TGF-β reguliert die Expression von Molekülen involviert in die Differenzierung

Unter den weiteren identifizierten Zielgenen befinden sich einige Transkriptionsfaktoren und Signalmoleküle, die für die Differenzierung neuronaler Zellen von besonderer Bedeutung sind. Dazu gehören das GATA-binding protein 2 (Gata2), der Inhibitor of differentiation 3 (Id3) und das Neuronal precursor cell expressed developmentally downregulated gene 9 (Nedd9).

Gata-Transkriptionsfaktoren sind in Vertebraten eine Gruppe von sechs Zinkfinger-Proteinen (Gata1 bis 6), die an die (T/A)GATA(G/A) Konsensus-Sequenz binden und eine bedeutende Rolle bei der Differenzierung und Proliferation von Zellen spielen (Lowry und Atchley, 2000).

Gata2, 3, 4 und 6 werden in unterschiedlichen Arealen des ZNS exprimiert, während Gata1 und Gata5 nicht im ZNS vorkommen. Transgene Mäuse mit einer homozygoten Gata2-Deletion sterben um den Embryonaltag E10,5 bis E11,5 aufgrund einer ausbleibenden Hämatopoese (Tsai et al., 1994). Diese Embryonen weisen auch einen schwerwiegenden Defekt in der frühen Neurogenese auf (Nardelli et al., 1999). Ein spezifisches und entwicklungsabhängiges Expressionsmuster von Gata2 konnte in neuronalen Zelltypen gezeigt werden. Im Rhombencephalon von Mäuseembryonen wird Gata2 mRNA im Entwicklungsstadium E9 im Rhombomer 4 und temporär im Rhombomer 2 exprimiert (Pata et al., 1999; Nardelli et al., 1999). Zwischen den Tagen E9,5 und E11,5 ist Gata2 in verschiedenen Bereichen mit früher neuronaler Differenzierung aktiv, z.B. im Bulbus olfactorius, im Prätektum, im Nucleus oculomotorius des Mittelhirns und in der Bodenplatte des Mittelhirns (Nardelli et al., 1999; Zhou et al., 2000). In Einklang mit diesen Expressionsdaten belegen weitere Studien eine Beteiligung von Gata2 an der Differenzierung vieler Neuronentypen des ZNS, wie z.B. an der Differenzierung cranialer Nerven des ventralen Rhombencephalons und Rückenmarks (Nardelli et al., 1999; Pata et al., 1999) sowie an Moto- und V2-Interneuronen des Rückenmarks (Karunaratne et al., 2002;

Zhou et al., 2000). Gata2 ist ebenfalls für die Entwicklung serotonerger Neurone relevant (Craven et al., 2004). Außerdem inhibiert es die Proliferation neuronaler Progenitoren des Rückenmarks in vivo und neuroepithelialer Progenitoren in vitro (El Wakil et al., 2006).

In der vorliegenden Arbeit war Gata2 sowohl in den jungen als auch in den reifen hippokampalen Kulturen bereits nach zwei Stunden TGF-β-Behandlung hochreguliert.

Während in den jungen Kulturen das Expressionslevel nach fortgesetzter TGF-β-Behandlung wieder stark abfiel und sogar deutlich unterhalb des Kontrollniveaus blieb, zeigten die reifen Kulturen eine anhaltend erhöhte Expression. Die Induktion von Gata2 könnte also in Einklang mit den beschriebenen Funktionen ein Faktor sein, der die differenzierungsfördernde Wirkung auf die Progenitoren in den hippokampalen Kulturen ausübt. Deshalb wurden die Konsequenzen eines shRNA vermittelten Verlustes von Gata2 auf den TGF-β induzierten neurogenen Effekt in den hippokampalen Kulturen im Weiteren noch näher untersucht. Die TGF-β vermittelte Steigerung der Neuronenzahl fand jedoch auch nach dem Ausschalten der Gata2-Expression statt, sodass ein direkter Zusammenhang zwischen gesteigerter Neurogenese und induzierter Gata2-Expression nicht bestätigt werden konnte.

Die Familienmitglieder der Id-Proteine sind strukturverwandt mit basic helix loop helix (bHLH) Transkriptionsfaktoren. Sie besitzen ebenso eine HLH-Domäne, es fehlt ihnen jedoch die basische DNA-Bindungsdomäne. Über die HLH-Domäne können sie an andere bHLH- Proteine wie z.B. E2-2 und E47 binden, die darauf hin nicht mehr die DNA kontaktieren können. Somit stellen die Id-Proteine Inhibitoren für die bHLH vermittelte Transkription dar (Benezra et al.,1990). In Säugern existieren vier Mitglieder der Id-Familie (Id1 bis Id4). Im Nervensystem ist für die Id-Proteine vor allem eine inhibierende Wirkung auf die Differenzierung von Neuronen beschrieben worden (Lyden et al., 1999; Tzeng et al., 2003), da sie die Funktion von neurogenen bHLH-Transkriptionsfaktoren hemmen. Id-Proteine werden in neuronalen Vorläuferzellen exprimiert und im Zuge des neuronalen Differenzierungsprogramms findet eine Reduzierung der Id-Expression statt, die nötig ist, um die inhibierende Wirkung der Id-Proteine auf die proneuralen Gene aufzuheben (Jögi et al., 2002). In epithelialen Zellen konnte bereits gezeigt werden, dass TGF-β die Expression von Id2 und Id3 unterdrücken kann und dass diese Repression für den wachstumshemmenden und differenzierungsfördernden Effekt von TGF-β auf diese Zellen verantwortlich ist (Kowanetz et al., 2004).

Eine TGF-β-abhängige Reduzierung der Id3-Expression konnte auch in den in dieser Arbeit verwendeten Hippokampuskulturen beobachtet werden, die in jungen Kulturen nach 24-stündiger TGF-β-Behandlung auftrat. Reife Kulturen zeigten dagegen keine Expressionsänderungen von Id3 mehr, was darauf hindeutet, dass hier vor allem Progenitoren und/oder junge postmitotische Zellen von der Id3-Reduktion betroffen sind. Der beobachtete proliferationshemmende und differenzierungsfördernde Effekt von TGF-β auf die Progenitoren in hippokampalen und cortikalen Kulturen könnte also unter anderem durch die Repression von Id3 und der damit verbundenen Aufhebung der Inhibierung proneuraler Gentranskription vermittelt werden. Um die Notwendigkeit der Id3-Repression im Rahmen der TGF-β induzierten Neurogenese zu belegen, könnte man die Auswirkungen einer Id3-Überexpression untersuchen.

Nedd9 ist ein zytoplasmatisches Gerüstprotein des β1-Integrin Signalweges und ist besonders an den fokalen Adhäsionsstellen lokalisiert (O’Neill et al., 2000).

Nedd9 ist ursprünglich im embryonalen Gehirn als Gen identifiziert worden, dessen Expression mit fortschreitender Entwicklung herabreguliert wird (Kumar et al., 1992). Dabei ist die Expression von Nedd9 hauptsächlich auf Progenitoren beschränkt und die Verminderung der Expression findet statt, wenn die Zellen in die neuronale Differenzierung eintreten (Aquino et al., 2008). Im adulten Gehirn ist dann die Nedd9 Expression normalerweise nicht mehr zu detektieren, wird aber nach cerebraler Ischämie in Neuronen reaktiviert und hat dort vermutlich eine Funktion bei der Differenzierung neuer Neurone

(Sasaki et al., 2005). Hinweise auf eine Funktion von Nedd9 bei der Entwicklung von Neuronen stammen auch aus in vitro Experimenten, wo Nedd9 das Neuritenwachstum in PC12 Zellen fördern kann (Sasaki et al., 2005). Darüber hinaus sind Mutationen im Nedd9-Gen mit einem verstärkten Auftreten der Alzheimerschen und Parkinsonschen Erkrankung in Verbindung gebracht worden (Chapuis et al., 2008).

In den hippokampalen Kulturen war Nedd9 nach TGF-β-Stimulation sowohl in den jungen, als auch in den reifen Kulturen kurz- und langfristig hochreguliert. Auch für dieses Gen wurde die Beteiligung am Prozess der TGF-β induzierten Neurogenese durch shRNA vermitteltem Knock-down der Genexpression näher untersucht. Die Reduktion der Nedd9-Expression führte zu einem Verlust des neurogenen Potentials von TGF-β. Die möglichen Funktionen von Nedd9 im Rahmen der TGF-β induzierten Neurogenese werden in Kapitel 4.5 eingehender diskutiert.

4.1.3 TGF-β reguliert die Expression von Molekülen, die ihrerseits auf