Stan-dardbedingungen mit 1 mM GDP-Man 2 Minuten ohne bzw. in Anwesenheit von 250 und 500( M GDP inkubiert.
2. Im Solubilisat aus Kontrollzellen wurde wie oben verfahren, jedoch neben 250 und 500( M noch mit 1 mM GDP inkubiert.
In beiden Fällen war hinsichtlich der prozentualen Anteile der einzelnen Zwischenstufen am Ge-samtsignal keinerlei Veränderung bzgl. der Kontrolle ersichtlich; jedoch nahm die Signalstärke mit steigenden GDP-Konzentrationen signifikant zu, siehe Abb. III.9. In humanen Zellen ist damit keine der für die Schritte von DolPP-GlcNAc Man bis DolPP-GlcNAc Man postulierten vier Mannosyltransferasen durch GDP hemmbar. Andererseits hemmt GDP die offensichtlich auch im Fibroblastensolublilisat aktive LLO-spezifische Pyrophosphatase, die in Hefe von Belard et al.
(1988) [5] beschrieben worden war. Infolgedessen beinhalteten spätere Experimente 1 mM GDP als Pyrophosphataseschutz.
Abbildung III.9: Versuch, die 1,3-Mannosyltransferase mit GDP zu hemmen. Die Prozentanga-ben spiegeln die Zunahme der Nettoradioaktivität mit zunehmender GDP-Konzentration wider, die unabhängigvon den jeweiligen LLO-Intermediaten ist.
Solubilisat aus Kontrollfibroblasten: 2 Minuten GDP-Man-Verlängerung von DolPP-GlcNAc Man unter Standardbedingungen (A.2.11.7) und unterschiedlichen GDP-Konzentrationen - Dünnschichtchromatogra-phie Silica G60, C/M/H 65:25:4.1. Zu sehen sind die DolPP-GlcNAc Man -Bande (ganz rechts, das Edukt) sowie DolPP-GlcNAc Man und DolPP-GlcNAc Man (fast am Ursprung). DolPP-GlcNAc Man wird in diesem System nicht vernünftig aufgelöst (Schatten dicht oberhalb DolPP-GlcNAc Man ).
III.4.1.2 Taurocholat-Solubilisierung
Nach Sasaket al.(1984) [101] hemmt Taurocholat die 1,3-Mannosyltransferase. Allerdings wur-de in dieser Veröffentlichung nicht beleuchtet, ob im Taurocholat-Solubilisat die anwur-deren Man-nosyltransferasen noch aktiv sind. Insofern wurde versucht, durch Solubilisierung von Kontroll-fibroblastenmembranen mit unterschiedlich hohen Taurocholat-Konzentrationen in vitro DolPP-GlcNAc Man aus DolPP-DolPP-GlcNAc Man zu gewinnen (Daten nicht gezeigt).
Nur beim kleinsten Detergens zu Protein-Verhältnis von 1 war überhaupt ein Umsatz zu beobach-ten, jedoch ohne Akkumulation von Zwischenprodukten: Neben wenig DolPP-GlcNAc Man war nur das Endprodukt, DolPP-GlcNAc Man deutlich nachweisbar. Höhere Taurocholatkonzentra-tionen führten zur totalen Inhibierung.
76 III Synthese von Lipid gebundenen Oligosacchariden in humanen Fibroblasten und
„Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) III.4.1.3 Schwermetall-Inhibierung
Eine weitere Strategie zur Anreicherung von LLO-Intermediaten zwischen DolPP-GlcNAc Man und DolPP-GlcNAc Man war der Versuch, die Enzymaktivität durch Schwermetalle zu hemmen:
Soweit bekannt, sind alle GDP-Man abhängigen Mannosyltransferasen auf Mg" als Kofaktor an-gewiesen. Unter der Annahme, unterschiedliche Bindungsspezifitäten der einzelnen Enzyme hin-sichtlich Magnesium könnten zu unterschiedlichen Sensitivitäten bezüglich zweiwertiger Schwer-metalle ähnlicher Ionengröße führen, wurden folgende Experimente in Gegenwart von den übli-chen 10 mM MgCl durchgeführt:
10 mM Mn" ; Ni" , Zn" und Cd" jeweils 5 und 10 mM.
Mangan hemmte nur geringfügig, aber ohne Anreicherung eines spezifischen Intermediates. Alle anderen Schwermetalle inaktivierten schon bei 5 mM alle Transferasen total. Insofern wurde die-ser Ansatz nicht weiter verfolgt.
III.4.2 Gewinnung von DolPP-GlcNAc
XMan
Xüber Partialverdau von DolPP-GlcNAc
XMan
amit Jack bean
i-Mannosidase
Da es nicht möglich schienin vitroin hinreichendem Umfang ein DolPP-GlcNAc Man -Intermedi-at zu isolieren, das zur weiteren Aufklärung des P-Intermedi-atienten-Defekts unbedingt notwendig war, wur-de versucht, DolPP-GlcNAc Man durch partiellen Mannosidase-Verdau aus DolPP-GlcNAc Man zu gewinnen. Allerdings war unklar, ob die bekannten und kommerziell verfügbaren Mannosidasen auch lipidgebundenes Oligosaccharid spalten. Ein erster Versuch fand ja schon relativ erfolgreich statt, um die Identität von DolPP-GlcNAc Man zu bestätigen (vgl. II.4.1). Das hier mit NP40 geringer Konzentration in Lösung gebrachte DolPP-GlcNAc Man wurde allerdings deutlich un-vollständiger prozessiert als die gleiche Menge freien Oligosaccharids. Entweder hemmte Dolichol an sich, oder aber das Detergens war der Mannosidase abträglich. Doch eventuell wäre es ja mög-lich, ganz ohne Detergens zu arbeiten und das LLO-Substrat über Ultraschall in Reaktionspuffer zur Dispersion zu bringen. In wässerigem Medium sollten Mizellen mit nach außen gerichteten (hydrophilen) Oligosaccharidresten entstehen und damit zugänglich für die gut löslichen Manno-sidasen sein.
Um DolPP-GlcNAc Man zu DolPP-GlcNAc Man zu prozessieren kamen nun zwei kommerziell erhältliche Enzyme in Frage:
1. -Mannosidase aus „Jack bean meal“, deren Spezifität im Produktdatenblatt (Glyko) als auch in der Originalveröffentlichung zu diesem Enzym der Gruppe um Kobata [112] mit Man 1-2,6>3Man angegeben wurde, sich im Laufe dieser Arbeit, im Einklang mit einer späteren Veröffentlichung der Kobata-Gruppe [126], aber als Man 1-2,3>6Man herausstellte.
2. Eine Mannosidase, die ursprünglich aus Xanthomonas manihotisisoliert wurde [123], nun aber rekombinant ausE. colivonCalbiochemerhältlich ist. Deren Spezifität wird mit Man 1-2,3Man angegeben.
Im Weiteren wurde mit derJack bean -Mannosidase gearbeitet.
In ersten Versuchen zum Mannosidaseverdau stellte sich heraus, daß dispergiertes LLO bei einer 37 C-Inkubation an die Oberfläche steigt, sich somit von der löslichen Mannosidase trennt. Da-her wurde ein Eppendorf TDa-hermo-Mixer mit einer Deckelheizung versehen, die ein Kondensieren
III.4 Suche nach Wegen zu einem definierten DolPP-GlcNAc Man -Substrat 77 verhinderte (undbedingt notwendig bei einem Reaktionsendvolumen von nur 15( l zum Verdau).
Andererseits war so ein effektives Durchmischen möglich und die Dispersion blieb erhalten.
Um geeignete Bedingungen für die Substratgewinnung zu finden, wurde nun systematisch die Menge an Jack bean Mannosidase sowie die Inkubationszeit reduziert. Ein Optimum (überwie-gend DolPP-GlcNAc Man nach HPLC-Analyse) war erreicht bei 1/4 U/ml und 50 Minuten In-kubation bei 37 C. Je Einzelverdau kamen 40.600 cpm LLO[ H]Man -Substrat zum Einsatz, das ausin vivo-[ H]Man-Markierung von Hefealg3-Mutanten (A.2.7) gewonnen worden war.
III.4.3 Nachweis der Identität des aus Jack bean
i-Mannosidaseverdau gewonnenen DolPP-GlcNAc
XMan
Xals DolPP-GlcNAc
Xkj1,4Man-i
1,6Man
Bei dem aus Jack bean Mannosidaseverdau von DolPP-GlcNAc Man gewonnenen DolPP-GlcNAc Man könnte es sich entweder um Man 1-3Man 1-4GlcNAc -PPDol oder aber um Man 1-6Man 1-4GlcNAc -PPDol handeln. Nach Angaben des Herstellers sowie der dort zitier-ten Veröffentlichung von Tadashiet al.[112] war ersteres anzunehmen. Zur Überprüfung der
Iden-Radioaktivität [cpm]
M1 M2
260
130
M1
700
350
Zeit [min]
Abbildung III.10: Analytischer Verdau des DolPP-GlcNAc Man -Substrats aus Jack bean Mannosidase-Verdau nach Hydrolyse:
Links: Verdau mitl 1-2,3-spezifischer Mannosidase; rechts: Verdau mitl 1,6-spezifischer Mannosidase. Je-weils HPLC-Elutionsprofile, M = GlcNAc Man , M = GlcNAc Man .
Das Profil links entspricht genau dem Profil unverdauten GlcNAc Man , das bei dieser Präparation auch etwas GlcNAc Man enthielt.
78 III Synthese von Lipid gebundenen Oligosacchariden in humanen Fibroblasten und
„Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) tität wurde DolPP-GlcNAc Man mildsauer hydrolysiert.
Die eine Hälfte wurde mit einer Man 1-2,3Man spezifischen Mannosidase ausXanthomonas ma-nihotis[123] verdaut (Calbiochem). Deren Aktivität bzgl. der Man 1-3Man-Bindung war vorher überprüft worden. Der Verdau erfolgte mit 10 U Mannosidase (5( l Enzym wie geliefert) 24 h bei 37 C (Abb. III.10, links). Näheres zur Methodik ist unter A.2.8.2 beschrieben.
Die andere Hälfte wurde mit einer ebenfalls ausXanthomonas manihotisstammenden [123] Man 1-6Man-spezifischen Mannosidase (Calbiochem) verdaut (1.125 mU Enzym bei 37 C 3.5 h, siehe A.2.8.3): Abb. III.10, rechts.
Wie aus den HPLC-Analysen beider Verdaue in Abb. III.10 ersichtlich, handelt es sich also bei der zweiten Mannose des vorliegenden DolPP-GlcNAc Man -Substrats um die 1,6-, nicht wie erwünscht und erwartet die 1,3-Verknüpfung.
Die hier gefundene, von der Produktbeschreibung abweichende, Spezifität des Enzyms wird durch eine zweite Veröffentlichung der Gruppe um Kobata bestätigt [126].