Optimierung der Reaktionsparameter und Kinetik der Reaktio-

Um den zeitlichen Ablauf der Reaktionen von DolPP-GlcNAc Man bis DolPP-GlcNAc Man , sowie die dabei sukzessive auftretenden Intermediate zu untersuchen, wurden zunächst Kinetiken durchgeführt und durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Gleichzeitig dienten diese Ex-perimente dazu, die Reaktionsbedingungen noch weiter zu verfeinern und letztlich zu dem unter A.2.11.7 beschriebenen Standardprotokoll zu gelangen.

Eine bereits unter weitgehend optimierten Bedingungen durchgeführte Kinetik ist in Form der Dünnschichtchromatographie in Abb. III.6 gezeigt. Alle Intermediate außer DolPP-GlcNAc Man lassen sich hier klar ansprechen. DolPP-GlcNAc Man ist mengenmäßig ähnlich schwach ver-treten wie DolPP-GlcNAc Man (siehe dazu HPLC-Analyse, Abb. III.11) und trennt sich in die-sem System kaum von DolPP-GlcNAc Man . Hier wurde noch mit einem Detergens zu

Protein-0´ 2´ 4´ 8´ 16´

LLOM₁ LLOM2 LLOM₃ LLOM_4/5

Abbildung III.6: Solubilisat aus Kontrollfibroblasten: Kinetik der DolPP-GlcNAc Man -Verlängerung mit GDP-Man bei 37 C

Dünnschichtchromatographie der Extrakte aus Lower- und Interphase: Silica G60, Laufmittel CHCl /CH OH/H O 65:25:4.1; die Reaktionen wurden bei den angegebenen Zeiten (Minuten) abgestoppt.

Zeit 0 entspricht dem eingesetzten DolPP-GlcNAc Man -Substrat.Reaktionsbedingungen: Fibroblasten-solubilisat aus 50^! g Membranprotein je Reaktion (NP40/P = 2.5 nmol/^! g zur Solubilisierung), 3000 cpm DolPP[ C]GlcNAc Man , 1 mM GDP-Man.

Verhältnis von 2.5 nmol/⁽ g gearbeitet. Wie ersichtlich, erfolgte der Umsatz von DolPPGlcNAc -Man (LLOM ) selbst im längsten Inkubationszeitraum von 16 Minuten nicht quantitativ. Durch Reduzierung des Detergens zu Protein-Verhältnisses auf 2.3 nmol/⁽ g konnte schließlich ein quanti-tativer und schnellerer Umsatz erzielt werden. Dies ist in Abb. III.7 zu sehen, wo Kinetiken für zwei Zeitfenster nach Dünnschichtchromatographie quantifiziert wurden und in Form der prozentualen Intermediatanteile, aufgetragen gegen die Zeit, dargestellt sind. Bereits innerhalb von 4 Minuten werden über 80 % des eingesetzten DolPPGlcNAc Man -Substrats nach DolPPGlcNAc Man um-gesetzt, innerhalb von 8 Minuten erfolgt ein praktisch quantitativer Umsatz zu DolPPGlcNAc Man .

70 III Synthese von Lipid gebundenen Oligosacchariden in humanen Fibroblasten und

„Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) Dies bedeutet also, daß die hier untersuchten Enzyme gegenüber höheren NP40-Mengen sensi-bel reagieren – in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von Jensen und Schutzbach 1981 [48], die für eine partiell gereinigte 1,3-Mannosyltransferase (und wie sich unter III.5.3 her-ausstellen wird, verkörpert diese Transferase das Enzym von DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man ) ausgesprochen hohe NP40-Sensitivität berichteten.

Aus Abb. III.7 unten wird deutlich, wie schnell die Bildung von DolPP-GlcNAc Man vor sich geht, ohne daß nennenswerte Mengen von GlcNAc Man auftreten. Damit ist DolPP-GlcNAc Man das einzige Intermediat, das in größerem Umfang akkumuliert. Zwischen ein und zwei Minuten erreicht es einen Anteil von etwa 30-50 % (vgl. Abb. III.8 und III.11 für die Kontrolle und Abb. IV.11 für Kontrolle und Patient). Nur leicht verzögert steigt dann DolPP-GlcNAc Man schnell an, während der Umfang von DolPP-GlcNAc Man marginal bleibt.

Warum aber sollten nun die Intermediate DolPP-GlcNAc Man und DolPP-GlcNAc Man in so viel niedriger Konzentration auftreten als DolPP-GlcNAc Man ? Würden einmal Enzym 1 (LLO-Man^bIMJ LLOMan ) und Enzym 2 (LLOMan ^IMJ LLOMan ), zum anderen Enzym 3 (LLOMan

IMJ LLOMan ) und Enzym 4 (LLOMan^cIMJ LLOMan ) einen Komplex ausbilden, wäre die lo-kaleKonzentration der LLO-Substrate der Enzyme 2 und 4, nämlich DolPP-GlcNAc Man und DolPP-GlcNAc Man besonders hoch. Sie bekämen diese Intermediate von ihrem Komplexpart-ner quasi „weitergereicht“. Diese hohe lokale Konzentration würde zu einem schnellen Umsatz führen und es käme zu keiner nennenswerten Anhäufung von LLOMan und LLOMan . Dage-gen läge das Produkt von Enzym 2 bzw. Edukt von Enzym 3, nämlich DolPP-GlcNAc Man , in

„Freiheit“ vor: Um zu ähnlich hohen Eduktkonzentrationen zu kommen wie sie lokal in den pos-tulierten Komplexen herrschten, müßte sich eine wesentlich größere Menge akkumulieren – was ja auch experimentell zu beobachten ist.

Für diese Hypothese sprechen nun nicht nur die hier vorliegenden Daten aus denin vitro-Experimen-ten. Jensen und Schutzbach berichteten bereits bei ihrem Versuch, die 1,3-Mannosyltransferaseak-tivität zu reinigen, von dem Problem, daß selbst nach 660-facher Aufreinigung und Abtrennung von jeglicher 1,2-Mannosyltransferaseaktivität noch immer eine 1,6-Restaktivität enthalten war [48]. Dies könnte durchaus für einen stabilen Komplex zwischen 1,3- und 1,6-Transferase (En-zymen 1 und 2, siehe III.5.3) sprechen.

Auch für einen Komplex der beiden 1,2-Mannosyltransferasen gibt es Hinweise: In ihrer Veröf-fentlichung zumS. cerevisiae ALG11-Gen untersuchten Cipolloet al.[12] detailliert den alg11-Disruptionsstamm sowohl hinsichtlich der Zusammensetzung des LLO-Pools und seiner Saccharid-Strukturen, als auch in Hinsicht auf die proteingebundenen Oligosaccharidstrukturen (siehe auch Einleitung). Und obgleich das beschriebene ALG11 aller Wahrscheinlichkeit nach die für den Schritt von DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man verantwortliche 1,2-Mannosyltrans-ferase codiert, ist das Bild doch keineswegs ungetrübt klar: In der LLO-Fraktion dieser Disruptante reichert sich nicht, wie zu erwarten wäre, eine DolPP-GlcNAc Man -Fraktion an. Vielmehr gibt es eine signifikante DolPP-GlcNAc Man -Fraktion, deren Ursache der Erklärung harrt. Desweite-ren zeigen die AutoDesweite-ren mittels Strukturanalysen der längerkettigen, luminalen LLO-Fraktion, daß etwa 50 % der translozierten LLOs auf DolPP-GlcNAc Man zurückgehen, nur die anderen 50 % haben in DolPP-GlcNAc Man ihren Ursprung. Selbst proteingebunden machen die von DolPP-GlcNAc Man herrührenden Oligosaccharide einen recht großen Anteil aus.

Die Autoren argumentieren nun, ein schlechter Transfer („flipping“) von DolPP-GlcNAc Man ins Lumen des ER führte dazu, daß vermehrt DolPP-GlcNAc Man ins Lumen transloziert wür-de. Dies Argument scheint wenig einleuchtend: Würde DolPP-GlcNAc Man wirklich so schlecht transloziert, sollte auch ein DolPP-GlcNAc Man -Pool nachweisbar sein – was nicht der Fall ist.

III.3 Aufbau einesin vitroTests zur Verlängerung von DolPP-GlcNAc bzw.

DolPP-GlcNAc Man 71

Anteil [%]Anteil [%]

Abbildung III.7: Kinetik und Kurzzeitkinetik der DolPP-GlcNAc Man -Verlängerung mit GDP-Man in Kontrollfibroblastensolubilisat: endgültige Solubilisierungs- und Reaktionsbedingungen Extrakte aus Lower- und Interphase wurden via Dünnschichtchromatographie Silica G60, Laufmittel CHCl /CH OH/H O 65:25:4.1 analysiert, über Phosphorimaging und Optiquant-Software quantifiziert und die jeweiligen LLO-Fraktionen prozentual gegen die Zeit aufgetragen. Zeit 0 entspricht dem Ausgangssub-strat DolPP-[ C]GlcNAc Man .

Oben: Langzeitkinetik, unten: Kurzzeitkinetik: Beide Experimente sind völlig unabhängig voneinan-der, d. h. verschiedene Membranpräparationen und Solubilisierungen. Reaktion: Fibroblastensolubilisat aus 56 ^! g Membranprotein je Reaktion (NP40/P = 2.3 nmol/^! g zur Solubilisierung), 3000 cpm DolPP-[ C]GlcNAc Man , 1 mM GDP-Man, 37 C.

72 III Synthese von Lipid gebundenen Oligosacchariden in humanen Fibroblasten und

„Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) Insofern kann aber auch nicht von einer Endprodukthemmung oder dergleichen der ersten 1,2-Transferase durch ihr Produkt, DolPP-GlcNAc Man , ausgegangen werden. Vielmehr scheint DolPP-GlcNAc Man erst gar nicht in ausreichendem Umfang zu entstehen. Aber all das, was entsteht, muß sofort effektiv ins ER transloziert werden. Dort erfolgt die weitere Verlängerung bis DolPP-GlcNAc Man Glc und dann der Transfer durch die OST auf naszierende Polypeptidket-ten.

Von der OST wiederum ist bekannt, daß eine ausgesprochen stark ausgeprägte Selektivität für das Vollängen-Oligosaccharidlipid besteht – solange dies in ausreichendem Umfang vorhanden ist. Erst bei drastischem Mangel an Vollängen-LLO werden auch kürzerkettige Oligosaccharide übertragen – dann aber praktisch ebenso effektiv wie das Vollängen-Substrat [52]. Da von translo-ziertem DolPP-GlcNAc Man herrührende LLOs maximal bis DolPP-GlcNAc Man luminal pro-zessiert werden (keine Glucosylierung möglich), stellen diese LLOs, insbesondere aufgrund des Fehlens der drei Glucose-Einheiten, zweifelsohne ein weitaus schlechteres Substrat für die OST dar als DolPP-GlcNAc Man Glc . Wenn sich dennoch ein signifikanter Anteil der proteingebun-denen Oligosaccharide auf ins ER-Lumen transloziertes DolPP-GlcNAc Man (und damit von der OST akzeptiertes DolPP-GlcNAc Man ) zurückführen lassen, spricht das für einen ernsten Man-gel an DolPP-GlcNAc Man Glc -Substrat (und damit DolPP-GlcNAc Man ).

Alles in allem heißt das, daß zwar inS. cerevisiae alg11 tatsächlich substantiell nur die DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man prozessierende 1,2-Mannosyltransferase betroffen ist.

Dennoch scheint die nachweislich vorhandene (sonst entstünde ja absolut kein DolPPGlcNAc -Man ), für die Prozessierung von DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man zuständige,

1,2-Transferase in ihrer Aktivität sehr stark eingeschränkt. Postuliert man nun einen Komplex aus diesen beiden Transferasen – wofür die hier vorliegendenin vitro-Daten sprechen – in dem beide Enzyme, eng assoziiert, ihre Aktivität in gewisser wechselseitiger Abhängigkeit entfalten, erklärt sich dieses Phänomen ganz zwanglos.

Es gibt also gute Gründe, in der Tat einen Komplex aus Enzym 1 und 2 einerseits und 3 und 4 an-dererseits anzunehmen. Auf diese Weise würde Sorge getragen, daß einerseits die höchst wichtige und strukturell komplexe Verzweigung an der initialen, 1,4-gebundenen Mannose korrekt abläuft ( 1,3- und 1,6-Ast), andererseits in schneller Folge beide 1,2-gebundenen Mannosen addiert und so eine vorschnelle Translokation von DolPP-GlcNAc Man zuverlässig vermieden würde.

Denn dies scheint, wie aus [12] ersichtlich (kein LLOM nachweisbar), zumindest in alg11sehr effektiv möglich zu sein. Dagegen weist die Akkumulation von DolPP-GlcNAc Man in alg11 deutlich darauf hin, daß dieses Intermediat erheblich schlechter transloziert wird – was auch phy-siologisch sinnvoll wäre. Denn wie den hier gezeigtenin vitro-Experimenten zu entnehmen, ist es gerade DolPP-GlcNAc Man , das im Ablauf der Prozessierung von DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man als einziges Intermediat in nennenswertem Umfang auftritt.

III.3.3.2 Vergleichskinetik der DolPP-GlcNAc Man -Verlängerung im Solubilisat aus