III.5 Ein neuer CDG-Fall, Subtyp Ii: Identifizierung und biochemische Charakterisie-
III.5.1 Im Enzymsolubilisat aus Patientenzellen ist die Verlängerung von DolPP-
Nachdem bereits aus den vorangegangenen Experimenten ein Defekt im Schritt von DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man wahrscheinlich erschien (Dünnschichtchromatographie-en, siehe Abb. III.8), erfolgte eine bestätigende HPLC-Analyse - wegen der besseren Trennlei-stung. Solubilisat aus Kontroll- und Patientenzellen wurde nach Standardmethoden A.2.11.7 ge-wonnen und mit GDP-Man sowie DolPP-[ C]GlcNAc Man umgesetzt. Die Aufarbeitung (A.2.11.9) sowie HPLC-Analyse (A.3.1) erfolgte wie im Methodenteil vermerkt. Aus Abb. III.11 geht klar hervor, daß die Reaktion von DolPP-GlcNAc Man bis DolPP-GlcNAc Man im Solu-bilisat aus Membranen von Kontrollzellen innerhalb von nur 4 Minuten nahezu quantitativ abläuft.
Dabei sind bei 2 Minuten alle Intermediate von DolPP-GlcNAc Man bis DolPP-GlcNAc Man präsent, besonders dominant DolPP-GlcNAc Man (wie auch schon in den Dünnschichtchroma-tographieen Abb. III.6 und III.8). Ganz anders im Patienten-Solubilisat, wo selbst nach 4 Minu-ten nicht mehr als eine Andeutung von Man -Oligosaccharid zu detektieren ist – ohne daß da-bei Intermediate gleich welcher Art aufträten. Folglich muß im Patienten der Schritt von DolPP-GlcNAc Man nach DolPP-GlcNAc Man betroffen sein. Folgerichtig sind auch keine Interme-diate nachzuweisen, da die nachfolgenden, in normaler Geschwindigkeit ablaufenden Reaktio-nen keine Anhäufung von Zwischenstufen zulassen. Dagegen verläuft die Reaktion von DolPP-GlcNAc nach DolPP-DolPP-GlcNAc Man völlig normal (siehe III.5.3).
III.5.2 Das defekte Patientengen ist das humane Ortholog zum ALG2 aus Saccharomyces cerevisiae
Untersuchungen von Thiel und Körner zufolge, die zusammen mit den vorliegenden Ergebnissen in [114] veröffentlicht sind, war nach metabolischer Markierung mit [ H]Man auch eine, aller-dings deutlich untergeordnete, Akkumulation von DolPP-GlcNAc Man in vivo zu beobachten,
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Radioaktivität [cpm] 450160400 400
Inkubations-zeit
10 20 30 40 10 20 30 40
Zeit [min]
Kontroll-Fibroblasten Patienten-Fibroblasten
Abbildung III.11:In vitroassay:
Dol-PP-GlcNAc Man + X GDP-Man IMJ Dol-PP-GlcNAc Man " + X GDP
HPLC-Profile; links: Kinetik mit Kontrollfibroblasten-Solubilisat von 0 bis 4 Minuten; rechts:
Patientenfibroblasten-Solubilisat 4 Minuten Reaktion, sowie schematische Darstellung der Reaktionsfolge bis DolPP-GlcNAc Man mit Kennzeichnung des Patientendefekts.
diein vitro nicht zu bestätigen war (vgl. Abb. III.11). Dies erinnerte an den Phänotyp der alg2-1-Mutante bei S. cerevisiae (vgl. Abb. III.14) [42]. Bei Überprüfung des Genotyps des Patienten zeigte sich in der Tat, daß Mutationen im präsumptiven humanenALG2 Ortholog nachzuweisen sind: Das väterliche Allel des Patienten wies eine Substitutionsmutation auf (G393T), was instabi-le Transkripte zur Folge hat, das mütterliche Alinstabi-lel war mit einer Einzelnukinstabi-leotiddeinstabi-letion behaftet ( 1040G), was zu einem Frameshift führt, die Stabilität der m-RNA aber unberührt läßt [114].
Infolgedessen schien es wichtig zu überprüfen, ob die aufgrund von Sequenzähnlichkeiten ver-bunden mit demalg2-1-ähnlichen Phänotyp postulierte Orthologie tatsächlich gegeben ist. Daher wurde sowohl die cDNA des potentiellen hALG2als auch die des mütterlichen Allels ( 1040G) in einen Hefe Shuttle-Vektor unter Kontrolle desPMA1-Promotors kloniert und jeweils, wie auch der leere Vektor, in dieS. cerevisiae alg2-1-Mutante transformiert (A.4.4). In den Abb. III.12 und III.13 sind die an den transformierten Stämmen gemachten Untersuchungen zusammengefaßt.
Zunächst wurde der in vivo-Pool an lipidgebundenen Oligosacchariden analysiert. Nach 30 Mi-nuten metabolischer Markierung mit [2- H]Mannose wurden die kurzkettigen, relativ unpolaren LLOs mit CHCl /CH OH, die längerkettigen mit CHCl /CH OH/H O extrahiert (A.2.7). Durch mildsaure Hydrolyse wurden die Oligosaccharide vom Dolicholrest abgespalten (A.2.11.9) und
80 III Synthese von Lipid gebundenen Oligosacchariden in humanen Fibroblasten und
„Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) über HPLC aufgetrennt (A.3.1). Wie aus Abb. III.12 ersichtlich, ist der C/M-Extrakt der alg2-1-Mutante transformiert mit dem humanen ALG2-Homolog (hWt) aus Kontrollzellen praktisch frei von kurzkettigen LLOs. Anders dagegen der mit dem humanen 1040G ALG2-Homolog aus Patientenzellen (hPat) transformierte Klon: Hier sind ein deutlicher Peak an der Position des GlcNAc Man -Standards sowie evtl. eine marginale Fraktion von GlcNAc Man zu beobachten.
Damit im Einklang die HPLC-Profile der C/M/H-Extraktion (Abb. III.13 oben). Bei
Expressi-Radioaktivität [cpm]
Zeit [min]
Hefealg2+ hALG2WT Hefealg2+ hALG2Pat
Abbildung III.12: Komplementation deralg2-1Hefemutante mit Patientengen und humanem Kon-trollgen: C/M-LLO-Extrakt
Siehe Untertext der Abb. III.13 zur weitergehenden Erläuterung
on des humanen Kontrollgens inalg2-1findet sich die für den LLO-Pool des Endoplasmatischen Reticulums charakteristische Verteilung. Die Zellen mit humanem Patientengen hingegen zeigen praktisch keine längerkettigen Oligosaccharide, dagegen ungewöhnlich viel an Tri- und Tetrasac-charid (M bzw. M ).
Eine weitere Untersuchung galt dem Wachstumsverhalten der mit hWt, hPat bzw. dem leeren Vek-tor transformierten alg2-1-Klone. alg2-1 zeigt einen deutlichen Wachstumsphänotyp bei 30 C, wächst aber annähernd normal bei der permissiven Temperatur (25 C). In Abb. III.13 Mitte ist die bei 30 C besonders deutliche Komplementation des Wachstumsphänotyps durch das humane Ho-molog aus Kontrollzellen klar erkennbar. Dagegen zeigt sich das humane HoHo-molog des Patienten ebenso wirkungslos wie der Vektor.
Zuletzt wurde noch die proteingebundene Glykosylierung der vorgestellten drei Klone analysiert.
Dazu wurde die Carboxypeptidase Y (CPY) untersucht. Die CPY der Hefe ist eine vakuoläre Se-rinprotease und wird vomPRC1-Gen kodiert [115]. Sie ist ein Glykoprotein und verfügt über vier N-Glykosylierungsstellen. Aufgrund einer 2 kDa großen Signalsequenz erfolgt die Translokation in das ER. Die Präproform der CPY besitzt ein Molekulargewicht von 59.5 kDa. Im ER erfolgt nach Abspaltung der Signalsequenz die core-Glykosylierung, aus der dann die 67 kDa p1-Form hervorgeht. Die weitere Prozessierung der vier core-Ketten des Proteins beginnt noch im ER und wird nach dem Transport in den Golgi-Apparat dort fortgesetzt. So entsteht zunächst die p2-Form mit 69 kDa, die dann durch Abspaltung der 8 kDa großen Prosequenz in die reife, proteolytisch
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aktive m-Form mit 61 kDa übergeht.
Abbildung III.13: Komplementation deralg2-1Hefemutante mit Patientengen und humanem Kon-trollgen
HPLC-Profile: Abb. III.12 C/M-,diese Abb. oben C/M/H-Extrakte nach metabolischer Markierung mit
H-Man. Nach mildsaurer Hydrolyse erfolgte die Auftrennung via HPLC nach Standardmethoden. M (G ) beziehen sich auf die Oligosaccharid-Standards GlcNAc Man (G ).Mitte: Wachstum von S. cerevisiae alg2-1-Zellen, transformiert mit dem Vektor, dem humanen Kontrollgen (hWt) oder dem Patientengen (hPat) bei permissiver (25 C) oder restriktiver (30 C) Temperatur. Unten: Glykosylierungsstatus der Car-boxypeptidase Y bei permissiver (25 C) und restriktiver (36 C) Temperatur. Metabolische Markierung mit
S-Methionin (30 min), Immunpräzipitation und SDS-PAGE; die Position der maturen CPY im Wildtyp (mCPY) sowie die unterglykosylierten Formen sind rechts vermerkt.
82 III Synthese von Lipid gebundenen Oligosacchariden in humanen Fibroblasten und
„Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) Dem untersten Teil der Abb. III.13 kann nun die Glykosylierung der CPY aller drei Klone entnom-men werden: Nachin vivo-Markierung mit [ S]-Methionin, durchgeführt bei permissiver (25 C) als auch restriktiver (36 C) Temperatur und Immunpräzipitation (A.2.9) erfolgte die Auftrennung via 8 % SDS-PAGE. Bei permissiver Temperatur zeigen praktisch alle untersuchten Klone noch die beim WT dominante 61 kDa Bande, wenngleich bereits unterglykosylierte Formen bei den mit Vektor und hPat transformierten Klonen zu erkennen sind. Bei 36 C fehlt dann bei den Letzt-genannten die 61 kDa Bande, die der mit vier N-gebundenen Oligosaccharidketten vollständig glykosylierten CPY entspricht, völlig. Vorhanden sind die -1, -2 und -3-Formen sowie das völlig unglykosylierte Protein. Dagegen besteht die Hauptfraktion der aus dem mit hWt transformierten Klon isolierten CPY aus der vollständig glykosylierten Form mit etwa 61 kDa. Leichtere (-1 und -2) Formen sind nur in geringem Ausmaß vorhanden.
Aus der Untersuchung der LLO-Pools, des Wachstumsphänotyps und der CPY-Glykosylierung der mit dem Vektor, hWt bzw. hPat transformierten Klone muß folglich von einer Komplementation des Defekts der Hefealg2-1-Mutante durch das humane Kontrollgen, nicht jedoch durch das Pati-entengen ausgegangen werden. Das defekte Gen im untersuchten Patienten ist also in der Tat das Ortholog zumS. cerevisiae ALG2 und der Defekt ursächlich für den biochemisch beobachteten Glykosylierungsphänotyp.
In Abb. III.14 ist der von Robbins et al.ermittelte biochemische Phänotyp für die S. cerevisiae alg2-1-Mutante dargestellt. Nach mildsaurer Hydrolyse waren die [ H]Man-markierten Oligosac-charide auf einer Bio-Gel P4-Säule getrennt worden [42]. Daneben ein Schema, das die mögli-che Reaktionsabfolge sowie die möglimögli-che Funktionalität von Alg2p (und damit den Block in der Prozessierung, dargestellt mit durchgestrichenem Pfeil) skizziert. Wie zu ersehen, ist es bisher un-klar, wie es zur Akkumulation von überwiegend DolPP-GlcNAc Man , daneben aber auch einer signifikanten Population von DolPP-GlcNAc Man kommt. In dieser wie einer früheren Veröf-fentlichung zuralg2-Mutante [38] werden sich widersprechende Hypothesen ins Feld geführt, von denen jedoch keine mit den bisherigen experimentellen Daten zu widerlegen war. Mit dem eta-bliertenin vitro Test und einem definierten DolPP-GlcNAc Man -Substrat sollte daher versucht werden, Klarheit zu gewinnen.
Abbildung III.14: Der biochemische Phänotyp vonS. cerevisiae alg2-1nach Robbinset al.[42]:
Nach wie vor bleibt unklar, für welche Transferaseaktivität Alg2p steht. Auch die enzymatische Abfolge liegt im Dunkel:l 1,3Man vorl 1,6Man, oder umgekehrt?
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