, die im Fall der Intergrine α3 und α5 vermutlich in Progenitoren und/oder Neuronen stattfindet und im Fall von Ctgf, Timp3 und TenascinC übewiegend in Astrozyten, sowie ebenfalls von Nedd9, könnten an Prozessen der Migration neuronaler Zellen beteiligt sein. Über die Beeinflussung von Notch-und Wnt-Signalen in Progenitoren und Neuronen könnte TGF-β einerseits ebenfalls in die Entwicklung von Progenitoren eingreifen, aber auch in postmitotischen Neuonen Prozesse wie Synapsenbildung oder Dendritenwachstum steuern. Daneben kam es zur Regulation von Faktoren, die TGF-β-Signale selbst wieder beeinflussen können, wie Smad7, Igf2r und Fstl3.

Hochregulation des Gens; Herabregulation des Gens