In vitro Studie zur neurotrophen Wirkung des Augenlinsen-Proteins BetaH-Kristallin auf Motoneurone des embryonalen Hühnchens (Gallus gallus)

Volltext

(1)In vitro Studie zur neurotrophen Wirkung des Augenlinsen-Proteins BetaH-Kristallin auf Motoneurone des embryonalen Hühnchens (Gallus gallus). Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -. dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen vorgelegt. von Petra Ahmann. Bremen 2003.

(2) Abstract Crystallins are water soluble proteins expressed abundantly in the eye lens, where their cell-protective function is known. These proteins are also consistently expressed in neurons, but their role remains obscure. In the first part of this study, it was examined whether different HPLC-fractions of lenticular crystallins exert an increase of neurite outgrowth in the organotypically cultured spinal cord. Next, different concentrations of HPLC-fractionated lens proteins from the rat were compared to the neurotrophic factors NGF, CNTF and NT-4. It was shown here that all mammalian crystallins promote an increase in neurite outgrowth of spinal neurites in vitro. The α- and βH-crystallin fractions had the greatest maximal neurotrophic effect of all the crystallins and their effect was comparable to NGF and NT-4 in organotypic chick spinal cord culture. In the second part of this study the βH-crystallin was tested on dissociated spinal motor neurons while it was applied to primary and metrizamide enriched motor neuron single cell culture. βH-crystallin promoted a direct increase of neurite length in motor neurons without involvement of microglia or macrophages. In the third part of this study it was determined if βB1-crystallin, a dominant subunit of βHcrystallin, showed a similar effect. Motor neurons in single cell culture were treated with recombinant human wildtype βB1-crystallin and it was found, that wildtype βB1-crystallin alone exerted the same growth promoting effect as the whole βH-crystallin fraction. Like βH-crystallin this effect was specific and can be totally blocked by anti-βH-crystallin antibodies (two-sided student’s t-test, unpaired comparison for means, P<=0.001). This specific effect may lead to a high affinity receptor coupled mechanism. Additional experiments with the deamidation mutant Q204E βB1-crystallin indicates an involvement into the neurotrophic effect by components of the β/γ-crystallin main domain which known for calcium binding properties, too. In this facts, βH- and βB1-crystallin could be able to support functional regeneration after spinal cord injury and possible be part of coming therapies to cure paralysis.. Key words: crystallin; neurite outgrowth; neurite length, in vitro; motor neurons.

(3) Gutachter:. Prof. Dr. Andreas Kreiter, Bremen Prof. Dr. Dr. Solon Thanos, Münster. Tag des öffentlichen Kolloquiums: 20.11.3003. ii.

(4) Für meine Familie, die mir das Leben gab und das unersättliche Interesse an ihm weckte. Für meine Freunde Irina, Astrid, Arndt und Sabine, die mit mir die schönsten Dinge des Lebens teilen. Und ganz besonders für meinen besten Freund Dieter, der mir für die wirklich wichtigen Dinge im Leben die Augen geöffnet hat.. iii.

(5) ˆT w|áxtáx à{tà vtÇÇÉà ux àÜxtàxwÂ Xwã|Ç fÅ|à{ fâÜz|vtÄ ctÑçÜâá? DJCC UAVA. „Regeneration does not take place in the nervous centers.“ Santiago Ramon y Cajal, 1933. „.,... when it may be possible to find substances that by exciting the neurons would promote the regenerative tendency to a degree hitherto unknown,...“ Francesco Tello, 1935. „It looks like one hell of a job – but one that might well be possible” J. Nash & A.. Pini, 1996. iv.

(6) Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................8 1 Einleitung.................................................................................................................9 1.1 Regeneration des ZNS „... does not take place...“? ................................................9 2 Wissenschaftliche Grundlage .............................................................................12 2.1 Traumatische Rückenmarkverletzung ...................................................................12 2.2 Tiermodell Gallus gallus.........................................................................................14 2.2.1 Anatomie des Rückenmarks bei Mensch und Huhn.........................................15 2.2.2 Embryonale Zell- und Gewebekultur des Huhns ..............................................18 2.3 Neurotrophe Faktoren............................................................................................19 2.4 Die Kristalline der Mammalia .................................................................................21 2.4.1 α-Kristallin..........................................................................................................21 2.4.2 βγ-Kristallin ........................................................................................................22 2.5 Arbeitsvorhaben .....................................................................................................24 3 Material und Methoden.........................................................................................25 3.1 Herkunft der neurotrophen Faktoren .....................................................................25 3.2 Gewebekultur .........................................................................................................26 3.2.1 Präparation ........................................................................................................26 3.2.2 Kultivierung ........................................................................................................27 3.2.3 Vorversuch mit Linsenhomogenat.....................................................................27 3.2.4 Pharmakodynamik.............................................................................................28 3.2.5 Antikörper-Blocktest ..........................................................................................28 3.2.6 Retrograde Färbung ..........................................................................................29 3.2.7 Immunhistochemie der Gewebekultur...............................................................29 3.3 Zellkultur.................................................................................................................30 3.3.1 Präparation ........................................................................................................31 5.

(7) 3.3.2 Kultivierung ........................................................................................................33 3.3.3 Quantifizierung ..................................................................................................33 3.3.3.1 Protektions-Test ...............................................................................................34 3.3.3.2 Neurotrophie Test.............................................................................................34 3.3.4 Antigen-Antikörper Wirkung ..............................................................................35 3.3.4.1 Westernblot-Analyse ........................................................................................35 3.3.4.2 Antikörper-Blocktest .........................................................................................37 3.5 Statistik ...................................................................................................................37 4 Ergebnisse.............................................................................................................38 4.1 βH-Kristallin als neurotropher Faktor .....................................................................38 4.1.1 E12-Gewebekultur.............................................................................................38 4.1.2 Neurotrophe Wirkung des Kristallins.................................................................38 4.1.3 Wachstumsfaktoren im Vergleich......................................................................43 4.1.4 Blockierung der βH-Kristallin Aktivität ...............................................................45 4.2 Zielzellen für βH-Kristallin ......................................................................................47 4.2.1 Charakterisierung der Zielzellen........................................................................47 4.2.2 α-Motoneuron Anreicherungszellkultur .............................................................49 4.2.3 βH-Kristallin in Einzelzellkultur ..........................................................................51 4.2.3.1 Protektions-Test ...............................................................................................51 4.2.3.2 Neurotrophie Test.............................................................................................51 4.3 Rekombinantes βB1-Kristallin des Menschen .......................................................53 4.3.1 Neurotrophe Wirkung des βB1-Kristallins .........................................................53 4.3.2 Antikörperblock bei wtβB1-Kristallin ..................................................................54 4.3.3 Neurotrophe Wirkung der Hauptdomäne von βB1-Kristallin.............................56 5 Diskussion .............................................................................................................58 5.1 βH-Kristallin in der Gewebekultur ..........................................................................58 6.

(8) 5.1.1 Neurotrophe Wirkung des Kristallins.................................................................58 5.1.2 Block der βH-Kristallin-Aktivität .........................................................................67 5.2 βH-Kristallin in der Einzelzellkultur.........................................................................67 5.2.1 Neuroprotektion .................................................................................................68 5.2.2 Neurotrophie......................................................................................................69 5.3 Rekombinantes βB1-Kristallin................................................................................69 5.3.1 Antikörperblock bei wtβB1-Kristallins ................................................................71 5.3.2 Neurotrophe Wirkung der Hauptdomäne von βB1-Kristallin.............................72 5.4 Überlegungen zum möglichen neurotrophen Mechanismus.................................76 5.4.1 Rezeptorvermittelte Wirkung ...............................................................................76 5.4.2 Intrazelluläre Wirkung..........................................................................................79 6 Zusammenfassung ...............................................................................................83 7 Danksagung...........................................................................................................85 8 Literatur..................................................................................................................86 9 Curriculum vitae....................................................................................................94 9.1 Wissenschaftliche Veröffentlichungen....................................................................95 9.1.1 Poster ................................................................................................................95 9.1.2 Wissenschaftliche Zeitschriften .........................................................................95. 7.

(9) Abkürzungsverzeichnis •. AS – Aminosäure. •. βA1-A4 – Beta Acidophilic Crystallin Typ 1 - 4. •. βB1- B3 – Beta Basophilic Crystallin Typ 1 - 3. •. βH – Beta High Organised Fraction. •. βL – Beta Low Organised Fraction. •. CNTF – Ciliary Neurotrophic Factor. •. DNS - Desoxyribonukleinsäure. •. DMEM – Dulbeccos Modificated Eagles Medium. •. FCS – Fetales Calf Serum. •. GFAP – Glial Fibrilliaric Acidic Protein. •. sHSP – Small Heat Shock Proteins. •. MN - Motoneurone. •. NF – Neurofilament. •. NGF – Nerve Growth Factor. •. NT – Neurotropher Faktor. •. PBS – Phosphat Buffered Saline. •. PKC – Proteinkinase C. •. PNS – Periphernervensystem. •. RGZ – Retinale Ganglienzellen. •. S4 – Serumfreies Medium No. 4. •. SMPI - Streptomyces Metalloproteinase Inhibitor. 8.

(10) Kapitel 1 Einleitung. 1 Einleitung 1.1 Regeneration des ZNS „… does not take place…“? Verletzungen des Zentralnervensystems (ZNS) beim Menschen sind nicht heilbar. Dies belegen bereits antike medizinische Dokumente wie das ägyptische „Edwin Smith Surgical Papyrus“ aus dem 17. Jahrhundert v. Chr., in dem Art und Verlauf von 48 SchädelHirntraumen und Rückenmarkverletzungen ausführlich beschrieben werden (Breasted, 1930). Rund dreieinhalbtausend Jahre lang konnte weltweit kein Hinweis darauf gefunden werden, dass das ZNS von Säugetieren zu einer funktionellen Regeneration fähig sein könnte. Und obwohl der spanische Anatom Francesco Tello und andere Wissenschaftler Anfang des 20. Jahrhunderts n. Chr. erstmals Zeichen für eine Regenerationsbereitschaft von Hirn und Rückenmark beim Kaninchen entdeckten (Abb. 1-1), wagten sie es nicht diesem von alters her gewachsenen Dogma offen zu widersprechen (Tello, 1911).. Abb. 1-1: „Retouchierte Mikrophotographie einer Neuroregeneration im Kortex nach Transplantation eines peripheren Ischias-Nerven in den zerebralen Kortex eines erwachsenen Kaninchens. A: Substantia alba des Kortex; B: abgrenzende Membran wird durch angrenzendes Gewebe gebildet; C: verbindendes Gewebe mit Körnerzellen am Anfang des Ischiasnerven; D: Faserbündel kreuzen die abgrenzende Membran und wachsen durch das Transplantat, E: verbindendes Gewebe erreicht die Neurolemma“ (aus Tello, 1911, S. 131).. 9.

(11) Kapitel 1 Einleitung. Auch Ramon y Cajal (1852-1934) fasste die vorherrschende Meinung 1933 in seinem Artikel. ¿Neuronismo. o. reticularismo?. in. Worte:. „Regeneration. findet. im. Zentralnervensystem nicht statt“, obwohl er die Ergebnisse seines Mitarbeiters Tello kannte und wertschätzte (Abb. 1-2).. Abb. 1-2: „Regeneration der Substantia grisea. Narbe in der Substantia grisea des Rückenmarks eines jungen Hundes, 9 Tage nach Läsion. A, neu formierter protoplasmatischer Einwuchs; B, perforierende Nervenfaser; D, Neurone mit ausgestülpten Zellkernen und hypertrophen neurofibrillären Bündeln; C, Neuron, in dem der Nucleus in einen Dendriten einwandert“ (aus Ramon y Cajal, 1928b, S. 524).. Gleichzeitig räumte er im Nachsatz ein, dass es zwar keine vollendete, funktionelle Regeneration gäbe, aber eine Regenerationsbereitschaft des Nervengewebes von Tello eindeutig nachgewiesen worden sei (Ramon y Cajal, 1933). Und sowohl er als auch sein Mitarbeiter hegten die Hoffnung: „...dass es möglich sein wird Substanzen zu finden, die es Neuronen ermöglichen ihre regenerativen Tendenzen bis zu einem bisher unbekannten Grade zu verstärken...” (Tello, 1935). Doch dieser Hoffnungsschimmer von Ramon y Cajal und Tello ging in den Wirren des zweiten Weltkrieges und dem erbitterten Widerstand der Wissenschaft verloren. Erst 80 Jahre nach Tellos ZNS-Transplantation wurde nahezu das gleiche Experiment von Richardson, McGuiness und Aguayo mit dem gleichen Ergebnis reproduziert (Richardson et al., 1980).. 10.

(12) Kapitel 1 Einleitung. Seitdem sind zahlreiche Studien zur Regeneration des ZNS gemacht worden, in deren Fokus die Suche nach Faktoren des Zentralnervensystems steht, die fördernd (Alderson et al, 1990; Alderson et al., 1996; Junger & Varon, 1997) oder hemmend auf die Regeneration der Nervenzellen einwirken (Rogers & Fawcett, 1994; Smith-Thomas et. al., 1995; Cai et al., 1999; Raineteau et al., 2001). Ebenso sind zahlreiche Tiermodelle von der Beutelratte bis zur Maus entstanden, welche die Bereitschaft des ZNS zu einer funktionellen Regeneration nach künstlicher Schädigung aufzeigen (Honmou et al., 1996; Ramon-Cueto et al., 1998; Gudino-Cabrera & Nieto-Sampedro, 2000; Plant et al., 2001; GrandPre et al., 2002; Raineteau et al., 2001). Eine Rückenmarkregeneration erscheint somit nicht mehr als prinzipiell unmöglich, allerdings durch ihren multifaktoriellen Charakter immer noch als sehr schwierig.. 11.

(13) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2 Wissenschaftliche Grundlage 2.1 Traumatische Rückenmarkverletzungen Die Inzidenz traumatischer Rückenmarkverletzungen mit anschließend lebenslänglicher Querschnittlähmung liegt bei ca. 30 Fällen pro einer Million Einwohner/Jahr und betrifft hauptsächlich Menschen im erwerbsfähigen Alter (Dietz, 2001). Die Primärschädigung ist sowohl eine direkte Folge der Verletzung, als auch der fortschreitenden Störung der Mikrozirkulation und einer damit einhergehenden Ischämie der Substantia grisea. Durch anterograde und retrograde Walersche-Degeneration kommt es darüber hinaus distal und proximal der Läsion zur Atrophie synaptisch gekoppelter Neurone. Eine zusätzliche Sekundärschädigung ergibt sich in der Folgezeit durch überschießende Aktivitäten von Mikroglia. und. einwandernden. Makrophagen.. Diese. lösen. in. der. Regel. eine. Apoptosereaktion aus, die zu einer gesteigerten Phagozytose von Nervenzellen führt (Schneider, 1985). Tiermodelle zeigen in den üblichen Kontusionssimulationen unter anderem die Bildung einer hämorrhagischen Nekrose. Nach mehreren Wochen formiert sich in der Läsion eine flüssigkeitsgefüllte zentrale Höhle, umgeben von einer kompakten Glianarbe (Young, 1993). Die Symptomatik der Querschnittlähmung kann alle Bereiche unterhalb der Läsion betreffen und ist damit für jeden Betroffenen individuell verschieden (Abb. 2-1). Je nach Höhe der Schädigung kommt es neben den motorischen und sensiblen Ausfällen der nicht mehr innervierten Muskel- und Sensorgruppen zu autonomen Funktionsstörungen. Dazu gehören auch kardiovaskuläre Funktionsstörungen, wie ein starker Blutdruck- und Pulsfrequenzabfall, thermoregulative und atemfunktionelle Störungen. Fast immer treten Urogenital-, und Darmfunktionsstörungen auf. Komplikationen im Rahmen von Dekubiti (mit Gefahr der Sepsis), Schmerzsyndromen, Thromboembolien, autonomer Dysreflexie (und damit einhergehendem Herzkreislaufversagen), posttraumatischer Syringomyelie (mit zusätzlich. aufsteigenden. Lähmungserscheinungen. bis. hin. zum. Herz-,. bzw.. Atmungsversagen), heterotroper Ossifikation (mit Gelenkversteifungen) und Osteoperose können sich im Verlauf einer Querschnittlähmung manifestieren und zur erheblichen Verschlechterung der Lebensqualität bis hin zum Ableben des Betroffenen führen (Dietz, 2001). 12.

(14) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. Tetraplegie C1-C3 sehr selten, da meist lebenswichtige Kerngebiete mit betroffen, Überlebensrate der ersten 24 Stunden niedrig, vollständig assistenz-abhängig, keine Handfunktion, keine eigene Atemfunktion. Tetraplegie. Atemvolumen immer reduziert unterhalb: C3-C4 vollständig assistenz-abhängig, keine Handfunktion, Elektrorollstuhl, thermoregulative, kardiovaskuläre, gastrointestinale und urologische Störungen C4-C5 vollständig assistenz-abhängig, passive Funktionshand, Elektrorollstuhl, thermoregulative, kardiovaskuläre, gastrointestinale und urologische Störungen C5-C6 teilweise assistenz-abhängig, aktive Funktionshand, aktiv Rollstuhl, Autofahren mit Handbedienung, thermoregulative, kardiovaskuläre, gastrointestinale und urologische Störungen möglich C6-C7 teilweise assistenz-abhängig, aktive Funktionshand, Oberkörperpflege, thermoregulative, kardiovaskuläre, gastrointestinale und urologische Störungen möglich C7-Th1 meist assistenz-unabhängig, Aktiv-Greifhand, Selbständigkeit wie Paraplegiker möglich, gastrointestinale und urologische Störungen, thermoregulative und kardiovaskuläre Störungen selten. Paraplegie. Th2-Th11 assistenz-unabhängig, rollstuhlabhängig, Gehapparate im Barren, Störungen von Urogenital- und Darmfunktionen, spastische Parese, Neigung zu Dekubiti Th12-L1 assistenz-unabhängig, vorwiegend rollstuhlabhängig, Orthesenversorgung mit Vierpunktegang, Störungen von Urogenitalund Darmfunktionen, spastische Parese, Neigung zu Dekubiti L2-L4 assistenz-unabhängig, Rollstuhl entbehrlich, Unterarmstützen mit Orthesen, Störungen von Urogenital- und Darmfunktionen L5-S1 assistenz-unabhängig, Unterarmstützen und Peroneusschienen, Störungen von Urogenitalund Darmfunktionen. Abb. 2-1: Orientierendes Schema der häufigsten funktionellen Störungen nach einer Querschnittläsion in Bezug auf die Läsionshöhe. Der Blick auf das Rückenmark erfolgt in der Abbildung von dorsal. Die Positionen der betroffenen spinalen Segmente ist auf der linken, die der Wirbelkörper auf der rechten Seite angegeben (verändert nach Dietz, 1996, und Nieuwenhues, 1991).. 13.

(15) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. Bis in die 60er Jahre galt die Faustregel, dass Patienten mit Läsionen im Bereich des 5. – 7. Halswirbels zwischen dem 5. und 7. Tag nach ihrem Unfall versterben (Paeslack, 1992). Seit den letzten zwanzig Jahren haben jedoch die meisten Querschnittpatienten aufgrund moderner medizinischer Versorgungsmöglichkeiten eine normale Lebenserwartung, sofern lebensbedrohliche Komplikationen frühzeitig erkannt und behandelt werden können (DeVivo et al., 1999).. 2.2 Tiermodell Gallus gallus Manipulationen am verletzten Rückenmark des Menschen ohne konkrete medizinische Indikation. (Fremdkörperentfernung. etc.). sind. undenkbar,. aber. ohne. gezielte. Manipulationen ist das Bild der traumatischen Querschnittlähmung zu heterogen um bestimmte Fragestellungen zu klären. Adultes Rückenmark Verstorbener lässt sich dagegen aufgrund der Ischämieempfindlichkeit des Gewebes nur zu histologischen Untersuchungen, nicht aber zu physiologischen Experimenten heran ziehen. Somit ist die Regenerationsforschung auf die Verwendung von Tiermodellen unterschiedlicher Spezies und Altersstufen angewiesen. Dabei ist zu beachten, dass jedes Modell in erster Linie nur eine Simplifikation der Wirklichkeit auf eine spezifische Fragestellung darstellt. Das heißt, kein Tiermodell kann gleichzeitig für alle Fragen der Rückenmarksregeneration herangezogen werden. Welches Tiermodell sich für eine Fragestellung eignet, hängt in erster Linie von der Fragestellung selbst, so wie von der Verfügbarkeit der Spezies und deren benötigter Altersstufen ab. Für viele neuroregenerative Fragestellungen eignen sich embryonale Gewebe bzw. Zellkulturen aus embryonalem Gewebe. Ein preiswertes Tiermodell für heranreifendes Gewebe stellt das embryonale Hühnchen (G. gallus) dar. Die Vögel entwickelten sich vor über 100 Millionen Jahren aus den Archeosauriern und werden zusammen mit den rezenten Reptilia zu den Sauropsiden gezählt. Ihre Fortpflanzung erfolgt über das amniotische Ei. Allerdings sind Aves im Gegensatz zu den rezenten Reptilien homoiotherm (Vollmerhaus, 1992). Diese Homoiothermie macht Vögel in. Tierversuchsmodellen. bezüglich. pharmakologischer. Wechselwirkungen,. Enzymkinetiken und anderer physiologischer Eigenschaften den ebenfalls homoiothermen Mammalia vergleichbar.. 14.

(16) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2.2.1 Anatomie des Rückenmarks bei Mensch und Huhn Alle Mammalia weisen 7 Halswirbel und 8 zervikale Segmente auf, aus denen Nervenwurzeln hervorgehen. Dagegen finden sich beim Haushuhn (G. gallus) 14 Halswirbel mit 15 Segmenten. Auch die Anzahl der Brustwirbel ist unterschiedlich. Bei G. gallus lassen sich 7 Brustwirbel mit 7 dazugehörigen Thorakalsegmenten finden. Die Wirbel 2-5 sind dabei zu einem sogenannten Notarium versteift und der 7. thorakale Wirbel ist mit dem nachfolgenden Synsacrum verwachsen. Beim Menschen liegen dagegen 12 freie Wirbel mit 12 thorakalen Nervenwurzeln vor. Das Synsacrum bzw. Os lumbosacrale des Haushuhns stellt das Dach des Beckens dar und umfasst 14 miteinander verschmolzene Einzelwirbel mit entsprechender Segmentzahl des Rückenmarks. Der Lumbalbereich des Menschen besteht aus 5 Wirbeln und 5 Segmenten, die aber räumlich weit voneinander getrennt liegen, so dass die austretenden Nerven in einem dicken Bündel am Sakralmark und dem Conus spinalis vorbei ziehen. Das Sakralmark des Menschen weist 5 Segmente auf und mündet in den Conus spinalis, der seinerseits in dem Filum terminale endet. Die 6 zugehörigen Sakralwirbel sind bei allen Mammalia miteinander zum Kreuzbein verwachsen. Bei den Vögeln folgen auf das Synsacrum die freien Schwanzwirbel in unterschiedlicher Zahl, an deren Ende das Pygostyl bzw. Coccyx zu finden ist, das aus dem Zusammenschluss mehrerer Schwanzwirbel gebildet wird. Beim Menschen spricht man bei den 2-3 direkt auf den Os sacralis folgenden Wirbelrudimenten vom Coccygeus (Steißbein) (Frewein, 1992; Zenker, 1994). Die Länge der Medulla spinalis der Aves entspricht ungefähr der des Wirbelkanals. Sie endet als einzelnes Filum terminale im kaudalen Bereich des Pygostyls. Alle Nervenwurzeln treten in etwa transversal aus dem Wirbelkanal aus ohne eine Cauda equina auszubilden. Dem gegenüber steht das Rückenmark des Menschen, das im adulten Organismus etwa auf Höhe des 2. Lumbalwirbels im Conus spinalis endet und eine breite Cauda equina bis in den Sakralbereich ausbildet. Das Rückenmark zeigt bei Vogel und Mensch gleichermaßen eine Auftreibung im Bereich des Hals- und Lumbalmarks (Intumescentia cervicalis und lumbosacralis). Ansonsten stellt es einen zylindrischen, nach kaudal dünner werdenden Strang dar (Abb. 2-2).. 15.

(17) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. A). B). Abb. 2-2: Wirbelsäule und Rückenmark von G. gallus und Mensch im Vergleich. A) Schematische Darstellung des Rückenmarks von G. gallus. Die Wirbel sind mit arabischen und die Rückenmarksegmente mit römischen Ziffern gekennzeichnet. A: Plexus brachialis; B: Plexus lumbosacralis und Plexus pudendus (nach Goller, 1962, in Nickel, 1996, S. 332). B) Halbschematische, dorsale Aufsicht auf das Rückenmark des Neugeborenen (Drenckhahn & Zenker, 1994, S. 278).. Viele motorische Funktionen laufen bei den Vögeln hauptsächlich reflektorisch über die Medulla spinalis und Medulla oblongata ab und werden von Kortex und Zerebellum nur geringfügig beeinflusst. Dem steht beim Menschen ein sehr hoher Einfluß höherer Hirnfunktionen auf die Motorik entgegen (Frewein, 1992; Zenker, 1994). 16.

(18) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. Eine anatomische Besonderheit der Vögel ist außerdem das Corpus gelatinosum auf Höhe des 3. bis 6. Lumbalsegments. Das stark vaskularisierte schwammartige Gewebe besteht aus spezialisierten großen, polygonalen Gliazellen, die reich an Glykogen sind und von marklosen Nervenfasern umgeben werden (Abb. 2-3 A).. A). B). Abb. 2-3: Querschnitt durch das Rückenmark von G. gallus und Mensch im Vergleich. A) Halbschematischer Querschnitt durch das lumbale Rückenmark des Huhnes. a: dorsales Horn, b: ventrales Horn, c: Zentralkanal, d: Corpus gelatinosum, p: Nucleus marginalis (nach Schwartzkopff, 1959, in Nickel, 1996, S.. 332). B) Halbschematischer Querschnitt durch das zervikale Rückenmark des Menschen. b: dorsales Horn, h: lateraler motorischer Kern des ventralen Horns, i: medialer motorischer Kern des ventralen Horns (Ramon y Cajal, 1995, S. 239).. Die Bedeutung dieses „Lumbalwulstes“ ist noch nicht voll verstanden. Die Feinstruktur des Rückenmarks ist bei Aves und Mammalia sehr ähnlich, obwohl der Anteil der Substantia alba im Verhältnis zum Anteil der Substantia grisea bei den adulten Vögeln kleiner ist als bei den adulten Säugetieren (Frewein, 1992) (Abb. 2-3). Die Laminae I-IV sind sowohl bei Vögeln als auch bei Säugern im dorsalen Horn der Substantia grisea lokalisiert. Auch der Nucleus dorsalis und die Muskelkerne des Vorderhorns liegen an der gleichen Stelle. Aber im Unterschied zu den Säugetieren, deren Substantia grisea vollständig durch die Substantia alba von der Oberfläche des Rückenmarks getrennt wird, zeigt das Vogelrückenmark an der Außenseite des sehr schmalen Seitenstranges den Nucleus marginalis. Dieses Kerngebiet, das sich beidseitig über die ganze Länge des Rückenmarks von Aves erstreckt und besonders im Bereich des Intumescentia lumbosacralis ausgeprägt ist und die Lobi accessorii bildet, wird bei Mammalia nicht beschrieben. Seine Zellen sind jedoch motorisch und üben die gleiche Funktion aus wie die großen α-Motoneurone der Lamina IX im Ventralhorn der Mammalia (Frewein, 1992; Zenker, 1994).. 17.

(19) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2.2.2 Embryonale Zell- und Gewebekultur des Huhns Als Tiermodelle für die Zell- und Gewebekultur bei Mammalia werden hauptsächlich embryonale Ratten (Ballerini et al., 1999), Mäuse und Hühnchen verwendet (Sharma & Frank, 1998). Das adulte Rückenmark ist aufgrund seines Aufbaus nur bei heterothermen Vertebraten wie z.B. Schildkröten (Perrier et al., 2000) für eine Gewebekultur geeignet. Die neurotrophe Wirkung von Wachstumsfaktoren im embryonalen Gewebe ist jedoch nicht vollständig mit der im adulten Gewebe vergleichbar. Mit steigendem Alter der Zellen werden eine Vielzahl von Rezeptoren und Enzyme der Neuronen reduziert, die in der Migration und Synapsenbildung bei der Embryonalentwicklung eine Rolle spielen. Aus diesem Grunde reagieren embryonale Zellen empfindlicher auf neurotrophe Faktoren und haben ein höheres Eigenpotential zur Regeneration als adulte Zellen. Allerdings bietet das embryonale Modell gerade aufgrund dieser größeren Empfindlichkeit den Vorteil, dass man diverse Wachstumsfaktoren genauer in ihrer Wirkung vergleichen kann. Außerdem ermöglicht. das. größere. Eigenpotential. eine. bessere. Reproduzier-. und. Standardisierbarkeit. Aus diesem Grund werden zur Untersuchung potenziell neurotrophe Substanzen zunehmend auch embryonale Hühnchenmodelle unterschiedlicher Reife verwendet (Guale & Burrows, 1997). Zell- und organotypische Gewebekulturen des Rückenmarks unterscheiden sich in ihrer Aussagefähigkeit. Während die Gewebekultur die Untersuchungen zur Interaktionen von Rückenmarkszellen in ihrem natürlich gewachsenen Gefüge und ihre gemeinsame Reaktion auf einen Wirkstoff zulässt (Munoz-Garcia & Ludwin, 1986), befasst sich die Einzelzellkultur alleine mit der Reaktion der Zielzelle auf einen Wirkstoff. Sowohl in der Zell- als auch in der Gewebekultur können Experimente zur Reaktion der Neurite von deund regenerierenden Motoneuronen nach künstlicher Schädigung, während der normalen Embryogenese oder bei Krankheit auf eine neurotrophe oder toxische Substanz durchgeführt werden (Bourque et al., 1983; Bilak et al., 1999).. 18.

(20) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2.3 Neurotrophe Faktoren Die Theorie eines Neurotrophismus im Nervensystem ist eine Entdeckung des 19. Jahrhunderts n.Chr. und wurde erstmals von Ramon y Cajal (1892) anhand von Untersuchungen an den Retinae verschiedener Spezies entwickelt. Forssman (1898, 1900) konnte als erster diese Hypothese in Experimenten belegen. Er untersuchte. eine. Vielzahl. verschiedener. organischer. Substanzen. auf. ihre. Neuroattraktivität, in dem er sie nah dem zentralen Stumpf durchtrennter Nerven platzierte. Anhand seiner Ergebnisse schloss er, dass es einige lösliche Substanzen mit neurotropher Wirkung geben müsse. Jedoch war er der Überzeugung, dass diese Stoffe durch die Desintegration der Myelin-Scheide freigesetzt würden. Durch Experimente mit Ischiastransplantaten ins Gehirn oder Rückenmark folgerte er zudem, dass die neurotrophen Substanzen auch in diesen Transplantaten vom Myelin freigesetzt würden. Cajal schrieb 1928, dass Forssman zwar prinzipiell mit seinen Ausführungen recht habe, sie aber einiger wichtiger Korrekturen bedürften. Cajals eigene Studien zu dem Thema hatten ihn zu dem Schluss geführt, dass die chemotaktische Ursache für die neurotrophe Wirkung von den lebenden Schwannzellen freigesetzt werden müsse (Ramon y Cajal, 1928). Was Forssman und Cajal jedoch zu diesem Zeitpunkt nicht wissen konnten, war dass sie einen ganzen „Cocktail“ aus verschiedenen neurotrophen Substanzen entdeckt hatten. Dazu gehören zum Beispiel auch die Vertreter der „Ciliary neurotrophic factor“ (CNTF) – Familie, die an einer Kombination aus CNTFRα-, gp130- and LIFRβ-Rezeptoren binden (Ward et al., 1994). Eine weitere Superfamilie stellen die Cystein-Knoten-MotivNeurotrophine dar (Butte, 2001). Der erste Vertreter dieser Familie wurde vor fast sechzig Jahren von Stanley Cohen und Rita Levi-Montalcini aus dem Gift der Mokassinschlange isoliert und trägt den Namen „Nerve Growth Factor“ (NGF) (Levi-Montalcini & Hamburger, 1951). Die biologisch aktive Form von NGF besteht aus einem Homodimer mit exponiertem NTerminus und kann gleichzeitig mit zwei Rezeptoren interagieren, TrkA und p75NTR (Edwards et al., 1986). Wiesmann und Mitarbeiter (1999) konnten zeigen, dass zwei Stellen von NGF an die TrkA binden.. 19.

(21) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. Die erste Bindung betrifft vier Beta-Faltblatt Strukturen und die erste Windung der Hauptdomänen (Aminosäuren-Sequenz 29-33) des Moleküls. Diese Sequenzen haben eine große Homologie mit den anderen Mitgliedern der Neurotrophin-Familie. Die zweite Bindung wird durch den N-Terminus des NGF gebildet. Das Fehlen einer Homologie des NGF N-Terminus mit anderen Neurotrophinen weist darauf hin, dass diese Struktur für die spezifische Bindung am TrkA Rezeptor notwendig ist (Wiesmann et al., 1999). Außerdem wird für NGF eine rezeptorvermittelte Endozytose in den Wachstumskegel und ein retrograder Transport ins Soma postuliert (Hosan & Shooter, 1987). Der Mechanismus, mit dem NGF innerhalb der Zelle zur Wirkung kommt, ist allerdings noch nicht voll verstanden (Neet & Campenot, 2001). Ein weiterer neurotropher Faktor, GDNF (Glial cell-derived neurotrophic factor) und die Mitglieder seiner Familie gehören zwar zur Superfamilie der Cystein-KnotenmotivWachstumsfaktoren. Sie unterscheiden sich aber bereits durch ihre Rezeptoren von der NGF Familie (Neet & Campenot, 2001). GDNF hat wie NGF einen langen N-Terminus und nutzt den relativ unspezifischen Tyrosin-Kinase-Rezeptor cRet in Kombination mit seinem spezifischen GFRα Rezeptor (GDNF family receptor α). Dieser gehört zur Gruppe der GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol) verankerten Rezeptoren (Eketjäll et al., 1999). Genauso wie für die NGF-Superfamilie der Cystein-Knotenmotiv-Neurotrophine wird für CNTF und GDNF eine rezeptorvermittelte Endozytose in das Axon und ein retrograder Transport in das Soma angenommen. Dieses „zweigleisige“ Verfahren der RezeptorAktivierung und gleichzeitigen Internalisierung des Wachstumsfaktors ist ein generelles Merkmal der bekannten neurotrophen Faktoren (Neet & Campenot, 2001). Offensichtlich gibt es jedoch noch weitere körpereigene Substanzen, die zwar neurotroph wirken, bisher aber nicht zu den klassischen „Neurotrophen Faktoren“ gezählt werden können. So üben die Inhaltsstoffe der Linse protektive oder sogar regenerative Eigenschaften auf Neurone aus (Leon et al., 2000; Fischer et al., 2000; Fischer, 2000; Fischer et al., 2001; Lorber et al., 2002; Yin et al., 2003).. 20.

(22) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2.4 Die Kristalline der Mammalia Man unterscheidet bei den Mammalia zwei strukturell verschiedene Kristallin-Familien: αKristallin und βγ-Kristallin, die in der Augenlinse als Strukturproteine dienen und sich in nicht lentikularen Geweben wie z.B. der Retina nachweisen lassen. Ihre Aufgabe und Funktion in diesen Zellen sind jedoch nach wie vor nicht voll verstanden (Graw, 1997; Coop et al., 1998; Xi et al., 2003).. 2.4.1 α-Kristalline Die α-Kristalline haben in der Augenlinse der Mammalia einen Anteil von ca. 30%. Sie lassen sich in αA- und αB-Monomere unterteilen, die miteinander heteromere, zirkuläre, große Komplexe von 800-1000 kDa bilden können (Groenen et al., 1994). α-KristallinMonomere haben zwei unterschiedlich große, globuläre Domänen mit einer starken Homologie zu den „small heat shock proteins“ (sHSP) (Ingolia & Craig, 1982). Die Cterminale Domäne ähnelt den sHSP am stärksten. Sie ist größer als die N-terminale Domäne und besitzt außerdem einen exponierten C-terminalen Arm (Wistow, 1985). αB-Kristallin findet sich meist in Geweben mit einer hohen oxidativen Aktivität der mitochondrialen Enzyme (Iwaki et al., 1993). Es ist in der Lage mit Membranen und Zytoskelett-Bestandteilen wie Aktin, Vimentin oder GFAP zu interagieren und deren Verknüpfungen zu größeren Aggregaten aufzuhalten (Cobb & Petrash, 2000; Fitzgerald & Graham,. 1991;. Nicholl. &. Quinlan,. 1994).. Außerdem. hat. es. neben. einer. „Chaperonaktivität“ auch noch die Möglichkeit Proteasen zu inhibieren und selbst als Proteinkinase zu wirken. αB ist zudem noch in der Lage Amine für die TransglutaminaseAktivität zu spenden (Sax & Piatigorsky, 1994). Das αB-Kristallin wird in vielen degenerativen Erkrankungen überexprimiert. Darunter fallen auch Erkrankungen des Gehirns und Rückenmarks wie Morbus Parkinson, ALD (Adrenoleukodystrophie), MS (Multiple Sklerose) und der Motoneurone wie ALS (Amyotrophe Lateral Sklerose) (Iwaki et al., 1992). Während der Einfluß des αB-Kristallins auf die Entstehung von ALD, ALS und Parkinson noch nicht klar ist, wird bei MS ein direkter Zusammenhang postuliert (van Stipdonk et al., 1998; van Sechel et al., 1999; Bajramovic et al., 2000; van Noort et al, 2000; van Stipdonk et al., 2000). 21.

(23) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2.4.2 βγ-Kristalline Die Familie der βγ-Kristalline ist charakterisiert durch ihre hydrophile, gleichartige, und konservierte Monomerstruktur. Alle βγ-Kristallin-Monomere weisen in ihrer Hauptstruktur bis zu 70% Homologie zu verschiedenen Spezies (Huhn, Ratte, Rind und Mensch) auf (Slingsby et al., 1988). Sowohl β- als auch γ-Kristallin-Monomere bestehen aus zwei gleich großen Domänen mit je zwei „Greek Key“-Motiven, die über ein schmales Bindungspeptid miteinander gekoppelt sind und so eine „Hantelform“ aufweisen. Der entscheidende Unterschied zwischen β- und γ-Kristallin besteht in der Länge und Struktur der N-Termini ihrer Monomere. Während γKristallin aufgrund seiner N-terminalen Struktur nur Monomere ausbilden kann, ist βKristallin in der Lage 2-8 Monomere miteinander zu verknüpfen (Slingsby et al., 1988). β-Kristallin liegt in sechs verschiedene Monomeren vor, die sich hauptsächlich in ihrem NTerminus unterscheiden: βA1, βA3, βA4, βB1, βB2 und βB3. Die Monomere βA1, βA3, βA4, βB2, und βB3 können dabei jeweils Di- bzw. Tetramere bilden, während βB1Kristallin als einziges Monomer in der Lage ist Hexa- und Oktamere auszubilden (Vermorken et al., 1977; Berbers et al., 1982; Siezen et al., 1986, Lampi et al., 1997, Shih et al., 1998). Aufbau und Struktur des βB1-Kristallin N-Terminus sind (anders als bei allen anderen Monomeren) zudem zwischen den verschiedenen Spezies nur zu 30% homolog (Hejtmancik et al., 1986). Die Länge variiert beim Huhn mit 45 Aminosäuren (AS), bei der Ratte mit 56 AS, dem Menschen mit 57 AS und dem Rind mit 58 AS (Berbers et al., 1983, Slingsby et al., 1988; SWISSPROT, 2002) (Abb. 2-4). Über die Funktion der βγ-Kristalline außerhalb der Augenlinse ist nur bekannt, dass sie innerhalb der Linse neben ihrer Aufgabe als Strukturproteine noch in die Kalzium Homeostase involviert sein könnten, da die vier „Greek Key“-Motive der Hauptstruktur Kalzium binden (Rajini et al., 2001). Aber auch die strukturellen Ähnlichkeiten zu SMPI (Streptomyces Metalloproteinase Inhibitor) lässt mögliche enzymatische Eigenschaften vermuten, die nicht auf die Augenlinse beschränkt sein müssen (Ohno et al., 1998). Anders als bei der α-Kristallin Familie ist bisher keiner der Vertreter der βγ-Kristalline mit Erkrankungen des Zentralnervensystems in Verbindung gebracht worden.. 22.

(24) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. A). B). C). D) Abb. 2-4: Stereo Aufsichts-Diagramme der βγ-Kristalline. A) γ-II-Kristallin wurde an den Resten 7 – 13 markiert um das gefaltete Haarnadelmotiv 1 zu kennzeichnen. Die N- und C-terminalen Extensionen des βKristallins (B-D) wurden durch eine dickere Linie gekennzeichnet. B) βB2; C) βB1-Kristallin besitz den längsten N-Terminus aller β-Kristalline, D) βA3 unterscheidet sich von den anderen Kristallinen durch eine weniger kompakte Hauptdomäne und stark gebogenem N-Terminus (Slingsby et al., 1988, S. 382).. 23.

(25) Kapitel 2 Wissenschaftliche Grundlage. 2.5. Arbeitsvorhaben Es konnte verschiedentlich in vivo und in vitro gezeigt werden, dass der homogenisierte Augenlinsenextrakt der Ratte in der Lage ist, axotomierte retinale Ganglienzellen (RGZ) zur Regeneration durch den Sehnervenstumpf anzuregen (Leon et al., 2000; Fischer, 2000; Fischer et al., 2000; Fischer et al., 2001). Auch isolierte Linsenproteine, die Kristalline der Ratten- und Rinder-Augenlinse, zeigen diesen Effekt in der adulten Ratte (Fischer, 2000). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass nicht nur RGZ, sondern auch andere Neurone des Zentralnervensystems auf Kristalline mit Regeneration reagieren könnten. In der vorliegenden Arbeit sollten anhand von Zell- und Gewebekultur in Verbindung. mit. histologischen,. molekularbiologischen,. pharmakologischen. und. immunhistochemischen Verfahren folgende Fragen untersucht werden: 1. Wirken die HPLC-Fraktionen des Augenlinsenproteins auf Zellen des embryonalen Rückenmarks und, wenn ja, welche HPLC-Fraktion zeigt den stärksten Effekt? 2. Welche Neurone des Rückenmarks werden von diesem Effekt betroffen? 3. Über welchen Mechanismus wirkt das Kristallin auf Neurone? Als Tiermodell hierzu wurde das embryonale Hühnchen (G. gallus) herangezogen.. 24.

(26) Kapitel 3 Material / Methoden. 3 Material / Methoden 3.1 Herkunft der neurotrophen Faktoren Für die unterschiedlichen Fragestellungen kamen sowohl die HPLC- (High Pressure Liquid Chromatography) Fraktionen aus adulter Ratten-Augenlinse: α- (α-Ratte), βH- (βH-Ratte), βL- (βL-Ratte) und γ-Kristallin (γ-Ratte), kommerziell erworbenes (Sigma) adultes RinderβH- (βH-bovin), αB-Kristallin (αB-bovin) und der homogenisierte Augenlinsenextrakt adulter Ratten (Linsenhomogenat) zum Einsatz. Außerdem stellte Prof. Lampi rekombinantes, humanes βB1-Kristallin in Form des Wildtyps (wtβB1) und der beiden Deamidierungs-Mutanten Q204E (Q204EβB1) und N157D (N157DβB1) für Experimente zur Verfügung (Lampi et al., 2001). Zur Gewinnung des Linsenhomogenats und der HPLC-Fraktionen wurden adulte Ratten (11 Wochen alt, 200 - 250 g) mit CO2, oder Chloralhydrat (5 ml/250 g Körpergewicht) getötet und ihre Augen enukliiert. Unter sterilen Bedingungen wurde die Linse vorsichtig mit Hilfe von Skalpell, Vannasschere und Pinzetten aus den Augen entnommen, bei –20°C gelagert und nach Bedarf aufgetaut. Anschließend wurde sie mit einem Stößel zerkleinert, 1 ml eisgekühltes HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, Gibco) oder destilliertes Wasser hinzugegeben und die Suspension im Ultraschallbad (Sonorex TK 52, Bandelin) für 3x10 min homogenisiert und bei 20000 x g 30 min bei 4°C zentrifugiert (GK15, Sigma). Der Überstand wurde schließlich sterilfiltriert (Millipore) und frisch für die Experimente, bzw. die HPLC verwendet. Die Auftrennung der Kristallin-Fraktionen erfolgte durch Dr. Dietmar Fischer mit der HPLC (Beckman BioSysTM2000, Coulter GmbH) über eine „Highload“ 16/60 Superdex 200 Säule (Pharmacia-Amersham). Die einzelnen Fraktionen, bestehend aus einer Kombination von αA- und αB-Kristallin (α-Ratte), βH-, βL- und γ-Kristallin, wurden über Nacht in destilliertem Wasser mit Hilfe von Dialyseschläuchen entsalzt (Membra-Cell, MD 25-14x100 CLR, Serva), gefriergetrocknet und bei –20°C gelagert (Fischer, 2000).. 25.

(27) Kapitel 3 Material / Methoden. 3.2 Gewebekultur Für alle Experimente wurden vier bis fünf keimfreie Leghorn-Eier (Firma Brinkschulte) 12 Tage in einem Wendebrutschrank (BSS160, Ehret) bei 37°C bebrütet. Die gesamte Präparation erfolgte eisgekühlt und unter sterilen Bedingungen in Sauerstoff begastem HBSS. Die Kultivierung erfolgte ausschließlich in serumfreiem S4 Medium (Astrozyten und Mikroglia Medium, Promocell) ohne Antibiotika Zusatz.. 3.2.1 Präparation Mit einem Eierlöffel wurde die Schale an der Luftkammer im stumpfen Bereich des Eies eröffnet und die Eihäute vorsichtig mit einer anatomischen Pinzette abgehoben. Anschließend wurde der Embryo in eine Gewebekulturschale (30 cm, Greiner) gelegt und zügig mit einer Schere dekapitiert. Mit einer kleinen Präparierschere und einer chirurgischen Pinzette wurden Flügel und Beine des Embryos entfernt. In einem zweiten Schritt erfolgte dann das Abbalgen und Ausweiden vom Hals bis zum Bürzel mit zwei feinen Pinzetten. Die so isolierte Wirbelsäule wurde in eine frische Gewebekulturschale (10 cm, Greiner) verbracht und mit zwei feinen anatomischen Pinzetten an drei Punkten vorsichtig ausgepresst ohne sie zu zerbrechen. Dabei rutschte das Rückenmark weitgehend ohne Meningen oder Wurzelganglien in die Gewebekulturschale und wurde mit zwei polierten Spateln in eine vorbereitete, frische Gewebekulturschale überführt. Das Rückenmark wurde anschließend auf eine „Chopper-Plattform“ (McIlwain) aufgelegt und auf eine Dicke von 500 µm gehackt. Mit einer HBSS gefüllten Spritze wurden die Scheiben in eine neue Gewebekulturschale gespült,. mit. einer. 1000. µl. Eppendorfpipette. vereinzelt. und. in. eine. weitere. Gewebekulturschale überführt. Dieser Schritt wurde ein weiteres Mal wiederholt um möglichst viele Gewebefragmente und Einzelzellen von den Schnitten zu entfernen.. 26.

(28) Kapitel 3 Material / Methoden. 3.2.2 Kultivierung Die Kultivierung erfolgte in je zwei 12-Wellplatten (Greiner). Hierzu wurden GlasDeckgläschen (20 mm, Assistent) zunächst mit Ethanol für einige Tage entfettet, anschließend autoklaviert und nach Auskühlung mit 200 µg/ml Poly-D-Lysin (Sigma) für 24 Stunden beschichtet. 2 – 4 Stunden vor der Präparation erfolgte dann nach gründlichem Waschen die abschließende Beschichtung mit 20 µg/ml EHS-Laminin (Roche). Während der Präparation wurde die Lamininlösung abgenommen und gleich durch einen Tropfen HBSS mit jeweils 10 Rückenmarksschnitten pro Well ersetzt. Anschließend wurde das vorbereitete S4-Medium zugegeben, die Wellplatten in einen Inkubator (Heraeus Instruments) mit 5% CO2 und 37°C verbracht und 20 Stunden nicht mehr bewegt, um eine optimale Anhaftung der Schnitte zu gewährleisten. Nach 20 Stunden wurden dann, sowohl in der unbehandelten Kontrolle als auch nach Zusatz der zu testenden Wirkstoffe jeweils 20 Gewebeschnitte pro Wirkstoff und Konzentration unter dem Mikroskop (Axiovert 135, Zeiss) betrachtet und alle auswachsenden Neurite gezählt. Es wurden nur Gewebeschnitte verwendet, die keine Ablösungen aufwiesen, nicht zu eng an anderen Schnitten lagen und gleichmäßig ausgewachsen waren. Jedes Experiment wurde 3- bis 4-mal wiederholt. Nach 48 Stunden Kultivierung erfolgte dann für 10 Minuten die Fixierung durch 5% Paraformaldehyd (PFA) und die Vorbereitungen für die verschiedenen Färbungen.. 3.2.3 Vorversuch mit Linsenhomogenat Im Vorversuch wurden zur Etablierung des Konzentrations-Wirkungs-Experiments verschiedene. Konzentrationen. des. Linsenhomogenats. auf. die. Rückenmarks-. Gewebekultur getestet. Dazu wurden mit HBSS Verdünnungsreihen des wasserlöslichen Überstandes homogenisierter Ratten-Augenlinse hergestellt und bei Explantation und Aussaat mit dem S4-Medium verabreicht. Die Proteinbestimmung des Linsenhomogenats erfolgte nach Bradford (1976). Hierbei wurde die selektive Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G 250 (Merck) zur Ermittlung des totalen Proteingehalts im wasserlöslichen Überstand des Linsenextraktes verwendet. 27.

(29) Kapitel 3 Material / Methoden. Coomassie Brilliant Blue besitzt in ungebundener Form ein Absorbtionsmaximum bei λ = 465 nm nach Proteinbindung bei λ = 595 nm. Mit Hilfe des Photometers kann Anhand einer BSA- (Bovines Serum Albumin, Sigma) Standardkurve aus 2, 4, 6, 8 und 10 µg/0,1 ml und jeweils 1 ml Proben-Reagenz (0,01% Coomassie Brilliant Blue, 8,5% Phosphorsäure und 4,7% Ethanol) die Proteinmenge des Untersuchungsmaterials einer Referenzgröße zugeordnet werden. Eine Proteinmenge des Linsenhomogenats von 4330 ng/ml (entsprechend 1/5 Linse/ml) erschien als optimierte Konzentration für das Gewebekultur Modell.. 3.2.4 Pharmakodynamik Die HPLC-Fraktion α-Ratte wurde (wie für das Linsenhomogenat in 3.2.3 beschrieben) auf Konzentrationen von 5, 25, 50, 100, 500, 1000 und 5000 ng/ml verdünnt. Die Verdünnungsreihe von βL-Ratte betrug 5, 25, 50, 500, 5000, 20000, 40000 ng/ml. βHRatte wurde in Konzentrationen von 5, 25, 50 und 75 ng/ml und γ - Ratte mit 50, 20000, 35000, 40000 und 60000 ng/ml mit dem Kulturmedium verabreicht. Auch von den gewählten Neurotrophen Faktoren CNTF (Roche), NGF (Sigma) und NT-4/5 (Sigma) wurden Verdünnungsreihen von 25, 50, 100, 200 und 300 ng/ml angefertigt und in gleicher Weise verabreicht. Die Emax- (maximaler Effekt) Werte und Verläufe der Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Wachstumsfaktoren wurden 20 Stunden nach Explantation durch Zählen der ausgewachsenen Neurite pro Explantat und Konzentration ermittelt und mit denen der verschiedenen Kristalline verglichen.. 3.2.5 Antikörper-Blocktest Für die Blockierung des βH-Kristallins wurde das Kristallin βH-bovin in einer Konzentration von 50 ng/ml gewählt und zwei Stunden vor Präparation des Rückenmarks mit 8750 ng/ml Anti-βH-bovin Antikörper (Biogenesis) präinkubiert. Als Kontrolle diente eine AntikörperLösung in gleicher Konzentration ohne Kristallin Zugabe. Alle Lösungen wurden zeitgleich angefertigt und zu den Schnitten gegeben.. 28.

(30) Kapitel 3 Material / Methoden. 3.2.6 Retrograde Färbung Die retrograde Färbung mit DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3-tetramethyl-indocarbocyanineperchlorate, Molecular Probes) erfolgte einige Tage nach Fixierung mit 5% PFA und anschließender Lagerung in PBS (pH 7,4) bei 4°C. Zu diesem Zweck wurde das PBS aus den Wellplatten abgesaugt und einzelne, fein gemahlene Kristalle des Farbstoffes mit einer fein ausgezogenen Glaspipette unmittelbar an die Neurite der Explantate platziert. Anschließend wurde mit PBS aufgefüllt und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach einem weiteren PBS-Wechsel wurden die Wellplatten unter Lichtabschluss für eine Woche bei 4°C gelagert. Anschließend erfolgte ein erneuter PBS Wechsel und eine zweistündige Inkubation bei 37°C, sowie einer weiteren Lagerung bei 4°C für weitere 3- bis 4-Tage. Schließlich wurde die Gewebekultur mit einer Pinzette aus den Wellplatten heraus gehoben und vorsichtig an der Unterseite abgetrocknet. Sie wurde dann mit der Oberseite auf einen mit einem Tropfen Mowiol (Hoechst) vorbereiteten Objektträger aufgesetzt. Nach einer kurzen Antrocknungszeit konnten die Färbungen mit Hilfe eines FluoreszenzPhotomikroskops (Axiophot, Zeiss) ausgewertet werden.. 3.2.7 Immunhistochemie der Gewebekultur Zur Unterscheidung der auswachsenden glialen und neuronalen Fasern, wurde eine Immunhistochemie. gegen. „Glial. Fibrillary. Acid“. (GFAP). und. phosphoryliertes. Neurofilament (NF) an den Gewebekulturen durchgeführt. Die fixierte Gewebekultur wurde 1 Stunde in PBS ohne Schütteln gewaschen. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Temperaturunterschiede zwischen Gewebe und Lösung nicht größer als 1–2°C waren, da sich sonst die Neurite von der Kulturoberfläche lösen. Um die unspezifischen Bindungsstellen abzudecken wurde anschließend der Blockpuffer, bestehend aus PBS mit 10% FCS (Fetal Calf Serum, PAA) und 6% Triton-X 100 (Sigma) gegen das PBS ausgetauscht um die Zellmembran für die Antikörper permeabel zu machen und 2- bis 3Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Antikörper Anti-Neurofilament (Maus Klon NE 14, Sigma) wurde in einer Verdünnung von 1:400 und Anti-GFAP (G9269, Kaninchen, Sigma) mit 1:80 in Blockpuffer verdünnt auf die Gewebekultur gegeben und über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer inkubiert. 29.

(31) Kapitel 3 Material / Methoden. Das Gewebe wurde anschließend in eiskaltem PBS für eine Stunde gewaschen. Ein Cy2konjugierter Zweitantikörper gegen Maus für die Neurofilamentfärbung (Anti-Maus IgG, Jackson Immuno Research Laboratories, INC) wurde anschließend in einer Konzentration von 1:200 und ein TRITC-konjugierter Zweitantikörper gegen Kaninchen, für die GFAPFärbung (Anti-Kaninchen IgG, T6778, Sigma) mit 1:100 in Blockpuffer verdünnt auf die Kultur gegeben. Nach erneuter Inkubation bei 4°C wurden die Kulturen in eiskaltem PBS für mehrere Stunden im Dunkeln ohne Schütteln über Nacht gewaschen. Anschließend wurden die Kulturoberflächen mit einer Pinzette aus den Wellplatten heraus gehoben, vorsichtig an der Unterseite abgetrocknet und mit der Oberseite auf vorbereiteten Objektträgern auf einen Tropfen Mowiol (Hoechst) aufgesetzt.. 3.3 Zellkultur Für die angereicherte Motoneuronen-Zellkultur wurden drei bis vier Eier am Bebrütungstag 6 (E6) verwendet. Die gesamte Präparation erfolgte unter sterilen Bedingungen und eisgekühlt in HBSS (PAA). Als Kulturmedium wurde wie zuvor S4-Medium verwendet, dem aber diesmal 20% konditioniertes Medium (KM) zugesetzt wurde. Das KM wurde durch. eine. Mischkultur. aus. dissoziierten. Hühnchen-Rückenmarkszellen. des. Bebrütungstages 14 (E14) gewonnen. Hierzu wurde das Rückenmark, wie bereits für die Gewebekultur (siehe 3.2.1) beschrieben,. entnommen.. Anschließend. wurde. das. Gewebe. in. einem. 14. ml. Zentrifugenröhrchen (Greiner) bei 50 x g für 2 Minuten bei 4°C zentrifugiert und enzymatisch mit 1 ml 0,05% Trypsin III + 0,02% EDTA (Sigma) + 1 ml 0,1% DNAse I (Serva) für 17 Minuten bei 37°C dissoziiert. Die Reaktion wurde anschließend mit DMEM (Dulbeccos Modificated Eagles Medium, Gibco) + 10% FCS gestoppt. Nach 2 min Zentrifugation bei 80 x g und 4°C wurde der Überstand bis auf 1 ml über dem Pellet abgenommen. Mit drei rund geschmolzenen Pasteurpipetten (Brand) unterschiedlicher Durchmesser erfolgte behutsam die mechanische Dissoziierung. Anschließend wurden die Zellen der Mischgliafraktion in einer Dichte von 10 x 106 Zellen/ml in DMEM + 10% FCS auf Poly-D-Lysin (siehe 3.2.2) beschichtete Kulturflaschen verteilt.. 30.

(32) Kapitel 3 Material / Methoden. Nach einer Kultivierungszeit von 7 Tagen bei 5% CO2 und 37°C in einem Inkubator (Haereus) wurde das gesamte Medium abgenommen, bei 5000 x g für 2 min zentrifugiert, sterilfiltriert und in Portionen von 2 ml bei –20°C bis zur Verwendung in der Zellkultur gelagert.. 3.3.1 Präparation Für die Motoneuronen-Zellkultur wurden die Eier, wie unter 3.2.1 beschrieben, präpariert. Die Dissektion und Motoneuronen-Anreicherung des Rückenmarks-Gewebes erfolgte nach dem modifizierten Protokoll 3 von Henderson und Mitarbeitern (1995). In einer frisch vorbereiteten Gewebekulturschale mit eisgekühltem HBSS wurden die Embryonen mit der Wirbelsäule nach oben platziert und der Spinalkanal mit einer abgerundeten Pinzette von rostral nach caudal eröffnet (Abb. 3-1).. Abb. 3-1: Eröffnung des Rückenmarks eines Hühnchenembryos am E6. A) Der Embryo wird mit dem Rücken nach oben platziert. B) Der Zentralkanal wird mit einer Pinzette eröffnet. C) Das Rückenmark wird aus dem Spinalkanal befreit (schematisch nach Henderson, in Cohen & Wilkin, 1995, S. 76).. 31.

(33) Kapitel 3 Material / Methoden. Die auseinander klaffenden Flügel des Rückenmarks wurden dann mit einer polierten Pinzette von den Meningen gelöst, vorsichtig aus dem Wirbelkanal abgehoben und in ein 14 ml Zentrifugenröhrchen mit eiskaltem HBSS überführt. Die enzymatische und mechanische Dissoziierung des Gewebes wurde in gleicher Weise durchgeführt, wie sie zuvor für die E14-Mischkultur (siehe 3.3) beschrieben wurde. Zur Anreicherung der Zellkultur wurden der Zellsuspension anschließend noch einmal 800 µl DMEM + 10% FCS zugegeben und die Lösung nach erneuter Resuspension über 2 ml 6,8% Metrizamid- (Sigma) in HBSS-Lösung geschichtet ohne die beiden Phasen zu vermischen. Die Dichtezentrifugation erfolgte für 15 min bei 500 x g und 4°C. Danach zeigten sich zwei gut getrennte Phasen, an deren Grenzschicht eine deutliche Trübung mit einer Anhäufung von α-Motoneuronen zu finden war (Abb. 3-2).. Zellsuspension. 15 min 500 x g. Zellfragmente Motoneurone. 6.8% Metrizamid. Astrozyten. Abb. 3-2: Überschichtung von 6,8% Metrizamid mit Zellsuspension. A) Vor der Dichtezentrifugation erkennt man zwei deutlich voneinander getrennte Phasen. B) Nach der Dichtezentrifugation sieht man in der Grenzschicht der zwei Phasen eine Ansammlung von Zellen.. Der Überstand wurde verworfen, die Grenzschicht behutsam abgehoben und in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführt. Auch die darunter liegende Metrizamid-Schicht, eine Gliamisch-Suspension, wurde verworfen. Die Motoneuronen wurde anschließend mit DMEM + 10% FCS aufgefüllt und bei 80 x g 20 min zentrifugiert um die Metrizamidreste abzutrennen. Der Überstand wurde bis auf das Pellet verworfen und das Röhrchen mit serumfreiem S4Medium + 20% KM sowie zu testenden Wirkstoffen aufgefüllt (siehe 3.3). Anschließend erfolgte eine 2 min Zentrifugation bei 80 x g um das restliche DMEM auszutreiben.. 32.

(34) Kapitel 3 Material / Methoden. Die Zellen wurden anschließend gezählt und in einer Dichte von 3-4 x 106 Zellen/ml in 4Well-Platten (Greiner) auf Glas Deckgläschen (15 mm, Assistent) ausgesät (siehe 3.2.2).. 3.3.2 Kultivierung Die Motoneuronen-Kultur wurde in einem Inkubator bei 5% CO2 und 37°C gehalten. Motoneurone benötigen 12– bis 18-Stunden zur Adhäsion und dürfen in dieser Zeit nicht bewegt werden. Abgelöste Motoneurone sterben ab. 18 Stunden nach der Präparation erfolgte der erste Medienwechsel um Zellfragmente und nicht adhärierte Zellen aus der Kultur zu entfernen. 22 und 48 Stunden nach Präparation erfolgte dann die photographische Dokumentation (Axiovision, Carl Zeiss). Am Ende der Dokumentation wurden die Zellen mit 5% PFA fixiert und zur Färbung vorbereitet. Die angereicherte Primärkultur wurde mit dem Motoneuron spezifischen Anti-ChAT-Antikörper (Ziege, polyklonaler AK, Chemicon) in einer Verdünnung von 1:80 mit Blockpuffer und einem AntiSchaf/Ziege Zweitantikörper (Fitc konjugiertes IgG, Serotec) in einer Verdünnung von 1:100 sowie mit dem für Astrozyten spezifischen Anti-GFAP (Anti-Maus-GFAP monoklonaler AK Klon G-A-5, Sigma) in einer Verdünnung von 1:400 und dem 2. Antikörper (Ziege–Anti-Maus-IgG Rhod-Red XM konjugiert, Jackson Immuno Research) bei einer Verdünnung von 1:100, wie für die Gewebekultur in 3.2.7 beschrieben, gefärbt um den Anreicherungsgrad mit Motoneuronen dokumentieren zu können.. 3.3.3 Quantifizierung Es. wurden. ausschließlich. die. Daten. der. α-Motoneuron-Zellkulturen. mit. einem. Mindestreinheitsgrad von ≥90% verwendet.. 33.

(35) Kapitel 3 Material / Methoden. 3.3.3.1 Protektions-Test Für die Zellzählungen nach βH-Kristallingabe (bovin, Sigma) wurden die 4-Well-Platten der Zellkultur mit einem 25 mm2 großen Messquadrat versehen. Das Kristallin wurde nicht (Kontrolle) für 18 Stunden (einmalige induktive Applikation) oder kontinuierlich für den gesamten Zeitraum (zweite Applikation mit erstem Mediumwechsel nach 18 Stunden) verabreicht und jedes Experiment sechsmal wiederholt. 20 und 40 Stunden nach Aussaat wurden die verbliebenen Zellen, die ein oder mehr Fortsätze (mit einer Länge gleich dem doppelten Somadurchmesser) ausgebildet hatten, als vital bewertet und direkt unter dem Mikroskop mit einem "Zellcounter" gezählt.. 3.3.3.2 Neurotrophie Test Mit dem Kulturmedium wurde für die Neuritenlängen-Messung direkt nach Präparation für die ersten 18 Stunden der Kultivierung eine Konzentration von 50 ng/ml Q204EβB1, βHbovin sowie wtβB1 verabreicht. Als Kontrolle wurde sowohl S4-Medium + 20% KM (unbehandelte Kontrolle), als auch 50 ng/ml BSA (Sigma) bzw. 17,4 µg/ml Anti-βH-bovinAntikörper verwendet. Die Verabreichung erfolgte identisch zur einmaligen induktiven Applikation mit dem Kulturmedium für 18 Stunden (siehe 3.3.3.1). Jedes Experiment wurde 2- bis 3-mal wiederholt. Ausgewertet wurden nur Zellen, deren Neuriten nach 48 Stunden frei endeten und die mindestens einen Neuriten hatten, der eine Länge von 100 µm und mehr erreichte. Alle Zellen, bei denen nach 48 Stunden noch immer kein Neurit eine Länge von mindestens 100 µm erreicht hatte, wurden als beschädigt/abgestorben bewertet. Von den als vital bewerteten Zellen wurden 48 Stunden nach Präparation jeweils mindestens 25 Zellen/Well mit einer digitalen Mikroskopkamera (AxioCam, Zeiss) in den Computer eingelesen und mit Hilfe einer Bildbearbeitungssoftware (Axiovision, Zeiss) aufgezeichnet. Somadurchmesser, Somafläche, Fortsatzanzahl und Fortsatzlänge wurden anschließend mit einer Messsoftware (KS300, Zeiss) am Computer ermittelt.. 34.

(36) Kapitel 3 Material / Methoden. 3.3.4 Antigen-Antikörper Wirkung 3.3.4.1 Westernblot-Analyse Der einzig erhältliche Antikörper für βH-Kristallin war der polyklonale bovine Anti-βHAntikörper (Biogenesis). Um den Antikörper für ein Blockierungs-Experiment an βHKristallinen verschiedener Spezies (Huhn, Ratte, Rind) und am humanen, rekombinanten βB1-Kristallin zu testen, wurde eine Westernblot-Analyse durchgeführt. Zunächst wurden verschiedene Konzentrationen der Probensubstanzen für die diskontinuierliche SDSPolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) vorbereitet. Als Probensubstanzen dienten im 1. Westernblot 8 Augenlinsen vom E12 Hühnchen, 1 Augenlinse der adulten Ratte und 500 µg/ml βH-bovin. Für den 2. Westernblot wurden die humanen, rekombinanten βB1Kristalline wtβB1, Q204EβB1 und N157DβB1 sowie als Referenz die HPLC-Fraktion βHRatte verwendet. Die SDS-PAGE dient der charakteristischen Auftrennung von Proteinen aufgrund ihres Molekulargewichtes. Zur SDS-PAGE wurde eine 10fach Laufpufferstammlösung aus 250 mM Tris (Roth), 1,92 M Glycin, 0,1% SDS (Laurylsulfat, Sigma) und 0,02% NaN3 sowie Probenpuffer aus 130 mM Tris/HCL pH 6,8; 10% SDS, 10% β-Mercaptoehtanol (Sigma), Bromphenolblau (Sigma) und 20% Glycerin (Merck) hergestellt. Ein 14%iges AcrylamidGel wurde in die Elektrophoreseapparatur (Mini Protean, Biorad) gesetzt und ohne Blasenbildung mit ca. 150 ml 1fach Laufpuffer umspült. Anschließend wurden die Kämme behutsam aus dem Sammelgel gezogen, so dass gleichmäßige Geltaschen für die Probenlösungen entstanden. Die Probenlösungen wurden im Verhältnis 1:3 mit dem Probenpuffer gemischt und für 5 min im Thermoblock (BT 200, Kleinfeld) bei 95°C denaturiert, gevortext und kurz anzentrifugiert (5415C-Tischzentrifuge, Eppendorf). Nach Beladung des Sammelgels mit dem Probenpuffer (Proteinmenge etwa 30 µg pro Geltasche) wurde mit Hilfe des „Power Pac“ (3000, Bio Rad) eine Spannung von 100 Volt an das Gel angelegt, bis die Bromphenolblaufront in das Trenngel überging und schließlich auf 200 Volt erhöht. Die Auftrennung war abgeschlossen, als die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht hatte. Für die anschließende WesternblotAnalyse mittels „Tank-Blotting“ wurde das Gel aus der Elektrophoreseapparatur ausgespannt und für 10 min in Transferpuffer gelegt. 35.

(37) Kapitel 3 Material / Methoden. Der Transferpuffer bestand aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 20% Methanol. Gleichzeitig wurden 2 Whatmanpapierstücke und eine Nitrozellulosemembran (ECL RPN 303D, Hybond) zugeschnitten und ebenfalls in Transferpuffer getränkt. Anschließend. wurde. ein. „Sandwich“. aus. Schwammtuch,. Whatmanpapier,. Nitrozellulosemembran, SDS-Gel, Whatmanpapier und Schwammtuch zusammen gefügt und in ein Plexiglasgitter eingespannt. Zur Vermeidung von Luftblasen, die das „Blotten“ behindert hätten, wurde das gepackte Sandwich mehrmals sanft mit einer Pasteurpipette überrollt. Anschließend wurde das Eisfach und die Kassette mit der Nitrozellulose in Richtung Anode und Gel in Richtung Kathode eingesetzt und eine Spannung von 80 Volt für 1 Stunde angelegt. Zum Blocken unspezifischer Bindungsstellen wurde eine Magermilchemulsion aus 5% Magermilchpulver (Merck) in TBS-T (Tris-Buffered Saline-Tween) unter langsamen Rühren hergestellt. Der Blockpuffer TBS-T bestand aus 20 mM Tris/HCL pH 7,6; 137 mM NaCl und 0,1% Tween-20 (polyoxyethylensorbitan-monolaurat, Fluka). Nach Entnahme der Nitrozellulosemembran aus dem „Tank-Blotting“ wurde diese zunächst für eine Stunde bei Raumtemperatur in der Magermilchemulsion geblockt und anschließend 1 x 15 min und 3 x 5 min in TBS-T gewaschen. Da die Bindungseigenschaft des Anti-βH-bovin bei den verschiedenen Probensubstanzen getestet werden sollte, wurde dieser Antikörper in einer TBS-T Verdünnung 1:1000 eingesetzt und über Nacht bei 4°C mit der Nitrozellulosemembran inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte 1 x 15 min und 3 x 5 min Waschen in TBS-T. Der Zweit-Antikörper Esel-Anti-Schaf-Peroxidase (Jackson Immuno Research) wurde in einer TBS-T Verdünnung 1:50000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 x 15 und 3 x 5 min in TBS-T gewaschen. Zur Detektion wurde ECL (Enhanced Chemoluminescence Kit, Amersham) verwendet. Dabei wurden ECL 1 und ECL 2 im Verhältnis 1:1 vermischt und für 1 min mit der Nitrozellulosemembran inkubiert. Anschließend wurde diese mit Hilfe von Haushaltsfolie auf einer trockenen Glasplatte fixiert ohne Falten zu werfen. Die Visualisierung der Banden erfolgte direkt im Anschluss daran über die Belichtung eines Röntgenfilms (Curix HC 1000G, Agfa) und dessen Entwicklung (Curix 60, Agfa).. 36.

(38) Kapitel 3 Material / Methoden. 3.3.4.2 Antikörper-Blocktest Es wurden zunächst 17,4 µg/ml βH-Antikörper mit rekombinantem wtβB1 1- bis 2-Stunden bei Raumtemperatur präinkubiert und anschließend mit dem Kultivierungsmedium auf die frisch präparierten Motoneurone gebracht. 18 Stunden nach Präparation erfolgte nach 2maligem. gründlichen. Waschen. in. HBSS. der. erste. Medienwechsel. mit. Kultivierungsmedium ohne Antikörper oder Kristallin-Zusatz. Als Kontrolle dienten Applikationen von wtβB1-, βH-Kristallin und BSA. 48 Stunden nach Präparation wurden die Zellen, wie in 3.3.3.2 beschrieben, aufgezeichnet und ihre Neuritenlängen bestimmt.. 3.5 Statistik Alle “two sided students t-tests for Unpaired Comparison” wurden mit einem Signifikanzlevel von 0,05 mit der Software KyPlot Version 2.0 beta 13 (23 bit) für Windows (Koichi Yoshioka, 1997-2000) durchgeführt.. 37.

(39) Kapitel 4 Ergebnisse. 4 Ergebnisse 4.1 βH-Kristallin als neurotropher Faktor 4.1.1 E12-Gewebekultur Die Gewebekultur der serumfreien Kontrolle zeigte 20 Stunden nach Präparation ein gleichmäßiges, spontanes Auswachsen von 107 ± 18 Neuriten pro Explantat (n=20). Die Fasern waren kurz, änderten häufig die Wachstumsrichtung und faszikulierten kaum. Sie wuchsen oft nahe der Gewebegrenze um das Explantat herum. Einige Neurone, Mikroglia und Astrozyten wanderten aus dem Gewebe in die Peripherie aus (Abb. 4-1).. 500 µm. Abb. 4-1: E12-Gewebekultur 48 Stunden nach Explantation im serumfreien Medium ohne neurotrophe Faktoren. Man erkennt den Zentralkanal in der Mitte des Explantats. Astrozyten, Mikroglia und einige Neurone migrieren aus dem Explantat auf das Deckgläschen und bilden einen Saum. Spontan auswachsende Fasern sind nur bei stärkerer Vergrößerung inmitten des Saumes zu erkennen.. 4.1.2. Neurotrophe Wirkung des Kristallins Die Morphologie der auswachsenden Neuriten änderte sich bei den Explantaten nach Verabreichung der verschiedenen Kristalline und Wachstumsfaktoren. Die Fasern wirkten dicker, bildeten nach kurzer Zeit dicht gepackte Bündel und wuchsen gerade und weit aus dem Explantat heraus ohne häufig die Richtung zu ändern.. 38.

(40) Kapitel 4 Ergebnisse. Auch die Anzahl der Neuriten vergrößerte sich konzentrationsabhängig mit dem Einsatz der verwendeten neurotrophen Substanzen. Nach 20 Stunden erfolgte die Neuritenzählung, da durch die große Anzahl und starke Faszikelbildung nach 48 Stunden keine quantitative Auswertung mehr durchführbar war (Abb. 4-2).. A. 500 µm. B. 500 µm. Abb. 4-2: E12-Gewebekultur A) 20 Stunden nach Präparation und α-Kristallin-Applikation wachsen bereits die ersten langen Fasern aus dem Explantat. Die noch wenig faszikulierten Neurite lassen sich gut voneinander unterscheiden und zählen. B) Gleiches Präparat 48 Stunden nach Explantation in α-Kristallin haltigem Medium. Die Zahl der auswachsenden Neuriten hat sich vervielfacht. Starke Faszikulationen und zahlreiche Verzweigungen der einzelnen Neurite lassen keine quantitative Auswertung mehr zu.. Im Vorversuch wurde dem serumfreien Medium eine Konzentration von 4330 ng/ml Linsenhomogenat zugesetzt. 20 Stunden nach Explantation war ein signifikanter Anstieg von 107 ± 8 Fasern in der serumfreien Kontrolle, auf 165 ± 31 Fasern nach Linsenhomogenat zu beobachten („two sided student’s t-test“, α < 0.001; n=20) (Fig. 4-3). Dieser Wert wurde später als positive Kontrolle verwendet (Abb. 4-3).. 39.

(41) Kapitel 4 Ergebnisse. auswachsende Neurite / Explantat. 250. n = 20 **. 200. 150. 100. 50. 0. Kontrolle. 4330 ng/ml totales Linsenprotein. Abb. 4-3: Neuritenzahl in der E12-Gewebekultur 20 Stunden nach Explantation und Behandlung mit 4330 ng/ml totalem Linsenprotein im Vergleich zur Kontrolle im serumfreien Medium.. Als erste HPLC-Fraktion wurde das Kristallin α-Ratte getestet. Es zeigte sich ein streng konzentrationsabhängiger Effekt zwischen 5 ng/ml und 5000 ng/ml mit einem gegenüber der Kontrolle signifikant stärkerem Optimum bei 50 ng/ml mit 330 ± 78 Fasern/Explantat. auswachsende Neurite / Explantat. („two sided students t-test“, α < 0.001; n=20) (Abb. 4-4).. 450 400 n = 20 350 300 ** 250 200 150 100 50 0 Kontrolle 4 330 5 totales Linsenprotein. ***. 25. 50. 100. (ng/ml). 500. 1 000 5 000. Ratten α−Κristallin. Abb. 4-4: Konzentrations-Wirkungsbeziehung von α-Kristallin der Ratte in der E12-Gewebekultur 20 Stunden nach Explantation im Vergleich zur Kontrolle in serumfreien Medium.. 40.

(42) Kapitel 4 Ergebnisse. Bei höheren Konzentrationen verringerte sich zwar der Effekt des α-Ratte, unterschritt aber auch bei der höchsten Konzentration noch nicht die Wirkung des totalen Linsenproteins. Eine Gabe von bovinem αB-Kristallin zeigte dagegen bei 50 ng/ml nur eine Neuritenzahl von 237 ± 45 („two sided students t-test“, α < 0.001; n=20) (Abb. 4-5).. ***. 400. Anzahl der Neurite/Explantat. 350. n = 20. 300 250 200 150 100 50 0. Kontrolle. A+B Ratte. B Rind. α-Kristallin [50 ng/ml] Abb. 4-5: 50 ng/ml αA+B-Kristallin der Ratte (A+B Ratte) und αB-Kristallin des Rindes (B Rind) im Vergleich zur serumfreien Kontrolle.. Darauf folgend wurden die Mitglieder der βγ-Familie untersucht. Konzentrationen von 50 ng/ml – 20000 ng/ml zeigten bei γ- Kristallin in der Gewebekultur keine signifikant erhöhte neurotrophe Wirkung als die Kontrolle. Erst bei sehr hohen Konzentrationen von 35000 bis 60000 ng/ml wurde eine Wirkung ermittelt, die jedoch nicht signifikant höher als die des Linsenhomogenats war („student’s t-test“, α < 0.001, n=20). Da sich bei Konzentrationen von 40000-60000 ng/ml keine weiteren signifikanten Unterschiede zeigten, wurde bei 60000 ng/ml das Experiment abgebrochen (Abb. 4-6).. 41.

(43) auswachsende Neurite / Explantat. Kapitel 4 Ergebnisse. 250 200. **. n = 20. 150 100 50 0 Kontrolle. 4.3 0.05 totales Linsenprotein. 20 (µg/ml). 35. 40. 60. Ratten γ−Κristallin. Abb. 4-6: Konzentrations-Wirkungsbeziehung von γ-Kristallin der Ratte in der E12-Gewebekultur 20 Stunden nach Explantation im Vergleich zur Kontrolle in serumfreien Medium.. Die βL-Kristallin HPLC-Fraktion zeigte dagegen bei Konzentrationen von 5 und 25 ng/ml keinen, aber bei 50 ng/ml einen deutlich signifikanten Effekt auf die Anzahl der auswachsenden Neurite im Vergleich zur Kontrolle („student’s t-test“, α < 0.001). Höhere Konzentrationen brachten keinen größeren Effekt und bei 40000 ng/ml sank sogar die Anzahl der auswachsenden Neurite wieder, war aber immer noch signifikant erhöht. auswachsende Neurite / Explantat. gegenüber der Kontrolle („student’s t-test“, α < 0.001) (Abb. 4-7). 250 200. n = 20. **. 150 100 50 0 Kontrolle 4330 5 totales Linsenprotein. 25. 50 (ng/ml). 500. 5 000 20 000 40 000. Ratten βL-Kristallin. Abb. 4-7: Konzentrations-Wirkungsbeziehung von βL-Kristallin der Ratte in der E12-Gewebekultur 20 Stunden nach Explantation im Vergleich zur Kontrolle in serumfreien Medium.. 42.