Typs II auf die Regulation von TGF-β-Zielgenen
4 DISKUSSION
4.4 TGF-β beeinflusst die Proliferation, Differenzierung und Morphologie neuraler
Aus früheren Studien war bekannt, dass TGF-β die Entwicklung des cerebralen Cortex beeinflussen kann. TGF-β1-Knock-out Mäuse weisen einen dünneren cerebralen Cortex auf (Brionne et al., 2003). Obwohl die Autoren dieser Studie eine vermehrte Apoptose von TGF-β (-/-) Neuronen festgestellt haben, geben die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise darauf, dass auch ein Defekt während der Neurogenese zu dem Verlust von Neuronen führen könnte. Siegenthaler und Miller (2005) zeigten in organotypischen Hirnschnittkulturen des Cortex von E17,5 Ratten, dass TGF-β den Austritt aus dem Zellzyklus von Progenitoren der cortikalen Ventrikularzone fördert und dass dies mit einer Beeinflussung von Zellzyklusregulatoren verbunden ist. Als Schlüsselmolekül wurde hier p21Cip1
herausgestellt, dessen Expression nach TGF-β-Behandlung anstieg. Frühere Studien an Foxg1-Knock-out Mäusen berichteten ebenfalls von einem Zusammenhang zwischen der TGF-β-Signalaktivität und der p21Cip1 Expression. Der Vorderhirn-spezifische Transkriptionsfaktor Foxg1 wirkt als Gegenspieler der TGF-β-Aktivität (Dou et al., 2000;
Rodriguez et al., 2001). In Foxg1-defizienten Mäusen kommt es, vermutlich durch eine ungehemmte TGF-β-Aktivität, zu einer verstärkten Expression von p21 und einem damit verbundenen verfrühten Austritt aus dem Zellzyklus von Progenitoren der Ventrikularzone (Seoane et al., 2004).
Auch in den in dieser Arbeit verwendeten hippokampalen Kulturen konnte eine Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen durch TGF-β beobachtet werden. In jungen hippokampalen Kulturen kam es nach TGF-β-Behandlung zu einer transienten Expressionssteigerung der Zellzyklusinhibitoren p21Cip1 und p57Kip1 und gleichzeitig zu einer Reduktion der Cycline D1 und D2, die für eine Progression des Zellzyklus wichtig sind.
Wie in Kapitel 1.1.8 beschrieben, bewirkt die vermehrte Expression dieser Zellzyklusinhibitoren durch Interaktionen mit CDKs eine Arretierung des Zellzyklus in der G1-Phase (Massague et al., 2000; Reynisdottir et al., 1995).
Der Austritt der neuronalen Progenitoren aus dem Zellzyklus, ist zwar eine notwendige Voraussetzung auf dem Weg zur Generierung von Neuronen, aber allein noch nicht ausreichend. Die Überexpression von p21Cip1 und p57Kip1 im Cortex von E14,5 Mäuseembryonen durch in utero Elektroporation belegt zwar den antiproliferativen Effekt von p21Cip1 auf cortikale Progenitoren, führt jedoch nicht zu vermehrter neuronaler Differenzierung (Nguyen et al., 2006). Die TGF-β vermittelte Induktion der Neurogenese muss daher noch durch andere Signale reguliert werden.
In dieser Arbeit konnten Hinweise gefunden werden, dass TGF-β seine Auswirkungen auf die Progenitoren nicht nur durch ein einfaches Arretieren des Zellzyklus entfaltet und sie daraufhin differenzieren, sondern sie vielmehr in einen Status versetzt, in dem sie neurogene Zellteilungen durchlaufen. Diese Vermutung wird durch die Ergebnisse des Experimentes zur Bestimmung des Zellzyklusaustritts der Progenitoren unterstützt. In diesem Experiment waren die Kulturen zunächst für 24 Stunden mit TGF-β behandelt worden und danach erfolgte für weitere 24 Stunden zusätzlich die Applikation von BrdU. Während dieser Zeitspanne war der Anteil der BrdU inkorporierenden Progenitoren in den TGF-β behandelten und unbehandelten Kulturen noch gleich. Wie aus dem Experiment des kumulativen BrdU-Markierens hervorging, benötigte das vollständige Markieren aller proliferativen Progenitoren mit BrdU etwa 17 Stunden. Das bedeutet, dass die Proliferation noch bis etwa 40 Stunden nach Beginn der TGF-β-Behandlung unverändert gegenüber der Kontrolle war. Erst 48 Stunden nach der Behandlung mit TGF-β konnte der Austritt der Progenitoren aus dem Zellzyklus durch die Reduzierung der Ki67/BrdU- doppelt-positiven
Zellen beobachtet werden. Diese Zeitspanne umfasst die Dauer von ein bis zwei Zellzyklen, dessen Länge in den cortikalen Kulturen durch kumulative BrdU-Markierung auf etwa 18 Stunden bestimmt wurde. Während dieser Zeit durchlaufen die Progenitoren vermutlich neurogene Zellteilungen und treten dann nach Verlassen des Zellzyklus in die neuronale Differenzierung ein. Die Bestimmung der quitting fraction zeigte, dass nach TGF-β-Behandlung mehr als die Hälfte der zuvor proliferativen Progenitoren aus dem Zellzyklus austrat, nämlich in den hippokampalen Kulturen 56% und in den cortikalen Kulturen 68%.
Das lässt zusätzlich die Schlussfolgerung zu, dass es sich, vor allem in den cortikalen Kulturen, auch um symmetrisch-neurogene Zellteilungen handelt, da der Pool an proliferativen Progenitoren stark abnimmt.
Dass sich TGF-β neben der Vermittlung des Zellzyklusarrests weitreichender auf die Progenitoren auswirkt, kann durch die Beobachtung untermauert werden, dass eine TGF-β- Behandlung zu morphologischen Veränderungen in Nestin-positiven Progenitoren führt.
Große, flach ausgebreitete Nestin-positive Vorläuferzellen wandeln sich innerhalb der ersten 48 Stunden der TGF-β-Behandlung zu schmalen Zellen mit oft bidirektionalen, dünnen Fortsätzen um. Diese Zellen sind, ebenso wie die flachen Zellen der unbehandelten Kulturen, noch stark proliferativ aktiv, was ein weiteres Indiz für die Hypothese ist, dass der durch die TGF-β-Behandlung eingeleitete Prozess der Neurogenese mit weiteren neurogenen Teilungen der Progenitoren verbunden ist. Diese schmalen Zellen in den TGF-β behandelten Kulturen zeigen auch im Gegensatz zu den flach ausgebreiteten Zellen der Kontrollgrupen häufiger eine Co-Lokalisation mit PSA-NCAM, einem Marker der von neuronal spezifizierten Progenitoren exprimiert wird, oder auch zu einem geringeren Anteil mit GFAP, einem Marker von glialen Zellen bzw. Progenitoren des Typs der Radialglia. Diese Zellen scheinen daher einen anderen, möglicherweise weiter in der Differenzierung fortgeschrittenen, Vorläuferzelltyp darzustellen. Dies könnte dann der Zelltyp sein, der durch eine letzte (symmetrisch)-neurogene Zellteilung zu der erhöhten Produktion von Neuronen beiträgt.
72 Stunden nach Beginn der TGF-β-Behandlung wurde die Steigerung der Neuronenzahl in den TGF-β behandelten Kulturen evident, betrug zu diesem Zeitpunkt aber noch weniger als 12%. Nach weiteren 72 Stunden konnte schließlich eine Steigerung der Neuronenzahl um 34% beobachtet werden. Dieser Zeitverlauf war unabhängig davon, ob TGF-β während des gesamten Zeitraums oder nur in einer initialen Phase von 24 Stunden anwesend war. Der anfängliche, 24-stündige TGF-β-Puls war ausreichend, um den Prozess der Neurogenese auszulösen. Das spricht dafür, dass TGF-β über die Regulation von stromabwärts gelegenen Zielgenen Signalkaskaden aktiviert, die zu der beschriebenen Umwandlung der Progenitoren und zur Vollendung der neuronalen Differenzierung führt.
Hinweise, um welche Faktoren es sich dabei handeln könnte, lieferten die Resultate der Suche nach möglichen TGF-β-Zielgenen. Neben den bereits erwähnten Zellzyklusregulatoren wurden weitere durch TGF-β regulierte Zielgene identifiziert, die bekanntermaßen eine Funktion bei der Generierung und Differenzierung von Neuronen besitzen. Diese Zielgene wurden bereits im vorangegangenen Kapitel eingehend besprochen. Aufgrund der bekannten Funktionen wurden Ctgf, Gata2, Runx1 und Nedd9 für eine nähere Betrachtung hinsichtlich ihrer Beteiligung an der TGF-β induzierten Neurogenese ausgewählt. Während für Ctgf, Gata2 und Runx1 keine direkte Beteiligung an diesem Prozess nachgewiesen werden konnte, führte die siRNA vermittelte Reduktion von Nedd9 zu einem Verlust des neurogenen Potentials des TGF-β-Signalweges.