Zellbiologische Methoden

3.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen

Die Zellen wurden in wassergesättigter Atmosphäre unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Medien und Lösungen wurden auf 37 °C vorgewärmt. Im Allgemeinen erfolgte die Kultivierung der Zellen mit dem folgenden Medium:

Normalmedium: DMEM 10 % dialysiertes FKS

1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (100  Stocklösung) 1 % (v/v) Glutamin (200 mM, 100  Stocklösung).

Hygromycin-Stocklösung: 394 mg/ml Hygromycin B.

Medien für stabil transfizierte Zellen mit pcDNA3.1-Hygro (+) enthielten zusätzlich 0,5 mg/ml Hygromycin B.

3.3.1.1 Trypsinieren von Zellen

Die Trypsinierung und Passage der Zellen erfolgte im Allgemeinen nach Erreichen der Konfluenz des Zellrasens. Das Medium wurde abgesaugt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Nach dem Absaugen des PBS wurden die Zellen etwa 5 min mit 0,05 % (w/v) Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe) bei 37 °C bis zum Abrunden der Zellen inkubiert. Die Trypsinierung wurde durch Zugabe von Normalmedium gestoppt. Die Zellen wurden durch mehrfaches Aufsaugen mit der Pipette vereinzelt und dann in der gewünschten Dichte ausgesät. Um die Zellen zur weiteren Verarbeitung zu pelletieren, wurden sie in der Labofuge 5 min bei 1 000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit PBS gewaschen und erneut abzentrifugiert. Die Zellpellets wurden bei Bedarf bei -20 °C gelagert.

3.3.1.2 Kryokonservierung von Zellen

Einfriermedium: 10 % DMSO in Normalmedium.

Die Zellen wurden trypsiniert, in Normalmedium aufgenommen und in der Labofuge (1 000 rpm, 5 min) pelletiert. Nach Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in 1 ml kaltem Einfriermedium aufgenommen und in Kryoröhrchen überführt. Die Zellen

wurden zunächst bei -80 °C eingefroren und nach 24 h in flüssigen Stickstoff überführt.

3.3.1.3 Auftauen und Revitalisieren von Zellen

Die Kryoröhrchen wurden aus dem Stickstoff genommen. Die Zellsuspension wurde bei 37 °C aufgetaut und direkt nach dem Auftauen in 5 ml 4 °C kaltem Normalmedium aufgenommen. Die Zellen wurden in der Labofuge (1 000 rpm, 5 min) pelletiert. Der Überstand wurde abgesaugt. Die Zellen wurden in 10 ml warmen Normalmedium resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt. Nach 24 h wurde das Medium gewechselt. Falls erforderlich, wurde dem Medium Selektionsantibiotikum zugesetzt.

3.3.2 Transfektion von eukaryontischen Zellen

Zur Transfektion von adhärenten Zellen in Zellkultur wurde das FuGENE^TM Transfektionsreagenz verwendet. Die Transfektion wurde auf 6-cm-Zellkulturschalen nach Angaben des Herstellers durchgeführt (FuGENE^TM Transfektionsreagenz Handbuch 2007, Roche Applied Science, Indianapolis, USA). Die Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit 70 % Konfluenz ausgesät. Für die Transfektion wurden 6 µl FuGENE^TM Transfektionsreagenz mit 200 µl serumfreiem DMEM vorsichtig vermischt. Der Ansatz wurde 5 min bei RT inkubiert. Dann wurden dem Transfektionsansatz 2 – 4 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNA (0,2 – 2 µg/µl) zugefügt. Der komplette Ansatz wurde für 20 – 30 min bei RT inkubiert und anschließend tröpfchenweise in das Zellkulturmedium gegeben. Für die Transfektion in kleineren Zellkulturschalen wurde die Menge des Transfektionsansatzes angepasst.

3.3.3 Isolierung von Zellklonen nach stabiler Transfektion

Zur Herstellung stabil transfizierter Zellklone wurden die HT1080-Zellen mit dem FuGENE^TM Transfektionsreagenz transfiziert. Zur Selektion von transfizierten Zellen wurde das Medium 48 h nach der Transfektion gewechselt. Die Zellen wurden mit Normalmedium mit 150 U/ml Hygromycin inkubiert. Als Sterbekontrolle wurden zusätzlich nicht transfizierte Zellen unter den gleichen Selektionsbedingungen kultiviert. Die Konzentration an Hygromycin B wurde alle 48 h bis zu einer Konzentration von 500 U/ml Normalmedium erhöht. Als auf der Kontrollplatte alle Zellen tot waren, wurden die selektionierten Zellen trypsiniert und in

unterschiedlichen Zelldichten auf 14-cm-Zellkulturschale mit Selektionsmedium ausplattiert. Auf den 14-cm-Schalen wuchsen innerhalb von 14 Tagen Zellklone heran. Zellklone, die sich durch starkes Wachstum im Selektionsmedium auszeichneten und sich gut von anderen Zellen abgrenzten, wurden von der Schale mit einer Pipettenspitze gelöst und in eine 96-well-Schale pipettiert, in der 50 µl Trypsinlösung vorgelegt wurden. Nach 10 min wurden die Zellen auf 24-well-Schalen überführt. Die Zellen eines Zellklons wurden vermehrt und kryokonserviert. Durch Western-Blot-Analyse wurde die Menge des sezernierten Proteins im Zellkulturmedium des Zellklons bestimmt. Dafür wurden die Zellen für 48 h mit DMEM/ 0,05 % FKS inkubiert, der Zellüberstand wurde abgenommen, 50 µl des Überstands wurde in Laemmli-Auftragspuffer aufgenommen und auf ein SDS-PAGE Gel aufgetragen.

3.3.4 Ernte von rekombinanten Proteinen aus serumarmem Zellkulturmedium Erntemedium: DMEM

0,05 % dialysiertes FKS

1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (100  Stocklösung) 1 % (v/v) Glutamin (200 mM, 100  Stocklösung).

Stabil transfizierte Zellen, die lysosomale Matrixproteine exprimieren, sezernieren auf Grund der hohen Expressionsrate große Mengen des Proteins in das Zellkulturmedium. Zur Ernte des Proteins aus dem Zellkulturmedium wurden die stabil transfizierten Zellen auf 14-cm-Zellkulturschalen ausplattiert. Der konfluente Zellrasen wurde zweimal mit PBS gespült und anschließend mit 20 ml Erntemedium inkubiert. Nach 48 h wurde der Überstand von den Zellen abgesaugt und bei 9 000 g zentrifugiert, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Anschließend wurde das im Medium enthaltene Protein durch Zugabe von 0,5 g/ml Ammoniumsulfat gefällt. Das gefällte Protein wurde bei 4 °C in der Ammoniumsulfat-Lösung gelagert. Die Zellen wurden noch zwei weitere Male für 48 h mit Erntemedium inkubiert und dann verworfen.

3.3.5 Metabolische Markierung von ethanolaminderivatisierten Lipiden Markiermedium: DMEM

+ 2,5 % dialysiertes FKS

+ [¹⁴C]-Ethanolamin 2,5 μCi/ml.

Lysepuffer 1 x TBS 0,1 % TX-100 1 mM EDTA 1 mM PMSF 5 mM JAA.

Am Vortag der metabolischen Markierung wurden HT1080-66-Zellen und MEF-66gt-Zellen in 6 cm großen Zellkulturschalen ausplattiert. Am Folgetag waren die Zellen zu 80 % konfluent. Die Zellen wurden vor der metabolischen Markierung zweimalig mit PBS gewaschen. Danach erfolgte die 20-stündige Inkubation der Zellen mit 3 ml Markiermedium, bei der die Inkorporation des radioaktiven Ethanolamin in die verschiedenen Ethanolaminderivate stattfand. Nach Abschluss der metabolischen Markierung wurden die Zellen zuerst zweimalig mit Normalmedium und anschließend zweimalig mit PBS gewaschen (Hansen HS et al.

1995). Im Anschluss wurden die Zellen in der Zellkulturschale mit einem Zellschaber vom Untergrund gelöst und in 500 μl eiskaltem PBS aufgenommen. Die Zellensuspension wurde nachfolgend zur Lipidextraktion verwendet.