TGF-β fördert die Neurogenese von hippokampalen und cortikalen

Um die Auswirkungen einer exogenen Stimulation mit TGF-β auf die Entwicklung cortikaler und hippokampaler Neurone zu untersuchen, wurden die dissoziierten Kulturen ab dem zweiten Kultivierungstag mit 5 ng/ml TGF-β1 behandelt und für weitere sechs Tage in Kultur gehalten. Anschließend wurden die Zellen fixiert und die Expression von Markern für Neurone, Gliazellen und Progenitoren immunzytochemisch detektiert und quantifiziert. Als neuronale Marker wurden HuC/D und NeuN verwendet. Gliazellen wurden über Antikörper gegen GFAP identifiziert und Progenitoren im Hippokampus und Cortex über Nestin-spezifische Antikörper sowie im Cortex zusätzlich über einen gegen Pax6 gerichteten Antikörper. In Abbildung 18 sind beispielhaft die hippokampalen (A) und cortikalen (B) Kulturen aus E16,5 Embryonen mit den genannten Immunfärbungen und einer DAPI-Kernfärbung dargestellt.

Die quantitative Auswertung ergab, dass die TGF-β behandelten Hippokampus-Kulturen (Abbildung 18 C) gegenüber den unbehandelten Kontrollen einen um 34% gesteigerten Anteil HuC/D-positive Neurone (Kontrolle: 58,83% ± 1,19 ; TGF-β: 79,05% ± 1,59, n=7) beinhalteten. Die Auszählung des zweiten neuronalen Markers NeuN lieferte ein gleichwertiges Ergebnis mit einer 37%igen Steigerung der Neuronenzahl (Kontrolle: 51,10%

± 3,20; TGF-β: 69,93% ± 2,08, n=4).

Die Anzahl GFAP-positiver Astrozyten war dagegen unverändert (Kontrolle: 17,57% ± 1,69;

TGF-β: 16,88% ± 1,74, n=4). Gleichzeitig mit der Zunahme an differenzierten Neuronen konnte eine Abnahme der Nestin-positiven Progenitoren beobachtet werden, deren Anteil sich um 31% reduzierte (Kontrolle: 27,94% ± 0,17; TGF-β: 19,29% ± 0,59, n=3).

Vergleichbare Resultate zeigten sich ebenso in den Cortex-Kulturen aus E16,5 Embryonen (Abbildung 18 D). Hier führte die Behandlung mit TGF-β zu 27% mehr HuC/D-positiven

(Kontrolle: 62,52% ± 2,07; TGF-β: 79,52% ± 1,02, n=6) und NeuN-positiven (Kontrolle:

62,97% ± 2,56; TGF-β: 80,35% ± 0,48, n=4) Neuronen.

Die Menge an Astrozyten war gleichermaßen unverändert (Kontrolle: 5,55% ± 0,29; TGF-β:

4,64% ± 0,18, n=3) und auch die Reduzierung der Progenitoren bestätigte sich. So waren Nestin-positive Zellen um fast 47% ( Kontrolle: 24,77% ± 1,47; TGF-β : 13,03% ± 0,55, n=3) und Pax6-positive Zellen um 32% (Kontrolle: 15,51% ± 1,51; TGF-β: 10,55% ± 0,46, n=4) vermindert.

Abbildung 18: TGF-β fördert die Neurogenese von hippokampalen und cortikalen Progenitoren

(A) und (B) Verteilung von Neuronen visualisiert durch immunzytochemische Darstellung von HuC/D und NeuN, Progenitoren markiert durch Nestin und Pax6 sowie von GFAP-positiven Astrozyten nach sechs Tagen TGF-β-Behandlung in hippokampalen (A) und cortikalen (B) Kulturen.

(C) und (D) Quantitative Auswertung der immunzytochemischen Analyse neuronaler, glialer und progenitorspezifischer Markerproteine in hippokampalen und cortikalen Kulturen nach sechstägiger Behandlung mit 5 ng/ml TGF-β1. Hippokampale (C) und cortikale (D) Kulturen zeigen eine Zunahme an Neuronen,

repräsentiert durch HuC/D und NeuN exprimierende Zellen sowie eine Abnahme von Nestin- bzw. Pax6-positiven Vorläuferzellen. Der Anteil GFAP-positiver Astrozyten ändert sich nicht. Die Werte geben den prozentualen Anteil bezogen auf die Gesamtzellzahl an. Die Daten wurden aus n voneinander unabhängigen Experimenten erhoben und sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Zur Überprüfung der statistischen Signifikanz wurde der t-Test verwendet ( ∗∗ P < 0,01; ∗∗∗ P < 0,001; n.s.: nicht signifikant).

Um zu testen, ob der Effekt auf die Bildung von Neuronen durch die Inhibition des TGF-β-Rezeptor Typ I blockiert werden kann, wurden hippokampale Kulturen zusätzlich zu TGF-β allein auch in Kombination mit dem ALK4,5,7-Inhibitor SB431542 (10 μM) behandelt.

Dadurch kam es zu keiner Steigerung der HuC/D-positiven Neuronenzahl mehr (Abbildung 19).

Abbildung 19: Inhibition des TGF-β-Signalweges durch den ALK4,5,7-Inhibitor SB431542 verhindert die vermehrte Generierung von Neuronen durch TGF-β

Die Graphik zeigt den Anteil HuC/D-positiver Neurone nach sechstägiger Behandlung mit TGF-β1 (5 ng/ml) und SB431542 (10 μM) bzw. der unbehandelten Kontrolle. Die Balken repräsentieren den Mittelwert aus n=3 unabhängigen Experimenten

± SEM (Kontrolle: 57,5% ± 0,59; TGF-β + SB431542:

54,54% ± 1,05).

3.3.1.1 Abhängigkeit der β induzierten Neurogenese von der TGF-β-Isoform

Da TGF-β1, welches in den vorangegangenen Experimenten zur Stimulation verwendet wurde, in vivo überwiegend in mesenchymalen Zellen exprimiert wird und TGF-β2 und 3 die eigentlich in neuronalen Zellen vorherrschenden Isoformen sind (Flanders et al., 1991;

Pelton et al., 1991), wurde überprüft, ob auch diese Isoformen in der Lage sind, die Neurogenese zu induzieren. In Abbildung 20 sind die Ergebnisse der Behandlung von hippokampalen Kulturen mit 5 ng/ml TGF-β 2 bzw. 3 dargestellt. Es zeigte sich, dass sowohl TGF-β2 als auch TGF-β3 zu einer gleichfalls um etwa. 34% vermehrten Generierung Hu C/D positiver Neurone führten (Kontrolle: 57,5% ± 0,59; TGF-β2: 77,0% ± 0,67; TGF-β3: 76,14%

± 0,70, n=3). Daher wurde in allen folgenden Experimenten weiterhin TGF-β1 verwendet.

Abbildung 20: Die Induktion der Neurogenese ist nicht abhängig von der TGF-β-Isoform

Die Balken stellen den Anteil HuC/D positiver Neurone nach sechstägiger Behandlung mit TGF-β2 und TGF-β3 (5 ng/ml) dar. Es ist der Mittelwert ± SEM aus n=3 unabhängigen Experimenten angegeben(Kontrolle: 57,5% ± 0,59; TGF-β2: 77,0%

± 0,67; TGF-β3: 76,14% ± 0,70, n=3). Zur Überprüfung der statistischen Signifikanz wurde der t-Test verwendet (∗∗∗ P < 0,001).

3.3.1.2 Abhängigkeit der TGF-β induzierten Neurogenese vom Zeitpunkt und der Dauer der TGF-β-Behandlung

Um herauszustellen, ob die TGF-β induzierte Neurogenese abhängig von der Länge des TGF-β-Pulses ist, wurden hippokampale Kulturen an DIV2 für 24 Stunden mit TGF-β behandelt und anschließend bis DIV8 weiterkultiviert, bevor die Menge HuC/D-positiver Neurone quantifiziert wurde (Abbildung 21, 2). Dieser 24-stündige TGF-β-Puls war ausreichend, um eine Steigerung der Neuronenanzahl um 33,74% ± 2,39 zu erzielen. Des Weiteren wurde untersucht, welche Zeitspanne zwischen Behandlungsbeginn und Sichtbarwerden des Effektes nötig ist. Dazu wurden die Kulturen erst ab DIV5 mit TGF-β behandelt und nach drei Tagen Behandlungsdauer an DIV8 analysiert (3). Hier konnte zwar ebenfalls eine Steigerung der Neuronenzahl beobachtet werden, die aber mit 11,69% ± 0,92 deutlicher schwächer ausgeprägt war. Wurde dagegen ab DIV5 wieder für sechs Tage mit TGF-β behandelt und an DIV11 analysiert (4), erreichte die Zunahme 44,14% ± 1,14. Auch hier war der 24-stündige, anfängliche Puls ausreichend und die Steigerungsrate des Neuronenanteils betrug hier 47,86% ± 4,22 (5). Die beiden letztgenannten Ergebnisse zeigen außerdem, dass die Kulturen zu einem späteren Zeitpunkt ihrer Entwicklung in der Kultur auf die Behandlung mit TGF-β sogar noch mit einer stärkeren Steigerung der Neuronengeneration reagieren. Um dies noch näher zu betrachten, wurde der Startpunkt der Behandlung um drei weitere Tage auf DIV8 verschoben und die Kulturen wiederum entweder für weitere sechs Tage bis DIV14 unter ständigem TGF-β-Einfluss gehalten (6) oder nur für 24 Stunden behandelt und anschließend bis DIV14 kultiviert (7). Auch hier war ein Anstieg der Neuronenpopulation zu erkennen, die Steigerungsrate vergrößerte sich mit 31,70% ± 2,25 bzw. 28,22% ± 1,19 jedoch nicht weiter, sondern sank vielmehr wieder etwas ab. Dies

ist dadurch zu erklären, dass unter den gegebenen Kulturbedingungen die Progenitoren auch spontan ausdifferenzieren und somit der Pool an zur Verfügung stehenden Vorläuferzellen, die auf TGF-β reagieren können, an DIV8 bereits wieder reduziert ist. Nach fünf Tagen Kultivierung scheint dagegen der Anteil an TGF-β responsiven Progenitoren am größten zu sein.

Abbildung 21: Behandlungsschema zur Untersuchung des Einflusses von Zeitpunkt und Dauer der TGF-β-Behandlung

Auf der linken Seite ist jeweils der Start- und Endpunkt der TGF-β-Behandlung dargestellt sowie die Länge der Kultivierungsperiode während bzw. nach dem TGF-β-Puls in Tagen. Die Balken rechts zeigen die korrespondierende prozentuale Steigerungsrate der HuC/D-positiven Neurone, jeweils in Bezug auf die unbehandelten Kontrollen. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben (n=3). (1) 34,33% ± 2,67; (2) 33,74%

± 2,39; (3) 11,69% ± 0,92; (4) 44,14% ± 1,14; (5) 47,86% ± 4,22; (6) 31,70% ± 2,25; (7) 28,22% ± 1,19

3.3.1.3 Abhängigkeit der TGF-β induzierten Neurogenese von der Smad-Aktivität

Da einer großer Teil der TGF-β-Signaltransduktion über die Aktivierung von Smad-Proteinen vermittelt wird, sollte untersucht werden, ob die TGF-β induzierte Neurogenese in hippokampalen und cortikalen Zellen ebenfalls abhängig von einer Aktivierung der Smad-Signalkaskade ist. Zu diesem Zweck wurde die gegen Smad4 gerichtete shRNA verwendet.

Da die virale Transduktion der Zellen und das Wirksamwerden der shRNAs einige Tage in Anspruch nimmt, wurde hier das Behandlungsschema Nr.4 aus Abbildung 21 (DIV5 bis

DIV11) verwendet. Als Negativkontrolle diente eine shRNA, deren Sequenz keine Homologie im Mausgenom besitzt, aber zum Anschalten der RNAi-Maschinerie führt (Non-Target-shRNA Control). Diese beeinträchtigte die TGF-β induzierte Neurogenese nicht (Abbildung 22). In Kulturen, die mit der Smad4 shRNA infiziert wurden, kam es dagegen zu keinem Anstieg der Neuronenpopulation mehr. Aus diesem Experiment kann daher geschlossen werden, dass die TGF-β vermittelte Neurogenese über den Smad-Signalweg verläuft.

Abbildung 22: Der shRNA vermittelte Knock-down der Smad-Aktivierung verhindert die TGF-β induzierte Neurogenese

Quantifizierung der HuC/D-positiven Neurone in hippokampalen (A) und cortikalen (B) Kulturen nach lentiviraler Transduktion einer gegen Smad4 gerichteten shRNA bzw. einer Non-target Kontroll-shRNA mit und ohne TGF-β-Behandlung. Es ist der Mittelwert ± SEM aus n=3 unabhängigen Experimenten angegeben. Zur Überprüfung der statistischen Signifikanz wurde der t-Test verwendet (∗∗∗ P < 0,001).