Zellkulturtätigkeiten wurden unter sterilen Bedingungen ausgeführt. Medien und Medienzusätze waren vor Gebrauch durch 0,22( m Sterilfilter filtriert, Glasgeräte und Pipetten waren autoklaviert oder sterilisiert worden. Alle Medien und Waschlösungen waren auf 37 C vortemperiert. Die Zel-len wurden in einem Begasungsbrutschrank bei 37 C und in einer wassergesättigten Atmosphäre aus 5 % CO und 95 % Luft kultiviert.
A.1.3.1 Kulturbedingungen für humane Fibroblasten
Als Medium für adhärente primäre humane Fibroblasten wurde grundsätzlich DMEM „High Glu-cose“ (4.5 mg/ml) mit L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat und Natriumbikarbonat von Gibco in Pul-verform bezogen, nach Herstellerangaben in H O798?&>5<G gelöst, mit 3.7 g/l NaHCO sowie PenStrept (60 mg/l Penicillin Na-Salz 1666 U/mg; 100 mg/l Streptomycinsulfat 750 U/mg) versetzt, mit konz. HCl auf pH 7.2-7.4 gebracht, steril filtriert und bei 4 C maximal 4 Wochen aufbewahrt. Vor Verwendung wurde jeweils noch 10 % foetales Kälberserum (Pan, steril ab Hersteller) ergänzt.
Die Kultivierung der adhärenten Zellen erfolgte in 175 cm großen Zellkulturflaschen mit jeweils
111
112 A Methoden 35 ml Medium (DMEM H. G., 10 % FKS, s. o.!). Das Medium wurde jeweils am Tag 7 gewechselt.
Bei vollständiger Konfluenz mit hoher Zelldichte (meist nach 21 Tagen ab Aussaat) erfolgte ent-weder Teilung 1:2 und wiederum Aussaat in 175 cm -Zellkulturflaschen, oder aber Teilung 1:2.6 und Aussaat der Zellen je einer Flasche auf 3 Schalen mit Ø 150 mm (etwa 152 cm ). Jede Schale wurde auf ein Endvolumen von etwa 25 ml Medium gebracht (inklusive der Zellsuspension). Auch in den Schalen erfolgte am Tag 7 nach Aussaat ein Medienwechsel, da in der Regel nach dieser Zeit noch keine vollständige Konfluenz erreicht war. Am Tag 14 nach Aussaat (nur bei ausneh-mend schnell wachsenden Zellen bereits am Tag 7) erfolgte dann die Ernte (siehe unten).
Das Trypsinieren der 175 cm -Flaschen bzw. 150 mm Ø Schalen:
Nach Absaugen des Mediums erfolgte jeweils eine Waschung mit 10 ml PBS . Anschließend kam je Flasche 5 ml, je Schale 4.5 ml eiskaltes Trypsin/EDTA (Gibco, 0,25 % Trypsin / 0,02 % EDTA) zur Anwendung. Nach kurzem Verteilen wurde 3.5 bis 4 Minuten im Kulturschrank (37 C) inku-biert, die vollständige Ablösung der Zellen mikroskopisch kontrolliert (evtl. durch etwas Klopfen nachgeholfen) und dann sofort mit 37 C-warmem Medium abgestoppt: 10 ml für die Flasche, 5 ml je Schale.
Die Teilung:
Nach Trypsinieren und Abstoppen befand sich demnach ein Gesamtvolumen von 15 ml in jeder Flasche. Durch vorsichtiges Pipettieren erfolgte eine Homogenisierung der Suspension. Davon wurden je 7.5 ml in eine neue Flasche pipettiert, die restliche Hälfte in der alten Flasche belassen.
Je Flasche kamen 27.5 ml frisches Medium hinzu (Endvol. 35 ml).
Die Aussaat:
Die homogenisierten 15 ml Zellsuspension einer Flasche (nach Trypsinieren und Abstoppen) wur-den auf 3 Schalen (150 mm) verteilt und mit je 20 ml frischen Mediums ergänzt.
Die Ernte:
Nach Trypsinieren der Schalen (siehe oben, Endvol. je 9.5 ml) wurde die Zellsuspension aus je-weils 3 Schalen in einem Falcon-Tube gesammelt, jede Platte mit 5 ml PBS nachgewaschen und mit der abgenommenen Zellsuspension vereinigt, bei 300 g und 32 C 5 Minuten abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt, das Pellet in 7 ml PBS resuspendiert, gegebenenfalls zusammen mit ei-nem weiteren Ansatz in eiei-nem 15 ml Falcon vereinigt und erneut zentrifugiert (wie oben). Nach gründlichem Absaugen des Überstands erfolgte die Resuspendierung des Pellets in 0.5 ml eis-kaltem Einfrierpuffer (ANP%2 ) und der Transfer in ein 1.5 ml Eppendorf-Gefäß. Nach kurzem Vortexen wurde in flüssigem Stickstoff „schockgefrostet“ und dann bei -80 C gelagert.
Puffer:
(*) PBS (10x, 1 l): 80 g NaCl, 2 g KCl, 7.64 g Na HPO x2H O und 2 g KH PO mit H O798?&>5<G
auf 1 l bringen. In 1x-Puffer (Autoklavieren erfolgte in dieser Form) ist der pH in der Regel wie gewünscht bei 7.2.
(**) ANP%2 : 30 mM Tris-Cl pH 7.5, 35 % Glycerin, 3 mM MgCl , 1 mM DTT, 1 mM Benz-amidin, 1 mM PMSF, wobei die letzteren beiden jeweils frisch zugegeben wur-den.
Dauerkulturen:
Flaschen wurden trypsiniert wie oben beschrieben. Die Zellsuspension wurde 5 min bei 32 C und
A.1 Kulturbedingungen 113 300 g zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet auf Eis „geparkt“. Je 75 cm Zellrasen wurde das Pelletvorsichtigin 1 ml auf Eis vorinkubiertem Einfriermedium (DMEM High Glucose, 10 % FKS, 7.5 % DMSO) suspendiert, je 1 ml in 1 ml Nunc-Kryotubes abgefüllt (Gilson-Pipette), die Röhrchen in eine Styropor-Box überführt und bei -80 C mindestens über Nacht belassen (lang-sames Temperieren), um dann in flüssigen Stickstoff zur dauerhaften Lagerung verbracht zu wer-den. DMSO schädigt die Zellen um so mehr, je höher die Temperatur. Daher ist Arbeiten auf Eis essentiell.
Auftauen:
. Nach Entnahme aus N 4<5< 8?B ca. 1 min bei RT halten um Platzen zu vermeiden, dann unter Schwenken im 37 C-Ethanolbad auftauen bis auf kleinen Eiskern;
. Überführen in 10 ml warmes Medium (evtl. Ampulle nachspülen) und sofort zentrifugieren (5 min 250-300 g, 32 C);
. Überstand gut absaugen und Zellen schonend in 5 ml warmem Medium resuspendieren und in 25 cm -Flasche überführen;
. Medienwechsel am Folgetag, um DMSO-Reste und tote Zellen zu beseitigen;
A.1.3.2 Kulturbedingungen für humane Lymphoblasten
Als Medium wurde „RPMI mit L-Glutamin, ohne Natriumbikarbonat“ als Pulver von Gibco bezo-gen, nach Herstellerangaben mit NaHCO versetzt, in H O798:><G gelöst, PenStrept zugegeben (60 mg/l Penicillin Na-Salz 1666 U/mg; 100 mg/l Streptomycinsulfat 750 U/mg) und steril fil-triert. Das fertige Medium wurde maximal 4 Wochen bei 4 C aufbewahrt und vor Gebrauch mit 10 % foetalem Kälberserum (Pan, steril ab Hersteller) versetzt.
Die nicht adhärenten Zellen wurden wie folgt in Suspensionskultur genommen:
175 cm -Flaschen mit Lüftungsmembrane im Deckel wurden mit 50 bis 70 ml Medium gefüllt (je nach Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen) undstehendim Begasungsbrutschrank kultiviert.
Eine Zellzahl von 10 /ml sollte nicht überschritten werden. Ermittelt wurde die Zellzahl nach Homogenisieren mit einer 10 ml Glaspipette mittels einer Zählkammer (Neugebauer improved).
Entsprechend erfolgte eine Passage 1-2 mal pro Woche, wobei 1:3 bzw. 1:5 verdünnt wurde, je nach Wachstumsgeschwindigkeit der Zellinie.
Medienwechsel und Passage:
Der Flascheninhalt (50-70 ml) wurde auf 2 50 ml Falcontubes (steril) gesplittet (dekantiert, nach Homogenisierung), 7 min bei 350 g und 32 C zentrifugiert, jedes Pellet in 10 ml RPMI/FKS-Medium suspendiert und je nach gewünschtem Teilungsverhältnis auf die entsprechende Anzahl von Flaschen verteilt und je nach Wachstumsgeschwindigkeit auf 50 bzw. 70 ml Endvolumen ge-bracht. Zellkulturflaschen können mehrfach verwendet werden.
Kryokulturen:
Die Zellen wurden nach Zählung pelletiert wie oben beschrieben und sofort auf Eis gelagert. Zwi-schen 8 x 10 und 10 Zellen wurden in 1 ml eiskaltem Einfriermedium (RPMI 10 % FKS, 7.5 %
114 A Methoden DMSO) suspendiert wie für Fibroblasten beschrieben (A.1.3.1). Auch die weitere Prozedur ent-sprach diesem Protokoll.