Massenspektrometrische Untersuchung der verschiedenen Fragmente des 66.3-kDa-

Die in Vorarbeiten durchgeführten Untersuchungen zur Prozessierung des 66.3-kDa-Proteins in HT1080-Zellen ergaben eine Synthese des 66.3-kDa-66.3-kDa-Proteins als Prä-Profrom, aus der durch Abspaltung des Signalpeptids von Aminosäure 1 bis 46 die 75-kDa-Proform entsteht (Deuschl et al. 2006). Diese wird in ein N-terminales 28-kDa-Fragment und ein C-terminales 40-kDa-Fragment gespalten. Die Ergebnisse der Kristallisation konnten diesen Prozessierungsschritt wie oben beschrieben bestätigen. Dabei bildet das 28-kDa-Fragment mit dem 40-kDa-Fragment als Komplex eine funktionelle Einheit. Da das 66.3-kDa-Protein in F2-Fraktionen allerdings hauptsächlich als 28-kDa-Fragment und 15-kDa-Fragment zu detektieren war, während das 40-kDa-Fragment nur noch in geringen Mengen zu finden war, legt dies eine weitere Prozessierung des 40-kDa-Fragments nahe. Das 15-kDa-Fragment war bereits als C-terminales Peptid des 40-kDa-Fragments beschrieben worden.

Über den Verbleib des N-terminalen Peptids des 40-kDa-Fragments gab es bisher keine Erkenntnisse. Die Ergebnisse der Kristallisation gaben aber gerade diesem N-terminalen Peptid des 40-kDa-Fragments eine entscheidende Bedeutung für die katalytische Funktion des Gesamtproteins. Daher war davon auszugehen, dass sich auch der N-terminale Anteil als 25-kDa-Fragment in der aktiven Form des 66.3-kDa-Proteins darstellte (vgl. Abb. 4.27 C). Bei der näheren Betrachtung des aufgereinigten, rekombinanten 66.3-kDa-Proteins im Silbergel, sowie im Western-Blot mit dem 66-Antiserum stellte sich heraus, dass in einigen Präparationen das 15-kDa-Fragment gut zu detektieren war, während es in anderen Präparationen völlig fehlte. Dabei schien die Prozessierung des 40-kDa-Fragments in das 15-kDa-Fragment am besten im HEPES-Puffer stattzufinden. Auffälligerweise ließ sich gerade in dieser HEPES-Präparation im Bereich des 28-kDa-Fragments eine weitere Bande bei 25 kDa detektieren (vgl. Abb. 4.26 A).

Abb. 4.26: Doppelbande des 66.3-kDa-Proteins im Silbergel und Western-Blot

Die Abb. 4.26 zeigt die Aufreinigung des 66.3-kDa-Proteins im Silbergel (A) und im Western-Blot mit 66-Antiserum (B). Die HEPES-Präparation ist in (A) mit einem roten Stern markiert. Die beiden roten Pfeile markieren im Silbergel die Doppelbande, welche im Western-Blot deutlich zu erkennen ist.

Zur weitergehenden Untersuchung der Doppelbande wurde ein Teil dieser HEPES-Präparation des 66.3-kDa-Proteins im Polyacrylamidgel aufgetrennt und die Bestandteile des oberen und unteren Anteils dieser Doppelbande wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Dazu wurden die Banden aus dem Polyacrylamidgel nach Coomassie Blue-Färbung ausgestanzt, im Gel mit Trypsin verdaut und die Peptide für eine Petid-Mass-Fingerprint-Analyse verwendet (MALDI-TOF-MS/PMF).

Die massenspektrometrischen Analysen wurden von Bernhard Schmidt und Nicole Eiselt der Abteilung Biochemie II am MALDI-TOF-MS (Reflex I/III, Bruker Daltonik) durchgeführt.

Abb. 4.27: Graphische Darstellung der massenspektrometrisch nachgewiesenen Peptide in der Doppelbande

In (A) und (B) sind die Ergebnisse der Massenspektrometrie des oberen bzw. unteren Anteils der Doppelbande des 66.3-kDa-Proteins dargestellt. Es sind jeweils die Massenspektrometrie-Rohdaten dargestellt, in denen die zum 66.3-kDa-Protein gehörigen Peptide mit einem schwarzen Pfeil markiert sind. Rechts darüber sind die Treffer in der NCBInr-Datenbank mit dem jeweiligen Mascot-Score abgebildet. Der grün schraffierte Bereich kennzeichnet dabei den nicht signifikanten Bereich (p>0,05).

In (C) ist die Prozessierung des 66.3-kDa-Proteins vom 40-kDa-Fragment in ein 25-kDa-Fragment und ein 15-kDa-Fragment abgebildet. Die verschieden Fragmente des 66.3-kDa-Proteins sind als graue Balken dargestellt. Die jeweils in der 28- bzw. 25-kDa-Bande massenspektrometrisch nachweisbaren

Anteile der Fragemente sind in schwarz hervorgehoben. Dabei waren alle Peptide, die sich in der 28-kDa-Bande nachweisen ließen, auch in der 25-28-kDa-Bande zu detektieren. Darüber hinaus konnten in der 25-kDa-Bande auch Peptide des 25-kDa-Fragments gefunden werden. Mit schwarzen Strichen sind die fünf Glykosylierungsstellen des 66.3-kDa-Proteins markiert.

Die ermittelten Massen wurden mit Hilfe des Programms Mascot (Matrix-Science) mit den Einträgen von in silico verdauten Proteinen mit der Proteindatenbank NCBInr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 02.12.09) verglichen. Für jede Übereinstimmung zwischen experimentell bestimmten Daten und den theoretischen Daten eines Datenbankeintrages wurde ein Mascot-Score ermittelt (vgl. Abb. 4.27).

Die massenspektrometrische Analyse der oberen der beiden Banden (28-kDa-Bande) ergab mit einem maximalen Mascot-Score von 112 Punkten eindeutig die Zugehörigkeit der gefundenen Fragmente zum 66.3-kDa-Protein (vgl. Abb. 4.27 A).

Auch die weiteren Treffer mit signifikantem Mascot-Score stellen verschiedene Datenbankeinträge des 66.3-kDa-Proteins dar. Insgesamt konnten neun tryptische Peptide dem 66.3-kDa-Protein zugeordnet werden. Diese neun Peptide liegen alle im N-terminalen 28-kDa-Fragment des 66.3-kDa-Proteins (vgl. Abb. 4.27 A und C sowie

Tab. 4.8). In der massenspektrometrischen Analyse der unteren Bande (25-kDa-Bande) konnte mit einem maximalen Mascot-Score von 152 Punkten erwartungsgemäß das 66.3-kDa-Protein identifiziert werden. Auch hier sind alle Treffer mit signifikantem Mascot-Score auf verschiedene Datenbankeinträge des 66.3-kDa-Proteins zurückzuführen. Insgesamt konnten in der unteren Bande zwölf tryptische Peptide gefunden werden, die dem 66.3-kDa-Protein zuzuordnen waren.

Neun dieser zwölf Peptide sind dem 28-kDa-Fragment zugehörig, während die verbliebenen drei Peptide dem potentiellen 25-kDa-Fragment als N-terminales Peptid des prozessierten 40-kDa-Fragements zugeordnet werden konnten (vgl. Abb. 4.27 B und C). Somit wurden vom 28-kDa-Fragment insgesamt 38% der Aminosäure-sequenz in der massenspektrometrischen Analyse detektiert. Für das 25-kDa-Fragment waren es 14% der Aminosäuresequenz (vgl. Tab. 4.8). Es wurden weder Peptide der Signalsequenz noch des C-terminalen 15-kDa-Fragments detektiert.

Einzelne Peptide der 28- und 25-kDa-Fragmente konnten nicht detektiert werden, da sie nicht in dem Bereich der eingestellten Messgrenzen für entstandene Peptide von 0,5 bis 4 kDa lagen, oder durch eine Glykosylierung auf Grund ihrer damit

verbundenen Massenzunahme nicht in der Peptid-Mass-Fingerprint-Analyse dem eigentlichen Peptid zugeordnet werden konnten.

Tab. 4.8: Massenspektrometrisch erfasste, tryptische Peptide des 66.3-kDa-Proteins Tab. 4.8

Die listet alle dem 66.3-kDa-Protein zuzuordnenden, tryptischen Peptide auf, die in der massenspektrometrischen Analyse der Doppelbande aus 28- und 25-kDa-Fragment zu detektieren waren. Dabei sind die Peptide nach ihrer Position im Gesamtprotein von N- zum C-Terminus sortiert aufgelistet. Im oberen Teil der Tabelle sind die Ergebnisse für das 28-kDa-Fragment dargestellt, im unteren Teil der Tabelle die Ergebnisse für das 25-kDa-Fragment. Die fettgedruckten Peptide wurden sowohl in oxidierter, als auch in nicht-oxidierter Form detektiert.

Berechnete Masse Gemessene Masse Sequenz Abgedeckte Sequenz 38%

1242,69 1243,67 68-79 SLLLDAASGQLR

1581,74 1582,69 100-113 ETGWAYLDLSTNGR

1549,73 1550,71 162-173 NFLEANLEWMQR 1899,86 1900,89 174-188 EMELNPDSPYWHQVR

827,54 828,51 189-195 LTLLQLK

1024,45 1025,46 196-204 GLEDSYEGR

790,43 791,49 205-211 LTFPTGR

Abgedeckte Sequenz 14%

1646,82 1647,80 341-353 YVQPQGCVLEWIR

1405,72 1406,69 360-372 LALDGATWADVFK

1198,61 1199,54 390-401 AFLPNGPSPGSR

Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchung bestätigen die anfänglichen Vermutungen, dass die Doppelbande aus dem 28-kDa-Fragment und dem potentiellen 25-kDa-Fragment gebildet werden. Diese Ergebnisse legen eine Prozessierung der 75-kDa-Proform in ein 28- und 40-kDa-Fragment mit sukzessiver Weiterprozessierung des 40-kDa-Fragments in ein C-terminales 15-kDa-Fragment und ein N-terminales 25-kDa-Fragment nahe. Der N-Terminus des 15-kDa-Fragments ist durch die Edman-Analysen in Vorarbeiten mit Serin 514 beschrieben worden (Deuschl et al. 2006). Ob der C-Terminus des 25-kDa-Fragments allerdings direkt mit der vorherigen Aminosäure (Arginin 513) endet, oder ob im Rahmen der Prozessierung weitere Aminosäuren abgespalten werden, ist unklar.

Welchen Einfluss die unterschiedlichen Pufferbedingungen während der Aufreinigung speziell auf die Geschwindigkeit dieser womöglich autokatalytischen Weiterprozessierung des 66.3-kDa-Proteins hatten, kann hier nicht abschließend geklärt werden.

4.9 Transkriptomanalyse des