3 Material und Methoden
3.3 Zellkultur
Für die angereicherte Motoneuronen-Zellkultur wurden drei bis vier Eier am Bebrütungstag 6 (E6) verwendet. Die gesamte Präparation erfolgte unter sterilen Bedingungen und eisgekühlt in HBSS (PAA). Als Kulturmedium wurde wie zuvor S4-Medium verwendet, dem aber diesmal 20% konditioniertes Medium (KM) zugesetzt wurde. Das KM wurde durch eine Mischkultur aus dissoziierten Hühnchen-Rückenmarkszellen des Bebrütungstages 14 (E14) gewonnen.
Hierzu wurde das Rückenmark, wie bereits für die Gewebekultur (siehe 3.2.1) beschrieben, entnommen. Anschließend wurde das Gewebe in einem 14 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner) bei 50 x g für 2 Minuten bei 4°C zentrifugiert und enzymatisch mit 1 ml 0,05% Trypsin III + 0,02% EDTA (Sigma) + 1 ml 0,1% DNAse I (Serva) für 17 Minuten bei 37°C dissoziiert. Die Reaktion wurde anschließend mit DMEM (Dulbeccos Modificated Eagles Medium, Gibco) + 10% FCS gestoppt. Nach 2 min Zentrifugation bei 80 x g und 4°C wurde der Überstand bis auf 1 ml über dem Pellet abgenommen. Mit drei rund geschmolzenen Pasteurpipetten (Brand) unterschiedlicher Durchmesser erfolgte behutsam die mechanische Dissoziierung. Anschließend wurden die
Kapitel 3 Material / Methoden
Nach einer Kultivierungszeit von 7 Tagen bei 5% CO2 und 37°C in einem Inkubator (Haereus) wurde das gesamte Medium abgenommen, bei 5000 x g für 2 min zentrifugiert, sterilfiltriert und in Portionen von 2 ml bei –20°C bis zur Verwendung in der Zellkultur gelagert.
3.3.1 Präparation
Für die Motoneuronen-Zellkultur wurden die Eier, wie unter 3.2.1 beschrieben, präpariert.
Die Dissektion und Motoneuronen-Anreicherung des Rückenmarks-Gewebes erfolgte nach dem modifizierten Protokoll 3 von Henderson und Mitarbeitern (1995). In einer frisch vorbereiteten Gewebekulturschale mit eisgekühltem HBSS wurden die Embryonen mit der Wirbelsäule nach oben platziert und der Spinalkanal mit einer abgerundeten Pinzette von rostral nach caudal eröffnet (Abb. 3-1).
Abb. 3-1: Eröffnung des Rückenmarks eines Hühnchenembryos am E6. A) Der Embryo wird mit dem Rücken nach oben platziert. B) Der Zentralkanal wird mit einer Pinzette eröffnet. C) Das Rückenmark wird aus dem Spinalkanal befreit (schematisch nach Henderson, in Cohen & Wilkin, 1995, S. 76).
Kapitel 3 Material / Methoden
Die auseinander klaffenden Flügel des Rückenmarks wurden dann mit einer polierten Pinzette von den Meningen gelöst, vorsichtig aus dem Wirbelkanal abgehoben und in ein 14 ml Zentrifugenröhrchen mit eiskaltem HBSS überführt.
Die enzymatische und mechanische Dissoziierung des Gewebes wurde in gleicher Weise durchgeführt, wie sie zuvor für die E14-Mischkultur (siehe 3.3) beschrieben wurde. Zur Anreicherung der Zellkultur wurden der Zellsuspension anschließend noch einmal 800 µl DMEM + 10% FCS zugegeben und die Lösung nach erneuter Resuspension über 2 ml 6,8% Metrizamid- (Sigma) in HBSS-Lösung geschichtet ohne die beiden Phasen zu vermischen. Die Dichtezentrifugation erfolgte für 15 min bei 500 x g und 4°C. Danach zeigten sich zwei gut getrennte Phasen, an deren Grenzschicht eine deutliche Trübung mit einer Anhäufung von α-Motoneuronen zu finden war (Abb. 3-2).
Abb. 3-2: Überschichtung von 6,8% Metrizamid mit Zellsuspension. A) Vor der Dichtezentrifugation erkennt man zwei deutlich voneinander getrennte Phasen. B) Nach der Dichtezentrifugation sieht man in der Grenzschicht der zwei Phasen eine Ansammlung von Zellen.
Der Überstand wurde verworfen, die Grenzschicht behutsam abgehoben und in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführt. Auch die darunter liegende Metrizamid-Schicht, eine Gliamisch-Suspension, wurde verworfen. Die Motoneuronen wurde anschließend mit DMEM + 10% FCS aufgefüllt und bei 80 x g 20 min zentrifugiert um die Metrizamidreste abzutrennen.
15 min 500 x g Zellfragmente 6.8%
Zellsuspension
Metrizamid Astrozyten
Motoneurone
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Die Zellen wurden anschließend gezählt und in einer Dichte von 3-4 x 106 Zellen/ml in 4-Well-Platten (Greiner) auf Glas Deckgläschen (15 mm, Assistent) ausgesät (siehe 3.2.2).
3.3.2 Kultivierung
Die Motoneuronen-Kultur wurde in einem Inkubator bei 5% CO2 und 37°C gehalten.
Motoneurone benötigen 12– bis 18-Stunden zur Adhäsion und dürfen in dieser Zeit nicht bewegt werden. Abgelöste Motoneurone sterben ab. 18 Stunden nach der Präparation erfolgte der erste Medienwechsel um Zellfragmente und nicht adhärierte Zellen aus der Kultur zu entfernen. 22 und 48 Stunden nach Präparation erfolgte dann die photographische Dokumentation (Axiovision, Carl Zeiss). Am Ende der Dokumentation wurden die Zellen mit 5% PFA fixiert und zur Färbung vorbereitet. Die angereicherte Primärkultur wurde mit dem Motoneuron spezifischen Anti-ChAT-Antikörper (Ziege, polyklonaler AK, Chemicon) in einer Verdünnung von 1:80 mit Blockpuffer und einem Anti-Schaf/Ziege Zweitantikörper (Fitc konjugiertes IgG, Serotec) in einer Verdünnung von 1:100 sowie mit dem für Astrozyten spezifischen Anti-GFAP (Anti-Maus-GFAP monoklonaler AK Klon G-A-5, Sigma) in einer Verdünnung von 1:400 und dem 2.
Antikörper (Ziege–Anti-Maus-IgG Rhod-Red XM konjugiert, Jackson Immuno Research) bei einer Verdünnung von 1:100, wie für die Gewebekultur in 3.2.7 beschrieben, gefärbt um den Anreicherungsgrad mit Motoneuronen dokumentieren zu können.
3.3.3 Quantifizierung
Es wurden ausschließlich die Daten der α-Motoneuron-Zellkulturen mit einem Mindestreinheitsgrad von ≥90% verwendet.
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3.3.3.1 Protektions-Test
Für die Zellzählungen nach βH-Kristallingabe (bovin, Sigma) wurden die 4-Well-Platten der Zellkultur mit einem 25 mm2 großen Messquadrat versehen. Das Kristallin wurde nicht (Kontrolle) für 18 Stunden (einmalige induktive Applikation) oder kontinuierlich für den gesamten Zeitraum (zweite Applikation mit erstem Mediumwechsel nach 18 Stunden) verabreicht und jedes Experiment sechsmal wiederholt. 20 und 40 Stunden nach Aussaat wurden die verbliebenen Zellen, die ein oder mehr Fortsätze (mit einer Länge gleich dem doppelten Somadurchmesser) ausgebildet hatten, als vital bewertet und direkt unter dem Mikroskop mit einem "Zellcounter" gezählt.
3.3.3.2 Neurotrophie Test
Mit dem Kulturmedium wurde für die Neuritenlängen-Messung direkt nach Präparation für die ersten 18 Stunden der Kultivierung eine Konzentration von 50 ng/ml Q204EβB1, βH-bovin sowie wtβB1 verabreicht. Als Kontrolle wurde sowohl S4-Medium + 20% KM (unbehandelte Kontrolle), als auch 50 ng/ml BSA (Sigma) bzw. 17,4 µg/ml Anti-βH-bovin-Antikörper verwendet. Die Verabreichung erfolgte identisch zur einmaligen induktiven Applikation mit dem Kulturmedium für 18 Stunden (siehe 3.3.3.1). Jedes Experiment wurde 2- bis 3-mal wiederholt.
Ausgewertet wurden nur Zellen, deren Neuriten nach 48 Stunden frei endeten und die mindestens einen Neuriten hatten, der eine Länge von 100 µm und mehr erreichte. Alle Zellen, bei denen nach 48 Stunden noch immer kein Neurit eine Länge von mindestens 100 µm erreicht hatte, wurden als beschädigt/abgestorben bewertet.
Von den als vital bewerteten Zellen wurden 48 Stunden nach Präparation jeweils mindestens 25 Zellen/Well mit einer digitalen Mikroskopkamera (AxioCam, Zeiss) in den Computer eingelesen und mit Hilfe einer Bildbearbeitungssoftware (Axiovision, Zeiss)
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3.3.4 Antigen-Antikörper Wirkung
3.3.4.1 Westernblot-AnalyseDer einzig erhältliche Antikörper für βH-Kristallin war der polyklonale bovine Anti-Antikörper (Biogenesis). Um den Anti-Antikörper für ein Blockierungs-Experiment an βH-Kristallinen verschiedener Spezies (Huhn, Ratte, Rind) und am humanen, rekombinanten βB1-Kristallin zu testen, wurde eine Westernblot-Analyse durchgeführt. Zunächst wurden verschiedene Konzentrationen der Probensubstanzen für die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) vorbereitet. Als Probensubstanzen dienten im 1. Westernblot 8 Augenlinsen vom E12 Hühnchen, 1 Augenlinse der adulten Ratte und 500 µg/ml βH-bovin. Für den 2. Westernblot wurden die humanen, rekombinanten βB1-Kristalline wtβB1, Q204EβB1 und N157DβB1 sowie als Referenz die HPLC-Fraktion βH-Ratte verwendet.
Die SDS-PAGE dient der charakteristischen Auftrennung von Proteinen aufgrund ihres Molekulargewichtes. Zur SDS-PAGE wurde eine 10fach Laufpufferstammlösung aus 250 mM Tris (Roth), 1,92 M Glycin, 0,1% SDS (Laurylsulfat, Sigma) und 0,02% NaN3 sowie Probenpuffer aus 130 mM Tris/HCL pH 6,8; 10% SDS, 10% β-Mercaptoehtanol (Sigma), Bromphenolblau (Sigma) und 20% Glycerin (Merck) hergestellt. Ein 14%iges Acrylamid-Gel wurde in die Elektrophoreseapparatur (Mini Protean, Biorad) gesetzt und ohne Blasenbildung mit ca. 150 ml 1fach Laufpuffer umspült. Anschließend wurden die Kämme behutsam aus dem Sammelgel gezogen, so dass gleichmäßige Geltaschen für die Probenlösungen entstanden. Die Probenlösungen wurden im Verhältnis 1:3 mit dem Probenpuffer gemischt und für 5 min im Thermoblock (BT 200, Kleinfeld) bei 95°C denaturiert, gevortext und kurz anzentrifugiert (5415C-Tischzentrifuge, Eppendorf).
Nach Beladung des Sammelgels mit dem Probenpuffer (Proteinmenge etwa 30 µg pro Geltasche) wurde mit Hilfe des „Power Pac“ (3000, Bio Rad) eine Spannung von 100 Volt an das Gel angelegt, bis die Bromphenolblaufront in das Trenngel überging und schließlich auf 200 Volt erhöht. Die Auftrennung war abgeschlossen, als die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht hatte. Für die anschließende Westernblot-Analyse mittels „Tank-Blotting“ wurde das Gel aus der Elektrophoreseapparatur ausgespannt und für 10 min in Transferpuffer gelegt.
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Der Transferpuffer bestand aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 20% Methanol.
Gleichzeitig wurden 2 Whatmanpapierstücke und eine Nitrozellulosemembran (ECL RPN 303D, Hybond) zugeschnitten und ebenfalls in Transferpuffer getränkt.
Anschließend wurde ein „Sandwich“ aus Schwammtuch, Whatmanpapier, Nitrozellulosemembran, SDS-Gel, Whatmanpapier und Schwammtuch zusammen gefügt und in ein Plexiglasgitter eingespannt. Zur Vermeidung von Luftblasen, die das „Blotten“
behindert hätten, wurde das gepackte Sandwich mehrmals sanft mit einer Pasteurpipette überrollt. Anschließend wurde das Eisfach und die Kassette mit der Nitrozellulose in Richtung Anode und Gel in Richtung Kathode eingesetzt und eine Spannung von 80 Volt für 1 Stunde angelegt.
Zum Blocken unspezifischer Bindungsstellen wurde eine Magermilchemulsion aus 5%
Magermilchpulver (Merck) in TBS-T (Tris-Buffered Saline-Tween) unter langsamen Rühren hergestellt. Der Blockpuffer TBS-T bestand aus 20 mM Tris/HCL pH 7,6; 137 mM NaCl und 0,1% Tween-20 (polyoxyethylensorbitan-monolaurat, Fluka).
Nach Entnahme der Nitrozellulosemembran aus dem „Tank-Blotting“ wurde diese zunächst für eine Stunde bei Raumtemperatur in der Magermilchemulsion geblockt und anschließend 1 x 15 min und 3 x 5 min in TBS-T gewaschen. Da die Bindungseigenschaft des Anti-βH-bovin bei den verschiedenen Probensubstanzen getestet werden sollte, wurde dieser Antikörper in einer TBS-T Verdünnung 1:1000 eingesetzt und über Nacht bei 4°C mit der Nitrozellulosemembran inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte 1 x 15 min und 3 x 5 min Waschen in TBS-T.
Der Zweit-Antikörper Esel-Anti-Schaf-Peroxidase (Jackson Immuno Research) wurde in einer TBS-T Verdünnung 1:50000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 x 15 und 3 x 5 min in TBS-T gewaschen. Zur Detektion wurde ECL (Enhanced Chemoluminescence Kit, Amersham) verwendet. Dabei wurden ECL 1 und ECL 2 im Verhältnis 1:1 vermischt und für 1 min mit der Nitrozellulosemembran inkubiert.
Anschließend wurde diese mit Hilfe von Haushaltsfolie auf einer trockenen Glasplatte
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3.3.4.2 Antikörper-Blocktest
Es wurden zunächst 17,4 µg/ml βH-Antikörper mit rekombinantem wtβB1 1- bis 2-Stunden bei Raumtemperatur präinkubiert und anschließend mit dem Kultivierungsmedium auf die frisch präparierten Motoneurone gebracht. 18 Stunden nach Präparation erfolgte nach 2maligem gründlichen Waschen in HBSS der erste Medienwechsel mit Kultivierungsmedium ohne Antikörper oder Kristallin-Zusatz. Als Kontrolle dienten Applikationen von wtβB1-, βH-Kristallin und BSA. 48 Stunden nach Präparation wurden die Zellen, wie in 3.3.3.2 beschrieben, aufgezeichnet und ihre Neuritenlängen bestimmt.