Interaktionsstudien mittels Quervernetzung

4.4.1 In-vivo-Quervernetzung

Eine weitere Möglichkeit die Interaktion zwischen Proteinen darzustellen ist die chemisch kovalente Verknüpfung in räumlicher Nähe zueinander liegender Moleküle mittels chemischer Agenzien (Quervernetzer). Hierbei werden Proteine über sogenannte Quervernetzer kovalent miteinander verknüpft, so dass anschließend die Analyse der neu gebildeten Komplexe mit verschiedenen Verfahren möglich ist. Eine besonders physiologische Variante, bei der die Interaktionspartner in der lebenden Zelle ohne Anwesenheit von chemischen Agenzien verlinkt werden können, ist das in-vivo-Quervernetzen mit photoaktiven Aminosäuren (Suchanek et al. 2005). Diese Methode erfordert allerdings eine große räumliche Nähe der entsprechenden Aminosäuren der potentiellen Interaktionspartner. Zusätzlich müssen die photoaktiven Aminosäuren, die während der metabolischen Markierung in das Molekül eingebracht werden, auch an der Interaktion der Proteine teilnehmen bzw. in der räumlichen Nähe zum Interaktionsmotiv liegen. Das 66.3-kDa-Protein enthält eine Reihe von Leucin- (74x) und Methioninseitengruppen (16x), die für diese Art des Quervernetzens benötigt werden.

Für das Quervernetzen mit photoaktiven Aminosäuren wurden HT1080 Zellen, die das 66.3-kDa-Protein stabil überexprimieren, für 24 Stunden mit Zellkulturmedium inkubiert, welches statt der proteinogenen Aminosäuren Leucin und Methionin, Photo-Leucin und Photo-Methionin enthielt. Dieser als metabolische Markierung

bezeichnete Vorgang der Inkoorperation der photoaktiven Aminosäuren in neu-synthetisierte Proteine erfolgte über Nacht. Um die photoaktiven Aminosäuren in einen reaktiven Zustand zu überführen, musste ihnen Energie zugeführt werden.

Dazu wurden die Zellkulturschalen auf Eis mit UV-Licht mit einem Emissionsspektrum zwischen 280 und 450 nm bestrahlt. Zum Schutz der Zellen vor zu hochenergetischer Strahlung wurde zwischen UV-Lampe und Zellkulturschale eine Filterscheibe installiert, die auf Grund ihres Transmissionsspektrums das Licht der Wellenlängen unter 300 nm nicht hindurch ließ. (Die UV-Lampe mit zugehöriger Filterscheibe in der entsprechenden Apparatur wurde freundlicherweise von Dr. Olaf Jahn am Max Planck Institut für Experimentelle Medizin zur Verfügung gestellt.)

Zur Ermittlung der genauen Bestrahlungsdauer im Experiment wurden die photoaktiven Aminosäuren zuvor in PBS gelöst und in einem Vorversuch mit dem beschriebenen Versuchsaufbau bestrahlt. Die Reaktion der photoaktiven Aminosäuren wurde anhand der Abnahme der Absorption von Licht der Wellenlänge 345 nm gemessen. Nach diesem Vorgehen wurde eine Halbwertszeit der photoaktiven Aminosäuren von 1,5 Minuten ermittelt (vgl. Abb. 4.7). Laut Herstellerangaben soll die Bestrahlung der Zellen nach der metabolischen Markierung mit fünf Halbwertszeiten (HWZ) erfolgen. Da die UV-Lampe nach dem Anschalten einige Zeit benötigte, um das Licht mit einem konstanten Energieniveau zu emittieren, wurde grundsätzlich mit einer Minute Vorlaufzeit gearbeitet. Deshalb ergab sich die Bestrahlungsdauer aus der fünffachen HWZ (7,5 min) plus 1 min Vorlauf, also 8,5 min Bestrahlung jeder Probe im Experiment.

Abb. 4.7: Bestimmung der Halbwertszeit der photoaktiven Aminosäuren

Für die Ermittlung der Halbwertszeit wurden photoaktive Aminosäuren (1 mg/ml) in PBS gelöst und im Abstand von 15 cm zur Lichtquelle bestrahlt, während die Absorption bei 345 nm in regelmäßigen Abständen bestimmt wurde.

Dabei ergab sich eine Halbwertszeit der photoaktiven Aminosäuren von 1,562 min mit einer Genauigkeit von R²=0,9996.

Halbwertszeitbestimmung

Nach der 8,5-minütigen Bestrahlung wurden die Zellen homogenisiert, im Polyacrylamidgel ihrer Größe nach aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Der Western-Blot wurde mit dem 66-Antiserum (G9) analysiert (vgl.

).

Abb.

4.8

Abb. 4.8: 66.3-kDa-Protein überexprimierende HT1080-Zellhomogenate nach in-vivo-Quervernetzung mit photoaktiven Aminosäuren

Abb. 4.8

Der in dargestellte Western-Blot zeigt die HT1080-66.3-kDa-Zell-Homogenate nach der in-vivo-Quervernetzung mit photoaktiven Aminosäuren. Die Fragmente des 66.3-kDa-Proteins wurden mit dem 66-Antiserum (G9) detektiert. Als Negativkontrollen wurden Zellhomogenate von HT1080-66.3-kDa-Zellen, die weder bestrahlt (UV) noch metabolisch markiert (AS) wurden, sowie Zellen, die entweder nur bestrahlt oder nur metabolisch markiert wurden, denen, die metabolisch markiert und bestrahlt wurden, gegenübergestellt. Dabei fallen die quantitativen Unterschiede des aufgetragenen Gesamtproteins (GP) auf. Signifikante Unterschiede in den Bandenmustern sind allerdings nicht zu erkennen.

Wie in Abb. 4.8 dargestellt, zeigten sich deutliche, quantitative Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsansätzen. Diese resultieren aus der unterschiedlichen Menge an geladenem Protein, da die Proteinausbeute im Homogenat nach mehrminütiger Inkubation der Zellen in PBS mit anschließender Zentrifugation bei einigen Ansätzen nur sehr schwach war. Signifikante Unterschiede in den Proteinbanden des 66.3-kDa-Proteins, sowie hochmolekulare Proteinkomplexe nach dem Quervernetzen mit den photoaktiven Aminosäuren lassen sich jedoch nicht erkennen, so dass auf weitere Versuche verzichtet wurde.

4.4.2 In-vitro-Quervernetzung

Das in-vitro-Quervernetzen bietet die Möglichkeit des Interaktionsnachweises verschiedener Proteine, bzw. einzelner Proteinuntereinheiten miteinander. Hierbei

wurden allerdings keine photoaktiven Aminosäuren verwendet, sondern verschiedene klassische heterobifunktionale Quervernetzer.

Anders als bei der in-vivo-Quervernetzung, bei der eine Quervernetzung mit allen potentiellen Interaktionspartnern möglich gewesen wäre, sollte in diesem Versuchansatz die Komplexbildung des 66.3-kDa-Proteins in Form von Di- bzw.

Oligomerisierung der einzelnen Fragmente des 66.3-kDa-Proteins untereinander überprüft werden. Dazu wurde aufgereinigtes rekombinantes 66.3-kDa-Protein mit verschiedenen Quervernetzern inkubiert (vgl. Tab. 4.4) und anschließend im Western-Blot mit dem 66-Antiserum (G9) analysiert.

Tab. 4.4: Verwendete Quervernetzer

Die Tab. 4.4 listet alle im Versuchsansatz verwendeten Quervernetzer auf. Dabei sind deren Eigenschaften bezüglich der Länge des Spacerarms und das Reaktions-pH-Optimum angegeben.

Abk. Name Eigenschaften

SPDP N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat Spacer: 6,8 Å

pH-Optimum: 7-8

Sulfo-DST Sulfodisuccinimidyl-tartrat Spacer: 6,4 Å

pH-Optimum: 7-9

Nach der Inkubation des aufgereinigten rekombinanten 66.3-kDa-Proteins mit den Quervernetzern Sulfo-DST und EDC/Sulfo-NHS konnten keine Unterschiede zum Ausgangsmaterial festgestellt werden. Allerdings zeigte sich nach der Inkubation mit dem SPDP eine neue Bande, die bei etwa 140-160 kDa mit dem 66-Antiserum (G9) detektiert werden konnte, während die anderen Banden des 66.3-kDa-Proteins deutlich an Intensität gegenüber dem Ausgangsprotein abgenommen hatten. Dies legt eine Beteiligung der 66-, 40-, 28-kDa-Formen an der Komplexbildung des 66.3-kDa-Proteins nahe, während die 75-kDa-Proform nicht an der Komplexbildung beteiligt zu sein scheint. Auch eine hier erstmals in der Deutlichkeit zu erkennende 25-kDa-Form des 66.3-kDa-Proteins scheint an der Komplexbildung beteiligt zu sein.

Auf die genauere Bedeutung dieser 25-kDa-Form wird später ausführlich

eingegangen (vgl. Kap. 4.8). Auf Grund des Molekulargewichts von etwa 140 kDa könnte es sich bei den gebildeten Komplexen am ehesten um eine Homodimerisierung von zwei 66.3-kDa-Proteinen bzw. den jeweiligen Fragmenten handeln. Eine weitere deutlich schwächere Bande mit noch höherem Molekulargewicht lässt sich ebenfalls nach der Inkubation mit SPDP erkennen (vgl.

).

Abb. 4.9

Abb. 4.9: In-vitro-Quervernetzung des 66.3-kDa-Proteins mit verschiedenen Quervernetzern Abb. 4.9 zeigt den Western-Blot der verschiedenen Ansätze des 66.3-kDa-Proteins, welche mit den Quervernetzern der inkubiert wurden. Dabei ist in der ersten Reihe die gleiche Menge an unbehandeltem 66.3-kDa-Protein aufgetragen. Nach Inkubation mit Sulfo-DST und EDC/Sulfo-NHS finden sich keine signifikanten Unterschiede zum Ausgangsmaterial. Nach der Inkubation mit SPDP finden sich zwei weitere Banden, die sich mit dem 66-Antiserum (G9) darstellen lassen (rote Pfeile).

Diese haben ein ungefähres Molekulargewicht von 140 bzw. 250-300 kDa. Ebenfalls gut zu erkennen ist eine Abnahme der Intensität der anderen Banden des 66.3-kDa-Proteins, mit Ausnahme der 75-kDa-Proform.

Tab. 4.4